Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Metoder för bestämning av priser av glukos och fettsyra oxidation i isolerade Working Rat hjärta

Published: September 28, 2016 doi: 10.3791/54497
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology and Biophysics, Mississippi Center for Obesity Research, Cardiovascular-Renal Research Center, University of Mississippi Medical Center

Abstract

Däggdjurs hjärta är en stor konsument av ATP och kräver en ständig tillförsel av energisubstrat för kontraktion. Inte överraskande, har förändringar av myocardial metabolism varit kopplade till utvecklingen av kontraktila dysfunktion och hjärtsvikt. Därför bör reda ut sambandet mellan metabolism och kontraktion belysa några av de mekanismer som styr hjärt anpassning eller missanpassning i sjukdomstillstånd. Den isolerade arbetsråtthjärta preparatet kan användas för att följa, samtidigt och i realtid, hjärtsammandragningsfunktion och flöde av energi som ger underlag till oxidativa metaboliska vägar. Det nuvarande protokollet syftar till att ge en detaljerad beskrivning av de metoder som används vid framställningen och användningen av buffertar för kvantitativ mätning av andelen oxidation för glukos och fettsyror, huvudenergigivande substrat i hjärtat. De metoder som används för provanalys och tolkning av data är också diskuteras.I korthet, är tekniken baserad på leverans av 14 C- radiomärkt glukos och en 3 H- radiomärkt långkedjig fettsyra till en ex vivo bultande hjärta via normotermisk kristalloid perfusion. 14 CO 2 och 3 H2O, slut biprodukter av enzymatiska reaktioner är involverade i användningen av dessa energi ger substrat, därefter kvantitativt återhämtat sig från krans utflödet. Med kännedom om den specifika aktiviteten hos de radiomärkta substrat som används, är det sedan möjligt att individuellt kvantifiera flödet av glukos och fettsyra i de oxidationstillstånd vägar. Kontraktila funktion av det isolerade hjärtat kan bestämmas parallellt med den lämpliga färdskrivaren och direkt korrelerad till metaboliska flödesvärden. Tekniken är mycket användbart för att studera metabolismen / kontraktion förhållande som svar på olika stressförhållanden, såsom förändringar i pre och efter belastning och ischemi, ett läkemedel eller en cirkulationsting faktor, eller efter förändringen i expressionen av en genprodukt.

Introduction

klinisk relevans

I däggdjurs hjärta, det finns en stark positiv relation mellan flödet av substrat genom oxidativa metaboliska vägar, ATP generation och hjärtarbetet en. Under de senaste två decennierna har utredningen av intrikata sambandet mellan hjärt metabolism och funktion har lett till att inse att förändringar i hjärtmetabolism är en orsak till kontraktil dysfunktion och eventuellt patologiska strukturell ombyggnad i fastställandet av olika typer av hjärtsjukdomar 2-4. därför förväntas det att vår förståelse av de mekanismer som styr metaboliska ombyggnad av den stressade hjärta kommer att leda till identifiering av terapeutiska mål för förebyggande eller behandling av hjärtsvikt 5-7. Den senaste offentliggörandet av en vetenskaplig förklaring från American Heart Association "bedöma Cardiac Metabolism", betonar det växande intresset för det vetenskapliga samfundet för thans forskningsområde 8. Men medan de tekniska framstegen inom hjärtavbildning tillåter nu för en snabb och noggrann utvärdering av hjärt morfologi och funktion, är fortfarande begränsad och betungande studier av hjärtmetabolism in vivo: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi och Positron Emission Tomography (PET) avbildning kan användas för att följa hjärtats högenergifosfat ämnesomsättning och Krebs cykel aktivitet, men dessa tekniker plågas av höga driftskostnader och deras oförmåga att bestämma bidraget av olika substrat till oxidativ metabolism i steady state 9 .För detta datum ex vivo arbets hjärta förberedelse representerar den enda och unika teknik som finns tillgänglig för att studera, samtidigt och i realtid, kontraktila funktion och flöde av substrat i oxidativa metaboliska vägar 7,9. Följande protokoll syftar till att ge riktlinjer vid framställning och användning av reagens som används för att bestämma råttaes av substrat utnyttjande i isolerade arbets råtta hjärta.

De isolerade Working Gnagare hjärta Apparatus

Även om tekniken är nästan ett halvt sekel gamla, isolerade arbetsråtthjärta förberedelse fortfarande en metod för val för kardiovaskulär forskning. Som med Langendorff hjärt beredning, erbjuder arbets gnagare hjärtat en relativt enkel, tillförlitlig, och billigt sätt att mäta ett brett spektrum av hjärtparametrar oberoende av de störande effekterna av andra organ, neurohormonella och andra cirkulerande faktorer. Men i motsats till Langendorff-perfusion hjärta, fortsätter att arbeta hjärtat att utföra nästan fysiologiska hjärtarbetet, en förutsättning för generering av oxidativa metabola flux till nivåer som är relevanta för in vivo-betingelser. Detta uppnås genom att leverera perfusionsbuffert till den vänstra kammaren (LV) via en kanyl som är ansluten till det vänstra förmaket, och såsom LV fyller och kontrakt,buffert matas ut genom aorta linje mot en bestämd afterload hydrostatiskt tryck. Utformningen av perfusion apparaten ursprungligen beskrevs av Neely och kollegor 10 därefter förbättrades med Taegtmeyer, Hems och Krebs 11, men har förändrats mycket lite sedan dess. Som beskrivits i den ursprungliga apparaten kan kontraktila funktion bedömas genom bestämning av hjärtminutvolym med hjälp av högst mätglas och ett stoppur för att mäta aorta och koronarflöden 10,11. Flera leverantörer erbjuder nu kompletta arbets gnagare hjärta perfusion system. Dessa kommersiellt tillgänglig apparat kan förvärvas med flowprobes, tryckgivare, en tryck volym kateter och all utrustning som behövs för hjärt funktionell datainsamling och analys. De leverantörer ger omfattande dokumentation och utbildning för att bekanta den nya användaren med sin utrustning. Flera översiktsartiklar också detaljprotokoll på arbets hjärta instrumsenta och om användningen av katetrar för att mäta hjärtfunktionen hos gnagare 12-15. Av denna anledning kommer vi endast kortfattat nämna installation av perfusion apparater och färdskrivaren. Det nuvarande protokollet syftar snarare att komplettera redan tillgänglig information med en beskrivning av de metoder som kan genomföras för att samtidigt mäta andelen glukos och långkedjiga fettsyra oxidation, de två stora energi ger substrat i normalt hjärta. Vi beskriver här alla de steg som ingår i användningen av radiomärkta energisubstrat för bedömning av myokardial oxidativ metabolism, från framställningen av reagens och buffertar till återvinning och bearbetning av prover, till dataanalysen.

Principer för metoden

Kardiomyocyter generera huvuddelen av sin energi för sammandragning från den oxidativa fosforyleringen av fettsyror (huvudsakligen långkedjiga fettsyror) och kolhydrater (glucose och laktat). Hjärtat har mycket begränsad energiska reserver och förlitar sig på en konstant tillförsel av dessa energikällor ger substrat från cirkulationen. Katabolismen av glukos genom den glykolytiska vägen ger pyruvat som sedan dekarboxyleras av pyruvatdehydrogenaskomplexet av det inre mitokondriemembranet. Långkedjiga fettsyror, extraherade från cirkulerande albumin eller lipoprotein triglycerider, först aktiveras till acyl-CoA-molekyler i cytosolen och därefter transporteras inne i mitokondriematrisen genom karnitin shuttle att gå in i beta-oxidation pathway. Acetyl-CoA molekyler som produceras av katabolismen av glukos och fettsyror bränsle Krebs cykel för att generera de reducerande ekvivalenter (NADH och FADH2) som används av elektrontransportkedjan att bygga den proton-drivkraft över det inre mitokondriemembranet och generera ATP genom aktiviteten av ATP-syntas. Vatten och koldioxid är slut biprodukter avenzymatiska reaktioner som sker inne i Krebs cykel. Leverans av 14 C- och 3 H- radiomärkta substrat (såsom 14 C-radiomärkt glukos och 3 H-radiomärkt oljesyra) till den isolerade arbets hjärta kommer följaktligen att leda till produktion av 14 CO2 och 3 H 2 O som kan kvantitativt utvinnas från krans utflödet. Insamlingen av 14 CO 2 utförs genom att hålla isolerad perfusion hjärtat i en förseglad kammare och genom att omedelbart återhämta sig krans utflödet när det lämnar hjärtat. En liten anjonbytarkolonn användes för att separera och utvinna 3 H2O från krans utflödet. Radioaktiviteten från de bearbetade proverna mäts med en vätskescintillationsräknare, och med kännedom om den specifika aktiviteten hos de radiomärkta substrat används, är det då möjligt att individuellt kvantifiera flödet av glukos och fettsyra i denoxidation vägar 16,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla djurförsök utfördes enligt NIH Public Health Service Policy på Human Care och användning av djur och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Mississippi Medical Center. Alla förfaranden som omfattar användning av radioisotoper godkändes och genomförs i enlighet med de riktlinjer som fastställts av strålsäkerheten kontor University of Mississippi Medical Center.

1. Framställning av Arkivbuffertlösningar och reagens

  1. Krebs-Henseleit (KH) Buffertstamlösningar
    1. Förbereda 2 L av en 20x koncentrerad saltförrådslösning innehållande (i mol / L) 2,37 NaCl, 0,0948 KCl, 0,0236 KH 2 PO 4, och 0,0236 MgSO 4 * 7H 2 O. Filtrera på ett 0,45 um porstorlek filtreringsenhet och förvara vid rumstemperatur i upp till en månad.
    2. Förbereda 2 L av en 20x koncentrerad (0,5 mol / L) lösning av NaHCOs 3. Lösningen kan varaförvaras vid rumstemperatur under en obestämd tid.
    3. Bereda 250 ml av en 1 mol / L lagerlösning av CaCl2. Filtrera på ett 0,45 um porstorlek filtreringsenhet och förvara vid rumstemperatur i upp till en månad.
  2. Omvandling av anjonbytarharts från kloridformen till hydroxidformen
    1. Tvätta anjonbytarhartset genom återsuspendering den i en L ultrarent vatten. Låt massan för att reglera och häll bort överflödigt vatten. Upprepa detta steg 4 gånger.
    2. Häll hartset i en glasmikroanalys vakuumfilterhållaren monterad på en filtreringskolv.
    3. Konvertera hartset till hydroxidformen genom att långsamt passera genom 22 volymer av en N NaOH. Blanda uppslamningen intermittent med en spatel av rostfritt stål.
    4. Tvätta hartset med ultrarent vatten tills pH sjunker under 9,0. Kontrollera pH regelbundet genom att doppa en testremsa pH nära ytan av hartsuppslamningen. Täck och förvara hartset med ultrarent vatten i en borosilicate glasflaska och skyddas mot ljus. Tillåter inte hartset torka före användning.
      OBS: När lagras på rätt sätt, kommer hartset att pågå åtminstone 3 månader.
  3. Oljesyra-albumin 8x koncentrerad förrådslösning
    1. I en 4 L Erlenmeyerkolv, blanda 200 ml av den 20x koncentrerade saltförrådslösning och 200 ml av 20x koncentrerade NaHCOs 3-lösning med 3,6 L ultrarent vatten.
    2. Med användning av ett gasdispersionsrör med en frittad cylinder, gas lösningen under 15 min med en blandning av koldioxid 5% och syre 95% för att stabilisera pH.
    3. Häll 470 ml buffert i en 1 liters glasbägare. Lägga 8,75 ml av 1 mol / L CaCl2 stamlösning till 3530 ml buffert som återstår i 4 L Erlenmeyerkolv och ställ åt sidan.
    4. Lägga 40 g fettsyra-BSA till en L glasbägare och rör om med en omrörarstav tills det är upplöst.
    5. I ett 15 ml koniskt rör, förbereda 4 ml av en 50% (v: v) etanollösning i ultrarent vatten. Lägg 487 mg sodium oleat och skaka tills pulvret är helt upplöst.
      OBS: Vissa forskare använder palmitinsyra i stället för oljesyra i perfusionsbuffert. En palmitinsyra-albumin stamlösning kan framställas enligt samma förfarande. Det är dock rekommenderas att värma lösningen vid 70 ° C för att uppnå fullständig upplösning av natriumpalmitat.
    6. Tillsätt oleat lösning droppvis till fettsyrafritt BSA-lösningen under konstant omröring och vänta 10 mer min för oljesyra-BSA-komplexet att bildas.
      OBS: Lösningen bör ha en ljusgul färg och sakna synliga partiklar. Närvaron av en fällning eller olösliga partiklar kan indikera ofullständig konjugering av fettsyran till BSA. Om detta händer, ska lösningen kasseras och den process som inleddes på nytt.
      OBS: Palmitat kommer att falla ut om det är tillåtet att sitta i en pipett och kan inte läggas till droppvis. Den omrörda lösning av BSA kan värmas vid 37 ° C för att underlätta binding palmitinsyra. Inte överhettas då detta kan orsaka denaturering och aggregering av BSA.
      VARNING: Nästa steg i detta protokoll involverar manipulering av radioaktivt material. Bära lämplig skyddsutrustning och följ säkerhet och eliminering av avfall föreskrifter som strålsäkerhet institutets kontor.
    7. Lägg 160 | il (0,8 mCi) [9,10- 3 H] oljesyra till den omrörda lösningen av oljesyra-BSA och rör om under ytterligare 10 min.
    8. Tillsätt 2,5 ml av 1 mol / L CaCl2 stamlösning till den omrörda lösningen av oljesyra-BSA.
    9. Klipp ca 1,2 m dialysmembranslang och skölj både inom och utanför med kranvatten. Skrubba dialysslangen kraftigt under rinnande vatten i 10 till 15 minuter för att avlägsna glycerolen beläggning av membranet. Alternativt avlägsna beläggningen genom blötläggning av dialysrör i varmt vatten under 1 timme före användning. Avsluta med att skölja dialysrör med ultrarent water.
    10. Säkert fästa en ände av dialysslangen. Fyll på med oljesyra-BSA-lösning och fästa den andra änden av dialysslangen.
    11. Placera den fyllda dialysslangen in i 4 L Erlenmeyerkolv av KH-buffert och låt dialysera över natten vid 4 ° C under försiktig omröring med en omrörare.
    12. Nästa dag, ta bort 8x koncentrerad oljesyra-BSA-lösningen från dialysslangen. Använd oljesyra-BSA-lösning omedelbart för perfusion eller delprov och förvara vid -20 ° C. Frysta alikvoter är stabil i minst 2 månader. Undvika att flera frysnings-upptiningscykler eftersom detta kan påverka lösligheten av oljesyra-BSA-komplexet.
      OBS: Använd endast ultrarent vatten (resistivitet av 18,2 MΩ.cm vid 25 ° C, totalt organiskt kol <10 ppb, mikroorganismer ≤ 1 CFU / ml, partiklar med storlek över 0,22 um ≤1 / ml) för att framställa reagens och buffertar används för hjärt perfusion. Omvandling av anjonbytarhartset från dess klorid underm till hydroxidform kan undvikas genom direkta köp av hydroxidform mot en extra kostnad (se Material tabell). Förutom oleat eller palmitat, kan någon annan typ av naturligt förekommande fettsyra också användas, så länge som en tritierad version av fettsyran är tillgänglig för att följa dess oxidation.

2. Beredning av Perfusion buffert

  1. I en 4 L Erlenmeyerkolv, blanda 200 ml av den 20x koncentrerade saltförrådslösning och 200 ml av 20x koncentrerade NaHCOs 3-lösning med 3,6 L ultrarent vatten. Gas lösningen under 15 min med en blandning av koldioxid 5% och syre 95%, och sedan lägga 10 ml av 1 mol / L CaCl2 stamlösning för att ställa in koncentrationen av fri Ca 2+ vid 2,5 mmol / L.
    VARNING: Följande steg innebär manipulering av radioaktivt material. Bära lämplig skyddsutrustning och följa säkerhets- och avfallsföreskrifter som institutionens radiation office säkerhet.
  2. Överföra 1,750 L KH-buffert till en 2 L flaska av borsilikatglas. Tillsätt 250 ml av 8x koncentrerad oljesyra-BSA-lösning, 1,802 g D-glukos, 400 | j, l insulin vid 0,4 U / ml, och 200 | il (0,2 mCi) [U 14 C] glukos. Vänd flaskan för att blanda. Detta kommer att ge 2 L av fullständig perfusion buffert innehållande oljesyra (0,4 mmol / l), D-glukos (5 mmol / l), och insulin (40 ^ U / ml).
    OBS: En volym av 2 liter är tillräcklig för att BEGJUTA en arbetande vuxen hjärta råtta i icke-cirkulerande under minst 60 minuter.
  3. Använda en del av den icke-radioaktiv KH buffert för att fylla två dissekering rätter och placera på is för att svalna.

3. Beredning av perfusionsapparat

OBS: Utredaren kan välja att använda en specialbyggd perfusion apparat såsom den beskrivs av Taegtmeyer, Hems och Krebs 11, eller en av de kommersiellt tillgängliga system. Perfusionssystem består typiskt avelement som beskrivs i figur 1 nedan. Förutom slangen och glas, är resten av färdskrivaren tillval och dess användning kommer att bero på utredarens behov att ta itu med den experimentella fråga som ställs. Ändå, rekommenderar vi användning av syremikroelektroder för att bestämma O 2 koncentrationen i buffert in och ut ur kranskärlscirkulation (Figur 1). Detta kommer att hjälpa utredaren kontroll att hjärtat är försedd med en lämplig mängd syre, och att syretillförseln inte varierar mellan experimenten. Dessutom kan fastställandet av "arteriovenösa" syreskillnad användas för att beräkna myokardial syreförbrukning och hjärteffektivitet 16,18.

  1. Slå på cirkulerande vattenbad och ställs in på 37 ° C för att värma upp perfusionsapparat.
  2. Slå på datorn och förvärvet systemdata som kommeranvändas för att mäta hjärtfunktion.
  3. Anslut inspelningsenheter (tryck kateter, tryck volym kateter, syre microelectrodes, flödesmätare, etc.) och datainsamlingssystemet och utföra kalibrering av instrument enligt tillverkarens instruktioner.
  4. Fyll buffertreservoaren med ultrarent vatten. Slå på den peristaltiska pumpen och spola ut vattnet genom alla slangarna och glas för att skölja systemet. Stäng av den peristaltiska pumpen och se till att inget vatten stannar i slangen och / eller glas eftersom det kan påverka koncentrationen av perfusion buffert och hjärtat förberedelse.
  5. Ansluter en ny 1,0 fim glasfiberfilter till systemet. Anslut gas tank som innehåller en blandning av koldioxid 5% och syre 95% till syresättningskammaren.
    VARNING: Följande steg innebär manipulering av radioaktivt material. Bära lämplig skyddsutrustning och följa säkerhets- och avfallsföreskrifter som institutionenKontor strålsäkerheten.
  6. Fyll buffertreservoaren med perfusionsbuffert. Slå på pumpen och säkerställa fyllning av alla slangar och glas med perfusionsbuffert. Kör perfusionsbuffert genom perfusionsapparat i den recirkulerande läge och oxygenat i minst 30 min före användning.
  7. Tätt fäster röret av en 20 ml spruta under hjärtkammaren för att återställa hjärtats utflöde. Anslut spetsen på sprutan till toppen av en trevägskran. Anslut sidoarmen till en 3 ml spruta. Anslut den nedre armen via rör till en behållare för flytande radioaktivt avfall.
    OBS: Vid användning av fettsyran-BSA-komplex, kan syresättning av perfusionsbuffert inte utföras genom direkt bubblande med en gasdispersionsrör eftersom detta kommer att orsaka överdriven skumning av lösningen. Använd en membranoxygenatorer (Figur 1) eller ett ark flödessyresättningskammare för detta ändamål. Det rekommenderas att kontrollera att en lämplig nivå of syresättning nås genom att placera en syremikroelektrod i perfusionskretsen (Figur 1).

4. Rat Heart Isolering och Kanyle

  1. Väg råtta på en skala.
  2. Förbered en spruta med bedövningsmedel dos av 150 mg / kg thiobutabarbital natriumsalt-hydrat och en tuberkulinspruta med 200 USP-enheter heparin.
  3. Injicera thiobutabarbital IP och vänta för djuret att förlora medvetandet. Andra induktionsmedel kan användas så länge som detta inte kommer att störa syftet med försöket (se Val av narkosmedel i diskussionsavsnittet nedan).
  4. Kontrollera om en lämplig nivå av anestesi genom att bekräfta bristen på tå nypa reflex. Se till att bibehålla rätt anestesidjupet för att säkerställa att djuret inte känner smärta under proceduren.
  5. När råttan är helt medvetslös och inte svarar på tå nypa, placera den på rygg på operationsbordet och sekure lemmar med tejp eller stift.
  6. Klippa buken fria från hår och utföra en mittlinjesnitt av buken. Inte öppna brösthålan vid denna tidpunkt ännu. Flytta magsäcken och tarmen åt sidan för att avslöja den nedre hålvenen. Injicera heparin direkt i den nedre hålvenen och vänta 5-10 sekunder innan du fortsätter.
  7. Med användning av sax klippa membranet och sidorna av bröstkorgen för att exponera innehållet i brösthålan.
  8. Fint ta hjärtat mellan tummen, pekfingret och långfingret och punktskatter både hjärta och lungor tillsammans. Skär på samma nivå som den nedåtgående aorta, försiktigt så att inte skada aortabågen och aorta ascendens i processen. Överför omedelbart hjärta och lungor till en av dissektion rätter fyllda med iskall KH buffert.
  9. Efter hjärtat slutar slå, överföra till andra dissektion skålen och trimma bort eventuella stora bitar av lungvävnad anslutna samtidigt hjärtat nedsänkt i iskallt KH buffert. Skär descending aorta precis ovanför aortabågen.
    VARNING: Följande steg innebär manipulering av radioaktivt material. Bära lämplig skyddsutrustning och följ säkerhet och eliminering av avfall föreskrifter som strålsäkerhet institutets kontor.
  10. Spola aorta raden i perfusionsapparaten för att fylla aortakanylen med varmt buffert och för att eliminera eventuellt vatten eller luft som fortfarande kan vara närvarande i slangen. Tillåta perfusion buffert för att droppa från aortakanylen för att minimera risken för luftemboli vid tidpunkten hjärtat är fäst vid kanylen.
  11. Med hjälp av två mikro dissekera pincett öppna försiktigt aorta och skjut hjärta upp till aortakanylen. Säkra aorta på kanylen med en mikro klämma och initiera Langendorff perfusion av hjärtat. Observera hjärtat börjar slå igen och utvisa allt blod kvar i kranskärlen i sekunder efter början av perfusion.
    OBS: Det är mycket viktigt att utföra steg 4.6 till 4,10 så fort som möjligt för att förhindra oåterkalleliga ischemisk skada på hjärtat. Med erfarenhet, bör hela proceduren tar mellan ett och två minuter. När skjuta aorta upp på kanylen, vara noga med att inte passera aortaroten, eftersom detta kan leda till hjärtinfarkt hypoperfusion och skador på aortaklaffen.
  12. Knyt aorta till aortakanylen med en 3-0 silke sutur och avlägsna mikro klippet. Leta lungvenen. Det kan vara nödvändigt att trimma de icke-hjärtvävnader för att hitta den, men inte skär alltför mycket av de icke-hjärtvävnader som de kommer att tjäna till att binda det vänstra förmaket till kanylen.
  13. Spola den vänstra förmaks raden i perfusionsapparaten för att fylla den atriella kanylen med varmt buffert och för att eliminera eventuellt vatten eller luft som fortfarande kan vara närvarande i slangen. Var särskilt noga med att ta bort eventuella luftbubbla från apparaten för att minimera risken för luftemboli vid den tidpunkt då hjärtat är kopplad till kanylen.
  14. Med användning av två mikro dissekera iska kraftereps försiktigt ta öppnandet av lungvenen och skjut hjärtat upp på förmaks kanylen. Det kan vara nödvändigt att ompositionera hjärtat genom att försiktigt rotera den atriella och / eller aortakanylen för att åstadkomma detta steg. I vilket fall som helst, se till att förfarandet inte medför alltför stor påfrestning på hjärtat och orsaka böjning av aorta. Knyt vänster förmak till förmaks kanylen med en 3-0 silke sutur.
  15. Öppna förmaksledningen och samtidigt koppla aortaledningen från Langendorff läget till arbetsläget. Om buffert läcker ut från vänster förmak, stänger förmaks linje, växla tillbaka aorta linje till Langendorff perfusion, och använda en annan 3-0 siden sutur att knyta vänster förmak säkrare till kanylen.

5. Mätning av hjärtfunktionen och Provtagning

OBS: Bestämningen av metaboliska flödena kommer att kräva kunskap om koronarflödet (CF). Såsom beskrivs nedan, kan kransflödesvärden varaerhölls med den enkla användningen av ett stoppur. Dessutom kommer mätning av aortaflöde (AF) med samma metod tillåter bestämning av hjärtminutvolym (CO = CF + AF), som sedan kan användas för att beräkna hjärt effekt (CP) som ett allmänt mått på hjärtfunktionen genom att tillämpa formeln CP = CO (m 3 / s) * afterload (Pa). En annan metod som finns tillgänglig för bedömning av hjärtfunktionen förlitar sig på realtidsmätning av pulstryck med en tryckomvandlare (fig 3 och 4). Även frivilligt, den mest exakta och detaljerade mätningar av hjärtsammandragningsfunktion och hemodynamik, inklusive fastställandet av systolisk vänsterkammar och diastoliska funktioner, kommer att uppnås med hjälp av en tryck volym (PV) ledningskateter. I detta avsnitt beskrivs kortfattat kateterisering av det isolerade hjärtat. Ytterligare information om kalibrering av PV katetrar och dataanalys med statistisk programvara kan varahittas i referenser 14,15.
VARNING: Följande steg innebär manipulering av radioaktivt material. Bära lämplig skyddsutrustning och följ säkerhet och eliminering av avfall föreskrifter som strålsäkerhet institutets kontor.

  1. Om försöket innefattar direkt mätning av LV funktion med en kateter, punktera LV spetsen med en 26 G nål och införa katetern via punktering.
  2. Vid användning av en tryck-volym kateter, noggrant positionera katetern så att dess axel är inriktad med LV längdaxel, med den distala elektroden precis nedanför aortaklaffen och intill den endokardiala gränsen, och den proximala elektroden precis innanför den ventrikulära väggen.
  3. Täta hjärtat i vattenmantlade hjärtkammare och övervaka hjärt funktionella parametrar med datainsamling programvara. Starta inspelningen efter initial hjärt parametrar har varit stabil under mer än fem minuter.
  4. Bestäm koronarflödet med measuring den tid som krävs för att fylla 20 ml spruta rör fäst på undersidan av hjärtkammaren. Efter mätningen öppna trevägskran att tömma koronar avloppsvatten i den radioaktiva behållaren flytande avfall.
    OBS: Flödesmätning kan också utföras med hjälp av en flödesmätare och flowprobes.
  5. Använd 3 ml spruta fäst vid sidan arm trevägskran att återhämta ~ 2 ml koronar avloppsvatten när det lämnar hjärtat. Överför 0,5 ml av krans avloppsvatten i en 2 ml Capless mikrocentrifugrör och omedelbart gå vidare med fastställandet av andelen glukos oxidation (avsnitt 6 nedan).
  6. Överför resten av krans utflödet provet (~ 1,5 ml) i ett lämpligt märkt mikrocentrifugrör och förvara på is.
  7. Upprepa steg 5,4-5,6 med jämna mellanrum (t.ex. varje 5 eller 10 min) till slutet av perfusion experimentet.
  8. Om man använder en tryck-volym kateter, injicera en 10 ^ il bolus av hyperton saltlösning (15%)i förmaks linje och precis innan förmaks kanylen innan avtalet experimentet. Använd den här bolusinjektion för att beräkna den parallella konduktansen (Vp), som är kritisk för noggrann bestämning av hjärtminutvolym 15.
  9. Bryta förseglingen hjärtkammaren och avlägsna katetern från LV, om en användes i experimentet. Återställa hjärtat med hjälp av ett av följande alternativ:
    1. Om det inte finns något behov av att isolera specifika områden i hjärtat för analyser nedströms och om perfusion utrustningen tillåter, nära både förmaket och aorta linjer och omedelbart fryst klämma hjärtat på sina kanyler använder Wollenberger tång förkyld i flytande kväve.
    2. Alternativt, skär i hjärtat av kanylerna och släppa den i iskall KH buffert. Snabbt torka hjärta på en pappershandduk och mäta dess våtvikt. Hjärtat kan därefter dissekeras och vävnadsprov uppsamlas för specifika mätningar. Frysa de resterande vävnad med hjälp Wollenberger tongs för-kyld i flytande kväve.
  10. Förvara frysta hjärtvävnad vid -80 ° C tills bestämning av torrvikt (se avsnitt 8. Beräkningar).

6. Prövning av Myocardial glukosoxidation priser

OBS: Metoden består i kvantitativ utvinning av 14 CO2 från krans utflödet med en fångst lösning av hydroxid av Hyamine. 14 CO2 upplöst som H 14 CO3- återvinns efter försurning av bufferten med perklorsyra. Prover bör behandlas omedelbart efter sitt tillfrisknande som passiv diffusion av gas mellan luft och prov kommer att resultera i en förlust av 14 CO2 över tiden. De scintillationsfläskor bör tätt tillsluten med gummihylsan proppar för att förhindra förlust av 14 CO 2 efter tillsats perklorsyra. Om nödvändigt, kan parafilm användas för att fästa gummihylsan proppar tillflaskor (Figur 2).

  1. Tillsätt 1 ml av 10x koncentrerad hydroxid av Hyamine till glas scintillationsfläskor (en flaska per prov + två extra flaskor för bestämning av bakgrundsaktiviteten).
    VARNING: hydroxid av Hyamine är mycket giftigt och orsakar svåra brännskador. Konsultera produktdatablad för korrekt hantering och lagring.
  2. Använda pincett försiktigt överföra 2 ml Capless mikrocentrifugrör innehållande 0,5 ml koronar avloppsprov till en flaska förfylld med hydroxiden av Hyamine. Använd 0,5 ml perfusionsbuffert för bestämning av bakgrundsaktiviteten.
  3. Förslut flaskan med en gummihylsa propp. Parafilm kan användas för att säkra förseglingen av flaskan. Med användning av en 1 ml spruta och en 23 G lång nål, injicera 200 pl perklorsyra (60% vikt: vikt%) genom gummihylsan propp och direkt in i 2 ml Capless rör.
    OBS! Krans utflödet ska vända vitt på grund av utfällning av BSA.
  4. Låt ampullerna söver natten.
    VARNING: Perklorsyra är starkt frätande, kan fungera som ett oxidationsmedel och / eller orsaka en explosion. Konsultera produktdatablad för korrekt hantering och lagring.
  5. Nästa dag, ta bort gummihylsan proppar. Noggrant återvinna varje 2 ml Capless rör med pincett och tvätta botten av röret på toppen av den öppna ampullen med 1 ml scintillationscocktail för att hämta alla av hydroxiden av Hyamine. Kasta utan lock röret i en lämpligt etiketterad avfallsbehållare radioaktiv.
  6. Tillsätt ytterligare 9 ml scintillationscocktail per flaska. Tillsätt 0,5 ml perfusionsbuffert direkt till två ampuller fyllda med 10 ml flytande scintillationscocktail för bestämning av den specifika aktiviteten. Skaka flaskorna kraftigt för hand och vänta åtminstone sex timmar för att tillåta luftbubblor att försvinna före mätning i en vätskescintillationsräknare lämpligt inställd för dubbla etikett experiment.
    OBS: Använd tydliga glasflaskor att visualisera needle när piercing gummimuffen proppar. Tappa inte perklorsyra i hydroxiden av Hyamine eftersom detta kommer att förstöra reaktionen. Lägga till perklorsyra frigör 14 CO 2 från krans avloppsvatten i luften. Även flaskorna ska vara tätt tillsluten och alla 14 CO2 skall fastna i Hyamine av hydroxid, rekommenderas att utföra denna analys under dragskåp.

7. Fastställande av Myocardial Oleat Oxidation priser

OBS: Metoden baseras på kvantitativ separation och utvinning av 3 H2O från krans utflödet användning av en stark anjonbytarharts. Till skillnad från återvinning av 14 CO2, finns det inget prov stabilitet fråga och krans utflödet kan hållas på is eller förvaras i frysen innan analysen utförs.

  1. Förbereda anjonbytarharts kolumner (en kolumn per prov + two extra kolumner för bestämning av bakgrundsaktiviteten) genom att fylla spetsen av 3 ml spruta rör med glasull. Tillsätt harts / vatten slurry med en överföringspipett tills hartset når 2 ml märket på sprutan röret.
  2. Tvätta hartset genom att passera 2 ml ultrarent vatten genom kolonnen. Upprepa detta steg två gånger.
  3. Placera öppna scintillationsflaskor i kolumnerna och ladda 0,5 ml koronar utflöde per kolumn. Ladda 0,5 ml perfusionsbuffert för bestämning av bakgrundsaktiviteten.
  4. Tvätta kolonnerna successivt med 0,5, 1 och 2 ml ultrarent vatten. När elueringen är klar, kasta kolumner i en lämpligt etiketterad avfallsbehållare radioaktiv.
  5. Lägg 13 ml flytande scintillationscocktail per scintillationsflaska. Tillsätt 0,5 ml perfusionsbuffert direkt till två ampuller fyllda med 13 ml flytande scintillationscocktail för bestämning av den specifika aktiviteten. Skaka flaskorna kraftigt och vänta åtminstone sex timmar före mätning i en flytande scintillation räknare lämpligt inställd för dubbla etikett experiment.

8. Beräkningar

  1. Om det inte redan gjort, bestämma den våta vikten av hela perfusion hjärtat.
    OBS: Låt inte den frysta vävnaden att tina om molekylära och biokemiska analyser ska därefter utföras på kvarvarande vävnad.
  2. Bestämma våtvikt av ett vävnadsprov från hela GJUTA-heart (använd cirka 15 till 30% av hela hjärtat). Placera vävnadsprovet i en ugn inställd på 50 ° C över natten och mäta dess torrvikt. Använd våtvikt / torrviktförhållande av vävnadsprovet för att bestämma den torra vikten av hela hjärtat i gram (g torrvikt.).
  3. För varje tidpunkt x uttrycka värdet av koronarflödet CF x i ml / min.
  4. Bestämning av hastigheten av glukosoxidation
    1. Genomsnitt två sönderfall / min (dpm) värden uppmättes för bakgrundsaktiviteten av 14 C till determine korrektionsfaktorn 14C dpm ba.
    2. Bestäm 14 C genomsnittliga värde specifik aktivitet 14C dpm sa.
    3. Bestämma den specifika radioaktiviteten av glukos i dpm / imol (F Glu) med användande av formeln
      ekvation 1
      OBS: Om n Glu (imol) = C Glu (| imol / l) * provvolym (L) = 2,5 vid användning av glukos vid 5 mmol / L och en 0,5 ml prov.
    4. Bestämma för varje tidpunkt x hastigheten för produktion av 14 CO2 i dpm / min (A) med användande av formeln
      ekvation 1
      OBS: Om Vol x (ml) = 0,5
    5. Divide A genom det bestämda värdet av torrhjärtvikt för att erhålla den normaliserade produktionshastigheten av 14 CO 2 (A Norm
    6. Tillämpa formeln GO = En Norm / F Glu att erhålla hastigheten av glukosoxidation (GO) i umol glukos / min per g torrvikt.
  5. Fastställande av Andel Oleat Oxidation
    1. Genomsnitt de två sönderfalls / min (DPM) värden som uppmätts för bakgrundsaktiviteten av 3 H för att fastställa korrektionsfaktorn 3H dpm ba.
    2. Bestäm 3H genomsnittliga värde specifik aktivitet 3H dpm sa.
    3. Bestämma den specifika radioaktiviteten av oleat i dpm / imol (F Ol e) med användande av formeln
      ekvation 1
      OBS: Om n Ole (nmol) = C Ole (mikromol / L) * provvolym (L) = 0,2 vid användning av oleat på 0,4 mmol / L och 0,5 ml prov.
    4. Bestäm för varje time punkt x produktionshastigheten av 3 H2O i dpm / min (B) genom att tillämpa formeln
      ekvation 1
      OBS: Om Vol x (ml) = 0,5
    5. Dividera B med det bestämda värdet av torrhjärtvikt för erhållande av den normaliserade-produktionshastigheten av 3 H2O (B Norm) i dpm / min per g torrvikt.
    6. Tillämpa formeln OO = B Norm / F Ole att erhålla graden av oleat oxidation (OO) i umol oleat / min per g torrvikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Två representativa experiment beskrivs i tabellen nedan. I båda fallen var mitt i en 16 veckor gamla Sprague Dawley isoleras och perfusion i arbetsläge med KH buffert som framställts i enlighet med föregående protokoll. I varje experiment var hjärtat utsattes för en spänningstillstånd för att påverka hjärtats arbete. Hjärtats kontraktila funktion bedömdes genom kontinuerlig registrering av pulstryck genom införande av en tryckomvandlare i aortaledningen och genom bestämning av hjärtkraft. Konsekvenserna av varje spänningstillstånd på utnyttjandet av energi ger substrat samtidigt bestämdes genom mätning av andelen glukos och oleat oxidation.

I det första experimentet var en akut ökning av arbetsbördan simuleras efter 20 min perfusion vid nära fysiologiska arbetsbelastning genom att öka efterbelastning med 40% (kommas genom att manuellthöja aortaöverströmningskammaren) och genom att tillsätta epinefrin (1 | j, mol / L) till perfusionsbuffert (figur 3A). Hjärtfrekvens, vilket kan fastställas genom mätning av intervallet mellan topp systoliska tryckvärden på pulstrycket spår, ökade omedelbart med mer än 50% vid workjump induktion (figur 3B). Hjärtkraft ökade med mer än 40% vid workjump, vilket åtföljdes av en ökning av både andelen glukos och oleat oxidation (Figur 3C). Resultaten visar att, under stress av en akut ökning av arbetsbelastningen, hjärtat anpassar sig snabbt för att öka energiproduktionen för kontraktion från både glukos och fettsyra oxidation. Det var den relativa ökningen i hastigheten för oxidation viktigare för glukos (~ 2,8-faldigt) än den var för oleat (~ 1,3 gånger). Ökat beroende av kolhydrater oxidation att klara av den extra arbetsbelastningen är en typisk egenskap hos tryckbelastad hjärta däggdjurs 18

I det andra experimentet, var hjärtat perfusion enligt baslinjen betingelser under 20 min följt av 15 min totalt, globalt, normotermisk ischemi (inducerad genom att stänga både den atriella och aorta linjer) och 30 min reperfusion (Figur 4A). Under dessa experimentella betingelser, blev en nästan normal pulstryck återställs mellan 2 och 3 minuter efter början av reperfusion (Figur 4B). Cardiac kraft snabbt ökas över före ischemi värden under de första 10 min reperfusion innan falla tillbaka till nära-baslinjevärden (Figur 4C). Jämfört med baslinjen, ökade graden av oleat oxidation under reperfusion medan glukos oxidation snabbt återvänt till före ischemiska nivåer. Genom att samtidigt mäta kontraktila funktion och båda andelen substrat oxidation kan man klart inse att i de nuvarande experimentella betingelser, variationen i andelen fettsyra oxidation är den viktigaste faktorn för förändringar i den mängd arbete som genereras vid reperfusion. Den högre knappen mot fettsyrautnyttjandepostischemi är en väl estalished särdrag hos reperfuserade hjärtat 19.

Figur 1
Figur 1:. Förenklat schema av den isolerade Working Rat Heart Apparatus Krebs-Henseleit-buffert kompletterad med fettsyran-BSA-lösningen syresätts genom att passera genom ett membranoxygenatom. Typiska hjärtats belastning och afterload värden för ett råtthjärta perfusion i nära fysiologiska förhållanden anges. Inställningarna kan ändras genom att justera höjder förmaks reservoaren och aortaöverströmningskammaren. Rören i graderade sprutor har placerats under hjärtkammaren och aortaöverströmningskammaren i syfte att mäta koronarflöde och aortaflöde, respektive. Flödet avbuffert kan stoppas (vid mätning av aorta och koronarflöden) eller omdirigerats (vid byte från Langendorff till arbetsläge) genom användning av trevägskranar. Röda pilarna indikerar den optimala positionering för in-line syre microlelectrodes att bestämma "arteriovenös" syre skillnad. In-line flödessonder och tryckgivare kan placeras i preload och afterload linjer för att mäta både förmaket och aorta flöden och tryck (gröna pilar). Vänsterkammartryck och volymer kan också spelas in med en PV kateter genom spetsen av vänster kammare. Ej visad i figuren är vattenmanteln som omger All glaselementen och perfusionen slangen i mörkblå färg. Dessa vattenmantlade element är alla anslutna i serie via slang till ett cirkulerande vattenbad inställt på 37 ° C. Klicka här för att se en större version av thans gestalt.

figur 2
Figur 2:. Representation av de olika stegen i installations av CO 2 Trap (A) Tillsätt 1 ml av 10x koncentrerad hydroxid av Hyamine. (B) Lägg till en 0,5 ml prov som ingår i en Capless rör. (C) Täta flaskan. (D) Injicera 200 pl perklorsyra (60% vikt: vikt%). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: representativa resultat av en Workjump experiment (A) Kontinuerlig inspelning av pulstryck.. (B) Kort itervallet inspelning som avbildar förändringen i pulstrycket vid tidpunkten för workjump inledande. (C) Hjärtat hastigheter av glukosoxidation (röd spår med cirklar) och oleat oxidation (blå spår med rutor) bestämdes genom analys av krans utflödet vid ett 5 minuters intervall. Cardiac effekt (svart spår med trianglar) bestämdes genom mätning av hjärtminutvolymen samtidigt kransutflödes proverna utvanns. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Representativa resultat av en ischemi-reperfusion Experiment (A) Kontinuerlig inspelning av pulstryck.. (B) kort intervall inspelning visar återvinning av kontraktila funktion during första fem minuter av reperfusion. (C) Hjärtat hastigheter av glukosoxidation (röda spår med cirklar) och oleat oxidation (blå spår med rutor) bestämdes genom analys av krans utflödet vid en 5 minuters intervall, utom under den första 5 min av reperfusion där analyserna genomfördes vid en 1 min-intervall. Cardiac effekt (svart spår med trianglar) bestämdes genom mätning av hjärtminutvolymen samtidigt kransutflödes proverna utvanns. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Föregående protokoll beskrivs de metoder för att samtidigt mäta flödet av substrat genom glukos oxidation och fettsyra oxidation i isolerade arbetsråtthjärta. Mätningarna kan sedan överlagras till de registrerade hjärt funktionella parametrar för att bestämma förhållandet mellan substrat metabolism och hjärtats arbete enligt baslinjen och stressförhållanden (förändring i arbetsbelastning, ischemi-reperfusion, etc ...). Det är också möjligt att utvärdera hur metabolismen / kontraktion förhållande påverkas av redan existerande förhållanden såsom hjärtsvikt och diabetes. Dessutom kan hjärtat av genetiskt modifierade gnagare användas för att förhöra effekten av ett specifikt protein på hjärtmetabolism och funktion. Slutligen kan effekten av droger och andra cirkulerande faktorer dessa parametrar testas individuellt. Eftersom flödet av glukos genom glykolysen inte alltid korrelerar med graden av glukosoxidation kan det vara informativ att följa andelen glukosflödet genom båda vägarna i en enda försöks inställning.

Hastigheterna av glykolys kan bestämmas genom tillsats av [5- 3 H] glukos till perfusionsbuffert, eftersom frisättningen av 3 H2O bestäms av aktiviteten hos enolas steget av glykolys 20. Alternativt [2- 3 H] glukos, vilket leder till produktionen av 3 H2O vid fosfoglukosisomeras steget av glykolytiska vägen, kan användas för att förhöra hastigheterna av glukosupptag genom hjärtmuskeln 16,17,21. Möjligheten att välja mellan flera radiomärkta spårämnen för att undersöka vad som händer med glukos vid olika nivåer av dess katabolism är ett annat exempel på mångsidigheten hos tekniken. Men eftersom alla flödesmätningar förlita sig på kvantitativ utvinning av antingen 3 H2O eller 14 CO2 från krans utflödet, endast två radiomärkninged spårämnen (ett 3 H-märkta och den andra en märkt med 14 C) kan användas i perfusionsbuffert åt gången.

metodologiska överväganden

Det finns vissa inneboende begränsningar för mätning av hjärt metabolisk flöde och funktion med detta protokoll. Även om användningen av KH-buffert möjliggör en total kontroll över sammansättningen av perfusatet, kan den fysiologiska relevansen av denna experimentuppställning ifrågasättas. För det första är användningen av en kristalloid lösningen över blod kända för att negativt påverka hjärt hemodynamik och motstånd mot ischemi 22,23. För det andra, perfusionsbuffert vi beskriver här saknar en mängd olika hormoner och näringsämnen som direkt kan modulera hjärtmetabolism och följaktligen påverka hjärtats svar på en simulerad spänningstillstånd. I själva verket är däggdjurs hjärta en metabolisk allätare och kan, förutom glukos och fettsyror, använda andra substrat till fulfill sitt energibehov (laktat, pyruvat ketonkroppar, grenkedjiga aminosyror). Det finns bevis för att en del av dessa substrat spelar en viktig roll i den metaboliska ombyggnad av det sjuka hjärtat 24,25. Det är fullt möjligt för utredaren att lägga dessa substrat till perfusion buffert, för att modulera deras koncentration för att efterlikna närmare olika fysiologiska förhållanden (t.ex. fed state mot fastande tillstånd) eller sjukdomstillstånd, och att följa sina skattesatser av oxidation med hjälp av lämpliga radiomärkta spårämnen 26,27. Metabolismen av triglycerider kan också spåras, och i detta fall är det rekommenderat att undvika användning av heparin före excision av hjärtat, eftersom detta kommer att inducera frisättningen av lipoproteinlipas från endotelet och signifikant minska utvinning av triglyceriden från bufferten 28. Ett noggrant urval av de radioaktivt märkta spårämnen, införlivandet av radioaktivitet i various vävnads metaboliter kan också mätas efter perfusion för att bestämma parametrar, såsom de novo triglyceridsyntes, glykogen omsättningen eller hastigheter av proteinsyntes 18,29,30. Med andra ord, kan undersökaren arbeta med en mängd olika underlag / hormoner kombinationer och koncentrationer. Valet av buffertsammansättning kommer främst att bero på målen för försöket. Eftersom dessa kontrollerade buffertbetingelser skapa en "förenklad" fysiologisk modell, ett resultat av ex vivo arbetar hjärta perfusion försök bör tolkas med försiktighet och om möjligt uppgifterna bör valideras ytterligare in vivo.

Val av bedövningsmedlet

Bedövningen används på råttor före excision av hjärtat bör noggrant utvalda baserat på dess kända effekter på hjärt-funktion och metabolism för att säkerställa att detta inte kommer att störa experimentet att utföraed. Både injicerbara och inhalationsanestetika snabbt framkalla hyperglykemi och varierande grader av glukosintolerans som kan påverka hjärt metabolism under perfusion 31,32. Jämfört med andra medel, de kortsiktiga effekterna av barbiturater (pentobarbital och thiobutabarbital) på glukoshomeostas är relativt försumbara 31. Emellertid har intraperitoneal pentobarbital anestesi före hjärt excision visat sig minska hjärtminutvolym, försämra vänsterkammarfunktion och öka hjärtmuskel laktat release i ett ex vivo protokoll av ischemi-reperfusion 33. Den negativa inotropa effekten som pentobarbital har på det isolerade råtthjärtat föreslås vara orsakad av vävnads ackumulering av läkemedlet 34. Omvänt användning av inhalationsanestetika, som är snabbare tvättas ut från hjärtvävnad, är förknippad med bättre sammandragningsfunktion ex vivo 33. Flyktiga anestetika kan faktiskt ge cardioprotection under ischemi-reperfusion genom en mekanism som involverar öppnandet av mitokondriella K ATP kanaler och ökad bindning av hexokinas mitokondrie 32. Sammanfattningsvis är den typ av narkosmedel som används i en isolerad arbets hjärta perfusion protokoll en betydande variabel vid bedömningen av både funktionella och metaboliska parametrar som direkt kan påverka resultatet av försöket. Därför bör typen och dosen av bedövningsmedel använt alltid redovisas i avsnittet av ett experiment metoder, och dessa parametrar bör inte ändras mellan experiment som är avsedda att jämföras.

Radioisotoper i hjärtat perfusion

Alla flödes mätningar utförda med föregående protokoll utförs i icke-återcirkulerande läge, vilket innebär att krans utflödet kastas i stället för att återföras till buffertreservoaren (Figur 1). Utredaren kan snarareväljer att använda perfusionsapparaten i det recirkulerande läge, vilket har den fördelen att den kräver en mycket mindre volym buffert och därmed radioaktivitet för att fungera. Emellertid, återvinning av koronar utflödet äventyrar det stationära tillståndet sammansättningen av perfusionsbuffert genom återvinning av biprodukter härrörande från den metaboliska aktiviteten hos hjärtat (inklusive laktat, men också 3 H2O och H 14 CO3-), vilket komplicerar bestämningen av metaboliska flöden och kan även ändra hjärtfunktionen över tiden 35. Dessa frågor förhindras i den icke-återcirkulerande läge. På grund av mängden radioaktivitet och den stora volymen av perfusion buffert som används i ett enda experiment, bör utredaren vara särskilt försiktig när du använder arbets råtta hjärta i metabola flux analyser. När du använder en perfusion apparat för första gången, är det rekommenderat att utföra flera mock experiment med icke-radioaktiv buffert för att bekanta sig medolika stegen i protokollet och med säkerhetsprocedurer. Monteringen av hjärtat på kanyler är ett särskilt känsligt steg eftersom det kräver upprättande av en nära kontakt med apparaten och eftersom buffert kan läcka eller skjuta ut från en av hjärtats avhuggna blodkärl. Perfusion apparat som beskrivs av Taegtmeyer och kollegor 11 har den fördelen att inkludera en Langendorff reservoar som är helt fristående från resten av perfusion apparaten, och kan därför fyllas med icke-radioaktiv KH buffert för att förhindra utsläpp av radioaktivt material under hjärtats kanyle . Oberoende av vilket system som används, skall försöken utföras i ett särskilt område med begränsad tillgång. Rummet bör innehålla ett handfat och en leverans av ultrarent vatten för att utföra buffert förberedelse och rengöring av förorenad utrustning i samma område. Utredarna ska ha ett nära samarbete med strålsäkerhet sin institution kontor för att etablera sÄRSKILD inneslutning, kontroll och saneringsåtgärder.

Rengöring av perfusionsapparat

Inlägget experimentella rengöring av perfusion apparaten är ett kritiskt steg som alltför ofta förbises, och om inte noggrant genomförs, som ansvarar för de flesta av de frågor som rör dålig experimentella reproducerbarhet. Det näringsrika perfusionsbuffert och den höga temperaturen i perfusionssystemet ger idealiska förutsättningar för bakterie- och svamptillväxt. Utnyttjandet av proteiner (insulin, BSA) och fettsyror i perfusionsbuffert tillför ytterligare grad av komplexitet till rengöringsförfarandet, därför att dessa föreningar kommer att fastna på ytan av slangen och glas, vilket gör dem svåra att spola ut ur apparaten. Användningen av radioisotoper kommer också införa ytterligare restriktioner såsom skapandet av ett särskilt kontrollområde i laboratoriet för manipulation av kontaminerad utrustning och bortskaffande av fast end flytande radioaktivt avfall. Därför kommer tillräcklig rengöring förfarande främst bero på både sammansättning perfusionsbuffert och på vilken typ av perfusion apparat som används. Om du använder en kommersiell apparat, kontrollera tillverkarens webbplats eller kontakta kundtjänst för att få information om hur man utför rengöring utan att skada någon av komponenterna i apparaten. I allmänhet kan alla glasvaror och plastdelar tvättas med ett brett spektrum av tvålar. Enzymaktiva drivna detergenter är särskilt användbara för avlägsnande av fettsyra-BSA-rest. De flesta föroreningar tas också bort genom att köra 0,1 M HCl eller 0,1 M HNO3 genom anordningen i flera timmar. Vi få tillfredsställande rengöringsresultat genom att spola systemet först med 0,1 M HCl, därefter med en färsk 1% (vikt: volym) lösning av enzymaktiva motordriven detergent framställd i varmt vatten, och slutligen genom att skölja systemet med ultrarent vatten. Vid användning av en specialbyggd perfusion apparat som den som ursprungligen described av Taegtmeyer och kollegor 11, kan det vara lättare och mer effektivt att helt ta isär utrustningen vid slutet av varje experimentell dag. Den glasvaror rengörs genom en 15 min nedsänkning i en koncentrerad bad av en kromsyra och svavelsyra blandning. Plastdelarna och PVC-slangar kan tvättas med en rest fria tvättmedel. Vi fann det är faktiskt snabbare och mer tillförlitlig för att helt ersätta PVC slang varje dag, eftersom det begränsar manipulering av material som förorenats av radiochemicals och eftersom det hindrar lämnar rester av rengöringsmedel bakom. I varje fall bör undersökaren tillämpa följande regler: 1- Rengör perfusion apparater och alla smutsiga utrustning omedelbart efter avslutad perfusion experimentet. Väntar kommer bara att göra rengöring svårare och mer tidskrävande. 2- Kontrollera cirkulerande bad av vattenmanteln system regelbundet för föroreningar. Användning av ett vattenkonditionerings kommer att öka intervallet mellan clutar i vattenbad. 3- Efter rengöring, skölj allt glas och slangar med kranvatten flera gånger och avsluta sköljning med ultrarent vatten för att avlägsna rester från rengöringsmedel. 4- två hjärtpreparat i följd misslyckas när dissektion noggrant avrättades och perfusionsbuffert noggrant förberedda sannolikt att indikera en kontaminering av apparaten (antingen av bakterier eller av lösningsmedelsrester). Om detta händer, bör tvätt- och skölj förfaranden vara helt upprepas.

Nedskalning till musen hjärtat

Även om föregående protokoll fokuserar på bestämning av metabolismen i en isolerad arbetsråtthjärta, kan på samma sätt tillämpas på mus hjärta med några ändringar till perfusion apparater och datainsamlingsutrustning 36. På grund av dess mindre storlek den isolerade arbets mus hjärta är tekniskt mer utmanande, men på grund av dess avsevärtlägre flödeshastighet den har fördelen att den kräver en mycket lägre volym av perfusionsbuffert. Det stora antalet modeller genetiskt modifierade möss som redan är tillgängliga gör också den isolerade arbets mushjärta mycket attraktiv för att studera funktionen av en enda genprodukt på hjärt metaboliska och funktionella ombyggnad. Men de senaste tekniska framstegen inom genomet redigering och en snabbt växande katalog av transgena och knockout råttor snabbt överbrygga klyftan mellan de två arter av gnagare. Dessutom har rått länge hyllats som en överlägsen djurmodell för att undersöka hjärt-kärlsjukdom eftersom dess patofysiologi efterliknar nära mänskliga förhållanden 37. Av dessa skäl anser vi att den isolerade arbets råtta hjärta fortfarande innehar en viktig plats i den moderna eran av kardiovaskulär forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP358
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P284
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4*7H2O) Fisher Scientific M63
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher Scientific S233
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670
AG 1-X8 resin, chloride form, 100 - 200 dry mesh size, 500 g Bio-Rad 1401441 This item can be replaced by purchasing directly the hydoxide form  (see reference below), but this will cost almost 8 times more
AG 1-X8 resin, hydroxide form, 100 - 200 dry mesh size, 100 g Bio-Rad 1432445 Purchasing this item allows to bypass the conversion of the anion exchange resin from the chloride form to the hydroxide form (See section 1.2 of protocol)
Glass Microanalysis Vacuum Filter Holder Fisher Scientific 09-753-2
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318 Corrosive. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage.
Gas Dispersion Tube with Fritted Cylinder Fisher Scientific 11-138B
Probumin Bovine Serum Albumin Fatty Acid Free, Powder EMD Millipore 820027 We recommend the use of a charcoal-defatted BSA, as other purification process such as cold ethanol fractionation may leave residues toxic for the heart.
Sodium Oleate Sigma-Aldrich O7501
Oleic Acid, [9,10-3H(N)]- PerkinElmer NET289005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Dialysis Membrane Tubing, 29 mm diameter Fisher Scientific 08-667E
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glucose, D-[14C(U)]- PerkinElmer NEC042B005MC Radioactive material. Follow your Institution's radiation safety office guidelines for ordering and handling.
Humulin R U-100 Eli Lilly and Company NDC 0002-8215-01 (HI-210)
Inactin Hydrate Sigma-Aldrich T133 Controlled substance on USDEA Schedule III
3-0 Silk Black Braid Roboz Surgical SUT-15-3
10x Hyamine Hydroxide PerkinElmer 6003005 Highly toxic and causes severe burns. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
20 ml Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-341-25E Use glass vials for quantitative recovery of 14CO2
20 ml HDPE Scintillation Vials Fisher Scientific 03-337-23B Use HDPE vials for quantitative recovery of 3H2O
Red Rubber Sleeve Stoppers Fisher Scientific 14-126DD Fit 20 mL scintillation vials; Reusable
BD PrecisionGlide Needle 23G x 40 mm BD 305194 Use to inject perchloric acid through the rubber sleeve stopper of the CO2 trap
Perchloric Acid, 60% Fisher Scientific A228 Highly corrosive and may act as an oxidizer and/or cause an explosion hazard. Consult the product MSDS for appropriate handling and storage
Ultima Gold, Scintillation Cocktail PerkinElmer 6013327
Glass Wool Fisher Scientific AC38606
Decon Dri-Clean Detergent Powder Fisher Scientific 04-355 For cleaning of glassware, plastic parts, and tubing
Alconox Tergazyme Enzyme-Active Powered Detergent Fisher Scientific 16-000-115 For cleaning of "hard to reach" surfaces (tubing, glassware) contaminated by fatty acid-BSA residue

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neely, J. R., Morgan, H. E. Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle. Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).
  2. Sen, S., et al. Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart. J Am Heart Assoc. 2, e004796 (2013).
  3. Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms. Circulation. 105, 1861-1870 (2002).
  4. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).
  5. Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure. Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).
  6. Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart. Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).
  7. Taegtmeyer, H. Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure. Circulation. 110, 894-896 (2004).
  8. Taegtmeyer, H., et al. Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ Res. , (2016).
  9. Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism. J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).
  10. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).
  11. Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochem J. 186, 701-711 (1980).
  12. Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).
  13. Cingolani, O. H., Kass, D. A. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).
  14. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).
  15. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. J Vis Exp. , (2015).
  16. Harmancey, R., et al. Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart. FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).
  17. Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart. FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).
  18. Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work. J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).
  19. Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).
  20. Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart. Biochem J. 128, 147-159 (1972).
  21. Katz, J., Dunn, A. Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism. Biochemistry. 6, 1-5 (1967).
  22. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).
  23. Qiu, Y., Hearse, D. J. Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts. J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).
  24. Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. Ketone body metabolism and cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).
  25. Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit? Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).
  26. Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration. J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).
  27. Liepinsh, E., et al. The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state. Metabolism. 63, 127-136 (2014).
  28. Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates. J Physiol. 558, 225-237 (2004).
  29. Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. Glycogen turnover in the isolated working rat heart. J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).
  30. Sender, P. M., Garlick, P. J. Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart. Biochem J. 132, 603-608 (1973).
  31. Hindlycke, M., Jansson, L. Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs. Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).
  32. Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats. Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).
  33. Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model? J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).
  34. Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart. J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).
  35. Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect? Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).
  36. Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart. Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).
  37. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats! Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).

Tags

Biokemi hjärta perfusion arbetar hjärta hjärtfunktion metabolism glukos oxidation fettsyra oxidation radioisotoper
Metoder för bestämning av priser av glukos och fettsyra oxidation i isolerade Working Rat hjärta
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bakrania, B., Granger, J. P.,… More

Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart. J. Vis. Exp. (115), e54497, doi:10.3791/54497 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter