Summary
ويرد بروتوكول لتركيب وتوصيف الحركة ناشر البوليمرات دوري على مستوى جزيء واحد.
Protocol
1. توليف أحادي الوظيفة وBifunctional بولي (THF)
- بولي أحادي الوظيفة (THF)
- لهب تجف ذهابا وأسفل الرقبة 2 100 مل قارورة. فراغ وملء قارورة مع النيتروجين (3 دورات).
- إضافة رباعي هيدرو الفوران المقطر (THF) (50 مل) إلى القارورة. وضع القارورة في حمام مائي عند 20 درجة مئوية، وتتوازن درجة الحرارة.
- إضافة triflate الميثيل (0.5 مليمول) إلى قارورة من حقنة. يحرك الخليط لمدة 5-10 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
- إضافة N -phenyl بيروليدين (4-6 يعادل.) إلى قارورة من حقنة. يحرك الخليط لمدة 30-60 دقيقة.
- تماما إزالة المذيب تحت ضغط منخفض (حوالي 100 عربة). حل هذه البقايا في 3-5 مل من الأسيتون. إضافة محلول الاسيتون إلى 300-500 مل ن -hexane. مرشح راسب وجففه تحت ضغط منخفض.
- بولي Bifunctional (THF)
- لهب تجف ذهابا وأسفل الرقبة 2 100 مل قارورة. فاcuum وملء قارورة مع النيتروجين (3 دورات).
- إضافة THF المقطر (50 مل) إلى القارورة. وضع القارورة في حمام مائي عند 20 درجة مئوية، وتتوازن درجة الحرارة.
- إضافة الخل triflic (0.3 مليمول) إلى قارورة من حقنة. يحرك الخليط لمدة 5-10 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
- إضافة N -phenyl بيروليدين (4-6 يعادل.) إلى قارورة من حقنة. يحرك الخليط لمدة 30-60 دقيقة.
- تماما إزالة المذيب تحت ضغط منخفض (حوالي 100 عربة). حل هذه البقايا في 3-5 مل من الأسيتون. إضافة محلول الاسيتون إلى 300-500 مل ن -hexane. مرشح راسب وجففه تحت ضغط منخفض.
2. تجميع Perylene Diimide أدرجت نجوم 4-المسلحة و 8 على شكل ثنائي الحلقة بولي (THF)
- مسلح نجم بولي (THF)
- تبادل أيون
- حل perylene diimide tetracarboxylate ملح الصوديوم في الماء (10 ملغ / مل، 150 مل). تذوببولي أحادي الوظيفة (THF) في الأسيتون (160 ملغ / مل، 4 مل). إضافة قطرة قطرة محلول الأسيتون في محلول مائي أثار بقوة. جمع يعجل شكلت عن طريق الترشيح.
- كرر الإجراء أعلاه مع راسب تعافى (2.1.1.1) أربع مرات.
- التساهمية التثبيت
- حل يعجل الحصول عليها في التولوين (5 ملغ / مل). ارتداد الحل لمدة 4 ساعة.
- تماما إزالة المذيب تحت ضغط منخفض (حوالي 100 عربة). تصفية بقايا من خلال المكونات من هلام السيليكا مع ن -hexane / الأسيتون (2/1 المجلد / المجلد). إضافة الحل في المياه المبردة الجليد (300-500 مل) لترسيب المنتج. جمع راسب عن طريق الترشيح.
- تبادل أيون
- ثنائي الحلقة 8 على شكل بولي (THF)
- تبادل أيون
- حل perylene diimide tetracarboxylate ملح الصوديوم في الماء (6 ملغ / مل، 50 مل). حل بولي bifunctional (THF) (0.5 غرام) في 30-50 مل من الأسيتون. إضافة قطرة قطرة محلول الأسيتون في محلول مائي أثار بقوة في 0 درجة مئوية. جمع يعجل شكلت عن طريق الترشيح.
- كرر الإجراء أعلاه مع راسب تعافى (2.2.1.1).
- التساهمية التثبيت
- حل يعجل الحصول عليها في التولوين (0.05 جم / لتر). ارتداد الحل لمدة 4 ساعة.
- تماما إزالة المذيب تحت ضغط منخفض (حوالي 100 عربة). إضافة التولوين حل جزئي لبقايا. إعادة يعجل إلى 300-500 مل ن -hexane.
- تصفية الرواسب تتشكل من خلال المكونات من هلام السيليكا مع ن -hexane / الأسيتون (2/1 المجلد / المجلد). إعادة يعجل إلى 300-500 مل من الماء.
- تنقية راسب التي شكلتها العمود اللوني 18 باستخدام هلام البوليسترين. وعلاوة على ذلك تنقية الناتج الخام بواسطة إعدادي الههلامي (المؤتمر الشعبي العام) 19 مع شاطف من CHCl 3 إلى عينيتركات اوفه من خلال مراقبة معامل الانكسار (RI) وأجهزة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية.
- تبادل أيون
3. جزيء واحدة الإسفار التصوير تجربة
- إعداد عينة
- تنظيف المجهر زلات غطاء
- مكان رقم 1.5 24 × 24 مم غطاء مجهر ينزلق في جرة تلطيخ.
- إضافة حل هيدريد 1 M البوتاسيوم (100 مل) في جرة ويصوتن لمدة 15 دقيقة. تخلصي من محلول هيدروكسيد البوتاسيوم عن طريق الترقيد وشطف زلات غطاء بالماء نقي للغاية لعدة مرات. إضافة الإيثانول الطيفية الصف (100 مل) في جرة ويصوتن لمدة 15 دقيقة.
- تخلصي من الإيثانول عن طريق الترقيد وشطف زلات غطاء بالماء نقي للغاية لعدة مرات. بعد صب قبالة المياه فائقة نقية عن طريق الترقيد، كرر الخطوة 3.1.1.2.
- إضافة الماء نقي للغاية إلى جرة ويصوتن لمدة 15 دقيقة. شطف زلات غطاء بالماء نقي للغاية لعدة مرات. اخراج زلات غطاء من جرة من ملاقط من البلاستيك وتجفيفها إما عن طريق الهواء الجاف أو النيتروجين الجاف.
- إعداد عينات البوليمر تذوب 14،15
- إضافة 100 ميكرولتر من بولي طردي غير المسمى (THF) في زجاجة وتسخينها إلى درجة حرارة أعلى من درجة انصهار (حوالي 25 درجة مئوية) باستخدام مجفف الشعر.
- حل البوليمر أدرجت fluorophore (خطي، نجمة 4 المسلحة، دوري، أو على شكل 8 ذو دورتين توليفها في 2.1 و 2.2) في الكلوروفورم (1 مل، 10 -6 م). إضافة 1 ميكرولتر من الحل إلى 100 ميكرولتر من ذوبان بولي طردي غير المسمى (THF).
- بعد خلط دقيق العينة مع طرف ماصة، تتبخر الكلوروفورم عن طريق تسخين العينة باستخدام مجفف.
ملاحظة: هذا يوفر ذوبان بولي الخطي غير المسمى (THF) تحتوي على 10 -8 M من البوليمرات fluorophore يدمج. - يستغرق 10 ميكرولتر من العينة باستخدام ماصة الصغيرة ودشرطة عمان السلطانية على زلة غطاء تنظيفها. وضع آخر زلة غطاء تنظيفها على عينة وساندويتش العينة بين اثنين من زلات الغطاء.
- اضغط على عينة بلطف باستخدام الملقط البلاستيك.
- تنظيف المجهر زلات غطاء
- واسعة المجال الإعداد والتصوير مضان 15
- مقدمة من ليزر الإثارة (488 نانومتر) في منفذ الخلفي للمجهر مقلوب
- إدراج مرشح الإثارة ممر الموجة والمستقطب في مسار الشعاع.
- توسيع شعاع لحوالي 1 سم في القطر من قبل المتوسع شعاع.
- اضافة الى وجود لوحة موجة الربع في مسار الشعاع. تعيين المحور البصري للوحة موجة في 45 درجة فيما يتعلق بذلك من المستقطب. بدلا من ذلك، اضافة الى وجود المعوض Berek وتعيين التأخير الضوئية لλ / 4.
- إدراج الحجاب الحاجز في طريق الإثارة شعاع لضبط حجم شعاع.
- وقبل أن أعرض على شعاع الليزر إلى ميناء الخلفي للmicrosco البصرية المقلوبالمؤسسة العامة، اضافة الى وجود عدسة التركيز (عدسة محدبة خطة، البعد البؤري ≈ 300 ملم) في موقف حيث موازى شعاع الليزر من العدسة الشيئية.
- بعد تعكس شعاع الليزر باستخدام مرآة مزدوج اللون التي شنت على مكعب مرشح، وإدخال شعاع الليزر على عينة من خلال ارتفاع الفتحة العددية (NA) عدسة الهدف (على سبيل المثال، NA 1.3، 100X التكبير، الغمر النفط).
- إرفاق سخان موضوعي للعدسة موضوعية وضبط درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية.
- تركيب العينة على مرحلة من مراحل المجهر المقلوب
- قطرة قطرة واحدة من النفط الغمر على العدسة الشيئية وجبل العينة على الدولة المجهر.
- تأكد من أن سمك عينة من حوالي 10 ميكرون يتم الحصول عليها عن طريق التحقق من موقف محوري من السطح السفلي والعلوي من العينة.
- ضبط بؤرة المجهر لبضعة ميكرومتر فوق السطح السفلي من العينة.
- إدراج المستقطب إلى شعاع الليزر موازى للخروج من العدسة الشيئية.
- تسجيل شدة الليزر التي تنتقل من خلال المستقطب عن طريق إدراج متر السلطة بعد المستقطب. تسجيل قوة الليزر التي تنتقل في زوايا الاستقطاب مختلفة عن طريق تدوير المستقطب.
- إذا كانت قوة الليزر التي تنتقل عن طريق ليست ثابتة في جميع الزوايا الاستقطاب، وتناوب قليلا لوحة موجة الربع أو Berek المعوض إدراجها في مسار الإثارة شعاع.
- يتم الحصول كرر الخطوة 3.2.5.2 و3.2.5.3 حتى قوة الليزر التي تنتقل عن طريق ثابتة في جميع الزوايا الاستقطاب. تأكد من أن الضوء المستقطب دائريا يتم الحصول على العينة.
- إعداد EM (بضرب الإلكترون) -charge إلى جانب جهاز (CCD) الكاميرا
- إرفاق كاميرا EM-CCD الى ميناء جانب المجهر وتوصيله إلى tانه برنامج الحصول على الصور.
- إذا لزم الأمر، وتزامن تعرض الكاميرا إلى مفتاح ميكانيكي أو صوتية الضوئية تصفية الانضباطي إدراجها في مسار شعاع الإثارة عن طريق إرسال منطق الترانزستور الترانزستور (TTL) الإشارات التي تم إنشاؤها بواسطة كاميرا EM-CCD إلى الأجهزة. بدلا من ذلك، مزامنة تعرض الكاميرا لإخراج ليزر عن طريق إرسال الإشارات TTL التي تم إنشاؤها بواسطة كاميرا EM-CCD ليزر.
ملاحظة: الخيار الأخير لا ينطبق إلا عندما ليزر الحالة الصلبة التي يمكن عن طريق التضمين إدخال منطق الترانزستور الترانزستور انتاج الطاقة يستخدم (TTL) إشارات للتجربة. - تطبيق مكاسب EM (عادة حوالي 300) لاتفاقية مكافحة التصحر الكاميرا باستخدام برامج التحكم في الكاميرا من أجل الحصول على صورة مضان جودة عالية من fluorophore واحد.
- تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) (عادة 128 × 128 بكسل في مركز مجال الرؤية) باستخدام برنامج التحكم في الكاميرا.
ملاحظة: هذا يسمح للimagiتجارب نانوغرام في معدلات الإطار من 100-200 هرتز في واسطة نقل الإطار، وهو مطلوب لتصور حركة سلاسل البوليمر أدرجت fluorophore في العينة ذوبان.
- مقدمة من ليزر الإثارة (488 نانومتر) في منفذ الخلفي للمجهر مقلوب
- تشغيل التجربة
- تحسين ظروف تجريبية
- ضبط المنطقة المضاءة من العينة إلى ما يقرب من 20 ميكرون في القطر استخدام الحجاب الحاجز إدراجها في مسار الإثارة شعاع.
- ضبط قوة الإثارة الليزر في العينة إلى 4-8 ميغاواط من خلال اختيار مرشح مناسب الكثافة المحايدة (ND) يدخل في مسار الإثارة شعاع يدويا.
ملاحظة: هذا يوفر قوة الليزر يعني من 1-2 كيلو واط سم -2 في العينة. - تسجيل صور مضان من العينة في معدلات الإطار من 100-200 هرتز. إذا كانت كثافة مضان الحصول عليها من البوليمرات أدرجت fluorophore الفردية منخفضة جدا، وزيادة تدريجيا قوة الإثارة باستخدام الالبريد ND فلتر حتى وصلت ما يقرب من 100 ميغاواط في العينة.
- إذا كانت جودة الصورة مضان جزيء واحد لا تزال غير مرضية، والتحقق من الشوائب مضان في العينة عن طريق تسجيل الصور مضان من ذوبان نقية من بولي غير المسمى (THF). في حال لوحظ مضان الخلفية عالية، واستخدام مختلف بولي غير المسمى (THF).
- إذا كانت كثافة بقعة مضان الحصول عليها من البوليمرات أدرجت fluorophore في ذوبان عالية جدا لعزلهم (هذا يسبب أخطاء في تحليل حركة ناشر) مكانيا، وانخفاض تركيز البوليمرات أدرجت fluorophore في العينة حتى مكانيا ويلاحظ بقع معزولة.
- إذا كانت كثافة بقعة مضان الحصول عليها من البوليمرات أدرجت fluorophore في ذوبان منخفضة جدا (وهذا يؤدي إلى سرعة منخفضة من تجربة التصوير)، وزيادة تركيز البوليمرات أدرجت fluorophore في العينة حتى على approprيتم التوصل إلى كثافة iate بقعة مضان.
- إذا هي واضحة في الصور مضان الحصول عليها من البوليمرات أدرجت fluorophore في الذوبان، وزيادة معدلات الإطار اكتساب التصوير.
ملاحظة: هذا غالبا ما يتطلب العائد على الاستثمار أصغر، عادة 64 × 64 بكسل.
- تحسين ظروف تجريبية
- الحصول على الصور
- مرة واحدة يتم تحسين ظروف تجريبية، وترك العينة التي شنت على المسرح المجهر لمدة ساعة بحيث تصل عينة شروط التوازن.
- تسجيل 500 - 1000 صورة متواليات مضان من البوليمرات أدرجت fluorophore في حالة ذوبان في 100 - معدل الإطار هرتز 200. إذا كان تنسيق الملف الافتراضي ليست TIFF، تحويل جميع متواليات الصورة إلى تنسيق TIFF.
4. تحليل ناشر الحركة
- متوسط-التربيعية النزوح (MSD) تحليل
- اقتصاص صورة متواليات مضان في مثل هذه الطريقةأن كل تسلسل الصور يحتوي على نشرها، أدرجت fluorophore البوليمر باستخدام صورة برامج معالجة واحد، وركزت بشكل جيد، مثل يماغيج.
- عندما تحتوي على تسلسل الصور المزروعة أكثر من 10 لقطة، وتقسيم تسلسل الصور في تسلسل متعددة مثل أن كل تسلسل يتكون من 10 لقطة.
- تحديد مواقع الجزيئات في كل تسلسل الصور بدقة عن طريق تركيب جاوس ثنائي الأبعاد من الصور.
- تحديد معامل الانتشار (D) من الجزيئات الفردية من النزوح (MSD) تحليل متوسط تربيع من مسارات نشر (أي المواقف التي تعتمد على الوقت من جزيء) باستخدام معادلة 20
حيث x و y ط ط هي مواقف جزيء في إطار الصورة ط، ن ويدل على رقم الإطار مع مرور الوقت Δt من إطار ط. - رسم معاملات نشر فيرسم بياني تردد.
ملاحظة: عادة، يتم إنشاء رسم بياني من أكثر من 100 الجزيئات.
- دالة التوزيع التراكمي (CDF) تحليل
ملاحظة: قوات الدفاع المدني، P (ص 2، ط Δ ر) يتوافق مع الاحتمال التراكمي للعثور على جزيئات نشرها ضمن دائرة نصف قطرها ص من أصل بعد فترة زمنية معينة ط Δ ت.- حساب الإزاحة المربعة التي تحدث أثناء الفارق الزمني من 1Δt، 2Δt، ····، iΔt لجميع مسارات نشر الحصول عليها في 4.1.3.
ملاحظة: هذه العمليات تعطي مجموع متر مربع I-نزوح للمرة يتخلف من iΔt. - حساب الأرقام للنزوح مربع (ل ط) من اجمالي مجموعة البيانات م ط التي تكون أصغر من ص 2 على مختلف ص 2 القيم (0 <R2 <∞). تطبيع ل ط مقابل ص 2 قطع تتوافق مع قوات الدفاع المدني، P (ص 2، iΔt).
- حساب الإزاحة المربعة التي تحدث أثناء الفارق الزمني من 1Δt، 2Δt، ····، iΔt لجميع مسارات نشر الحصول عليها في 4.1.3.
- تحليل التنمية الشاملة مع نماذج الانتشار متميزة
ملاحظة: يتم تجهيز التنمية الشاملة التي حصل عليها نماذج الانتشار متميزة. نموذج متجانس نشر، وسائط نشر المتعددة التي وصفت توزيع D من التمويه (نموذج جاوس واحد)، وسائط نشر المتعددة التي وصفت توزيع D من قبل العديد من التمويه (متعددة نموذج جاوس).- في نموذج نشر متجانسة، تحديد متوسط D عن طريق تركيب قوات الدفاع المدني باستخدام معادلة 21
ملاحظة: أي انحراف عن هذه المعادلة تشير إلى انتشار غير متجانسة من الجزيء. - في نموذج جاوس واحد، وتحديد توزيع احتمال D التي وصفها التمويه (و (D)) من خلال تركيب CDF باستخدام 15
ON3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54503 / 54503equation3.jpg "/>
حيث أ، ث، د 0 هي السعة، عرض، ومركز للتمويه. - في نموذج جاوس مزدوج، وتحديد التوزيع الاحتمالي لي مكون من D التي وصفها التمويه (و (D)) عشر من المناسب قوات الدفاع المدني باستخدام 14
حيث A ي هو جزء من كل مكون نشر، وα ي، ث ي، د 0 ي هي السعة، عرض، ومركز للي مكون من التمويه عشر.
- في نموذج نشر متجانسة، تحديد متوسط D عن طريق تركيب قوات الدفاع المدني باستخدام معادلة 21
- حساب زعته احتمال نظرييسود تبادل لمعامل الانتشار
ملاحظة: التوزيعات الاحتمالية من D التي تحدث بسبب أخطاء إحصائية (ع (D) د D) وتحسب لنماذج الانتشار مختلفة؛ نموذج متجانس نشر، وسائط نشر المتعددة التي وصفت توزيع D من التمويه (نموذج جاوس واحد)، وسائط نشر المتعددة التي وصفت توزيع D من قبل العديد من التمويه (متعددة نموذج جاوس).- في نموذج نشر متجانسة، وحساب التوزيع الاحتمالي الإحصائي للD باستخدام معادلة 22
حيث N هو عدد نقاط البيانات في مسار نشر (N = 10، انظر 4.1.2)، D 0 هو معامل متوسط الانتشار (التي يحددها التحليل قوات الدفاع المدني، انظر 4.2.3.1)، ودال هو الحصول تجريبيا معامل الانتشار لمسار فردي. - في الواحد نموذج نشر الضبابي، وحساب التوزيع الاحتمالي الإحصائي للD باستخدام معادلة 15
حيث f (D) يدل على توزيع احتمال D يحددها التحليل قوات الدفاع المدني (انظر 4.2.3.2)، ودال 0 هو معامل متوسط الانتشار (التي يحددها التحليل قوات الدفاع المدني، انظر 4.2.3.2). - في ضعف نموذج نشر الضبابي، وحساب التوزيع الاحتمالي الإحصائي للD باستخدام معادلة 14
حيث f (D ي) يدل التوزيع الاحتمالي للي مكون من D (D ي) التي يحددها التحليل CDF عشر (انظر 4.2.3.3)، وD 0J هو معامل متوسط نشر من ي عنصر ال (يحددها الدفاع المدني تحليل، انظر 4.2.3.3).
- في نموذج نشر متجانسة، وحساب التوزيع الاحتمالي الإحصائي للD باستخدام معادلة 22
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وperylene diimide-أدرجت نجوم 4-المسلحة و 8 على شكل بولي ثنائي الحلقة تم توليفها (THF) الصورة باستخدام كهرباء التجميع الذاتي وتثبيت التساهمية (ESA-CF) عملية (الشكل 1، الشكل 2). تم قياس الصور مضان جزيء واحد الوقت الفاصل بين ل4 المسلح (الشكل 3A) و (الشكل 3B) البوليمرات 8 شكل. الصور الوقت الفاصل بين مضان (الشكل 3) تظهر مكانيا النقاط المضيئة وحادة معزولة بسبب إدراج الفلورسنت عالية fluorophore perylene diimide 23 في سلاسل. تم احتساب رسوم بيانية تردد معامل الانتشار ل4 المسلح (الشكل 4A) و 8 على شكل حرف (الشكل 4B) البوليمرات من تحليل متوسط تربيع النزوح (MSD) في الوقت الفاصل بين الصور. وتجرى حسابات المؤامرات MSD والتنمية الشاملة باستخدام إجراءات مكتوبة في MATLAB. تركيبمن التنمية الشاملة التي تم الحصول عليها من التجارب تتم باستخدام تطبيقات معالجة البيانات مثل المنشأ برو. رسوم بيانية تردد معامل الانتشار التي يحددها التحليل MSD عرض التوزيعات واسعة (الشكل 4) الناتجة عن كل من الخطأ الإحصائي لتحليل وتجانس نشر. تظهر رسوم بيانية تردد انحرافات واضحة عن نموذج نشر متجانسة (الخط الأخضر في الشكل 4)، والذي يدل على انتشار غير متجانسة من جزيئات البوليمر. 14 وظائف التوزيع التراكمي (التنمية الشاملة) حسبت ل4 المسلح (الشكل 5A) و 8 على شكل (الشكل 5B) البوليمرات وتركيبها من قبل احد التمويه (الشكل 5A) ونماذج مزدوجة التمويه (الشكل 5B). تم احتساب التوزيعات الاحتمالية الإحصائية للمعامل الانتشار ل4 المسلح (الشكل 4A) وعلى شكل 8 (الشكل 4B) بول ymers من التمويه واحد، أو نماذج جاوس مزدوجة. في واحد (الشكل 5A) ومزدوجة (الشكل 5B) نماذج التمويه تناسب التنمية الشاملة التي تم الحصول عليها تجريبيا جيدا. هذه النتائج تثبت أن نشر البوليمر 4 المسلح التي وصفها التوزيع الواسع لمعامل الانتشار، في حين يعرض البوليمر 8 على شكل وضعين نشر متميزة.
الشكل 1. توليف مسار بولي أدرجت diimide-perylene (THF) ق. الطريق توليف (أ) البوليمرات نجوم 4-المسلحة والبوليمرات ثنائي الحلقة (ب) على شكل 8. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
54503fig2.jpg "/>
الشكل 2. توصيف البوليمرات المركبة. أطياف الرنين المغناطيسي النووي (أ) البوليمرات نجوم 4-المسلحة والبوليمرات ثنائي الحلقة (ب) على شكل 8. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3 (الأفلام). واحد التصوير جزيء مضان من perylene-أدرجت diimide بولي (THF) ق. الصور الوقت الفاصل بين مضان (أ) البوليمرات نجوم 4-المسلحة و (ب) 8 شكل البوليمرات ذو دورتين في الذوبان عدم المسمى بولي الخطي (THF ). شريط مقياس = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض الأفلام (أ) و 3 / Figure_3b_submit.mov "الهدف =" _ فارغة "> (ب).
الشكل 4. تحليل MSD للperylene بولي أدرجت diimide (THF) ق نزع فتيله في الذوبان. رسوم بيانية تردد من معامل الانتشار المقررة لل(أ) البوليمرات نجوم 4-المسلحة الفردية والبوليمرات ثنائي الحلقة (ب) على شكل 8 في الذوبان من غير المسمى بولي الخطي (THF). خطوط الصلبة تظهر المحسوبة نظريا التوزيعات الاحتمالية للمعامل الانتشار على أساس نماذج الانتشار الثلاث المختلفة. نموذج متجانس نشر (خطوط خضراء، انظر 4.3.1)، نموذج واحد جاوس (الخطوط الحمراء، انظر 4.3.2)، ونموذج جاوس مزدوج (الخط الأزرق، انظر 4.3.3). 14 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> 
الرقم تحليل 5. قوات الدفاع المدني من perylene-أدرجت diimide بولي (THF) ق نزع فتيله في الذوبان دالة التوزيع التراكمي تم الحصول عليها تجريبيا (iΔt = 7،5 حتي 75 ميللي ثانية). في شكل 1-P ل(أ) البوليمرات نجوم 4-المسلحة و (ب) 8 على شكل البوليمرات ذو دورتين في ذوبان بولي الخطي غير المسمى (THF). تبين الخطوط المتقطعة التجهيزات مع (أ) المعادلات في 4.2.3.2 و (ب) المعادلات في 4.2.3.3. 14 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أعدت البوليمرات 4 المسلحة و 8 على شكل عبر بروتوكول ESA-CF (الشكل 1)، الذي هو خطوة حاسمة لتركيب. 12،24 أحادي الوظيفة وbifunctional بولي الخطي (THF) الصورة مع مجموعات نهاية -phenylpiperidinium N كانت توليفها وفقا للإجراء السابق. وقد أجريت 11 التبادل الأيوني بها reprecipitation من حل الأسيتون من السلائف البوليمر مع counteranions triflate في محلول مائي يحتوي على كمية كبيرة من الكربوكسيل.
تم إجراء تحويل التساهمية من الناتج التبادل الأيوني للبوليمرات نجوم 4-المسلحة في التولوين (4.9 جم / لتر) من خلال الجزر لمدة 4 ساعة. إذا كان التحويل ليست كافية، وتمديد فترة رد الفعل. تم الحصول على المنتج المستعبدين تساهميا من هلام السيليكا العمود اللوني مع الأسيتون / ن -hexane وreprecipitation في الماء. يظهر 1 H NMR من البوليمرات 4 المسلحة في الشكل 2A. ثييسمح الإجراء الصورة ESA-CF لتركيب الفعال للبوليمرات دوري. ومع ذلك، يقتصر هذا البروتوكول لالبوليمرات التي لديها جماعات نهاية أونيوم دوري.
للمنتج البوليمر على شكل 8، وأجري التفاعل في التولوين في التخفيف (0.2 جم / لتر) تحت الجزر لمدة 4 ساعة وأسفرت عن تشكيل جزء كبير من جزء غير قابل للذوبان، ويفترض بسبب بين الجزيئات ردت المنتجات. وقد reprecipitated جزء قابل للذوبان في ن -hexane، تعرض للهلام السيليكا العمود اللوني مع الأسيتون / ن -hexane، وreprecipitated في الماء. تعرض المنتج الخام التي تم الحصول عليها اللوني العمود مع حبات استبعاد حجم وإعادة تدوير المؤتمر الشعبي العام للسماح عزل المنتج البوليمر على شكل 8. يظهر 1 H NMR من البوليمرات 8 الشكل في الشكل 2B. هذا البروتوكول ESA-CF يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لمزيد من البوليمرات الطوبوغرافية المعقدة.
الصور مضان ذات جودة عالية هي essentiالقاعدة في تحليل دقيق لحركة ناشر من الجزيئات. وتدهورت الصور مضان بشكل ملحوظ عندما 1) الشوائب مضان موجودة في العينة، 2) العائد الكم مضان من fluorophore أدرجت منخفضة، و 3) معدل إطار التصوير أبطأ من حركة ناشر من جزيئات البوليمر. ووضع درجة حرارة أقل من درجة حرارة الغرفة (20 درجة مئوية) أو أعلى 37 درجة مئوية يؤدي إلى عدم تطابق معامل الانكسار، والتي سوف أيضا تدهور نوعية الصور مضان المسجلة. باستخدام أضيق الانبعاثات الفرقة ممر الموجة مرشح شنت على مكعب مرشح في وقت ما يحسن من جودة الصورة مضان. منذ وقت التعرض للكاميرا EM-CCD المستخدمة في تجربة التصوير يقتصر عادة إلى أجزاء من الثانية، وحركة ناشر أسرع من هذا النطاق الزمني لا يمكن التقاطها بواسطة هذه الطريقة.
تقييم تأثير الخطأ الإحصائي في تحليل MSD هو خطوة حاسمة FOص توصيف نشر غير المتجانسة. ينبغي تقييمها الخطأ الإحصائي بعناية عن طريق حساب التوزيع الاحتمالي للمعامل الانتشار باستخدام نموذج نشر متجانسة 22 قبل مناقشة انتشار غير المتجانسة. وينبغي أيضا أن يتم تقييم انتشار غير المتجانسة بعناية من قبل التحليل قوات الدفاع المدني. عندما تظهر التنمية الشاملة انحرافات واضحة عن نموذج نشر متجانسة (أي منحنى المتحللة احد الأسي)، وهذا يشير إلى وجود مضاعفات نشرها المكونات. توصيف الكمي للنشر غير متجانسة يتطلب المشترك MSD، قوات الدفاع المدني، ويحلل توزيع الاحتمالات. 14،15
ديناميات البوليمر، بما في ذلك حركة ناشر، وقد وصفها بأنها قيم متوسط الفرقة في الطرق التقليدية مثل الرنين المغناطيسي، 7 تشتت الضوء و 8 و قياسات اللزوجة. 9 والواقع أن الحركة ناشر غير المتجانسة التي كشفت عنها سينغلجزيء البريد التصوير 16 غالبا ما يكون من الصعب جدا اكتشاف في أساليب متوسط الفرقة. وبالنظر إلى الطبيعة غير المتجانسة الكامنة البوليمرات، لا يقتصر 25-27 الطريقة الواردة في هذا البروتوكول على توصيف البوليمرات الطوبوغرافية، ولكن ينطبق على جميع أنواع البوليمرات في ظل ظروف متشابكة. 28 وعلاوة على ذلك، فإن نهج ذكرت في هذا البروتوكول يجد تطبيق نطاق واسع في تحليل نشر غير متجانسة في الأنظمة المعقدة، مثل الانتشار الجزيئي من خلال المواد mesoporous 29
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| THF | Godo | ||
| Wakosil C-300 | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Acetone | Godo | ||
| Toluene | Godo | ||
| n-Hexane | Godo | ||
| CHCl3 | Kanto Chemical | ||
| Bio-Beads S-X1 | Bio-Rad | ||
| Methyl triflate | Nacalai Tesque | ||
| Triflic anhydride | Nacalai Tesque | ||
| Potassium Hydroxide | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Poly(tetrahydrofuran) | Aldrich | ||
| Chloroform | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Immersion oil | Cargille | Type 37 / Type A | |
| Equipment | |||
| 2-Neck 100-ml round-bottom flask | |||
| Flask | |||
| Beaker | |||
| Funnel | |||
| Filter paper | Whatman | ||
| Reflux condenser | |||
| Syringe | |||
| Water bath | |||
| Magnetic stirrer | |||
| Rotary evaporator | |||
| Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) | Matsunami Glass | CO22241 | |
| Staining jar | AS ONE Corporation | 1-7934-01 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 142-0047 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Ar-Kr ion laser | Coherent | Innova 70C | |
| Berek compensator | Newport | 5540 | |
| Excitation filter | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Dichloric mirror | Omega optical | 500DRLP | |
| Emission filter | Semrock | BLP01-488R-25 | |
| Lens and mirror | Thorlabs | ||
| EM-CCD camera | Andor Technology | iXon | |
| Objective lens (100X, N.A. = 1.3) | Olympus | UPLFLN 100XOP | |
| Objective heater | Bioptechs | ||
| Preparative GPC | Japan Analytical Industry | LC-908 |
References
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Tuneable enhancement of the salt and thermal stability of polymeric micelles by cyclized amphiphiles. Nat. Commun. 4, (2013).
- Jun, S., Mulder, B. Entropy-driven spatial organization of highly confined polymers: Lessons for the bacterial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (33), 12388-12393 (2006).
- McLeish, T. Polymers without beginning or end. Science. 297 (5589), 2005-2006 (2002).
- McLeish, T. Polymer dynamics: Floored by the rings. Nat. Mater. 7 (12), 933-935 (2008).
- Roovers, J. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 137-156 (2013).
- Klein, J. Evidence for reptation in an entangled polymer melt. Nature. 271 (5641), 143-145 (1978).
- Leger, L., Hervet, H., Rondelez, F. Reptation in entangled polymer-solutions by forced rayleigh light-scattering. Macromolecules. 14 (6), 1732-1738 (1981).
- von Meerwall, E. D., Amis, E. J., Ferry, J. D. Self-diffusion in solutions of polystyrene in tetrahydrofuran - comparison of concentration dependences of the diffusion-coefficients of polymers, and a ternary probe component. Macromolecules. 18 (2), 260-266 (1985).
- Kapnistos, M., et al. Unexpected power-law stress relaxation of entangled ring polymers. Nat. Mater. 7 (12), 997-1002 (2008).
- Adachi, K., Takasugi, H., Tezuka, Y. Telechelics having unstrained cyclic ammonium salt groups for electrostatic polymer self-assembly and ring-emitting covalent fixation. Macromolecules. 39 (17), 5585-5588 (2006).
- Oike, H., Imaizumi, H., Mouri, T., Yoshioka, Y., Uchibori, A., Tezuka, Y. Designing unusual polymer topologies by electrostatic self-assembly and covalent fixation. J. Am. Chem. Soc. 122 (40), 9592-9599 (2000).
- Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topological polymer chemistry: a cyclic approach toward novel polymer properties and functions. Polym. Chem. 2 (9), 1930-1941 (2011).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Single-molecule imaging reveals topological isomer-dependent diffusion by 4-armed star and dicyclic 8-shaped polymers. Polym. Chem. 6 (22), 4109-4115 (2015).
- Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Vacha, M., Tezuka, Y. Single-Molecule Study on Polymer Diffusion in a Melt State: Effect of Chain Topology. Anal. Chem. 85 (15), 7369-7376 (2013).
- Habuchi, S., Satoh, N., Yamamoto, T., Tezuka, Y., Vacha, M. Multimode Diffusion of Ring Polymer Molecules Revealed by a Single-Molecule Study. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (8), 1418-1421 (2010).
- Habuchi, S. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific. 265-290 (2013).
- Fernandez, P., Bayona, J. M. Use of off-line gel-remeation chromatography normal-phase liquid-chromatography fro the determination of polycyclic aromatic-compounds in environmental-samples and standard reference materials (air particulate matter and marine sediment). J. Chromatogr. 625 (2), 141-149 (1992).
- Biesenberger, J. A., Tan, M., Duvdevan, I., Maurer, T. Recycle gel permeation chromatography. 1. recycle principle and design. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 9 (5), 353 (1971).
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane-receptors as studied by single-particle tracking (nanovid microscopy) - effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial-cells. Biophys. J. 65 (5), 2021-2040 (1993).
- Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys. J. 73 (2), 1073-1080 (1997).
- Vrljic, M., Nishimura, S. Y., Brasselet, S., Moerner, W. E., McConnell, H. M. Translational diffusion of individual class II MHC membrane proteins in cells. Biophys. J. 83 (5), 2681-2692 (2002).
- Margineanu, A., et al. Photophysics of a water-soluble rylene dye: Comparison with other fluorescent molecules for biological applications. J. Phys. Chem. B. 108 (32), 12242-12251 (2004).
- Tezuka, Y., Oike, H. Self-assembly and covalent fixation for topological polymer chemistry. Macromol. Rapid Commun. 22 (13), 1017-1029 (2001).
- Deres, A., et al. The Origin of Heterogeneity of Polymer Dynamics near the Glass Temperature As Probed by Defocused Imaging. Macromolecules. 44 (24), 9703-9709 (2011).
- Flier, B. M. I., et al. Heterogeneous Diffusion in Thin Polymer Films As Observed by High-Temperature Single-Molecule Fluorescence Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (1), 480-488 (2012).
- Habuchi, S., Oba, T., Vacha, M. Multi-beam single-molecule defocused fluorescence imaging reveals local anisotropic nature of polymer thin films. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (15), 6970-6976 (2011).
- Zettl, U., et al. Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Macromolecules. 42 (24), 9537-9547 (2009).
- Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T., Brauchle, C. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat. Mater. 6 (4), 303-310 (2007).
