Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

סינתזה של מחזורי פולימרי אפיון Motion הפעפוע שלהם במדינת הממסים ברמת המולקולה הבודדה

Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54503
Automatic Translation
1, 2,3, 3
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 2Division of Applied Chemistry, Faculty of Engineering, Hokkaido University, 3Department of Organic and Polymeric Materials, Tokyo Institute of Technology

Summary

פרוטוקול עבור הסינתזה והאפיון של תנועת diffusive של פולימרים מחזוריים ברמת המולקולה הבודדה מוצג.

Protocol

1. סינתזה של Monofunctional ו bifunctional midi (THF)

  1. פולי Monofunctional (THF)
    1. הלהבה לייבש בקבוקון מסביב לתחתית 2-צוואר 100 מ"ל. ואקום למלא את הבקבוק עם חנקן (3 מחזורים).
    2. להוסיף tetrahydrofuran מזוקקים (THF) (50 מ"ל) אל הבקבוק. שים את הבקבוק באמבט מים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, לאזן את הטמפרטורה.
    3. להוסיף triflate מתיל (0.5 מילימול) אל הבקבוק על ידי מזרק. מערבבים את התערובת למשך 5-10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף N -phenyl pyrrolidine (4-6 equiv.) אל הבקבוק על ידי מזרק. מערבבים את התערובת במשך 30-60 דקות.
    5. להסיר לחלוטין את הממס בלחץ מופחת (בערך 100 Torr). ממיסים את שאריות 3-5 מ"ל של אצטון. מוסיפים את פתרון אצטון לתוך 300-500 מ"ל של n -hexane. סנן את המשקע ולייבש אותו בלחץ מופחת.
  2. פולי bifunctional (THF)
    1. הלהבה לייבש בקבוקון מסביב לתחתית 2-צוואר 100 מ"ל. Vacuum ולמלא את הבקבוק עם חנקן (3 מחזורים).
    2. להוסיף THF מזוקקים (50 מ"ל) אל הבקבוק. שים את הבקבוק באמבט מים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, לאזן את הטמפרטורה.
    3. להוסיף אנהידריד triflic (0.3 מילימול) אל הבקבוק על ידי מזרק. מערבבים את התערובת למשך 5-10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף N -phenyl pyrrolidine (4-6 equiv.) אל הבקבוק על ידי מזרק. מערבבים את התערובת במשך 30-60 דקות.
    5. להסיר לחלוטין את הממס בלחץ מופחת (בערך 100 Torr). ממיסים את שאריות 3-5 מ"ל של אצטון. מוסיפים את פתרון אצטון כדי 300-500 מ"ל של n -hexane. סנן את המשקע ולייבש אותו בלחץ מופחת.

2. סינתזה של Perylene Diimide-משולב 4-חמוש כוכב ו -8 בצורה Dicyclic midi (THF)

  1. פולי כוכב המזוינים (THF)
    1. חילוף יונים
      1. ממיסים מלח נתרן diimide tetracarboxylate perylene במים (10 מ"ג / מ"ל, 150 מ"ל). לְהִתְמוֹסֵספולי monofunctional (THF) אצטון (160 מ"ג / מ"ל, 4 מ"ל). מוסיפים את dropwise פתרון אצטון לתוך בתמיסה מימית וערבבה במרץ. אסוף את המשקע שנוצר על ידי סינון.
      2. חזור על התהליך הנ"ל עם המשקע התאושש (2.1.1.1) ארבע פעמים.
    2. קיבעון קוולנטיים
      1. ממיסים את המשקע שהתקבל טולואן (5 מ"ג / מ"ל). ריפלוקס הפתרון עבור 4 שעות.
      2. להסיר לחלוטין את הממס בלחץ מופחת (בערך 100 Torr). סנן את השאריות באמצעות תקע של סיליקה ג'ל עם אצטון n -hexane / (2/1 כרך / כרך). מוסיף את הפתרון לתוך מים מקוררים-קרח (300-500 מיליליטר) כדי לזרז את המוצר. אסוף את המשקע על ידי סינון.
  2. פולי 8 בצורת Dicyclic (THF)
    1. חילוף יונים
      1. ממיסים מלח נתרן diimide tetracarboxylate perylene במים (6 מ"ג / מ"ל, 50 מ"ל). ממיסים פולי bifunctional (THF) (0.5 גרםב) 30-50 מ"ל של אצטון. מוסיפים את dropwise פתרון אצטון לתוך בתמיסה מימית וערבבה במרץ ב- C ° 0. אסוף את המשקע שנוצר על ידי סינון.
      2. חזור על התהליך הנ"ל עם המשקע התאושש (2.2.1.1).
    2. קיבעון קוולנטיים
      1. ממיסים את המשקע שהתקבל טולואן (0.05 גר '/ ל). ריפלוקס הפתרון עבור 4 שעות.
      2. להסיר לחלוטין את הממס בלחץ מופחת (בערך 100 Torr). להוסיף טולואן לפזר את השאריות חלקיות. Re-לזרז לתוך 300-500 מ"ל של -hexane n.
      3. סנן את המשקע שנוצר באמצעות תקע של סיליקה ג'ל עם אצטון n -hexane / (2/1 כרך / כרך). Re-לזרז לתוך 300-500 מ"ל מים.
      4. לטהר את המשקע שנוצר על ידי כרומטוגרפיה בעמודה 18 באמצעות ג'ל קלקר. בהמשך לטהר את המוצר הגולמי ידי כרומטוגרפיה חלחול ג'ל preparative (GPC) 19 עם eluent של CHCl 3 עד remתוצרי לוואי אובה ידי ניטור מקדם השבירה (RI) וגלאי UV.

3. ניסוי דימות פלואורסצנטי מולקולה בודדת

  1. להכנת דגימות
    1. ניקוי של תלושי מיקרוסקופ כיסוי
      1. מקום מס '1.5 24 x כיסוי מיקרוסקופ מ"מ 24 מחליק בצנצנת מכתים.
      2. הוסף 1 פתרון הידריד M אשלגן (100 מ"ל) לתוך הצנצנת sonicate במשך 15 דקות. יוצקים את פתרון אשלגן ידי decantation ולשטוף את תלושי לכסות עם מים טהורים במשך כמה פעמים. הוספת אתנול כיתה ספקטרוסקופיות (100 מ"ל) לתוך הצנצנת sonicate במשך 15 דקות.
      3. יוצקים את אתנול על ידי decantation ולשטוף את תלושי לכסות עם מים טהורים במשך כמה פעמים. לאחר שמזג את המים הטהורים ידי decantation, לחזור על השלב 3.1.1.2.
      4. מוסיפים מים טהורים אל הצנצנת sonicate במשך 15 דקות. שוטף את התלושים לכסות עם מים טהורים עבור מספר פעמים. קח את התלושים לכסות מהצנצנת ידי פינצטה פלסטיק ולייבש אותם באמצעות אוויר יבש או חנקן יבש.
    2. הכנת דגימות להמיס פולימר 14,15
      1. הוספת 100 μl של פולי ליניארי שכותרתו (THF) בבקבוק זכוכית ומחממים לטמפרטורה מעל נקודת התכה (כ -25 ° C) בעזרת מייבש שיער.
      2. ממיסים את פולימר משולב-fluorophore (ליניארי, כוכב 4-חמושים, מחזורית, או 8 בצורת dicyclic מסונתז 2.1 ו -2.2) כלורופורם (1 מ"ל, 10 -6 M). הוסף 1 μl של פתרון 100 μl של להמיס של פולי ליניארי שכותרתו (THF).
      3. לאחר ערבוב המדגם ביסודיות עם קצה פיפטה, להתאדות כלורופורם על ידי חימום מדגם בעזרת מייבש.
        הערה: זו מספקת להמיס של פולי ליניארי שכותרתו (THF) המכיל 10 -8 M של פולימרים משולבים fluorophore.
      4. קח 10 μl של המדגם באמצעות מיקרו-פיפטה דROP אותו על פיסת כיסוי לנקות. במילים אחרות לכסות להחליק ניקה על המדגם כריך במדגם בין שני תלושי לכסות.
      5. לחץ על המדגם בעדינות בעזרת פינצטה פלסטיק.
  2. דימות פלואורסצנטי רחב בתחום ההתקנה 15
    1. מבוא של ליזר עירור (488 ננומטר) ליציאה האחורית של מיקרוסקופ הפוכה
      1. כנס מסנן bandpass העירור מקטב לתוך נתיב הקרן.
      2. הרחב את הקורה של כ 1 סנטימטר קוטר על ידי הרחבה קורית.
      3. הכנס צלחת גל ברבעון לתוך נתיב קרן. הגדר את לציר האופטי של לוחית הגל ב 45 מעלות ביחס לזה של המקטב. לחלופין, כנס מפצה ברק ולהגדיר את העיכוב האופטי כדי λ / 4.
      4. כנס סרעפת בנתיב קרן עירור כדי להתאים את גודל הקורה.
      5. לפני החדרת קרן הליזר ליציאה האחורית של microsco האופטי ההפוךPE, הכנס העדשה מתמקדת (עדשה קמורה תוכנית, אורך מוקדי ≈ 300 מ"מ) לעמדה שבה קרן לייזר מתוך העדשה המטרה היא collimated.
    2. לאחר המשקף את קרן הליזר באמצעות מראה dichroic רכוב על קובייה מסננת, להציג את קרן הליזר אל המדגם באמצעות צמצם מספרי גבוה (NA) עדשה אובייקטיבית (למשל, NA 1.3, גדלת 100X, טבילת שמן).
    3. צרף מחמם אובייקטיבי העדשה האובייקטיבית להגדיר את הטמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס.
    4. הרכבה המדגם על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה
      1. טיפת טיפה אחת של שמן טבילה על העדשה האובייקטיבית הר המדגם על מצב מיקרוסקופ.
      2. ודא כי עובי המדגם של כ -10 מיקרומטר מתקבל על ידי סימון המיקום הצירי של המשטח התחתון והעליון של המדגם.
      3. התאם את המיקוד של מיקרוסקופ כדי מיקרומטרים אחדים מעל המשטח התחתון של המדגם.
      השג אור העירור מקוטב מעגלי תחת העדשה האובייקטיבית
      1. הכנס מקטב לתוך קרן לייזר collimated מתוך העדשה אובייקטיבי.
      2. רשום את עוצמת הלייזר מועבר דרך מקטב על ידי החדרת מד הכוח לאחר מקטב. רשום את כוח הליזר מועבר בזוויות קיטוב שונות על ידי סיבוב המקטב.
      3. אם כוח הליזר המועבר אינו קבוע בכל זוויות הקיטוב, מעט לסובב את הצלחת ברבעון הגל או מפצה ברק הוכנסה נתיב קרן עירור.
      4. חזור על שלב 3.2.5.2 ו 3.2.5.3 עד כוח ליזר מועבר הקבוע מתקבלים בכל זוויות הקיטוב. ודא כי אור המקוטב המעגלי מתקבל על המדגם.
    5. הגדר את EM (הכפלת אלקטרונים) -charge מכשיר מצמיד (CCD) מצלמה
      1. צרף את המצלמה-CCD EM לנמל בצד של המיקרוסקופ ולחבר אותו ל- tהוא תוכנת רכישת התמונה.
      2. במידת הצורך, לסנכרן את החשיפה המצלמה צמצם מכני או מסנן מתכונן אופטי acousto הוכנס נתיב קרן עירור על ידי שליחת ההיגיון-טרנזיסטור טרנזיסטור (TTL) אותות שנוצר על ידי המצלמה EM-CCD להתקנים. לחלופין, לסנכרן את החשיפה המצלמה פלט לייזר על ידי שליחת אותות TTL שנוצר על ידי המצלמה EM-CCD ללייזר.
        הערה: האפשרות האחרונה היא ישים רק כאשר לייזר מצב מוצק שכוחם פלט יכול להיות מווסתת על ידי קלט טרנזיסטור טרנזיסטור ההיגיון (TTL) אותות משמש לצורך הניסוי.
      3. החל רווח EM (בדרך כלל כ 300) למצלמת CCD באמצעות תוכנת שליטה על המצלמה כדי לקבל תמונת קרינה באיכות גבוהה של fluorophore היחיד.
      4. הגדרת האזור של עניין (ROI) (בדרך כלל 128 x 128 פיקסלים במרכז שדה הראייה) באמצעות תוכנת השליטה במצלמה.
        הערה: זו מאפשרת Imagiניסויי ng בשיעורי המסגרת של 100 - 200 הרץ במצב העברת מסגרת, אשר נדרש לדמיין את ההצעה של שרשרות הפולימר-משולב fluorophore במדגם להמס.
  3. הפעלת הניסוי
    1. אופטימיזציה של תנאי הניסוי
      1. התאם את אזור התאורה המדגמת לכ -20 מיקרומטר קוטר באמצעות הסרעפת הוכנסה נתיב קרן עירור.
      2. הגדר את כוח ליזר עירור על מדגם 4 - 8 mW על ידי בחירה ידנית צפיפות ניטראלית מתאים (ND) מסנן הוכנס נתיב קרן עירור.
        הערה: זה מספק את כוח לייזר ממוצע של 1 - 2 כ"ס -2 ס"מ על מדגם.
      3. תמונות קרינת שיא של המדגם בשיעורי המסגרת של 100 - 200 רץ. אם עוצמת הקרינה המתקבלת פולימרי fluorophore-משולב הפרט היא נמוכה מדי, להגדיל בהדרגה את כוח העירור באמצעות הדואר ND מסנן עד שמגיעים כ 100 מגה ואט עם המדגם.
      4. אם איכות התמונה הקרינה מולקולה בודדת עדיין אינה משביעת רצון, לבדוק את הזיהומים הקרינה במדגם ידי הקלטת תמונות הקרינה של להמיס טהור של פולי אי שכותרתו (THF). במקרה רקע קרינה גבוה הוא ציין, להשתמש פולי אי שכותרתו שונים (THF).
      5. אם את הצפיפות של מקום הקרינה המתקבל הפולימרים משולבים fluorophore ב להמס גבוהה מדי כדי לבודד אותם מרחבית (הדבר גורם שגיאות בניתוח של תנועת diffusive), להקטין את הריכוז של הפולימרים משולבים fluorophore במדגם עד מרחבית הם נצפו כתמים בודדים.
      6. אם את הצפיפות של המקום הקרינה המתקבל פולימרים משולבים fluorophore ב להמיס הוא נמוך מדי (זה גורם תפוקה נמוכה של ניסוי הדמיה), להגדיל את הריכוז של פולימרים משולבים fluorophore במדגם עד להשגת approprצפיפות iate של מקום הקרינה הוא הגיע.
      7. אם תמונות הקרינה המתקבלות הפולימרים משולבים fluorophore ב להמס מיטשטשים, להגדיל את מסגרת החליפין של רכישת ההדמיה.
        הערה: זה בדרך כלל דורש החזר השקעה קטנה, בדרך כלל 64 x 64 פיקסלים.
  4. תמונת רכישה
    1. ברגע תנאי הניסוי ממוטבים, לעזוב את המדגם רכוב על במת מיקרוסקופ במשך שעה כך המדגם מגיע תנאי שיווי משקל.
    2. הקלט 500 - 1,000 רצפים תמונה הקרינה של פולימרים משולבים fluorophore במדינת להמיס בכל 100 - קצב הפריימים 200 הרץ. אם קובץ בפורמט ברירת מחדל הוא לא TIFF, להמיר את כל רצפי תמונות לפורמט TIFF.

4. ניתוח של Motion הפעפוע

  1. עקירת Mean-בריבוע (MSD) ניתוח
    1. חתוך את רצפי תמונת קרינה בצורה כזאתשכל רצף תמונה מכיל תוכנות עיבוד תמונה באמצעות פולימר לשדר יחידה היטב ממוקדות משולב-fluorophore, כגון ImageJ.
    2. כאשר הבסיסים המשלימים התמונה החתוכה להכיל יותר מ -10 מסגרות, לפצל את התמונה sequences לתוך רצפים מרובים כך שכל רצף מורכב של 10 פריימים.
    3. לקבוע את עמדותיהם של מולקולות בכל רצפים תמונה מדויקת על ידי הולם גאוס דו מימדי של התמונות.
    4. קבע את מקדם הדיפוזיה (D) של מולקולות בודדות ידי ניתוח עקירה בריבוע אומר (MSD) של מסלולי דיפוזיה (כלומר, עמדות תלויות זמן של המולקולה) באמצעות משוואה 20
      Equation1
      כאשר x ו- y i i הן עמדות של המולקולה מסגרת התמונה i, ו- n מציין את מספר הפריים עם הזמן לשגות Δt ממסגרת i.
    5. מגרש את מקדמי דיפוזיההיסטוגרמה תדירה.
      הערה: בדרך כלל, היסטוגרמה בנוי יותר מ -100 מולקולות.
  2. פונקציית התפלגות מצטברת (CDF) ניתוח
    הערה: CDF, P (r 2, i Δ t) תואמת את ההסתברות המצטברת של מציאת מולקולות לשדר ברדיוס r מהראשית בפיגור זמן מסוים אני Δ t.
    1. חשב את העקירה בריבוע המתרחשת בזמן מפגר של 1Δt, 2Δt, ····, iΔt עבור כל מסלולי דיפוזיה שהושגו 4.1.3.
      הערה: לתת חישובים אלה מ סכו i בריבוע-התקות בפעם מפגרת של iΔt.
    2. לחשב מספרים של-ההתקות בריבוע (i l) במסגרת קבוצת הנתונים i מ הכוללת כי הם קטנים מ r 2 בערכי r 2 שונים (0 <R2 <∞). אני l מנורמל vs r 2 מגרשים תואמים את CDF, P (r 2, iΔt).
  3. ניתוח של CDFS עם מודלים דיפוזיה ברורים
    הערה: CDFS השיג מצוידים ידי מודלים דיפוזיה ברורים; מודל דיפוזיה הומוגנית, מצבי דיפוזיה מרובה, בהם חלוקת D מתואר על ידי (מודל גאוס יחיד) גאוס, מצבי דיפוזיה מרובה, בהם חלוקת D מתואר על ידי מספר רב של גאוס (מודל גאוס מרובים).
    1. במודל דיפוזיה הומוגנית, לקבוע ממוצעת D על ידי התאמת CDF באמצעות משוואה 21
      Equation2
      הערה: כל סטייה מן המשוואה מרמזת על דיפוזיה הטרוגנית של המולקולה.
    2. במודל גאוס יחיד, לקבוע את התפלגות ההסתברות של D מתואר על ידי גאוס (f (D)) על ידי התאמת CDF באמצעות 15
      on3 "src =" / files / ftp_upload / 54,503 / 54503equation3.jpg "/>
      Equation4
      כאשר A, W, ו- D 0 הם משרעת, רוחב, ובמרכז גאוס.
    3. במודל גאוס כפול, לקבוע את התפלגות ההסתברות של j ה מרכיב של D מתואר על ידי גאוס (f (D)) על ידי התאמת CDF באמצעות 14
      Equation5
      Equation6
      כאשר A j הוא שבריר של כל רכיב דיפוזיה, ו α j, w j, ו j D 0 הם משרעת, רוחב, ובמרכז j ה מרכיב של גאוס.
  4. חישוב distri ההסתברות התיאורטיbution של מקדם הדיפוזיה
    הערה: ההסתברויות של D המתרחשות עקב הטעויות הסטטיסטיות (p (D) ד ד) מחושבות עבור דגמי דיפוזיה השונים; מודל דיפוזיה הומוגנית, מצבי דיפוזיה מרובה, בהם חלוקת D מתואר על ידי (מודל גאוס יחיד) גאוס, מצבי דיפוזיה מרובה, בהם חלוקת D מתואר על ידי מספר רב של גאוס (מודל גאוס מרובים).
    1. במודל דיפוזיה הומוגנית, לחשב את התפלגות ההסתברות הסטטיסטית של D באמצעות משוואה 22
      Equation7
      כאשר N הוא מספר נקודות הנתונים במסלול דיפוזיה (N = 10, ראה 4.1.2), D 0 הוא מקדם הדיפוזיה הממוצע (הנקבע על ידי ניתוח CDF, ראה 4.2.3.1), ו- D הוא השיג באופן ניסיוני מקדם הדיפוזיה עבור מסלול פרט.
    2. במודל דיפוזיה גאוס יחיד, לחשב את התפלגות ההסתברות הסטטיסטית של D באמצעות משוואה 15
      Equation8
      כאשר f (D) מציין התפלגות הסתברות של D שקבעה ניתוח CDF (ראה 4.2.3.2), ו- D 0 הוא מקדם הדיפוזיה הממוצע (הנקבע על ידי ניתוח CDF, ראה 4.2.3.2).
    3. במודל דיפוזיה גאוס הכפול, לחשב את התפלגות ההסתברות הסטטיסטית של D באמצעות משוואה 14
      Equation9
      כאשר f (D j) מציינת התפלגות ההסתברות של j ה מרכיב של D (j D) שקבע ניתוח CDF (ראה 4.2.3.3), ו- D 0j הוא מקדם הדיפוזיה הממוצע של j ה מרכיב (הנקבעת על ידי CDF ניתוח, ראה 4.2.3.3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Perylene diimide-משולב 4 כוכבים-חמושים ו -8 בצורת פולי dicyclic (THF) s היו מסונתז באמצעות הרכבה עצמית אלקטרוסטטי וקיבוע קוולנטי (ESA-CF) תהליך (איור 1, איור 2). תמונות הקרינה מולקולה בודדת זמן לשגות נמדדו עבור (איור 3 א) 4-חמושים בצורת 8 (איור 3B) פולימרים. התמונות הקרינה זמן לשגות (איור 3) להראות מבודד מרחבית כתמים בהירים וחדים בשל איחוד של fluorophore perylene diimide פלורסנט מאוד 23 לתוך שרשראות. היסטוגרמות תדר של מקדם דיפוזיה חושבו (איור 4 א) 4-חמושים בצורת 8 (איור 4 ב) פולימרים ידי עקירה בריבוע-ממוצע (MSD) ניתוח של זמן לשגות תמונות. החישובים של מגרשי MSD ו CDFS מתבצעים באמצעות שגרות כתובות MATLAB. הולםשל CDFS המתקבל ניסויים מתבצע באמצעות תוכנת עיבוד נתונים כגון פרו מוצא. היסטוגרמות התדירות מקדם הדיפוזיה שקבע ניתוח MSD להציג הפצות רחבות (איור 4) נובע הוא הטעות הסטטיסטית של ניתוח ההטרוגניות של דיפוזיה. היסטוגרמות התדירות להראות סטיות ברורות ממודל דיפוזיה הומוגנית (קו ירוק באיור 4), אשר מביא לידי ביטוי דיפוזיה הטרוגנית של מולקולות הפולימר. 14 פונקציות התפלגות מצטברות (CDFS) חושבו עבור (איור 5 א) 4-החמושים ו -8 בצורה (איור 5 ב) פולימרים והתאים ידי (איור 5 א) גאוס יחיד ומודלים גאוס (איור 5 ב) כפול. התפלגויות ההסתברות הסטטיסטיות של מקדם הדיפוזיה חושבו (איור 4 א) 4-החמושים ו -8 בצורת pol (איור 4 ב) ymers ידי גאוס היחיד, או מודלים גאוס כפולים. הסינגל (איור 5 א) ו כפולה (איור 5 ב) מודלים גאוס להתאים את CDFS שהושגו בניסוי היטב. תוצאות אלו מראות כי דיפוזיה של הפולימר 4-החמוש מתוארת על ידי הפריסה הרחבה של מקדם הדיפוזיה, ואילו הפולימר 8 בצורת מציג שני מצבי דיפוזיה ברורים.

איור 1
איור 1. סינתזת תוואי perylene diimide-משולב פולי (THF) s. סינתזת תוואי (א) 4-חמושים פולימרי כוכב ו- (ב) 8 בצורת פולימרי dicyclic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

54503fig2.jpg "/>
אפיון איור 2. של פולימרים מסונתז. NMR ספקטרה של (א) 4-חמושים פולימרים כוכב ו- (ב) 8 בצורת פולימרים dicyclic. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3 (סרטים). דימות פלואורסצנטי מולקולה בודדת של פולי perylene משולב-diimide (THF) s. תמונות הקרינה זמן לשגות של (א) פולימרים 4 כוכבים-חמושים (ב) 8 בצורת פולימרים dicyclic ב להמיס של פולי ליניארי שכותרתו שאינם (THF ). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטים (א) ו "Target =" 3 / Figure_3b_submit.mov _ blank "> (ב).

איור 4
איור 4. ניתוח MSD של פולי diimide-משולב perylene (THF) s לשדר ב להמיס. היסטוגרמות תדר של מקדם הדיפוזיה נקבע לאדם (א) 4-חמושים פולימרים כוכב ו- (ב) 8 בצורת פולימרים dicyclic ב להמיס של אי שכותרתו פולי ליניארי (THF). הקווים מוצק תיאורטית להראות מחושב הסתברויות של מקדם הדיפוזיה מבוסס על שלושה דגמים דיפוזיה שונים; מודל דיפוזיה הומוגנית (קווים ירוקים, ראה 4.3.1), מודל גאוס יחיד (redlines ראה 4.3.2), ודגם גאוס כפול (קו כחול, ראה 4.3.3). 14 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה דמות.

FO: keep-together.within-page = "1"> איור 5
ניתוח CDF איור 5. של פולי perylene משולב-diimide (THF) s לשדר ב להמיס פונקציית הצטברות השיג ניסיוני (iΔt = 7.5 - 75 msec). בצורת 1-P עבור (א) פולימרים 4 כוכבים-חמושים ו- (ב) 8 בצורת פולימרים dicyclic ב להמיס של פולי ליניארי שכותרתו (THF). קווים מקווקווים להראות אבזרים עם (א) משוואות ב 4.2.3.2 ו- (ב) משוואות ב 4.2.3.3. 14 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפולימרים 4-חמושים בצורת 8 הוכנו באמצעות פרוטוקול ESA-CF (איור 1), אשר הוא שלב קריטי לסינתזה. 12,24 Monofunctional פולי ליניארי bifunctional (THF) s עם קבוצות סוף N -phenylpiperidinium היו מסונתז על פי הנוהל הקודם. 11 חילוף היונים בוצע על ידי reprecipitation של פתרון אצטון של מבשר פולימר עם counteranions triflate לתוך בתמיסה מימית המכילה כמות של carboxylate עודפת.

ההמרה קוולנטי של מוצר יון-בתמורת פולימרי 4 כוכבים-החמושים בוצעה טולואן (4.9 גר '/ ל') על ידי ריפלוקס במשך 4 שעות. אם ההמרה אינה מספיקה, להאריך את זמן התגובה. המוצר המלוכד קוולנטית הושג על ידי כרומטוגרפיה בעמודת סיליקה ג'ל עם אצטון / n -hexane ו reprecipitation במים. 1 H NMR של פולימרים 4-חמושים מוצג באיור 2a. תיהליך ESA-CF s מאפשר לסינתזה היעילה של פולימרים מחזוריים. עם זאת, פרוטוקול זה מוגבל פולימרים שיש קבוצות סוף onium מחזוריות.

עבור מוצר פולימר 8 בצורה, התגובה בוצעה טולואן בדילול (0.2 גר '/ ל') תחת ריפלוקס במשך 4 שעות ו הביאה להיווצרות של חלק גדול של חלק מסיס, ככל הנראה בשל מולקולאריים הגיבו מוצרים. חלק מסיסים היה reprecipitated ב -hexane n, נתון כרומטוגרפיה בעמודה סיליקה ג'ל עם אצטון / n -hexane, ו reprecipitated במים. המוצר הגולמי המתקבל היה נתון כרומטוגרפיה טור עם חרוזי הדרת גודל ולמחזר GPC לאפשר בידוד של מוצר פולימר 8 בצורה. 1 H NMR של הפולימרים 8 בצורה מוצגת איור 2b. פרוטוקול ESA-CF זה יכול לחול על פולימרים טופולוגי מורכב עוד יותר.

תמונות הקרינה גבוהה והאיכות הם essentiאל לניתוח המדויק של תנועת diffusive של המולקולות. תמונות הקרינה מידרדות באופן משמעותי כאשר 1) זיהומי קרינה נוכחים במדגם, 2) תשואת קוונטי הקרינה של fluorophore משולב היא נמוכה, ו -3) את מסגרת הדולר של ההדמיה הוא איטי יותר מאשר תנועת diffusive של מולקולות הפולימר. הגדרת הטמפרטורה מתחת לטמפרטורת חדר (20 מעלות צלזיוס) או מעל 37 מעלות צלזיוס תגרום חוסר התאמה קדם שביר, אשר גם להתדרדר את איכות תמונות קרינה רשמו. באמצעות מסנן bandpass פליטת להקה צר רכוב על קובייה מסננת מתישהו משפר את איכות תמונת הקרינה. מאז את זמן החשיפה של מצלמת EM-CCD השתמשה בניסוי ההדמיה בדרך כלל מוגבל מילישניות, תנועת diffusive מהר יותר בקנה מידה הפעם לא יכולה להיות שנתפסה על ידי שיטה זו.

הערכת ההשפעה של הטעות הסטטיסטית בניתוח MSD היא השלב הקריטי FOr האפיון של דיפוזיה הטרוגנית. השגיאה הסטטיסטית יש להעריך בזהירות על ידי חישוב התפלגות ההסתברות של מקדם הדיפוזיה באמצעות מודל דיפוזיה הומוגנית 22 לפני שדנים דיפוזיה הטרוגנית. דיפוזיה הטרוגנית צריך גם להיבדק בקפידה על ידי ניתוח CDF. כאשר CDFS להראות סטיות ברורות ממודל דיפוזיה הומוגנית (כלומר, יחיד מעריכי העקומה מתפורר), זה מרמז על הנוכחות של רכיבים לשדר מרובים. אפיון כמותי של דיפוזיה הטרוגנית דורש משולב MSD, CDF, והפצת הסתברות מנתחת. 14,15

דינמיקת פולימרים, כוללים תנועת diffusive, תוארה כערכים בממוצע אנסמבל בשיטות הקונבנציונליות כמו תמ"ג, 7 פיזור אור, 8 ומדידות צמיגות. 9 אכן, תנועת diffusive הטרוגנית מתגלה על ידי Singlדואר מולקולת הדמית 16 היא בדרך כלל קשה מאוד לזהות בשיטות ממוצעות האנסמבל. בהתחשב באופי הטרוגנית הטבוע של פולימרים, 25-27 שיטת הדיווח בפרוטוקול זה אינה מוגבל לאפיון פולימרים טופולוגי, אבל הוא ישים את כל סוגי פולימרים בתנאים הסתבכו. 28 יתר על כן, גישת דיווח בפרוטוקול זה תמצא יישום רחב בניתוח דיפוזיה הטרוגנית במערכות מורכבות, כגון דיפוזיה מולקולרית דרך חומרים mesoporous. 29

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
THF Godo
Wakosil C-300 Wako Pure Chemical Industries
Acetone Godo
Toluene Godo
n-Hexane Godo
CHCl3 Kanto Chemical
Bio-Beads S-X1 Bio-Rad
Methyl triflate Nacalai Tesque
Triflic anhydride Nacalai Tesque
Potassium Hydroxide Wako Pure Chemical Industries
Ethanol Wako Pure Chemical Industries
Poly(tetrahydrofuran) Aldrich
Chloroform Wako Pure Chemical Industries
Immersion oil Cargille Type 37 / Type A
Equipment
2-Neck 100-ml round-bottom flask
Flask
Beaker
Funnel
Filter paper Whatman
Reflux condenser
Syringe
Water bath
Magnetic stirrer
Rotary evaporator
Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) Matsunami Glass CO22241
Staining jar AS ONE Corporation 1-7934-01
Ultrasonic cleaner VWR International  142-0047
Inverted microscope Olympus IX71
Ar-Kr ion laser Coherent Innova 70C
Berek compensator Newport 5540
Excitation filter Semrock LL01-488-12.5
Dichloric mirror Omega optical 500DRLP
Emission filter Semrock BLP01-488R-25
Lens and mirror Thorlabs
EM-CCD camera Andor Technology iXon
Objective lens (100X, N.A. = 1.3) Olympus UPLFLN 100XOP
Objective heater Bioptechs
Preparative GPC Japan Analytical Industry LC-908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
  2. Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Tuneable enhancement of the salt and thermal stability of polymeric micelles by cyclized amphiphiles. Nat. Commun. 4, (2013).
  3. Jun, S., Mulder, B. Entropy-driven spatial organization of highly confined polymers: Lessons for the bacterial chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (33), 12388-12393 (2006).
  4. McLeish, T. Polymers without beginning or end. Science. 297 (5589), 2005-2006 (2002).
  5. McLeish, T. Polymer dynamics: Floored by the rings. Nat. Mater. 7 (12), 933-935 (2008).
  6. Roovers, J. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 137-156 (2013).
  7. Klein, J. Evidence for reptation in an entangled polymer melt. Nature. 271 (5641), 143-145 (1978).
  8. Leger, L., Hervet, H., Rondelez, F. Reptation in entangled polymer-solutions by forced rayleigh light-scattering. Macromolecules. 14 (6), 1732-1738 (1981).
  9. von Meerwall, E. D., Amis, E. J., Ferry, J. D. Self-diffusion in solutions of polystyrene in tetrahydrofuran - comparison of concentration dependences of the diffusion-coefficients of polymers, and a ternary probe component. Macromolecules. 18 (2), 260-266 (1985).
  10. Kapnistos, M., et al. Unexpected power-law stress relaxation of entangled ring polymers. Nat. Mater. 7 (12), 997-1002 (2008).
  11. Adachi, K., Takasugi, H., Tezuka, Y. Telechelics having unstrained cyclic ammonium salt groups for electrostatic polymer self-assembly and ring-emitting covalent fixation. Macromolecules. 39 (17), 5585-5588 (2006).
  12. Oike, H., Imaizumi, H., Mouri, T., Yoshioka, Y., Uchibori, A., Tezuka, Y. Designing unusual polymer topologies by electrostatic self-assembly and covalent fixation. J. Am. Chem. Soc. 122 (40), 9592-9599 (2000).
  13. Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topological polymer chemistry: a cyclic approach toward novel polymer properties and functions. Polym. Chem. 2 (9), 1930-1941 (2011).
  14. Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Single-molecule imaging reveals topological isomer-dependent diffusion by 4-armed star and dicyclic 8-shaped polymers. Polym. Chem. 6 (22), 4109-4115 (2015).
  15. Habuchi, S., Fujiwara, S., Yamamoto, T., Vacha, M., Tezuka, Y. Single-Molecule Study on Polymer Diffusion in a Melt State: Effect of Chain Topology. Anal. Chem. 85 (15), 7369-7376 (2013).
  16. Habuchi, S., Satoh, N., Yamamoto, T., Tezuka, Y., Vacha, M. Multimode Diffusion of Ring Polymer Molecules Revealed by a Single-Molecule Study. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (8), 1418-1421 (2010).
  17. Habuchi, S. Topological Polymer Chemistry: Progress of Cyclic Polymers in Syntheses, Properties and Functions. Tezuka, Y. , World Scientific. 265-290 (2013).
  18. Fernandez, P., Bayona, J. M. Use of off-line gel-remeation chromatography normal-phase liquid-chromatography fro the determination of polycyclic aromatic-compounds in environmental-samples and standard reference materials (air particulate matter and marine sediment). J. Chromatogr. 625 (2), 141-149 (1992).
  19. Biesenberger, J. A., Tan, M., Duvdevan, I., Maurer, T. Recycle gel permeation chromatography. 1. recycle principle and design. J. Polym. Sci. Pol. Lett. 9 (5), 353 (1971).
  20. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane-receptors as studied by single-particle tracking (nanovid microscopy) - effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial-cells. Biophys. J. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  21. Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion. Biophys. J. 73 (2), 1073-1080 (1997).
  22. Vrljic, M., Nishimura, S. Y., Brasselet, S., Moerner, W. E., McConnell, H. M. Translational diffusion of individual class II MHC membrane proteins in cells. Biophys. J. 83 (5), 2681-2692 (2002).
  23. Margineanu, A., et al. Photophysics of a water-soluble rylene dye: Comparison with other fluorescent molecules for biological applications. J. Phys. Chem. B. 108 (32), 12242-12251 (2004).
  24. Tezuka, Y., Oike, H. Self-assembly and covalent fixation for topological polymer chemistry. Macromol. Rapid Commun. 22 (13), 1017-1029 (2001).
  25. Deres, A., et al. The Origin of Heterogeneity of Polymer Dynamics near the Glass Temperature As Probed by Defocused Imaging. Macromolecules. 44 (24), 9703-9709 (2011).
  26. Flier, B. M. I., et al. Heterogeneous Diffusion in Thin Polymer Films As Observed by High-Temperature Single-Molecule Fluorescence Microscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (1), 480-488 (2012).
  27. Habuchi, S., Oba, T., Vacha, M. Multi-beam single-molecule defocused fluorescence imaging reveals local anisotropic nature of polymer thin films. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (15), 6970-6976 (2011).
  28. Zettl, U., et al. Self-Diffusion and Cooperative Diffusion in Semidilute Polymer Solutions As Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Macromolecules. 42 (24), 9537-9547 (2009).
  29. Kirstein, J., Platschek, B., Jung, C., Brown, R., Bein, T., Brauchle, C. Exploration of nanostructured channel systems with single-molecule probes. Nat. Mater. 6 (4), 303-310 (2007).

Tags

כימיה גיליון 115 פולימר מחזורי סינתזה פולימר נמס טופולוגיה דיפוזיה מולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי
סינתזה של מחזורי פולימרי אפיון Motion הפעפוע שלהם במדינת הממסים ברמת המולקולה הבודדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka,… More

Habuchi, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level. J. Vis. Exp. (115), e54503, doi:10.3791/54503 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter