Summary
Un protocole pour la synthèse et la caractérisation du mouvement diffusif de polymères cycliques au niveau molécule unique est présenté.
Protocol
1. Synthèse des mono- et bifonctionnels Poly (THF)
- Poly monofonctionnel (THF)
- Flamme sécher un ballon à fond rond à 2 cols de 100 ml. Aspirer et remplir le flacon avec de l'azote (3 cycles).
- Ajouter du tétrahydrofuranne distillé (THF) (50 ml) dans le ballon. Placer le ballon dans un bain d'eau à 20 ° C et à équilibrer la température.
- Ajouter le triflate de méthyle (0,5 mmol) dans le flacon par une seringue. Agiter le mélange pendant 5-10 min à 20 ° C.
- Ajouter N -phényl pyrrolidine (4-6 équiv.) Dans le flacon par une seringue. Agiter le mélange pendant 30-60 min.
- Complètement éliminer le solvant sous pression réduite (environ 100 Torr). On dissout le résidu dans 3-5 ml d'acétone. Ajouter la solution d'acétone dans 300-500 ml de n - hexane. Filtrer le précipité et le sécher sous pression réduite.
- Poly Bifonctionnel (THF)
- Flamme sécher un ballon à fond rond à 2 cols de 100 ml. Virginiecuum et remplir le flacon avec de l'azote (3 cycles).
- Ajouter du THF distillé (50 ml) dans le ballon. Placer le ballon dans un bain d'eau à 20 ° C et à équilibrer la température.
- Ajouter de l'anhydride triflique (0,3 mmol) dans le flacon par une seringue. Agiter le mélange pendant 5-10 min à 20 ° C.
- Ajouter N -phényl pyrrolidine (4-6 équiv.) Dans le flacon par une seringue. Agiter le mélange pendant 30-60 min.
- Complètement éliminer le solvant sous pression réduite (environ 100 Torr). On dissout le résidu dans 3-5 ml d'acétone. Ajouter la solution d'acétone à 300-500 ml de n - hexane. Filtrer le précipité et le sécher sous pression réduite.
En forme de 8 2. Synthèse de pérylène diimide incorporé Étoiles 4-armé et dicyclique Poly (THF)
- Armed poly étoiles (THF)
- Échange d'ion
- Dissoudre le sel pérylène diimide tétracarboxylate de sodium dans de l'eau (10 mg / ml, 150 ml). Dissoudrepoly monofonctionnel (THF) dans l'acétone (160 mg / ml, 4 ml). Ajouter goutte à goutte une solution d'acétone dans la solution aqueuse sous agitation vigoureuse. Recueillir le précipité formé par filtration.
- Répétez la procédure ci-dessus avec le précipité récupéré (2.1.1.1) quatre fois.
- covalent fixation
- On dissout le précipité obtenu dans le toluène (5 mg / ml). Faire refluer la solution pendant 4 heures.
- Complètement éliminer le solvant sous pression réduite (environ 100 Torr). Filtrer le résidu à travers un bouchon de gel de silice avec un mélange n - hexane / acétone (01/02 vol / vol). Ajouter la solution dans de l'eau glacée (300-500 ml) pour précipiter le produit. Recueillir le précipité par filtration.
- Échange d'ion
- Poly-forme 8 dicyclique (THF)
- Échange d'ion
- Dissoudre le sel pérylène diimide tétracarboxylate de sodium dans l'eau (6 mg / ml, 50 ml). Dissoudre du poly bifonctionnel (THF) (0,5 g) Dans 30-50 ml d'acétone. Ajouter goutte à goutte une solution d'acétone dans la solution aqueuse sous agitation vigoureuse à 0 ° C. Recueillir le précipité formé par filtration.
- Répétez la procédure ci-dessus avec le précipité récupéré (2.2.1.1).
- covalent fixation
- On dissout le précipité obtenu dans le toluène (0,05 g / L). Faire refluer la solution pendant 4 heures.
- Complètement éliminer le solvant sous pression réduite (environ 100 Torr). Ajouter le toluène pour dissoudre partiellement le résidu. Re-précipiter dans 300-500 ml de n - hexane.
- Filtrer le précipité formé à travers un bouchon de gel de silice avec un mélange n - hexane / acétone (01/02 vol / vol). Re-précipiter dans 300-500 ml d'eau.
- On purifie le précipité formé par Chromatographie sur colonne 18 en utilisant un gel de polystyrène. Purifier davantage le produit brut par chromatographie sur gel preparative (GPC) , 19 avec un éluant CHCl 3 à remsous-produits ove en surveillant l'indice de réfraction (RI) et des détecteurs UV.
- Échange d'ion
3. Single-molécule Fluorescence Imaging Experiment
- La préparation des échantillons
- Nettoyage de couverture glisse de microscope
- Lieu n ° 1,5 24 x 24 mm couverture de microscope glisse dans un bocal de coloration.
- Ajouter la solution de l'hydrure de potassium 1 M (100 ml) dans le récipient et de traitement par ultrasons pendant 15 min. Décanter la solution d'hydroxyde de potassium par décantation et rincer les lamelles avec de l'eau ultra-pure à plusieurs reprises. Ajouter l'éthanol de qualité spectroscopique (100 ml) dans le bocal et sonication pendant 15 min.
- Verser de l'éthanol par décantation et rincer les lamelles avec de l'eau ultra-pure à plusieurs reprises. Après avoir versé de l'eau ultra-pure par décantation, répéter l'étape 3.1.1.2.
- Ajouter de l'eau ultra-pure à la jarre et sonication pendant 15 min. Rincer les lamelles avec de l'eau ultra-pure à plusieurs reprises. Sortez les lamelles de la jarre par des brucelles en plastique et les sécher soit par l'air sec ou de l'azote sec.
- Préparation des échantillons de polymère fondu 14,15
- Ajouter 100 ul de non marqué linéaire poly (THF) dans un flacon en verre et chauffer à une température supérieure au point de fusion (environ 25 ° C) à l'aide d'un sèche-cheveux.
- Dissoudre le polymère fluorophore incorporé (linéaire, étoile 4 bras, cyclique ou bicyclique en forme de 8 synthétisé en 2.1 et 2.2) dans le chloroforme (1 ml, 10 -6 M). Ajouter 1 pi de la solution à 100 ul de la masse fondue du poly linéaire non marqué (THF).
- Après avoir mélangé à fond l'échantillon avec une pointe de pipette, évaporer le chloroforme en chauffant l'échantillon à l'aide d'un sèche-linge.
REMARQUE: Ceci permet d' obtenir une masse fondue du poly linéaire non marqué (THF) contenant 10 -8 M des polymères fluorophore incorporé. - Prélever 10 pi de l'échantillon à l'aide d'une micro-pipette et dRop sur une lamelle nettoyée. Mettez une autre lamelle nettoyée sur l'échantillon et l'échantillon en sandwich entre les deux lamelles.
- Appuyez sur l'échantillon doucement à l'aide des brucelles en plastique.
- Nettoyage de couverture glisse de microscope
- Grand champ configuration d'imagerie par fluorescence 15
- Introduction d'un laser d'excitation (488 nm) dans l'orifice arrière du microscope inversé
- Insérer un filtre passe-bande d'excitation et le polariseur dans le trajet du faisceau.
- Étendre le faisceau à environ 1 cm de diamètre par un élargisseur de faisceau.
- Insérez une plaque quart d'onde dans le trajet du faisceau. Régler l'axe optique de la plaque d'onde à 45 degrés par rapport à celui du polariseur. Vous pouvez également insérer un compensateur Berek et régler le retard optique à X / 4.
- Insérer un diaphragme dans le trajet du faisceau d'excitation pour régler la taille du faisceau.
- Avant d'introduire le faisceau laser dans le port arrière du microsco optique inversépe, insérer une lentille de focalisation (lentille plan-convexe, longueur focale ≈ 300 mm) à une position où le faisceau laser sur l'objectif est collimaté.
- Après la réflexion du faisceau laser à l' aide d' un miroir dichroïque monté sur un cube de filtre, d' introduire le faisceau laser sur l'échantillon à travers une grande ouverture numérique (NA) objectif (par exemple, NA 1.3, 100X, immersion dans l'huile).
- Fixer un chauffe objectif à l'objectif et régler la température à 30 ° C.
- Monter l'échantillon sur la platine du microscope inversé
- Déposer une goutte d'huile à immersion sur la lentille d'objectif et monter l'échantillon sur l'état du microscope.
- Faire en sorte que l'épaisseur d'environ 10 um d'échantillon est obtenue en contrôlant la position axiale de la surface supérieure et inférieure de l'échantillon.
- Ajuster la mise au point du microscope à quelques micromètres au-dessus de la surface inférieure de l'échantillon.
- Insérez un polariseur dans le faisceau laser collimaté sur l'objectif.
- Enregistrer l'intensité du laser transmise à travers le polariseur en insérant un dispositif de mesure de puissance après le polariseur. Enregistrer la puissance du laser émis à des angles différents de polarisation en faisant tourner le polariseur.
- Si la puissance du laser transmis est pas constant à tous les angles de polarisation, tourner légèrement la plaque quart d'onde ou Berek compensator inséré dans le trajet du faisceau d'excitation.
- Répétez l'étape 3.2.5.2 et 3.2.5.3 jusqu'à ce que la puissance constante laser transmise est obtenue à tous les angles de polarisation. Faire en sorte que la lumière polarisée circulairement est obtenue à l'échantillon.
- Configuration EM (de multiplication d'électrons) -charge dispositif couplé (CCD)
- Fixez la caméra EM-CCD au port côté du microscope et le connecter à til logiciel d'acquisition d'images.
- Si nécessaire, synchroniser l'exposition de la caméra à un obturateur mécanique ou un filtre accordable acousto-optique inséré dans le trajet du faisceau d'excitation en envoyant le transistor à transistor logique (TTL) des signaux générés par la caméra CCD EM aux appareils. En variante, synchroniser l'exposition de la caméra à la sortie du laser en envoyant les signaux TTL générés par la caméra EM-CCD au laser.
NOTE: La dernière option est applicable seulement quand un laser à l'état solide dont la puissance peut être modulée par une entrée logique transistor-transistor signaux (TTL) est utilisé pour l'expérience. - Appliquer un gain EM (typiquement environ 300) à la caméra CCD en utilisant un logiciel contrôlant l'appareil afin d'obtenir une image de fluorescence de haute qualité du fluorophore unique.
- Définir une région d'intérêt (ROI) (typiquement 128 x 128 pixels au centre du champ de vision) en utilisant le logiciel de contrôle de l'appareil photo.
NOTE: Cela permet l'imagiexpériences ng aux taux de trames 100 - 200 Hz dans le mode de transfert de trame, qui est nécessaire pour visualiser le mouvement des chaînes de polymère fluorophore incorporé dans l'échantillon à l'état fondu.
- Introduction d'un laser d'excitation (488 nm) dans l'orifice arrière du microscope inversé
- Exécution de l'expérience
- L' optimisation des conditions expérimentales
- Ajuster la zone d'illumination de l'échantillon à environ 20 um de diamètre à l'aide du diaphragme inséré dans le trajet du faisceau d'excitation.
- Régler la puissance du laser d'excitation à l'échantillon à 4 - 8 MW en sélectionnant manuellement une densité neutre (ND), un filtre approprié inséré dans la trajectoire du faisceau d'excitation.
REMARQUE: Ceci permet d' obtenir la puissance laser moyenne de 1 - 2 cm -2 kW à l'échantillon. - images de fluorescence d'enregistrement de l'échantillon aux taux de 100 cadres - 200 Hz. Si l'intensité de fluorescence obtenue à partir des polymères de fluorophores incorporés individuels est trop faible, augmenter progressivement la puissance d'excitation utilisant ee filtre ND jusqu'à atteindre environ 100 mW à l'échantillon.
- Si la qualité de l'image de fluorescence de molécule unique est toujours pas satisfaisante, vérifier les impuretés de fluorescence dans l'échantillon en enregistrant des images de fluorescence d'une masse fondue pure du poly non marqué (THF). Dans le cas où un fond de fluorescence élevée est observée, utiliser différents poly non marqué (THF).
- Si la densité de la tache de fluorescence obtenue à partir des polymères de fluorophores incorporés dans la masse fondue est trop élevée pour isoler spatialement eux (ce qui provoque des erreurs dans l'analyse du mouvement diffusif), diminuer la concentration des polymères de fluorophores incorporés dans l'échantillon jusqu'à spatialement endroits isolés sont observés.
- Si la densité de la tache de fluorescence obtenues à partir des polymères d'un fluorophore incorporé dans la masse fondue est trop faible (ce qui provoque un faible débit de l'expérience d'imagerie), d'augmenter la concentration des polymères fluorophore incorporé dans l'échantillon jusqu'à une approprdensité iate de la tache de fluorescence est atteint.
- Si les images de fluorescence obtenues à partir des polymères de fluorophores incorporés dans la masse fondue sont floues, augmenter les taux de l'acquisition d'imagerie de cadre.
NOTE: Cela nécessite souvent un retour sur investissement plus faible, typiquement 64 x 64 pixels.
- L' optimisation des conditions expérimentales
- Acquisition d'image
- Une fois que les conditions expérimentales sont optimisés, laisser l'échantillon monté sur la platine du microscope pendant une heure afin que l'échantillon atteint des conditions d'équilibre.
- Enregistrer 500 - 1000 images de fluorescence des séquences des polymères de fluorophores incorporés dans l'état de fusion à 100 - 200 taux de trame Hz. Si le format de fichier par défaut est pas TIFF, convertir toutes les séquences d'images au format TIFF.
4. Analyse de la Diffusive Mouvement
- Déplacement quadratique moyenne (MSD) Analyse
- Rogner les séquences d'images de fluorescence de telle sorteque chaque séquence d'image contient un polymère en utilisant la diffusion de logiciels de traitement unique et bien ciblé fluorophore incorporé image, par exemple ImageJ.
- Lorsque les séquences d'image rognée contiennent plus de 10 trames, diviser les séquences d'images en séquences multiples de telle sorte que chaque séquence est constituée de 10 trames.
- Déterminer les positions des molécules dans chacune des séquences d'images avec précision par ajustement gaussienne à deux dimensions des images.
- Déterminer le coefficient de diffusion (D) de molécules individuelles par déplacement (TMS) analyse quadratique moyenne des trajectoires de diffusion ( par exemple, des positions dépendant du temps de la molécule) , en utilisant une équation 20
où x i et y i sont les positions de la molécule dans le cadre de l' image i, et n désigne le numéro de l' image avec le laps de temps At de trame i. - Tracer les coefficients de diffusion dansun histogramme de fréquence.
NOTE: En règle générale, l'histogramme est construit à partir de plus de 100 molécules.
- Fonction de distribution cumulative (CDF) Analyse
NOTE: Un CDF, P (r 2, i Δ t) correspond à la probabilité cumulative de trouver les molécules diffusant dans un rayon r de l'origine après un certain laps de temps i ô t.- Calculer le déplacement carré se produisant pendant le temps des décalages 1Δt, 2Δt, ····, iΔt pour toutes les trajectoires de diffusion obtenues en 4.1.3.
NOTE: Ces calculs donnent total m i au carré-déplacements pour les décalages de iΔt. - Calculer le nombre des-déplacements au carré (l i) dans le total ensemble de données m i qui sont plus petites que r 2 à différents r 2 valeurs (0 <r2 <∞). Normalized l i vs r 2 parcelles correspondent à la CDF, P (r 2, iΔt).
- Calculer le déplacement carré se produisant pendant le temps des décalages 1Δt, 2Δt, ····, iΔt pour toutes les trajectoires de diffusion obtenues en 4.1.3.
- Analyse des CDFs avec des modèles de diffusion distincts
Remarque: Les CDFs obtenus sont montés par des modèles de diffusion distincts; l' homogénéité du modèle de diffusion, plusieurs modes de diffusion dans laquelle la distribution D est décrite par une gaussienne (Gaussian modèle simple), et de multiples modes de diffusion dans laquelle la distribution D est décrite par plusieurs gaussiennes (modèle gaussien multiple).- Dans le modèle de diffusion homogène, déterminer une dimension moyenne en ajustant la CDF en utilisant une équation 21
NOTE: Tout écart par rapport à l'équation suggère la diffusion hétérogène de la molécule. - Dans le modèle gaussien unique, de déterminer la distribution de probabilité de D décrite par une gaussienne (f (D)) en ajustant la FCD à l' aide 15
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où A, W, D et 0 sont l'amplitude, la largeur et le centre de la gaussienne. - Dans le modèle de Gauss double, de déterminer la distribution de probabilité du j - ième composante du D décrite par une gaussienne (f (D)) en ajustant la CDF en utilisant 14
où A j est la fraction de chaque composante de diffusion et α j, W j et D j 0 sont l'amplitude, la largeur et le centre de la j - ième composante du gaussienne.
- Dans le modèle de diffusion homogène, déterminer une dimension moyenne en ajustant la CDF en utilisant une équation 21
- Calcul de la probabilité théorique distrition du coefficient de diffusion
NOTE: Les distributions de probabilité de D se produisant en raison des erreurs statistiques (p (D) d D) sont calculés pour les différents modèles de diffusion; l' homogénéité du modèle de diffusion, plusieurs modes de diffusion dans laquelle la distribution D est décrite par une gaussienne (Gaussian modèle simple), et de multiples modes de diffusion dans laquelle la distribution D est décrite par plusieurs gaussiennes (modèle gaussien multiple).- Dans le modèle de diffusion homogène, calculer la distribution de probabilité statistique de D en utilisant une équation 22
où N est le nombre de points de données dans une trajectoire de diffusion (N = 10, voir 4.1.2), D 0 est le coefficient de diffusion moyen (déterminé par l'analyse CDF, voir 4.2.3.1), et D est le obtenue expérimentalement coefficient de diffusion pour une trajectoire individuelle. - dans leseul modèle de diffusion gaussienne, on calcule la répartition de la probabilité statistique de D en utilisant une équation 15
où f (D) désigne la distribution de probabilité de D déterminée par l'analyse CDF (voir 4.2.3.2), et D 0 est le coefficient de diffusion moyen (déterminé par l'analyse CDF, voir 4.2.3.2). - Dans la double modèle de diffusion gaussien, calculer la distribution de probabilité statistique de D en utilisant une équation 14
où f (D j) désigne la distribution de probabilité du j - ième composante D (D j) déterminée par l'analyse CDF (voir 4.2.3.3), D 0j est le coefficient de diffusion moyenne de la j - ième composante (déterminée par la CDF analyse, voir 4.2.3.3).
- Dans le modèle de diffusion homogène, calculer la distribution de probabilité statistique de D en utilisant une équation 22
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Representative Results
Le pérylène diimide-incorporé étoiles 4-armé et poly bicyclique en forme de 8 (THF) s ont été synthétisés en utilisant l'auto-assemblage électrostatique et fixation covalente (ESA-CF) processus (Figure 1, Figure 2). Une seule molécule des images de fluorescence Time-lapse ont été mesurées pour le 4-armé (Figure 3a) et en forme de 8 (Figure 3b) des polymères. Les images de fluorescence temps-lapse (Figure 3) montrent spatialement taches lumineuses et nettes isolées en raison de l'incorporation de la très fluorescentes fluorophore pérylène diimide 23 dans les chaînes. Les histogrammes de fréquence du coefficient de diffusion ont été calculées pour les quatre bras (figure 4a) et en forme de 8 (figure 4b) polymères par l'analyse de déplacement quadratique moyenne (MSD) des images time-lapse. Les calculs des parcelles MSD et CDFs sont effectuées en utilisant des routines écrites en MATLAB. Le raccorddes CDFs obtenues à partir des expériences est réalisée en utilisant un logiciel de traitement de données tel que Origin Pro. Les histogrammes de fréquence du coefficient de diffusion déterminé par l'analyse des TMS présentent des distributions larges (figure 4) , résultant à la fois de l'erreur statistique de l'analyse et de l' hétérogénéité de la diffusion. Les histogrammes de fréquence montrent des écarts clairs à partir du modèle de diffusion homogène (ligne verte dans la figure 4), ce qui démontre la diffusion hétérogène de molécules de polymère. 14 fonctions de distribution cumulative (CDF) ont été calculés pour les 4 bras (figure 5a) et 8 en forme (figure 5b) polymères et monté par le gaussienne unique (figure 5a) et double gaussienne modèles (figure 5b). Les distributions de probabilités statistiques du coefficient de diffusion ont été calculées pour les quatre bras (figure 4a) et en forme de 8 (figure 4b) pol ymers par la seule gaussienne, ou doubles modèles gaussiennes. La seule (figure 5a) et doubles (figure 5b) modèles gaussiennes correspondent aux CDFs obtenues expérimentalement bien. Ces résultats démontrent que la diffusion du polymère 4 armé est décrit par la large répartition du coefficient de diffusion, tandis que le polymère en forme de 8 présente deux modes de diffusion distinctes.
Figure 1. Voie de synthèse de poly pérylène diimide incorporé (THF) s. Voie de synthèse de (a) 4-armées des polymères en étoile et les polymères dicycliques (b) en forme de 8. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. Caractérisation des polymères synthétisés. Les spectres RMN (a) 4-armées des polymères en étoile et les polymères dicycliques (b) en forme de 8. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 (films). Simple fluorescence molécule imagerie du pérylène diimide incorporé poly (THF) s. Les images de fluorescence Time-lapse de (a) 4-armées des polymères en étoile et (b) 8 en forme de polymères bicycliques dans la masse fondue de poly non marqué linéaire (THF ). Barre d'échelle = 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir des films (a) et3 / "target =" Figure_3b_submit.mov _ blank "> (b).
Figure 4. Analyse MSD du pérylène diimide incorporé poly (THF) s de diffusion dans la masse fondue. Histogrammes de fréquence du coefficient de diffusion déterminé pour chaque (a) 4-armées des polymères en étoile et les polymères bicycliques (b) en forme de 8 dans la masse fondue de non-linéaire marqué par poly (THF). Les lignes pleines montrent théoriquement calculées les distributions de probabilité du coefficient de diffusion sur la base des trois modèles différents de diffusion; modèle homogène de diffusion (lignes vertes, voir 4.3.1), modèle unique gaussien (de redlines, voir 4.3.2), et le modèle gaussien double (ligne bleue, voir 4.3.3). 14 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Analyse CDF du pérylène diimide incorporé poly (THF) s de diffusion dans la masse fondue des fonctions de distribution cumulatives obtenues expérimentalement (iΔt = 7,5 à 75 msec). Sous la forme de 1-P pour (a) 4-armées des polymères en étoile et (b) en forme de 8 polymères bicycliques dans la masse fondue de poly linéaire non marqué (THF). Les lignes pointillées indiquent les raccords avec (a) des équations en 4.2.3.2 et (b) des équations dans 4.2.3.3. 14 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les polymères armés 4 et 8 en forme ont été préparés par le protocole ESA-CF (figure 1), ce qui constitue une étape critique pour la synthèse. 12,24 monofonctionnel et bifonctionnel poly linéaire (THF) s avec des groupes N - terminaux sont -phenylpiperidinium synthétisé selon la procédure précédente. 11 l'échange d'ions a été effectuée par reprécipitation d'une solution d'acétone d'un précurseur de polymère avec des contre - anions triflates dans une solution aqueuse contenant une quantité en excès de carboxylate.
La conversion covalente du produit d'échange d'ions pour les polymères armés 4 étoile a été effectuée dans du toluène (4,9 g / L) au reflux pendant 4 heures. Si la conversion ne suffit pas, prolonger le temps de réaction. Le produit lié de manière covalente a été obtenu par Chromatographie sur colonne de gel de silice avec un mélange acétone / n - hexane et reprécipitation dans l' eau. 1 H - RMN des polymères armés 4 est représentée sur la figure 2a. Thiprocédure s ESA-CF permet la synthèse efficace des polymères cycliques. Cependant, ce protocole est limité à des polymères ayant des groupes terminaux cycliques onium.
Pour le produit polymère en forme de 8, la réaction a été effectuée dans du toluène en dilution (0,2 g / L) au reflux pendant 4 heures et a donné lieu à la formation d'une grande partie d'une fraction insoluble, vraisemblablement en raison de la intermoléculaire des produits mis en réaction. Une partie soluble a été reprécipité dans du n - hexane, soumis à une Chromatographie sur colonne de gel de silice avec un mélange acétone / n - hexane et on l'a reprécipité dans l' eau. Le produit brut obtenu a été soumis à une Chromatographie sur colonne d'exclusion de taille des billes et à recycler GPC pour permettre l'isolement du produit polymère en forme de 8. RMN 1 H des polymères en forme de 8 est représentée sur la figure 2b. Ce protocole ESA-CF peut être applicable à d'autres polymères topologiques complexes.
Les images de fluorescence de haute qualité sont essential pour l'analyse précise du mouvement diffusif des molécules. Les images de fluorescence sont considérablement détériorées lorsque 1) les impuretés de fluorescence sont présents dans l'échantillon, 2) le rendement quantique de fluorescence d'un fluorophore incorporé est faible, et 3) le taux de formation d'image de trame est plus lent que le mouvement diffusif des molécules de polymère. Réglage de la température au-dessous de la température ambiante (20 ° C) ou au-dessus de 37 ° C entraîne une désadaptation de l'indice de réfraction, qui sera également détériorer la qualité des images de fluorescence enregistrées. À l'aide d'un filtre passe-bande à bande étroite d'émission monté sur un cube de filtre améliore quelque temps la qualité de l'image de fluorescence. Depuis le temps d'exposition de la caméra EM-CCD utilisé dans l'expérience d'imagerie est généralement limitée à quelques millisecondes, le mouvement diffusif plus rapide que cette échelle de temps ne peut pas être capturé par cette méthode.
L'évaluation de l'effet de l'erreur statistique dans l'analyse MSD est l'étape critique for la caractérisation de la diffusion hétérogène. L'erreur statistique doit être soigneusement évaluée en calculant la distribution de probabilité du coefficient de diffusion en utilisant le modèle de diffusion 22 homogène avant de discuter de la diffusion hétérogène. La diffusion hétérogène doit aussi être évaluée avec soin par l'analyse CDF. Lorsque les CDFs montrent des déviations claires à partir du modèle de diffusion homogène (ie, la courbe de décomposition unique exponentielle), ce qui suggère la présence de diffuser plusieurs composants. La caractérisation quantitative de la diffusion hétérogène nécessite combiné MSD, CDF, et analyse la distribution de probabilité. 14,15
La dynamique des polymères, y compris un mouvement diffusif, a été décrite comme valeurs de moyenne d' ensemble, dans les procédés classiques tels que la RMN, la diffusion de lumière 7, 8 et les mesures de viscosité. 9 En effet, le mouvement diffusif hétérogène révélé par la tête du comimagerie e-molécule 16 est souvent très difficile à détecter dans les méthodes d'ensemble moyenné. Compte tenu de la nature hétérogène inhérente des polymères, 25-27 la méthode décrite dans ce protocole ne se limite pas à la caractérisation des polymères topologiques, mais est applicable à tous les types de polymères dans des conditions intriqués. 28 En outre, l'approche rapportée dans ce protocole trouvera une large application dans l'analyse de la diffusion dans les systèmes hétérogènes complexes, tels que la diffusion moléculaire à travers des matériaux mésoporeux. 29
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| THF | Godo | ||
| Wakosil C-300 | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Acetone | Godo | ||
| Toluene | Godo | ||
| n-Hexane | Godo | ||
| CHCl3 | Kanto Chemical | ||
| Bio-Beads S-X1 | Bio-Rad | ||
| Methyl triflate | Nacalai Tesque | ||
| Triflic anhydride | Nacalai Tesque | ||
| Potassium Hydroxide | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Ethanol | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Poly(tetrahydrofuran) | Aldrich | ||
| Chloroform | Wako Pure Chemical Industries | ||
| Immersion oil | Cargille | Type 37 / Type A | |
| Equipment | |||
| 2-Neck 100-ml round-bottom flask | |||
| Flask | |||
| Beaker | |||
| Funnel | |||
| Filter paper | Whatman | ||
| Reflux condenser | |||
| Syringe | |||
| Water bath | |||
| Magnetic stirrer | |||
| Rotary evaporator | |||
| Microscope cover slips (24 x 24 mm, No. 1) | Matsunami Glass | CO22241 | |
| Staining jar | AS ONE Corporation | 1-7934-01 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 142-0047 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Ar-Kr ion laser | Coherent | Innova 70C | |
| Berek compensator | Newport | 5540 | |
| Excitation filter | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Dichloric mirror | Omega optical | 500DRLP | |
| Emission filter | Semrock | BLP01-488R-25 | |
| Lens and mirror | Thorlabs | ||
| EM-CCD camera | Andor Technology | iXon | |
| Objective lens (100X, N.A. = 1.3) | Olympus | UPLFLN 100XOP | |
| Objective heater | Bioptechs | ||
| Preparative GPC | Japan Analytical Industry | LC-908 |
References
- Honda, S., Yamamoto, T., Tezuka, Y. Topology-Directed Control on Thermal Stability: Micelles Formed from Linear and Cyclized Amphiphilic Block Copolymers. J. Am. Chem. Soc. 132 (30), 10251-10253 (2010).
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