Introduction
Nonarteritic前部虚血性視神経症（NAION）が1（ON）視神経の前方部分の焦点虚血性病変です。 NAIONは、機構が神経内の浮腫につながるコンパートメント症候群であると考えられる。50 2歳以上の個人の突然の視神経関連失明の最も一般的な原因であり、視神経内の軸索を供給する毛細血管の圧迫を引き起こします3。
ONは、実際に、中枢神経系（CNS）管であることから、齧歯類NAION（rNAION）モデルは、単離されたCNS白質ストロークの機構および応答を研究するために使用することができます。 rNAIONモデルは、したがって、白質に脳卒中に関連する損傷に関連した多くの問題を解剖するのに有用であり得ます。白質行程で異なる神経保護戦略と薬剤を評価するために使用することができます。
モデルの中で最も魅力的な特徴の一つは、それがあるということです無痛、非侵襲的な手順。レーザー出力は、虚血性損傷の種々の程度を生成するように調整することができます。別の特徴は、進行性の毛細管機能不全を生成、毛細血管内皮を損傷するレーザー誘起スーパーオキシドラジカルに依存することです。それはNAIONを引き起こすメカニズムと非常に類似していると考えられているこの機能障害および進行性の浮腫です。研究は、それが直接の毛細管凝固を起こさないことを示したが、少なくとも二つのメカニズムを介して動作している：毛細血管内皮細胞の一部4のスーパーオキシド誘導死とストリッピング、およびNFkBの（核因子カッパ軽鎖-エンハンサー活性化B細胞の間質5に細胞膜を横切る流体輸送を増加して）、内皮の残りにまで炎症レギュレーションに関連。視神経乳頭虚血における間質液の蓄積結果に起因する視神経の毛細血管および圧縮の閉鎖。模式画像がに示されています図2。rNAIONモデルは両方ラットおよびマウス種6,7で使用することができ、軽度病変から視神経と網膜の完全な、しかし痛み破壊する、その重症度のレベルに変化させることができる、そのような網膜中心動脈閉塞（CRAO）など。
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Protocol
このプロトコルは、メリーランド大学の施設内動物管理及び利用委員会（ボルチモア、MD、USA IACUC）によって承認されました
1.実験の設定
- 3ミリメートルの厚さの直径プレキシグラスで明確な光学グレード円形7ミリメートル、からカスタム設計されたコンタクトレンズを作ります。ドリルプレスの円形レンズをカットします。内側の曲線を作るために、標準のドリルビットを使用し、最終的には超微細グリット（3000分の1000）のコンタクトレンズ研磨機を使用して、外側と内側のカーブを磨きます。
- 事前にpH7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に2.5 mMのローズベンガル（RB）を準備し、フィルタまでの6ヶ月間、光を通さない容器に-20℃で0.45ミクロンのシリンジフィルターと店舗1ミリリットルのアリコートで滅菌します。
注：このようなスプラーグドーリーなどのアルビノの非近交系雄の動物の使用は、ひずみ依存性応答の違いを最小限に誘導の増加使いやすさを可能にし、発情cycliで発生する可能性が変動性を減少させますngの女性。 - 周波数を設定しネオジムイットリウム・アルミニウム・ガーネット（FD-YAG）532 nmのレーザー光を発生する眼科医療レーザーを、倍増しました。標準的な眼科用レーザーアダプタを使用して、ハーグ・シュトライト眼科スリットランプ上にレーザをマウントします。この市販の装置は、動物の眼とレーザスポットアプリケーションの同時可視化を可能にします。医療レーザーは、レーザー誘導と同じスポットサイズを使用して焦点を当て、適切および中心のための照準ビームを持っています。次のようにレーザパワーパラメータは次のとおりです。
- ラットrNAIONの誘導のために：500μmのスポットサイズ/ 50mWのレーザパワー/千ミリ秒の持続時間/千ミリ秒間隔を使用します。
- マウスrNAION誘導のため：小さい視神経乳頭のために300μmのスポットサイズを変更し、ラットの設定と同じ他のパラメータを残します。
- 日常的にレーザー出力を保証するために、レーザーパワーメーターを使用。
2.実験方法
- レーザーパワーをオンにしますそして、適切なレーザーパラメータを設定します。使用前に少なくとも5分間レーザーを温めます。
- ケタミン/キシラジンおよびRB色素に対する適切な用量を決定するために動物を秤量します。 80 mg / mlでケタミンおよび4 mg / mlとキシラジンを1ml / kgの混合物の腹腔内注射によって動物を麻酔。
- 完全に麻酔になるまで加熱されたケージに動物を残します。嫌悪刺激（尾や足指のピンチ）への応答がないか確認してください。麻酔の深さごとに10分のために動物をチェックしてください。
- 1％トロピカミドで動物の瞳孔を拡張し、0.5％のプロパラカインと眼の表面を麻酔。このようなロング・エヴァンスなどの着色された動物を、使用している場合は、2.5％neosynephrine眼滴が瞳孔拡張が増加します。
- ビューをブロックしないようするように誘導される側の銃口に近いウィスカーをカットするはさみを使用してください。
- 1％メチルセルロースまたはカスタムメイドコンタクトレンズの内側に他の眼科用カップリングドロップのドロップを入れて、[トンの上にレンズを適用ラットの目を彼。
- スリットランプの高さに調節プラットフォーム上で動物を置きます。眼は、スリットランプ、レーザービームに対して垂直になるように45°の角度で、動物の頭を設定します。
- 眼科スリットランプを通して目を可視化します。照準ビームは、右のサイズだけでなく、集中して可視化視神経に直接中心にあることを確認します。特注のアダプタを使用してスリットランプの目の作品の一つに搭載された高速 - 高ASA（2000 1200）でデジタルカメラを使用して眼底を撮影。
注：脈絡膜血管を見る能力が網膜の透明性を明らかにする。これが発生した場合の解釈を混乱することができ、後に網膜虚血を検出することができるようにするために重要な兆候です。 rNAIONは、網膜損傷における網膜虚血の結果は、内網膜層の細胞のすべてに影響を与えながら、孤立したRGCの損失をもたらす視神経虚血、です。 - 必要に応じて、さらに画像網膜と非誘導の目を評価するために、スペクトルドメイン光コヒーレンス断層撮影（SD-10月8日）を使用して視神経。網膜（ 図3C）を介して、 面 （ 図3B）、ならびに7断面スキャンエンスキャンします。 SD-OCT画像化は、レーザー誘導のために使用される同一のコンタクトレンズを使用します。
- 1ml /尾静脈を介してキロRBを注入し、30秒間、次いで、レーザーパワーをアクティブに待機。この遅延時間は、循環全体に均等に分配するためにRBを可能にします。私たちは、1秒/パルスで50mWのレーザーパルスを使用しています。グレーターエネルギー（≥60 MW）は、網膜を損傷したり、網膜血管虚血を引き起こす可能性があります。
注意：誰もが研究者の目に入る迷光レーザ光を防止するために、適切な遮断波長のレーザー安全フィルタリング眼鏡を持っていることを確認します。
注：染料は循環から迅速に除去されるので、レーザーの管理は、IV RB注射後急速に与えられなければなりません。長いレーザー誘導、より深刻な視神経虚血。立て続けに12秒のパルス - 一般に、動物を7が与えられます。循環色素レーザ光の接触は、視神経血管にスリットランプ（ 図4B）を通して見ることができる美しい金色の輝きを与えます。これは、染料が全身に注入し、血流中に分布していたことを証明します。グローはかすかな、または全くなし（ 図4A）である場合、色素が静脈内に注射されませんでした。動物が再注入する前に、少なくとも2日間回復する必要がありますので、この場合には、すぐに二回目の注射を与えることはありません。 - すぐに誘導した後、コンタクトレンズを取り外してください。デキサメタゾンと眼科トリプル抗生物質（ネオスポリン/ポリミキシン/バシトラシン）軟膏で両目を覆い、完全に回復するまで近い観察下で、単一の収容されたケージ内の37℃の加温パッドの上に動物を配置します。
- 蒸留ワットでコンタクトレンズを清掃してくださいATERは、将来の使用のための非研磨洗浄布で水分を拭き取ります。
- 誘導後の二日は、眼底のカラー写真とSD-OCT分析8の両方によって視神経浮腫を評価します。
注：視神経浮腫の程度を比較するとは、視神経虚血の重症度の推定を与えます。 2日目に、視神経ディスクマージンがぼやけて、網膜静脈はやや反対側（非誘導）目と比較して、拡張されています。電図（ERG）を実行し、2と4週目に視覚誘発電位（VEP 11）を点滅電気生理学解析のための誘導を投稿してください。
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Representative Results
コンタクトレンズ有効中心網膜の視覚化（ 図1）。焦点レーザスポットは、網膜の奥の視神経乳頭（ 図2）を照射します。通常の非誘導網膜は細隙灯生体顕微鏡（ 図3A）によって、およびSD-OCT（ 図3Bおよび3C）によって撮像示されています。全く色素が循環中に存在しない場合、レーザー誘導中、レーザ光は、容器と、ディスク蛍光（ 図4A）をもたらしません。静脈内RBおよび視神経（ 図4B）に黄金色の蛍光の光学ディスクの結果について、レーザー光の照射。 rNAION誘導2日後、視神経は（ 図 5A）の腫れである。 エン面と断面SD-OCTディスク腫脹（ 図5B）および視神経（ 図5C）の拡大を明らかにしました。
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ラット平凹レンズコンタクトレンズの図1の回路図。特注のコンタクトレンズは、外径7ミリメートル、内径5 mmの3mmのプレキシガラス（設計が示されている）、から構成されています。このレンズは、ラットの眼の角膜上に適合し、網膜の直接可視化を可能にするように設計されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2。rNAION モデルの概略図。目の奥を通る縦断面図。レーザスポットは、視神経乳頭（緑の矢印）の中央に配置されます。緑色セルと軸索は網膜神経節細胞ニューロンを表します。直後に静脈内RB ADMInistrationは、RBは、眼および視神経の奥に血管系を循環します。所望虚血性重症度に応じて12秒 - レーザービームは7ディスクを照明するために使用されます。オンヘッドから出てくる大きい網膜血管を温存しながら、レーザーは、頭の上に前方に毛細血管の閉鎖を引き起こす光増感RBスーパーオキシドラジカルを生成するために、（小さな赤いラインの損失として神経の左側に見られる軸索虚血）を活性化眼内へ。局所的虚血は、局所的な軸索機能不全（一戸建て緑色の線）を生成します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. ベースラインの正常網膜（RET）とカラー写真とSD-OCTを用いた視神経（ON）の分析。 A.ピクチャー 。網膜血管が網膜の内側の層を供給するために視神経乳頭から出現します。ディスクは、明確な境界線と赤みを帯びた周囲の色相（脈絡膜フラッシュを）持っています。網膜血管は細く均一に分布しています。視神経ディスクマージンは、通常よくrNAION誘導の前に画定されています。通常の眼底のB.画像を顔 SD-OCTイメージングエンによって。パネルCに示す網膜の個々の断面画像は、緑色のボックスの中から生成されています。スキャン方向は緑の矢印で示されている。網膜層を示す正常な網膜や視神経乳頭のC.シングルSD-OCT断面スキャンを。網膜神経線維層（RNFL、小さな白い矢印）は灰色がかった外観を持っていますが、根底にある外核層（ONL、小さな白い矢印）よりも軽いです。 RNFLは、視神経に対して平坦です。視神経影は（指示狭いです 2矢印により、D）。 ON：視神経。 RNFL：網膜神経節細胞/神経線維層。 ONL：外顆粒層。スケールバー：200μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4. rNAION誘導全身RB注入なしの視神経円板と網膜の外観。A.波長532nm / 500μmのスポットレーザー照射。視神経円板と網膜は暗いです。B. 532 nmのレーザー照射全身RB注入後30秒。 ONは、緑色レーザ光が照射血流に全身RBを示し、レーザースポット部位でディスクから出る血管内金色の輝きを示します。グラム "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. rNAION誘導。A.カラー眼底画像は、周囲の脈絡膜フラッシュの損失で、腫れや視神経乳頭蒼白ON示して2日後に網膜や視神経分析 。静脈は通常、箱入り（中断フロー）静脈で時々 、拡大して湾曲している。B. エン面 SD-OCT画像誘導後は、ディスクの浮腫や静脈拡張を示しています。個々の断面は、緑色のボックス内で生成されます。スキャン方向は緑の矢印で示されています。 （以上、白より高い水分含有量と一致して）RNFLの厚みの増加によって証明されるとグレーの強度を低下させたとしてC.クロスセクションでは、ディスク浮腫ON示しています。 BLとの間に示された網膜内ONの直径（ackの矢印）。増加させ、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
視神経損傷（視神経挫滅12、視神経離断13、及びパイオン14）のモデルの数がありますが、rNAIONモデルは、ラットとマウスの両方に適応人道的です。これは、より密接NAIONのヒト臨床症状に似ています。この条件は、プログレッシブ前方視神経浮腫、前視神経コンパートメント症候群、焦点軸索虚血、長時間経過にわたって孤立した網膜神経節細胞の軸索損傷および損失が含まれています。現在のレポートは、rNAION誘導のための適切な手順を与える誘導の間に潜在的な問題について説明し、説明した後早期誘導は前のデータを含めるに誘導された病変の品質を評価するために使用することができる分析します。 rNAIONモデルの利点は、実際と、損傷の比較的一定のレベルを達成することができるということです。典型的には10 - 65％のRGC喪失 - 40で11秒露光結果。成功率は、個体から個体へデに変えることができます経験やスキルに保留中が、経験豊富な研究者はほぼ100％の誘導率を達成することができます。
誘導が容易に加えて、病変の重症度と経過時間を容易に監視することができます。利点をモデル化するために追加することができrNAIONモデル、品質管理の重要な初期の部分は、初期の誘導後の分析です。視神経浮腫が最大であるとき、私たちは通常、2日誘導後、動物を評価します。 rNAIONは視神経蒼白と分離された網膜神経節細胞の損失に続いて5日間の期間（約5回、ヒトに発生するよりも速い）、上で解決視神経浮腫によって特徴づけられます。一つは、網膜の網膜透明性と美白の喪失により（視神経虚血と区別など）網膜虚血を識別することができます。網膜虚血は、機能電図（ERG）と内網膜シグナルの損失によって確認されます。網膜透明と白の広範な損失が存在する場合網膜の寧、それは網膜中心静脈閉塞と一致して、単独でrNAIONない拡散網膜虚血を示唆しています。 （断面または合計網膜白化によって特徴付けられる）動物の数の重症網膜虚血で誘導をもたらす場合には、誘導パラメータは、1〜2秒の露光時間を低減することができます。この方法では、1は、視神経損傷の程度の両方を最適化し、動物で誘導の一貫性を得ることができます。 ERG信号の重大な損失を有する動物は研究から排除されるべきです。視神経機能の単離された損失は、フラッシュ視覚誘発電位測定（VEP）により確認することができます。
rNAIONモデルを使用する場合に留意すべき変数の数があります。複数の動物が神経保護アッセイにおいて使用される必要があるように、個々の動物は、病変の全体的な重症度で異なることができ、電力解析は、STAを達成するために必要な動物の最小数を決定するために実行されるべきですより緩やかな保護効果が見られたり予測され、特にtistically有効な結果、。 15匹のラットに25％のRGC保護効果を決定するために必要であり、15 - - 私たちは、10ということを発見したマウスは、20匹の動物を使用した場合。誘導に使用されるRB色素が急速に除去されるので、動物が注入されると、変動性はまた、誘導を実行するのに必要な時間の速度に依存し得ます。わずかな視神経乳頭に焦点上の違い、レーザ照明の角度の違い、および誘導の速度差も結果に影響を与えることができます。一つ専用個体はさらに変動を低減するために、各実験室での技術を実行するために選択されるべきです。大体10 - 誘発された動物の15％が原因で誘導（中央または網膜静脈分枝閉塞）の重症度に初期の誘導後の評価後に除去する必要があるかもしれません。このレポートでは、このような性差からのような結果に影響を与える可能性がある無数の他の固有の変数を、説明しません。概日リズム、年齢や歪みの違い。これらの質問は、個々の研究者が満たさなければなりません。このような80 mWのレーザパワー15として最近報告された他の修飾されたパラメータ設定は、あります。これらの修飾は、異なるコンタクトレンズやレーザー波長を用いるが、同様の結果が得られました。
臨床NAIONの多くの側面にrNAIONの類似性にもかかわらず、rNAIONがモデルであることを認識することが重要であり、NAIONの実際の原因因子が不明であるため、何のモデルは、ヒト疾患の完全な複製ではなく、血管および炎症げっ歯類の網膜や視神経の生理学的制御は、ヒトおよび非ヒト霊長類から多くの点で異なっています。モデルによって生成された知見は、これらの違いに照らして解釈される必要があります。これに関係なく、rNAIONモデルが急速に視力低下やアプローチを担う潜在的な病態生理学的メカニズムの多くを解剖する貴重な方法であります生きている哺乳動物系における神経保護に。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、その有効性を改善するために、そのメカニズムを理解するために、このモデルに働いている多くの学生や仲間に感謝します。特別な感謝は、博士のによるものです。メアリー・ジョンソン（メリーランド州バルチモアの大学）、Nitzaゴールデン・コーエン（シュナイダーマン小児病院、Petah-Tikva、イスラエル）、チャールズチャン（アインシュタイン医科大学、ブロンクス、NY）、およびヴァレリーTouitou（Hopital Salpetrie、パリ、フランス）。この研究は、SLBにRO1 EY015304によって部分的に資金を供給されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mW 532 nm laser | Iridex | Standard Ophthalmic Laser | |
| 0 - 100 mW 532 nm laser | Laserglow technologies | Substitute for iridex | |
| Laser slit lamp adapter | Iridex | SMA coupled adapter for laser output | |
| Coherent Fieldmate laser meter with thermopile sensor | Coherent | others also appropriate | |
| Ophthalmic Examing Slit lamp biomicroscope | Various | Haag-Streit is the best; cheaper versions available on ebay | |
| Rose Bengal | Sigma | 330000-1G | Photoinducing agent |
| Fundus Contact lens or glass cover slip | custom/Cantor and Nissel (UK) | Custom designed planoconvex plastic lens for eye exam and induction | |
| Tropicamide 1% | |||
| Tamiya polishing compound | Tamiya, INC | 87068 | polishing contact lens |
| 2.5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose | HUB Pharmaceuticals | contact lens coupling agent | |
| 2.5% Neosynephrine Ophthalmic drops | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| Tropicamide 1% | Alcon labs | pupil dilating agent | |
| 0.5% Proparacaine | Alcon labs | topical Anesthetic | |
| 30 G fused needle insulin syringe | Various | Various | for intravenous injection of rose bengal |
| Ophthamic Antibiotic ointment with dexamethasone added (Triple antibiotic ointment) | Various | Various | Apply after induciton to minimize corneal scarring |
| Heidelberg Corporation Spectral domain-Optical Coherence Tomograph | Heidelberg Corporation | For Optical coherence measurements baseline and post-induction; not essential for induction |
References
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