Le modèle Rongeur de non-artéritique neuropathie optique ischémique antérieure (de rNAION)

Introduction

Antérieure non - artéritique neuropathie optique ischémique (NOIAN) est une lésion ischémique focal de la partie antérieure du nerf optique (ON) ^1. NOIAN est la cause la plus fréquente de soudaine nerf optique perte de vision liée chez les personnes âgées de plus de 50 ^2. Le mécanisme est considéré comme un syndrome du compartiment qui se traduit par un œdème intraneurale, et provoque une compression des capillaires alimentant les axones dans le nerf optique ^3.

Depuis l'ON est en fait un système nerveux (CNS) tractus central, le NOIAN rongeur (rNAION) modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes et les réponses aux isolés du SNC substance blanche coups. Le modèle rNAION peut donc être utile à disséquer de nombreux problèmes associés à l'AVC dommages liés à la substance blanche. Il peut être utilisé pour évaluer les différentes stratégies et agents neuroprotecteurs en blanc coup de matière.

L'une des caractéristiques les plus attrayantes du modèle est qu'il est, Une procédure non invasive indolore. La puissance du laser peut être ajusté pour produire divers degrés d'altération ischémique. Une autre caractéristique est qu'il repose sur les radicaux superoxydes laser induit endommager l'endothélium capillaire, produisant un dysfonctionnement capillaire progressive. Il est ce dysfonctionnement et progressive oedème qui est censé être remarquablement similaire au mécanisme qui provoque NOIAN. La recherche a montré qu'il ne provoque pas la coagulation capillaire directe, mais fonctionne à travers au moins deux mécanismes: superoxyde mort induite et le décapage d'une partie du capillaire des cellules endothéliales ⁴ et NFkB (facteur nucléaire kappa-chaîne légère-activateur des cellules B activées ) associée à la régulation inflammatoire dans l' endothélium restante, avec une augmentation du transport du fluide à travers les membranes cellulaires dans l'interstitium ^5. La fermeture des capillaires du nerf optique et la compression causées par la suite de l'accumulation de liquide interstitiel dans la tête du nerf optique ischémie. Une image schématique est représenté dansLa figure 2. Le modèle rNAION peut être utilisé dans les deux espèces de rats et de souris ^6,7, et on peut faire varier le niveau de sa gravité, d'une lésion bénigne à une destruction complète, mais sans douleur du nerf optique et la rétine, par exemple comme l'occlusion de l'artère centrale de la rétine (CRAO).

Protocol

Ce protocole a été approuvé par l'Université du Maryland Comité d'utilisation des institutions de protection des animaux et (IACUC, Baltimore, MD, USA)

1. Experimental Set-up

1. Faire une coutume conçue lentilles de contact à partir d'une qualité optique claire circulaire de 7 mm de diamètre en plexiglas, d'une épaisseur de 3 mm. Couper les lentilles circulaires avec une perceuse à colonne. Utilisez un foret standard pour rendre la courbe intérieure, et enfin polir les courbes extérieures et intérieures à l'aide d'un polissoir de lentilles de contact des grains ultrafine (1000/3000).
2. Préparer 2,5 mM Rose Bengale (RB) de pH 7,4 tampon phosphate salin (PBS) à l'avance, le filtre stériliser avec un filtre à seringue de 0,45 micron et stocker 1 ml aliquotes à -20 ° C dans un récipient étanche à la lumière pour un maximum de 6 mois.
   NOTE: L'utilisation d'animaux mâles consanguines albinos, tels que Sprague Dawley minimise les différences de réponse dépendant des souche, permet une facilité accrue de l'induction et réduit la variabilité qui peut se produire avec oestrus cycling femelle.
3. Mettre en place la fréquence doublée néodyme-grenat d'yttrium aluminium (Fd-YAG) du laser médical ophtalmique, qui génère une lumière laser de 532 nm. Monter le laser sur une lampe à fente ophtalmique Haag-Streit en utilisant un adaptateur laser ophtalmique standard. Ce dispositif disponible dans le commerce permet la visualisation simultanée de l'application localisée des yeux et laser de l'animal. Le laser médical a également un faisceau de visée pour la focalisation et centration appropriée en utilisant même taille de la tache que l'induction laser. les paramètres de puissance de laser sont les suivants:
   1. Pour rat rNAION induction: utiliser 500 um tache de taille / 50 laser mW / 1000 msec / 1000 intervalle msec.
   2. Pour la souris rNAION induction: changer la taille de la tache à 300 um pour les plus petits disque optique et de laisser d'autres paramètres le même que le réglage du rat.
   3. utiliser systématiquement un dispositif de mesure de puissance laser pour assurer la puissance de sortie du laser.

2. Procédure expérimentale

1. Allumez la puissance du laseret mettre en place le paramètre laser approprié. Chauffer le laser pendant au moins cinq minutes avant utilisation.
2. Peser l'animal pour déterminer la dose appropriée pour la kétamine / xylazine et RB colorant. Anesthésier l'animal par injection intraperitoneale de 1 ml / kg de mélange de 80 mg / ml de kétamine et 4 mg / ml de xylazine.
3. Laissez l'animal dans une cage chauffée jusqu'à entièrement anesthésié. Vérifiez aucune réponse à des stimuli aversifs (queue ou d'un orteil pincement). Vérifier les animaux pour la profondeur de l'anesthésie toutes les 10 min.
4. Dilater les élèves de l'animal avec 1% tropicamide et anesthésier la surface de l'œil avec 0,5% proparacaine. Si l'utilisation d'animaux pigmentés, tels que Long Evans, 2,5% des gouttes oculaires néosynéphrine va augmenter la dilatation des pupilles.
5. Utilisez des ciseaux pour couper les moustaches à proximité de la bouche sur le côté pour être incités à ne pas bloquer la vue.
6. Mettre une goutte de 1% de méthylcellulose ou d'une autre goutte de couplage ophtalmique à l'intérieur de la lentille de contact sur mesure, et ensuite appliquer la lentille sur til oeil de rat.
7. Placer l'animal sur une plate-forme adaptée à la hauteur de la lampe à fente. Fixer la tête de l'animal à un angle de 45 °, de sorte que l'oeil est perpendiculaire à la lampe à fente et le faisceau laser.
8. Visualisez l'oeil à travers la lampe à fente ophtalmique. Assurez-vous que le faisceau de visée est la bonne taille ainsi que ciblée et centrée directement sur le nerf optique visualisé. Photographie du fond de la rétine à l'aide d'un appareil photo numérique à haute ASA (1200 - 2000) vitesse monté sur l'une des pièces de l'oeil de la lampe à fente avec un adaptateur personnalisé.
   REMARQUE: La capacité de voir les vaisseaux choroïdiens révèle la transparence de la rétine. Ceci est un signe important afin d'être en mesure de détecter l'ischémie rétinienne plus tard, ce qui peut confondre l'interprétation si elle se produit. rNAION est une ischémie du nerf optique, qui se traduit par une perte isolée RGC, alors que les résultats de l'ischémie rétinienne en dommages à la rétine qui affecte toutes les cellules des couches rétiniennes internes.
9. Eventuellement, autre image de la rétine etnerf optique à l' aide d' un domaine-optique spectrale cohérence tomographe (SD-OCT ⁸⁾ pour évaluer l'œil induit non. Numériser en face (figure 3B), ainsi que 7 scans en coupe à travers la rétine (figure 3C). Le SD-OCT imagerie utilise la même lentille de contact utilisée pour l'induction laser.
10. Injecter 1 ml / kg par voie intraveineuse RB par veine de la queue, et attendre pendant 30 secondes, puis d'activer la puissance du laser. Cette temporisation permet au BO de distribuer uniformément dans toute la circulation. Nous utilisons une impulsion laser de 50 mW à un sec / impulsion. énergies supérieures (≥ 60 mW) peuvent endommager la rétine ou de provoquer une ischémie vasculaire rétinienne.
    Attention: Assurez - vous que tout le monde a une paire de lunettes de filtrage de sécurité laser de la longueur d' onde de blocage approprié pour empêcher la lumière laser parasite entrant dans l'œil de l' enquêteur.
    REMARQUE: L'administration du laser doit être administré rapidement après l'injection IV RB étant donné que le colorant est rapidement éliminé de la circulation sanguine. Plus l'induction laser, le plus sévère du nerf optique ischémie. En général, les animaux sont donnés 7 - 12 impulsions par seconde dans une succession rapide. Le contact de la lumière laser avec le colorant circulant donne les vaisseaux du nerf optique une belle lueur d' or qui peut être vu à travers la lampe à fente (figure 4B). Cela prouve que le colorant a été injecté par voie systémique et distribué dans le flux sanguin. Si la lueur est faible, ou pas du tout (figure 4A), le colorant n'a pas été injecté par voie intraveineuse. Dans ce cas, ne pas donner une seconde injection immédiatement, puisque l'animal aura besoin de récupérer pendant au moins deux jours avant réinjection.
11. Immédiatement après l'induction, retirer la lentille de contact. Couvrir les deux yeux avec ophtalmique antibiotique triple (Neosporin / polymyxine / bacitracine) pommade avec la dexaméthasone, et placez l'animal sur un coussin chauffant à 37 ° C dans une seule cage logé sous observation jusqu'à ce que la récupération complète.
    1. Nettoyez la lentille de contact avec distillée water et essuyez avec un chiffon de nettoyage non abrasif pour une utilisation future.
    2. Deux jours après l'induction d' évaluer le nerf optique oedème à la fois par la photographie de fundus de couleur et SD-OCT analyse ^8.
       NOTE: En comparant le degré de nerf optique oedème donne une estimation de la gravité du nerf optique ischémie. A deux jours, la marge du nerf optique disque est floue, et les veines rétiniennes sont légèrement dilaté, par rapport à l'oeil (induite par non) controlatéral. Effectuer électrorétinogramme (ERG) et flash visuel potentiel évoqué (VEP ¹¹⁾ à deux et quatre semaines après l' induction pour l' analyse de l' électrophysiologie.

Representative Results

La visualisation des lentilles de contact activé centrale de la rétine (figure 1). Le spot laser focale illumine le disque optique à l'arrière de la rétine (figure 2). La rétine induite non normale est représentée en image par une lampe à fente bio-microscope (figure 3A) et par SD-OCT (figure 3B et 3C). Lors de l' induction par laser, en l' absence de colorant est présent dans la circulation, la lumière laser ne se traduit pas dans la cuve et la fluorescence de disque (figure 4A). RB intraveineux et la lumière laser d' éclairage sur les résultats de disque optique dans une fluorescence de couleur dorée sur le nerf optique (figure 4B). Deux jours après rNAION induction, le nerf optique est gonflé (figure 5A). En face et en coupe SD-OCT révèle disque gonflement (figure 5B) et l' expansion du nerf optique (figure 5C).

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Figure 1. Schéma du Rat planconcave Contact Lens. La coutume fait lentille de contact est fabriqué à partir de 3 Plexiglas mm (conception représentée), avec un diamètre externe de 7 mm, diamètre intérieur 5 mm. Cet objectif est conçu pour tenir sur la cornée de l'oeil de rat, et de permettre la visualisation directe de la rétine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Schéma de rNAION Modèle. De section longitudinale à travers le fond de l'œil. Le spot laser est centrée sur le disque optique (flèches vertes). La cellule verte et représente un axone du neurone de cellules ganglionnaires de la rétine. Immédiatement après intraveineuse RB administration, le RB circule à travers le système vasculaire à l'arrière de l'œil et le nerf optique. Le faisceau laser est utilisé pour illuminer le disque pendant 7-12 secondes en fonction de la gravité ischémique souhaitée. Le laser active le RB photosensibilisant pour générer des radicaux superoxydes, ce qui provoque la fermeture capillaire dans la partie antérieure sur la tête (ischémie axonale, vu sur le côté gauche du nerf que la perte de petites lignes rouges) tout en épargnant les vaisseaux intrarétiniennes grands émergents de la tête ON dans l'oeil. L'ischémie focale produit dysfonction axonale localisée (ligne verte détaché). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Baseline normale Retina (RET) et Optic Nerve (ON) Analyse en utilisant Photographie couleur et SD-octobre A. Image d'un rat Sprague-Dawley fundus rétinienne normale par lampe à fente fundus photographie. Les vaisseaux de la rétine sortent du disque optique pour fournir les couches internes de la rétine. Le disque a une frontière claire et une teinte rougeâtre entourant la teinte (flush choroïde). Les vaisseaux rétiniens sont minces et uniformément répartie. La marge nerf optique disque est généralement bien délimité avant rNAION induction. B. Image d'une fundus normale de face SD-OCT imagerie. images transversales individuelles de la rétine montré dans le panneau C sont générés à partir de la boîte verte. Direction de balayage est indiquée par une flèche verte. Section C. Simple SD-OCT cross scan de la rétine normale et disque optique montrant les couches de la rétine. La couche rétinienne des fibres nerveuses (CFNR, petite flèche blanche) a un look gris, mais est plus légère que la couche sous-jacente extérieure nucléaire (ONL, petite flèche blanche). La CFNR est à plat contre le nerf optique. L'ombre du nerf optique est étroit (indiquer d par deux flèches). ON: nerf optique. CFNR: ganglionnaires de la rétine couche de fibres / cellules nerveuses. ONL: couche nucléaire externe. Barre d' échelle:. 200 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. rNAION Induction Apparence. A. 532 nm / 500 um tache illumination laser du disque du nerf optique et de la rétine sans injection systémique de RB. Le disque du nerf optique et de la rétine sont sombres. B. 532 nm illumination laser 30 sec après l' injection systémique de RB. L'ON montre une lueur dorée dans les vaisseaux émergents à partir du disque sur le site du spot laser, ce qui indique RB systémique dans le flux sanguin éclairé par la lumière laser vert.g "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. rétinienne et Optic Nerve Analyse de 2 jours après rNAION Induction. A. Couleur image rétinienne montre sur le gonflement et le disque optique pâleur, avec la perte de la chasse choroïde environnante. Les veines sont généralement agrandies et courbes, parfois avec en boîte (flux interrompu) veines. B. En face SD-OCT image post-induction montre un œdème du disque et la dilatation veineuse. section individuelle est générée à partir de la boîte verte. direction de balayage est indiquée par une flèche verte. Section C. Cross montre sur le disque oedème, comme en témoigne l' augmentation épaisseur de la CFNR et l' intensité de gris réduite (plus blanc, en accord avec la teneur en eau plus élevée). Le diamètre de l'intra-rétinien (indiqué entre le blflèches ack) est augmentée. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Bien qu'il existe un certain nombre de modèles de lésions du nerf optique (optique écrasement du nerf ^12, section du nerf optique ^13, et PION ^14), le modèle de rNAION est humain, adaptable à des rats et des souris. Il ressemble plus à l'état clinique humain de NOIAN. Cette condition comprend antérieure progressive du nerf optique œdème, un syndrome du compartiment de nerf optique antérieure, l'ischémie focale axonale, isolé cellules ganglionnaires de la rétine des lésions axonales et la perte sur un parcours de temps prolongée. Le présent rapport donne les mesures appropriées pour rNAION induction, discute des problèmes potentiels lors de l'induction, et analyse décrit tôt après l'induction qui peut être utilisé pour évaluer la qualité de la lésion induite avant l'inclusion de données. L'avantage du modèle de rNAION est que, avec la pratique, des niveaux relativement constants de dommages peuvent être atteints. Typiquement 10 - 11 résultats d'exposition de sec à 40 - 65% de perte de RGC. Le taux de réussite peut varier d'un individu à, dedans l'attente de l'expérience et de la compétence, mais un enquêteur expérimenté peut atteindre près d'un taux d'induction de 100%.

En plus de sa facilité d'induction, au cours de la gravité et le temps de la lésion peut être facilement contrôlée. Une première partie importante du contrôle de la qualité dans le modèle de rNAION, qui peut ajouter au modèle des avantages, est tôt après l'analyse de l'induction. Nous évaluons normalement les animaux deux jours après l'induction, lorsque le nerf optique est un œdème maximal. La rNAION est caractérisée par un œdème du nerf optique qui se résout au cours d'une période de cinq jours (environ 5 fois plus rapide que celle qui se produit chez l'être humain), suivie par le nerf optique paleur et isolé ganglionnaires de la rétine perte de cellules. On peut identifier une ischémie rétinienne (distincte de nerf optique ischémie) par la perte de la transparence et de blanchiment de la rétine rétinienne. l'ischémie rétinienne est fonctionnellement confirmée par la perte du signal de la rétine intérieure avec électrorétinogramme (ERG). S'il y a une perte généralisée de transparence et blanc rétiniennening de la rétine, elle suggère une ischémie rétinienne diffus, ce qui est cohérent avec l'occlusion de la veine centrale de la rétine, et non rNAION seul. Si les résultats d'induction dans l'ischémie rétinienne grave dans un certain nombre d'animaux (caractérisé par le blanchiment de la rétine coupe ou totale), les paramètres d'induction peuvent être réduits par une ou deux secondes du temps d'exposition. De cette façon, on peut optimiser à la fois le degré de détérioration du nerf optique, et d'obtenir la cohérence de l'induction chez les animaux. Les animaux avec une perte significative de signaux ERG devraient être éliminés de l'étude. Perte isolée de la fonction du nerf optique peut être confirmé par le flash visuel mesure de potentiel évoqué (VEP).

Il y a un certain nombre de variables à garder à l'esprit lors de l'utilisation du modèle de rNAION. Les animaux individuels peuvent différer de la gravité globale de la lésion, de sorte que plusieurs animaux doivent être utilisés dans les essais neuroprotecteurs, et une analyse de puissance doivent être effectuées pour déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires à la réalisation d'un starésultats statistiquement valides, en particulier quand un effet protecteur plus modeste est vu ou prédit. Nous avons constaté que 10 - 15 animaux sont nécessaires pour la détermination d'un effet protecteur de 25% RGC chez le rat, et 15 - 20 animaux lorsque les souris sont utilisées. Etant donné que le colorant RB utilisé dans l'induction est rapidement éliminé, une fois que l'animal est injecté, la variabilité peut aussi être fonction de la vitesse du temps nécessaire pour effectuer l'induction. De légères différences sur la mise au point sur le disque optique, des différences dans l'angle d'éclairage laser, et une différence dans la vitesse d'induction peuvent également influer sur le résultat. Une personne dédiée doit être sélectionné pour effectuer la technique dans chaque laboratoire, afin de réduire davantage la variabilité. Environ 10 à 15% des animaux induits peut avoir besoin d'être éliminé après l'évaluation précoce post-induction en raison de la gravité de l'induction (occlusion centrale ou de la branche veineuse rétinienne). Ce rapport ne traite pas d'autres variables intrinsèques innombrables qui peuvent influer sur les résultats, tels que des différences de sexe,rythme circadien, et les différences d'âge ou de déformation. Ces questions doivent être satisfaites par le chercheur individuel. Il existe d' autres paramètres modifiés récemment signalés, tels que 80 mW de puissance laser ^15. Ces modifications utilisées lentilles de contact différent ou longueur d'onde laser, mais ont abouti à des résultats similaires.

Il est important de se rendre compte que malgré les similitudes de rNAION à de nombreux aspects de NOIAN clinique, rNAION est un modèle, et aucun modèle est une copie parfaite d'une maladie humaine, étant donné que les facteurs étiologiques réels dans NOIAN sont inconnus et vasculaires et inflammatoires contrôle physiologique de la rétine de rongeurs et le nerf optique sont différents à bien des égards du primate humain et non humain. Les résultats générés par le modèle doivent être interprétés à la lumière de ces différences. Indépendamment de cela, le modèle de rNAION est une méthode utile de disséquer rapidement de nombreux mécanismes physiopathologiques potentiels responsables de la perte et des approches visuellesà la neuroprotection dans un système de mammifère vivant.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mW 532 nm laser	Iridex		Standard Ophthalmic Laser
0 - 100 mW 532 nm laser	Laserglow technologies		Substitute for iridex
Laser slit lamp adapter	Iridex		SMA coupled adapter for laser output
Coherent Fieldmate laser meter with thermopile sensor	Coherent		others also appropriate
Ophthalmic Examing Slit lamp biomicroscope	Various		Haag-Streit is the best; cheaper versions available on ebay
Rose Bengal	Sigma	330000-1G	Photoinducing agent
Fundus Contact lens or glass cover slip	custom/Cantor and Nissel (UK)		Custom designed planoconvex plastic lens for eye exam and induction
Tropicamide 1%
Tamiya polishing compound	Tamiya, INC	87068	polishing contact lens
2.5% Hypromellose (Goniovisc)/1% Methycellulose	HUB Pharmaceuticals		contact lens coupling agent
2.5% Neosynephrine Ophthalmic drops	Alcon labs		pupil dilating agent
Tropicamide 1%	Alcon labs		pupil dilating agent
0.5% Proparacaine	Alcon labs		topical Anesthetic
30 G fused needle insulin syringe	Various	Various	for intravenous injection of rose bengal
Ophthamic Antibiotic ointment with dexamethasone added (Triple antibiotic ointment)	Various	Various	Apply after induciton to minimize corneal scarring
Heidelberg Corporation Spectral domain-Optical Coherence Tomograph	Heidelberg Corporation		For Optical coherence measurements baseline and post-induction; not essential for induction