Här beskriver vi protokoll för att störa däggdjursceller genom solid-state fräsning vid en kryogen temperatur, producerar ett cellextrakt från den resulterande cellpulver, och isolera proteinkomplex av intresse genom affinitetsinfångning vid antikroppsförenade mikron-skaleparamagnetiska pärlor.
Affinitetsinfångning är en effektiv teknik för isolering av endogena proteinkomplex för vidare studier. När den används tillsammans med en antikropp, är denna teknik också ofta kallad immunoprecipitation. Affinitetsinfångning kan appliceras i en bänkskala och i en hög genomströmning sammanhang. När den kombineras med protein masspektrometri, har affinitetsinfångning visat sig vara en arbetshäst av interactome analys. Även om det finns potentiellt många sätt att utföra de många stegen, följande protokoll genomföra våra gynnade metoder. Två funktioner är utmärkande: användningen av cryomilled cellpulver för att framställa cellextrakt, och antikroppskopplade paramagnetiska pärlor som affinitetsmedium. I många fall har vi erhållit överlägsna resultat med de som erhölls med mer konventionella affinitetsinfångningsmetoder. Cryomilling undviker många problem som är förknippade med andra former av cellbrott. Det ger effektiv sönderbrytning av materialet, samtidigt som man undviker denaturation som hör samman med uppvärmning eller skumning. Den behåller det nativa proteinkoncentrationen upp till punkten för utvinning, mildra makromolekylära dissociation. Det minskar den tid extraherade proteiner bringar i lösning, vilket begränsar skadliga enzymaktiviteter, och det kan minska den icke-specifika adsorptionen av proteiner genom affinitetsmediet. Micron skala magnetiska affinitets media har blivit allt vanligare under de senaste åren i allt högre grad ersätter den traditionella agarose- och Sepharose-baserade medier. Främsta fördelarna med magnetiska media inkluderar typiskt lägre ospecifik proteinadsorption; ingen storlek uteslutningsgräns eftersom proteinkomplex bindning sker på pärlan ytan snarare än inom porer; och enkel manipulation och hantering med hjälp av magneter.
En typisk tillämpning av de presenterade förfarandena är att stabilisera och erhålla ett högt utbyte och renhet av endogena proteinkomplex är av intresse för interactomic karakterisering 1. Det är underförstått att dynamiska näten i båda stabilt och transient associerade makromolekylära komplex, huvudsakligen bestående av proteiner, orchestrate cellulära processer 2,3. Även om det finns många experimentella metoder för att identifiera protein-proteininteraktioner, är affinitetsinfångning bland de mest använda metoderna för att isolera och dissekera fysiologiska proteinkomplex 4-6. Dessutom har denna teknik fördelen att ge de makromolekylära komplex som fysiska enheter, inte bara som datapunkter i en utläsning; fördelaktigt, kan de erhållna komplexen således användas i en mängd ytterligare nedströms biokemiska, enzymatiska och strukturella analyser 7-9. De presenterade protokoll har utvecklats som svar på behovet av att kartlägga protein-proteininteraktioner nätverk och karakterisera makromolekylära komplex i sina roller som de effektormolekyler i cellbiologi. De är detaljerade med avseende på deras tillämpning på däggdjursceller odlade i vävnadskultur, men är lika tillämpbara på ett brett spektrum av biologiska prover som ges lämpliga systemspecifika tweaks.
Historien om affinitetsinfångning sträcker sig tillbaka till början av nittonhundratalet med de första immunoaffinitetskromatografi experiment – som liknar det som brukar kallas numera som immunoprecipitation (IP) – som förekommer i litteraturen av de tidiga 1950-talet. Mainstream användning av tekniken vidareutvecklas genom sekelskiftet till den nuvarande 10-13. Diverse cell och molekylärbiologiska studier har använt mekaniska brott på celler genom målning vid låga temperaturer under åtminstone de senaste fyrtio åren 14-19; och molekylära separationer använder (super) paramagnetiska pärlor har become allt vanligare under de senaste två decennierna 20. Genom att kombinera dessa olika tekniker har använts för att synergistiskt förbättra resultaten som kan erhållas i proteinkomplex affinitetsinfångning experiment 1, vilket framgår av en omfattande samling av verk som produceras av oss själva och det bredare forskarsamhället 7,9,11,18,19,21 -23. Stödjande Resultaten presenteras i Figur 1.
En samling av varningar och överväganden som gäller för verkställande effektiva affinitetsinfångning experiment kan hittas i referens 1. Normalt denna metod är mest lämplig för: (I) katalog interactmedlemmarna av ett protein av intresse, det vill säga använda protein masspektrometri (MS) för att identifiera hittills okända copurifying proteiner (förberedande analys); (II) -analys med avseende på närvaro av en speciell samverkande partner, dvs använder MS eller western-blot för att detektera en särskild protein eller begränsad uppsättning av proteiner som misstänks iagera med proteinet av intresse (hypotestestning); eller (III) förbereda endogent sammansatta proteinkomplex som innehåller proteinet av intresse för vidare studier av ytterligare tekniker (preparativ upparbetning). Innan man börjar på en affinitetsinfångnings experimentell regim är det absolut nödvändigt att ha en hög kvalitet affinitetsreagens som binder till målproteinet, typiskt en IP-kompetent antikropp mot det nativa målproteinet av intresse eller mot en tagg bifogas ett fusionsprotein. Det är också viktigt att ha lämpliga metoder för experimentell avläsning på plats: allmän proteinfärgning (såsom Coomassie blå, Sypro Ruby eller silver, efter SDS-PAGE), Western blotting, och protein MS är alla vanligen används i samband med affinitetsinfångning 1. De presenterade protokoll utnyttjar antikroppar konjugerade magnetiska pärlor som affinitetsmedium. Medan funktionen av affinitetsmediet initialt kan valideras i tester som utnyttjar några experimentella parametrar, tillfå bästa resultat varje försök bör empiriskt optimeras 1,11,24. Protokollen är separerade i tre distinkta faser: (1) framställning av frusen cellmaterial; (2) cellbrott genom solid state fräsning vid kryogen temperatur; och (3) proteinextraktion och affinitetsinfångning med användning antikroppsförenade paramagnetiska pärlor.
Dessa tre protokoll arbetar tillsammans för att (1) förbereda celler för solid-state brott genom cryomilling, (2) åstadkomma brott i en planet kulkvarn, och (3) producerar extrakt från cell pulver till affinitetsinfångning ett protein av intresse i komplex med dess fysiologiska interactmedlemmar. Många olika cellysering tekniker finns, inklusive mekaniska / fysikaliska metoder som utnyttjar krossning effekt, klippning och / eller tryck, samt kemiska / enzymatiska metoder, var och en med olika för- och nackdelar 49,50. Varje utredare uppmuntras att undersöka metoder är mest lämpade för sina analyser, med tanke på att någon vald metod för cellbrott och proteinextraktion är sannolikt att införa fördomar 51,52 nödvändiggör empirisk optimering (diskuteras nedan). Mekaniska metoder kan producera hög värme och / eller skjuvkrafter, som kan störa proteinkomplex. Cryomilling undviker uppvärmningseffekter genom att använda LN två kylning av prover för than varaktighet av processen. Planet kulkvarnar förstås att förlita sig på påverkan och friktionskrafter, inklusive skjuvspänning, som komponenter i partikelstorleksminskning 53,54. Vid inställningar rapporterade vi inte har observerat degeneration av proteinkomplex. I själva verket har vi extraherade och hämtas synes intakta ~ 50 Mda kärnpor komplex 11 och enzymatiskt aktiva retrotransposoner uppvisar högre specifik aktivitet än preparat som använder "mild" tvättmedel baserade lys 7. Kemiska / enzymatiska metoder för cellys lider av begränsningen att innehållet i cellen frigörs i ett in vitro-miljö som stödjer avbrott i cellmembran och strukturella makromolekyler, men kanske inte passar för underhåll av integriteten hos proteinkomplexet (es ) av intresse. Ofta, varken beståndsdelarna i komplexen som bildas med proteinet av intresse och inte heller de villkor som behövs för att stabilisera målkomplex ärkända i förväg. En stor fördel med solid-state fräsning är att brott och utvinning är okopplade, medger källmaterial som skall framställas utan tillsatt vätska, lagras (vid -80 ° C eller lägre), samlat och bekvämt hämtas för on-demand experiment; t.ex. att undersöka optimerade in vitro förutsättningar för affinitetsinfångning. Proteininteraktioner är mest stabila vid hög koncentration 55,56, därför minimera volymen av extraktionsmedlet kan vara fördelaktigt för att bevara fysiologiska interaktioner. Å andra sidan finns det praktiska överväganden – de proteinkomplex behöver partition ut ur cellerna och in i en icke-viskös vattenhaltig fas, fri från olösliga aggregat, för att blanda de målkomplex med affinitetsmediet. Dessutom behövs en viss standardisering och kontroll över in vitro miljö (pH, saltkoncentration, etc.) för systematisering och reproducerbarhet. Vi finner att extraherar produced i utspädnings intervallet 1: 4-1: 9 (vikt: vol) uppfyller praktiska och teoretiska problem, som ger kvalitetsresultat. Dessutom, det optimala förhållandet mellan cellextrakt för att affinitetsmedelbehov som skall fastställas. Detta görs empiriskt genom titrering av extrakt med varierande mängder av affinitetsmediet och kan ha detekterbara effekter på förhållandet signal-till-brus av experimentet, diskuteras ytterligare nedan. En utmärkt utarmning av målproteinet är typiskt ≥70% av den lösliga fraktionen av målproteinet, men> 90% är önskvärt och kan vara möjlig att uppnå med noggrann parametrering av extraktionsbetingelser. Många sådana praktiska överväganden behandlas i referens 1. Paramagnetiska pärlor manipuleras med hjälp neodymmagneter i en specialiserad mikrocentrifugrör hållare, även hemlagad alternativ är livskraftiga. När de placeras i hållaren, pärlor ansamlas vid sidan av röret under inverkan av det magnetiska fältet. Lösningar kan därefter avlägsnas utan disturbing pärlorna.
En begränsning av den presenterade cryomilling protokollet utvecklats med planet kulkvarn används här (se tabell of Materials), är att en minimal mängd material krävs för att effektivt kvarn och återställa cell pulver med hjälp av den här enheten (> 1 g). Sådana mängder kan lätt erhållas med många mikrober, cellinjer och modellorganismer, och kan också ofta uppnås med vävnader utskurna från försöksdjur. Emellertid kan vissa cellinjer vara mycket svårt att växa i överflöd och djurvävnader kan vara knappa. Små mängder av material kan jämförbar malas med hjälp av andra anordningar som utnyttjar mindre behållare, men potentiellt på bekostnad av pulver finhet uppnås. Dessutom kan kostnaden för mekaniska fräsanordningar vara oöverkomligt dyr för vissa laboratorier. Cryomilling kan uppnås med användning av ett antal alternativa uppställningar 14-19, inklusive, mest kostnadseffektivt för hand med användning av en pestle och murbruk, även om brott verkningsgrad sjunker avsevärt. Affinitetsinfångning protokoll syftar typiskt för en hög effektivitet av cell-lys för att underlätta maximal proteinextraktion i lösning och därmed maximal potential för infångning av målproteinet komplex. Å andra sidan har det visats för jäst in vitro skarvning extrakt att maximal lys inte kan likställa med maximal in vitro biokemisk aktivitet 57,58. Vi har inte observerat sådana problem i de system vi har testat hittills och därför inte avsiktligt begränsa vår cellbrott när cryomilling. Icke desto mindre bör denna möjlighet i åtanke när man optimerar för in vitro-enzymatiska analyser. Även cryomilling är en mycket effektiv metod för att bryta celler, en begränsad mängd ultraljudsbehandling ofta gynnar produktions homogena helcellextrakt från däggdjursvävnader eftersom inhomogena aggregat kan ibland observeras genom visuell inspektion: typiskti extraktionsbetingelser med användning av låg till måttlig salt (100-300 mM) och icke-jonisk detergent (0,1-1% vol / vol) koncentrationer. Eftersom vi observerat att närvaron av dessa aggregat kan minska avkastningen och / eller kvaliteten på den efterföljande affinitetsinfångnings, vi rutinmässigt genomföra ultraljudsbehandling för att sprida dem (även när de inte observeras med blotta ögat). Aggregaten är förenliga med agglomererade membranfragment, som är jämförbara med dem som tidigare rapporterats i extrakt från malda jästceller 58. Ultraljudsbehandling används också i vissa protokoll för att klippa DNA och befria kromatin fragment i lösning, men graden av ultraljud tillämpas i detta protokoll inte nämnvärt fragment DNA. Den begränsade tillgängligheten (eller den höga kostnaden) av en utmärkt affinitetsligand eller antikropp mot det specifika proteinet av intresse kan vara en annan hinder. Ett brett utbud av kommersiellt tillgängliga affinitetsreagens kan tas tillvara när modellorganism är mottaglig för genomisk märkning eller transfection med ektopiska expressionsvektorer, som medger expression av proteiner av intresse som affinitets-taggade fusioner. Däremot har produktionen av anpassade antikroppar blivit allt möjligt och både polyklonala och monoklonala antikroppar kan utföra utmärkt i affinitetsinfångning applikationer. Dessa många överväganden omfattas också mer i detalj i referens 1.
Exempel på hur cellen lyseringsmetoden och val av affinitetsmediet kan påverka Resultaten illustreras i Figur 1. Exempel på effekter som utövas av olika extraktionsmedel kan ses i referenser 1,11,24. Eftersom dessa och andra experimentella parametrar påverkar kvaliteten på affinitetsinfångnings, vilket gör det svårt att skilja FP, till förråd av "pärla proteom" och beräkningsmetoder eliminera ospecifika föroreningar har tagits fram för att hjälpa till att identifiera ramprogrammen 40-43. Ändå sådana metoder endast substitute för optimal beredning av prov i en begränsad utsträckning 59. Användning av bästa praxis och empiriskt optimera affinitetsinfångnings experiment kommer att ge högsta kvalitet prover som sedan analyseras nedströms, diskuteras vidare nedan. En lätt implementeras praxis som kan förbättra prov renhet är infödd eluering. Nativt eluering Oftast används för att erhålla den affinitet isolerad proteinkomplex, intakt, för ytterligare experimentering; men eftersom det ofta förbättrar prov renhet, det kan också användas för detta skäl. Emellertid, som visats i figur 1, panel II, kan förmågan hos nativt eluering för att förbättra prov renhet beror på en exakt titrering av den mängd affinitetsmedium till överflödet av målproteinet i cellextraktet – när mediet är i överskott kan lediga paratoper tillåta off-target ansamling av FP proteiner observer i inbyggt eluerade fraktionerna. Med hjälp av reagens och förfaranden som beskrivs här, det hsom varit vår erfarenhet att den största enskilda bidragsgivaren av ramprogrammen till våra experiment är det märkta proteinet själv en gång avlägsnats från ramen för den levande cellen. (Fig. 1.II och Fig. S1). I sådana fall, modercellinjen kontroller som ger irrelevanta proteom i frånvaro av antigenet är av inget praktiskt värde; likaledes för taggen enbart eller spik-kontroller som saknar något annat än målantigenet. Därför, när praktisk vi genomför I-DIRT 7,38, som direkt mäter ackumuleringen av efter lys proteininteraktioner med hjälp av kvantitativa MS. Som nämnts i steg 3.2.7 i protokollet, kommer förfaranden för infödda eluering variera med detaljerna i affinitetssystemet används. Nativt eluering är oftast uppnås genom kompetitiv undanträngning av det märkta proteinkomplex eller proteolytisk klyvning av taggen, släppa komplexet från affinitetsmediet. Flera affinitetssystem som består av små epitopmärkningar existerar, for som epitopen i sig är tillgängligt som peptid som är användbar för konkurrenskraftig eluering av etiketteproteinkomplex 60. Likaså flera proteaser finns tillgängliga för att specifikt klyva besläktade platser strategiskt placerade i affinitet taggade fusionsproteiner 61. Beroende på detaljerna i de valda affinitetssystem, kan den lämpliga elueringen systemet antas.
I allmänhet, kommer kvaliteten på de uppnådda resultaten påverkas avsevärt av kvaliteten på provberedning. Det är viktigt att arbeta noggrant och exakt genom varje steg i dessa protokoll, och så snabbt som möjligt med bibehållande av omsorg och precision. Det är lämpligt att spåra uppdelningen av proteinet av intresse genom varje steg för att förstå effektiviteten av varje manipulation. Till exempel: hur riklig är proteinet av intresse i cellen eller vävnaden i fråga? Kanske proteinet som studeras (och dess komplex) kommer att vara svårt att karaktärisera massspektrometri på grund av begränsad omfattning. Om de renade komplexen kan detekteras genom allmän proteinfärgning (ungefär nanogram intervall), kommer sannolikt att lyckas masspektrometri. Om den infångade proteinet av intresse endast kan upptäckas genom känsliga förstärkt kemiluminiscerande western blotting (ungefär pikogram intervall), är mindre sannolikt att vara effektiva masspektrometri. Även om proteinet av intresse är rikligt förekommande i cellen, hur rikligt är det i cellextraktet som produceras? Gör proteinet partitionen till lösningen eller är det i pelleten? Om det senare, kan en ny extraktion lösning utarbetas som kan förbättra återvinningen. När väl cellextraktet kombineras med affinitetsmediet, hur effektivt är det protein fångas? Har proteinet förblir bundna genom efterföljande tvättar? Vad om andra copurifying proteiner? Genom att spara en alikvot av varje prov vid lämpliga steg av protokollet dessa frågor lätt kan besvaras, typiskt genom western blotting mot proteinet av intresseeller allmän proteinfärgning, men andra analyser kan också vara lämpliga. Optimera varje steg kommer att öka utbytet och renheten av infångade komplex, även om det kan finnas en avvägning göras i maximera ett attribut eller den andra.
En typisk tillämpning av affinitetsinfångning för många forskare är att identifiera kandidat in vivo Interact för ett litet antal proteiner av intresse; dessa kandidater vanligen utsätts för validering av ortogonala metoder in vivo för att visa den biologiska betydelsen av fysiska interactmedlemmarna. Affinitetsinfångning används också av hög genomströmning studier för att generera listor med copurifying proteiner som observerats på en (nästan) proteomet-nivå, vilket underlättar beräknings slutsatser om förmodade in vivo komplex. Många exempel på sådana studier kan hittas i litteraturen. Detta tillvägagångssätt avstår från optimering av villkoren för fångst för varje givet mål till förmån för att utforska människany mål; som sådana, de antydda komplexen själva sällan hämtas helt intakt och mycket ren i varje givet prov. Snarare är de partiella överlappningar i kompositioner som observerats mellan många olika affinitets fångade prov användas som underlag för de slutsatser 42. Båda tillvägagångssätten bidrar värdefulla data till vår förståelse av interactome. Ändå är en stor fördel av affinitetsinfångning att det ger ofta möjlighet att få komplexen intakt och högrenat, förutsatt att ansträngningar görs för att optimera förfarandet. Vi tror att framtiden för den strategi ligger i att öka den lätthet och effektivitet att optimera infångandet av endogena proteinkomplex 11, för mer exakt bedömning av spektrat av fysiologiska Interact och mer frekvent användning i längre nedströms biokemiska, enzymologisk och strukturstudier, t.ex., refererar 7,9,23.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar professor Brian T. Chait för hans ovärderliga råd, stöd och tillgång till MS instrumentering, samt Ms Kelly R. Molloy för utmärkt teknisk support. Vi tackar Ms Kelly Bare för stöd med kopia redigering. Detta arbete stöddes delvis av NIH bidrag P41GM109824, P41GM103314 och P50GM107632.
Growth media & cell culturing implements | For producing frozen cells (I) | ||
500 cm^2 culture dishes | Corning | 431110 | For producing frozen cells (I) |
Large beaker (1-2L) | For producing frozen cells (I) | ||
Rectangular ice pan | Fisher Scientific | 13-900-747 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
Phosphate buffered saline (PBS) | For producing frozen cells (I) | ||
Large cell scrapers | Fisher Scientific | 08-100-242 | For producing frozen cells (I) |
Liquid nitrogen | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
50 ml conical tubes | Corning | 352098 | For producing frozen cells (I), & cryomilling (II) |
20 ml Luer lock syringe | For producing frozen cells (I) | ||
Leur lock syringe caps | www.dymax.com | T11182 | For producing frozen cells (I) |
Refrigerated centrifuge | For producing frozen cells (I) | ||
50 ml tube rack, 4 position | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Styrofoam box | For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III) | ||
Planetary ball mill, PM 100 | Retsch | 20.540.0001 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling jar, 50 ml | Retsch | 01.462.0149 | For cryomilling (II) |
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø | Retsch | 05.368.0062 | For cryomilling (II) |
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm | www.marcorubber.com | T1044-2.62×44.63 | For cryomilling (II) |
mini-LN2 decanter | homemade | see Ref 19 | For cryomilling (II) |
250 ml PTFE jar insulator (optional) | Retsch | custom order | For cryomilling (II) |
PTFE puck insulator (optional) | homemade | The Rockefeller University | For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request. |
5 bar/500 KPA pressure relief valve (optional) | http://www.leeimh.com/ | 558 series check valve | For cryomilling (II) |
1.5 – 2 ml microfuge tubes | For affinity capture (III) | ||
Extractant | For affinity capture (III) | ||
cOmplete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | 11873580001 | For affinity capture (III) |
Vortex mixer | For affinity capture (III) | ||
Ice bucket | For affinity capture (III) | ||
Microtip sonicator, Q700 | Qsonica | Q700 | For affinity capture (III) |
low intensity 1/16” microtip probe | Qsonica | 4717 | For affinity capture (III) |
Bench-top refrigerated microcentrifuge | For affinity capture (III) | ||
Dynabeads M-270 Epoxy | Thermo Fisher | 14302D | For affinity capture (III) |
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads | homemade | For affinity capture (III); see reference 19 | |
Sample rotator | For affinity capture (III) | ||
Neodymium magnet | Life Technologies | 123-21D | For affinity capture (III) |
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) | For affinity capture (III) | ||
DTT | For affinity capture (III) | ||
SDS-PAGE system | For affinity capture (III) | ||
SDS-polyacrylamide gel | For affinity capture (III) | ||
Protein Stain | For affinity capture (III) |