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Biochemistry

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54518
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。

Abstract

親和性捕捉は、さらなる研究のために内因性のタンパク質複合体を単離するための有効な手法です。抗体と組み合わせて使用​​すると、この技術は、しばしば、免疫沈降法とも呼ばれます。親和性捕捉は、ベンチスケールで、高スループットの状況で適用することができます。タンパク質の質量分析法と組み合わせると、親和性捕捉は、インタラクトーム解析の主力であることが証明されました。関連する多くの工程を実行するために、潜在的に多くの方法がありますが、次のプロトコルは、私たちに好まメソッドを実装します。 2つの機能は独特である。親和性媒体として、細胞抽出物、および抗体結合常磁性ビーズを製造するためcryomilled細胞粉末の使用。多くの場合、我々は、多くの従来の親和性捕捉の実践で得られたものよりも優れた結果を得ました。低温ミリングは、細胞破壊の他の形態に関連した多くの問題を回避します。 denatを回避しながら、それは、材料の効率的な破壊を提供します加熱または発泡に関連付けられレーションの問題。これは、巨大分子解離を軽減、抽出のポイントにネイティブのタンパク質濃度の上昇を保持します。これは有害な酵素活性を制限し、抽出されたタンパク質は、溶液中で費やす時間を短縮し、それは、親和性媒体によるタンパク質の非特異的吸着を減少させることができます。ミクロンスケールの磁気アフィニティー媒体はますます伝統的なagarose-とセファロースベースのメディアを交換し、最後の数年間で、より一般的になってきました。磁気媒体の主な利点は、典型的には、低い非特異的タンパク質吸着を含みます。いかなるサイズ排除限界ない結合タンパク質複合体は、ビーズ表面上ではなく、細孔内で発生するからです。および操作の容易さと磁石を使用して処理します。

Introduction

提示された手順の一般的なアプリケーションは、interactomicキャラクタリゼーション1のための目的の内在性タンパク質複合体の高い収率および純度を安定させ得ることです。主にタンパク質で構成さの両方を安定かつ一過関連巨大分子複合体の動的ネットワークは、細胞プロセス2,3を調整することが理解されます。タンパク質-タンパク質相互作用を同定するための多くの実験的なアプローチがあるが、親和性捕捉は、単離および生理学的なタンパク質複合体4-6を解剖するために最も広く用いられる方法の一つです。また、この技術は、読み出したデータポイントとしてだけでなく、物理的なエンティティとして、巨大分子複合体が得られるという利点を有します。有利には、得られた複合体は、このようにして、追加の下流の生化学的、酵素的、および構造的アッセイ7~9の宿主で使用することができます。提示されたプロトコルはproteiをマッピングする必要性に応えて開発されてきましたN - タンパク質相互作用ネットワークと細胞生物学のエフェクター分子としての役割に高分子複合体を特徴づけます。これらは、組織培養で増殖させた哺乳動物細胞への適用に関して詳述されているが、適切なシステム固有のひねり所与の生物学的試料の広い範囲にも等しく適用可能です。

親和性捕獲の歴史は、最初の免疫アフィニティークロマトグラフィー実験で逆世紀初頭に広がって - 一般的に免疫沈降（IP）として、今日と呼ばれるものに似ている - 1950年代初期によって文献に登場します。技術の主流の使用は、本10-13に、この世紀の変わり目で開発します。多様な細胞および分子生物学的研究は、少なくとも過去40年間14-19のために極低温で粉砕することにより、細胞の機械的破損を利用してきました。そして、（超）常磁性ビーズを用いた分子の分離は、BECを持っています過去20年間20以上の青梅ますます一般的。これらの異なる技術を組み合わせることで相乗的に自分自身と、より広い研究コミュニティによって生成される作業の広範な体によって証明されるように、1タンパク質複合体親和性捕捉実験で得られる結果を改善するのに役立っている7,9,11,18,19,21 -23。支持結果を図1に示されています。

警告および有効アフィニティー捕捉実験の実行に適用する考慮事項の収集文献1に見出すことができます。典型的には、この方法は、最も適切である：（I）これまで未知の同時精製タンパク質（探索的分析）を同定するためにタンパク質の質量分析（MS）を使用し、すなわち 、目的のタンパク質の相互作用をカタログ。特定の相互作用パートナーの存在について（II）アッセイ、 すなわち、特定のタンパク質または中に疑われるタンパク質の限定セットを検出するために、MSまたはウェスタンブロットを使用金利（仮説検定）のタンパク質とteract。または（III）追加の技術（取後処理）によるさらなる研究のために、目的のタンパク質を含む内因的に組み立てられたタンパク質複合体を準備します。親和性捕捉実験レジームに着手する前に、標的タンパク質は、目的の天然の標的タンパク質に対して、または融合タンパク質に付​​加されたタグに対して、典型的にIP能力の抗体に結合する高品質の親和性試薬を有することが不可欠です。すべての一般的な親和性のキャプチャと組み合わせて使用​​され、ウェスタンブロット法、およびタンパク質MS（例えばクーマシーブルー、シプロルビー、または銀、以下のSDS-PAGEなど）の一般的なタンパク質染色：場所で実験的な読み出しの適切なメソッドを持つことも重要です1。提示されたプロトコルは、親和性媒体としての抗体結合磁性ビーズを利用しています。親和性媒体の機能は、最初に、いくつかの実験パラメータを利用してテストで検証することができるが、各実験は、経験的に1,11,24を最適化すべきで最良の結果を得ます。プロトコルは3独特の相に分離されている：凍結細胞材料の（1）調製; （2）低温で固体粉砕による細胞破壊を。 （3）タンパク質の抽出および抗体結合常磁性ビーズを用いたアフィニティー・キャプチャー。

Protocol

1.細胞の回収および凍結

  1. 関心25,26の細胞株のための適切な培養条件を用いて細胞材料1-8 gで成長します。このプロトコルは、参考文献19,27,28から改変された細胞の最大8グラム（〜10 9細胞）、最適化されています。典型的には、約5 gをHEK-293またはヒーラ細胞が約90％コンフルエントまで増殖8 500 cm 2の培養プレートから得ることができます。
    注意：これらのプロトコルは、重度の低温やけどを引き起こすことができる液体窒素（LN 2）を使用します。ドン・保護服と適切な取り扱い上の注意を行使する。
  2. 大きなビーカーに成長培地（廃棄物）をオフに注ぎます。
  3. 大きな長方形の氷皿に氷の上で培養皿を置きます。
  4. 培養皿に氷冷1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の20ミリリットルを追加し、大細胞スクレーパーを用いて皿から細胞を放出。氷上で予冷し、50ミリリットルチューブに細胞を移します。チューブを氷上に保持します。
    注意：すべてのセルの取り扱い手順については転送操作の間に細胞の過剰な剪断を回避するために、「低」と25ミリリットルピペットに設定した電気ピペッターを使用しています。 50ミリリットル収集チューブを手配し、前の手順を開始するアイスバケットにPBSを1倍。
  5. 同じ皿に氷冷1×PBSの追加の10ミリリットルを追加します。残りの細胞を収集し、50mlチューブに移します。
  6. 各皿のために繰り返します。別の皿からの細胞懸濁液は、サンプル数やプラスチック廃棄物を減らすために組み合わせることができます。
    注：細胞自体は懸濁液体積の大部分を構成しないので、細胞懸濁液の価値三板は、2つの50mlチューブに組み合わせることができます。 50ミリリットルチューブは実際に名目上の量よりも多くを保持しているので、8枚のプレートは、一般的に5などのチューブに分散させることができます。
  7. 1,000×gで5分間遠心分離し、4℃。
  8. 上清を慎重に取り除きます。 10ミリリットルの氷冷1×PBS中で各ペレットを再懸濁します。 RESUを統合サンプルの数を減らすために、50mlチューブ当たり5まで、ペレットをspended。
  9. 千×gで、4℃で5分間遠心。
  10. 上清を慎重に取り除きます。 10ミリリットルの氷冷1×PBSでペレットを再懸濁
  11. 20ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外し、脇に置きます。注射器のノズルをキャップとそれに細胞懸濁液を転送します。
  12. 千×gで、4℃で50mlのチューブと遠心分離機5分の内側に注射器を置きます。
  13. 細胞のちょうど上部層が吸い上げされ始めるまで、真空トラップシステムに取り付けられた先端の細いピペットで上清を吸引除去します。これは、湿った細胞ペレットになります。
  14. プランジャーを挿入し、発泡スチロールの箱でLN 2浴で開催されたLN 2を充填した大規模なプラスチックビーカー、中に直接細胞を滴下、注射器をキャップを取ります。強制的にシリンジから残りの細胞を急落。
  15. 注ぐことにより、50mlチューブに凍結細胞を転送します。ゆるく過剰LN 2が蒸発することを可能にするチューブをキャップ。トンを開催-80℃での裾一晩。翌日、完全にキャップを締めます。凍結した細胞は、低温ミリングまで-80℃で、このように記憶されてもよいです。
    注：すべてのLN 2が目に見えて蒸発する前にしっかりとそうでない場合は、過度の圧力が管が爆発する恐れがあり、チューブを閉じないでください。 LN 2が消失した後、チューブを閉鎖しないと、過剰な水の量を添加して効果的に粉砕時にタンパク質濃度を減少させる、細胞材料の霜の蓄積をもたらすことができます。

凍結細胞の2極低温破壊

注：粉砕及び操作のためのすべてのツールは、LN 2を事前に冷却する必要があります。小さなデカンタは、瓶の中にLN 2を追加すると、閉じた製粉ジャーの上にLN 2を注ぐために必要とされるであろう。自家製のツールは、参照19に示されています。極低温グローブ粉砕装置を冷却LN 2を処理するために必要とされます。フライス加工ここで使用される瓶の蓋は、一般的にインストールされてゴムパッキンに同梱（ 材料の表を参照のこと）。これは、確実に次のプロトコルを実行するために、市販のテフロン蓋ガスケットに交換する必要があります。気体状のN 2からの圧力は、粉砕中瓶内の高レベルまで構築することができますので、また、私たちは安全リリース対策28として市販されている5バー/ 500キロパスカルの圧力弁を設置することをお勧めします。

  1. -80℃の保存から細胞ビーズを除去し、LN 2浴中に50ミリリットルチューブホルダーに保持します。
  2. LN 2を含むきれいな長方形のアイスバケットに50ミリリットルの瓶、2 20ミリメートルボール、および蓋を事前冷却します。 1を使用する場合はポリテトラフルオロエチレン（PTFE）絶縁体を事前冷却;パックのセット（27を参照する参照）、またはスリーブ・アンド・パック（ 図2を参照）のいずれか。事前冷却が完了すると、LN 2落ち着かの暴力的な沸騰。
  3. 上の適切なカウンターバランスを設定しますミル。
    注：これは瓶の質量、瓶のふた、使用されている粉砕用ボール、ジャーに追加する細胞の量と同じになります。任意のPTFE絶縁体を使用している場合は、それらの質量も含まれるべきです。私たちは事前に瓶、蓋、および（使用される任意の絶縁体を含む、それらの合計質量、）ボールの質量を記録し、工場の近くに格納された情報シート上に記録を示唆しています。
  4. ピンセットを使用して、2つの予備冷却の20mMミリングボールと予め冷却ミリングジャー内部の凍結細胞を置きます。
    注：これにより、ミリング中瓶、ボール表面上の材料の小さな損失のため、増加粉砕された細胞の塊として回収された物質の割合が増加します。記載の方法により、材料損失が〜0.3グラムのウェット細胞重量（WCW）の順であること、非常に控えめです。メーカーのガイドラインでは、サンプルの最大容量は、ジャーボリュームの〜1月3日であるべきロードを示しています。 29ボールの総容積は〜1月3日とrであるべきですemaining〜1月3日の空き領域がボールの自由な移動のためのものです。
  5. 〜½完全にジャーまでにLN 2を追加し 、瓶に蓋を配置し、ミルにアセンブリを転送します。
    注：1を使用している場合、最初に選択された絶縁体を取り付けます。
  6. 場所にアセンブリをクランプし、次のプログラム使用して製粉の3つのサイクルを実行します。400回転、3分、逆回転を毎分、無区間の区切りを。各サイクルの間にLN 2と製粉ジャーを冷却します。
    注：ボールが惑星運動で瓶内の衝突のように明確なclunkingノイズが生成される粉砕中。これらの音は聞かれていない場合は、粉砕が発生していません。フライスサイクルを終了し、このサイクルをカウントバックLN 2にジャーアセンブリを移動し、jarファイルの内容を調べていません。何の氷が形成されず、それが持っている場合、予め冷却したスパチュラでジャー壁からそれを離れてチップしていることを確認します。ステップ2.5から再び起動します。
    全くの絶縁体または絶縁体のパックを使用していない場合は、に戻っジャーアセンブリを移動LN 2を追加します。追加されたLN 2は 、ミリング中に瓶の温度が上昇するように瓶の中に蒸発します。これは、瓶内の圧力上昇をもたらします。工場からjarを外すときしたがって、非常にゆっくりとクランプを解放します。クランプが急速に放出された場合、細胞粉末は、急速減圧して逃げることができます。クランプの徐放は、圧力が穏やかな、制御された形で瓶から脱出することを可能にし、細胞材料の損失を防ぎます。これは正常です-気体状のN 2の穏やかなエスケープは、多くの場合、クランプがゆっくりと放出されるようヒス聞くことができます。
    スリーブ・アンド・パックの絶縁体を使用する場合は、ジャーアセンブリはミルに残され、LN 2は、 その場で 、絶縁体/ジャーアセンブリに加えることができます。
  7. バックLN 2にjarファイルを移動し、冷却するために一時的に休ませて。スリーブ・アンド・パックの絶縁体を使用する場合、瓶スリーブWから除去することができます2へらの助けi番目の、いずれかの側にレバレッジを提供します。瓶はLN 2で休んされたら、慎重にピンセットを使ってボールを削除し、ふたを取り外し、予め冷却したスパチュラを用いて予め冷却した50ミリリットルチューブに粉末を移します。オープン瓶/粉末に少しLN 2を追加すると、それらを削除する前に、ボールの上にこびりついされる粉末を除去するのに役立ちます。
    注：jarファイルが開かれた後、ボールを取り外す前に、それにLN 2を少量加えます。これは、表面にこびりつい粉末を回復するのに役立ちます。細胞粉末は、-80℃で、または下記の使用まで保持してください。我々の経験では、細胞粉末は、性能に影響を与えることなく、本質的に無制限に、この方法で保存することができます。

細胞抽出物からのタンパク質複合体の3アフィニティー捕捉

注：以下のプロトコルは、目的のタンパク質と相互作用する親和性リガンド、餌、または抗体からなるアフィニティーメディアを実装し、共同ミクロンスケールの常磁性ビーズにupled。これらは、市販のキットを使用して、社内19,30調製、または既製の試薬として購入することができます。

  1. 細胞抽出物の準備
    注：セルの粉末を取り扱うときは、LN 2で予備冷却調理器具やチューブを使用することを忘れないでください。細胞粉末を含むチューブは必ずしもないときは、-80℃でLN 2に開催されるべきです。 LN 2と発泡スチロールの容器に、チューブのラックに細胞粉末を含む50 mlチューブ（複数可）を配置します。
    1. 1.5または2ミリリットルの微量遠心チューブに細胞粉末100mgを秤量。
      注：我々は、細胞のこの量は、通常、ナノグラム数十〜数百中の標的タンパク質をもたらす良い出発点があるあたりのコピー数千で、適度に発現されたタンパク質（〜50 kDaの質量のためのアフィニティー捕捉した後に現在のレンジことを観察しましたターゲットの抽出と捕獲効率を推定セル）は、≳70％です。このような収率は直接visualizを提供しますSDS-PAGE及びタンパク質染色による精製画分のエーション。
    2. 空のマイクロチューブと風袋分析天びん。スプーンやへらを冷却LN 2を使用してチューブに細胞粉末を分注します。化学天秤でチューブ内に分配さ粉体の質量を確認してください。
      注：細胞粉末の秤量を容易にするために、小さな容積測定スプーンを使用してもよいです。これらは、（19を参照する参照）、再現性のある結果を与えることが見出されています。私たちは、スクリューキャップまたは「安全ロック」マイクロ遠心チューブを使用して最良の結果を発見しました。チューブに入ることがLN 2を蒸発させてからの圧力は、標準的なマイクロ遠心管が直前に抽出溶液の添加後に温暖化時にオープンポップする可能性があります-潜在的にサンプルの損失が生じます。
    3. チューブを開きます（またはスクリューキャップを緩め）細胞粉末とし、1分間室温で放置。これは、チューブ内の圧力を解放し、抽出の即時凍結を防止します粉末に添加ソリューション。いいえ解凍はこの1分間のインキュベーションの間に観察されません。
    4. 3.1.5に進みながら、氷上で保持した後、プロテアーゼ阻害剤と簡単に渦を補った抽出剤の400μLを加えます。サンプルは、溶出するまで、後続のすべての操作の間に氷上に保持する必要があります。
      注：抽出の最良の組成物を精製するタンパク質複合体（複数可）に依存します。いくつかの一般的なガイダンスについては、 表1と支持参考文献において提供されます。
    5. サンプルを任意の凝集体を分散させるための簡単な低エネルギーパルスを与えるためにマイクロチップ超音波装置を使用してください。 4パルス（;総エネルギーの約15-20 J 2秒ずつ、2 A）と（ウルトラ）超音波処理。
      注：ボルテックスは、抽出剤への細胞の粉末を分配するが、溶液の文字に応じて、いくつかの凝集体が観察されてもよいです。私たちは、これらの凝集体を分散させることは、その後の親和性捕捉時の最高の収量を提供することを見出しました。簡単なマイクロチップSONI陽イオンは、簡単にこれらの凝集体を分散させます。解決策は、明らかな凝集体をなし、半透明のが、均質で表示されます。水浴超音波処理を効率的に有意に長いサンプル処理時間をすることなく、このような凝集体を分散させるには余りにも低消費電力をする傾向があるが、適切な設定で適切であり得ます。
    6. 遠心分離により抽出液を明確に（ 例えば20,000×gで、10分間、4℃）。
      注：清澄細胞抽出物のアリコートをペレット、後アフィニティー捕捉上清の内容と比較するために保存することができ、アフィニティ媒体からの溶出後に得られた画分は、標的タンパク質の抽出の効率および捕捉を決定します例えば、ウェスタンブロットにより（説明を参照）。
    7. 上清（清澄化抽出物）を取り外し、アフィニティー捕捉に進みます。
      注：ペレットが標的タンパク質Dの放出の程度を決定するために、70℃でSDS-PAGEサンプルローディング緩衝液中に再抽出することができますステップ3.1.6で得られた抽出物と比較することにより、最初の非変性抽出をuring。
  2. アフィニティキャプチャ
    1. 磁気親和性媒体を予洗。細胞抽出物を遠心している間に行われることができます。
    2. 磁石上にチューブ（複数可）を配置します。ビーズを除去するストレージソリューションを可能にする、数秒以内に管の側面に蓄積します。
    3. ビーズに抽出溶液500μlを追加します。中速で短時間ボルテックスミックス（再懸濁させるのに十分な）。底にすべてのコンテンツを収集するためのミニ遠心機でチューブをパルススピン。そうすることでソリューションの最小キャリーオーバーを保証します。磁石上にチューブを置き、ソリューションを吸引します。
      注：独特の特性を持つ磁気メディアは商業的供給業者の多種多様から入手可能です。結果は、ビーズの大きさ、均一性、表面コーティング、および抗体結合化​​学を含む、これらの特性に依存して変動し得ます。サイド・バイ・SIアプリケーションのデ試験は選択試薬に定住する前に、推奨されています。
    4. 再懸濁するために簡単に予め洗浄した親和性媒体と渦を含む1.5から2.0 mlのチューブに清澄化した細胞抽出液を転送することにより、親和性捕捉を開始します。
    5. 回転子ホイール上に連続穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベートします。ビーズは、インキュベーション全体で停止されたままにする必要があります。
    6. チューブの底にすべてのコンテンツを収集するためのミニ遠心機でチューブをパルススピン。上清を吸引し、ステップ3.2.3に記載のように冷抽出溶液1mlでビーズを3回洗浄します。磁石上にチューブを入れます。溶液を除去。次のソリューションを追加し、繰り返しに進みます。 2 回目の洗浄中に、ピペットで新たなマイクロチューブに一緒にビーズや洗浄溶液を移します。これは、Tとのインキュベーションのために使用されるチューブの壁に吸着ランダムタンパク質により、溶出の時点で、サンプルの汚染を減少させます彼は、抽出物を細胞。 3 回目の洗浄の後、ビーズが底にすべての内容を収集するために、ミニ遠心機にパルス紡糸簡単であるべきです。背面磁石にチューブを置き、すべての残留液体を除去します。これは、溶出均一なボリュームを持つことになり溶出したサンプルを確保する前に、ソリューションの最後の数マイクロリットルの除去を可能にします。また、溶出溶液は、残留洗浄によって希釈されることはありませんように溶出は、有効であることが保証されます。このような残基は、（下記参照）の塩効果に寄与し、SDS-PAGEにおけるタンパク質の移動を変化させることができます。
      注：結合後の上清のアリコートは、3.1.6で生成された清澄化抽出物との比較のために保存することができます。ウェスタンブロットによる。結果は、細胞抽出物から標的タンパク質の枯渇の程度を示します。
    7. いずれかのネイティブまたは変性の方法で溶出。下流側のアプリケーション1のための最善の戦略を検討してください。
      注：ネイティブ溶出ストラテジーの詳細sが使用される親和性タグ（説明を参照）に依存することになります。タンパク質染色31でSDS-PAGEにより試料の分析に続いてSDS-PAGE試料緩衝液で溶出変性ほとんどのユーザーのために、最も実用的な最初のアプローチであろう。
      注：サンプル緩衝液の組成は、使用される電気泳動システムに依存するであろう。多くのラボでは、不連続電気泳動およびLaemmliバッファーシステム32-34を利用して、自分のトリス-グリシンゲルをキャスト。一般的なサンプルバッファレシピ（1X）を含む10％のスクロース、50mMのDTT、2％ブルーSDS（​​w / v）の、62.5 mMのトリス-Cl pHは8.8、0.0004％（重量/ v）のブロモフェノール31（w / v）の。私たちは、DTTを省略し1.1倍の株式を準備することをお勧めします。 500mMのDTTの量はSDS-PAGEの前にサンプルに添加されるべき第 1/10（下記参照）。多くの市販のSDS-PAGEシステムもご利用いただけます。これらは、システム固有のサンプル・バッファを含むことができます。
    8. 放出を軽減する（還元剤なしでSDS-PAGEサンプルバッファーを加えますビーズからの抗体鎖の）と攪拌しながら、室温で5〜10分間インキュベートします。
      注：これは上清中に捕捉されたタンパク質を放出し、最も親和性に基づく相互作用を妨害します。より永続的な相互作用は、（典型的には70°Cで十分である）放出のための高温から利益を得ることができます。
    9. 上清を収集し、保存します。サンプルは、（数日）の簡単な保存のために-20℃で凍結してもよいし-80拡張記憶のためのC°分析が望まれるまで。
    10. 標準的な技術31を用いて、タンパク質染色に続いてSDS-PAGEにサンプルを供します。 MSは、試料組成物1を特徴付けるために使用することができます。個々のタンパク質バンドは、識別のために切除しても良いし、試料全体を短時間だけ（ゲルに4〜6ミリメートル）サンプルを電気泳動し、として一緒に、試料中の全てのタンパク質を処理することによって、1回の分析で特徴づけることができる「ゲルプラグ」。
      注：イニシア前にDTTを追加ティン電気泳動。 MSに進むことを計画している場合、サンプルは、電気泳動の35の後にアルキル化することができます。しかし、それは電気泳動前36にアルキレートに頻繁に便利です。

Representative Results

図1は 、パネルIは、低温ミリングと磁性ビーズは、サンプルの品質を向上させるために一緒に働くことができることを示しています。パネルIA-Cは、親和性捕捉のために使用される不溶性の媒体を含む材料を回収プロテオーム19に影響を与えることができることを示しています。目的のタンパク質は、精製されたFLAGタグ化細菌アルカリホスファターゼ（BAP）は、ヒト細胞抽出物に添加しました。 BAPは、特異的に相互作用し、ヒトタンパク質を同時精製することが期待されていません。 SDS-PAGEおよびクーマシー染色によって判断同時精製タンパク質の署名は、使用される媒体に依存して変化しました。ミクロンスケールの磁気ビーズは、非特異的タンパク質吸着の比較的低いレベルを示す、クリーンなプロファイルを示しました。パネルIDおよびIEは、細胞溶解の方法は、回収されたプロテオームに影響を与えることができることを示します。提供された例では、内因性のタンパク質複合体は、（NEXT 37複合体）、アフィニティーcaptuに供しましたcyromilledまたは超音波処理した細胞からの再19を抽出します 。細胞抽出物はcryomilled細胞粉末から作製した場合、より少ない高質量の汚染物質が観察されました。

内因性タンパク質複合体を研究するために、アフィニティー捕捉を用いたチャレンジは、偽陽性（FPS）から目的のタンパク質の真正な生理学的相互作用を区別することは困難であり得ることです。 FPおよび/または対象自体のタンパク質に非特異的チューブ及び容器への吸着、親和性媒体、抗体またはアフィニティーリガンドを含む多くのソースから生じ得ます。その結果、かなりの努力が取得プロセスの最適化に専念しなければなりません。 FPの検出は、さまざまなツールの多くは、41-43 38-40実験と計算手法を含め、異なる長所と短所で各開発されているために中心的な課題のまま。私たち自身の実験において、我々は以前にFのパターンを指摘しました対照細胞抽出物とα-FLAG磁気媒体のインキュベーション後に得られた結合Pタンパク質は、それは3xFLAGタグ融合タンパク質の存在下で得られたパターンは異なっていました。さらに、これらのFPは3xFLAGペプチド7とのインキュベーションにより培地から放出され得ます。この観察は、日和見同族エピトープの非存在下でα-FLAGのパラトープへのFPの結合と一致しています。多くの研究は、親和性捕捉のための模擬対照として、タグの付いていない「親細胞株」を使用するので、このFPの背景の性質を理解することは重要です。これらのコントロールは、したがって、タグタンパク質との相互作用の特異性を決定するのは不適切かもしれません。抗体パラトープが占有またはされていないときに私たちの親和性媒体によって貢献したバックグラウンド結合を決定するために、我々は3xFLAGの存在下または非存在下で（ないタグ付きタンパク質が発現しない）モックα-FLAG磁気媒体を用いたアフィニティー捕獲実験及びHEK 293T細胞抽出物を実施しましたペプチドスパイクインチ結果を図1、パネルIIに示されています。簡潔には、α-FLAG磁気媒体は、500mMのNaClと30分間、20mMのHEPES-ナトリウムpH7.4中の1％V /トリトンX-100 Vを含む（≳10ミリグラム/ mlの総タンパク質）、細胞抽出物中でインキュベートしました。培地は、次いで競合変性溶出を達成するために、ネイティブまたはSDS-PAGE試料緩衝液でα-FLAGのパラトープに結合した任意のタンパク質を置換するために1mg / mlの3xFLAGペプチドと共にインキュベートしました。加えて、同じ実験を細胞抽出物に1μg/ mlおよび3xFLAGペプチドを10μg/ mlのスパイクしたときに行きました。すべての溶出画分をSDS-PAGE及び銀染色に供しました。我々は、その同族のエピトープの不在下で、α-FLAG媒体は3xFLAGペプチドで溶出させることができるバックグラウンドタンパク質の検出可能なレベルを捕捉していることを観察-実施例の図1-IIによって提供される、優勢な種は37の間で観察されました50kDaの。で溶出パターンSDS-PAGEサンプル緩衝液は、さらなる顕著な種と、同等でした。しかし、1 / mlの3xFLAGペプチドの存在下で、FPは、親和性媒体への結合は検出レベル未満まで除去し、いずれかの天然または変性溶出画分では観察されませんでした。この結果は、3xFLAG /α-FLAG M2の場合のように空いて抗体パラトープが、その同族エピトープの不在下で無差別であること、さらには高い親和性で、そのエピトープに結合する抗体についての親和性捕捉の間に得られたプロテオームに大きく貢献することができることを示唆していますペアリング。それはまた、多くの場合、非特異的結合を軽減するために選択された高濃度の塩を用いて、非常にストリンジェントな条件は、抗原/抗体相互作用の非存在下で無効であり得ることをsuggestd。フォローアップするために、我々は、SDS-PAGEによる分析だけでなく、定量的MS（ 図S1）を含む、同様の実験を行いました。定量化347タンパク質のうち、我々はすべてのタンパク質が1（偽ディスコのために保存することが観察されとても率= 1％; 3xFLAGペプチドが対照試料をスパイクと比較して、 表S1）は 3xFLAGタグ化ベイトタンパク質と関連していました。これらの結果は、我々の実験で観察されたタンパク質の圧倒的多数は、タグタンパク質と同時精製する可能性があるか、占有されていないα-FLAGのパラトープの副産物オフターゲットであることを示しています。我々の経験では、高い信号対雑音親和性捕捉の結果は、鋭い豊富でおおよそ化学量論的なバンドだけでなく、他の暗いバンドのバックグラウンド染色の不足の離散パターンでSDS-PAGEおよびタンパク質染色に例示されています。この原則の多数の例は、参照11で見ることができます。

低温ミリング時（推奨）PTFE絶縁体を使用するための動機は、フライス加工時の瓶の温暖化の速度を低下させる粉砕プロセス中に繰り返さLN 2冷却の負担を軽減し、氷の度合いを軽減することです瓶で形成。これは、一貫性のあるフライス性能を容易にし、細胞粉末の取り扱いが容易になります。例えば絶縁体は、基準27（パック）中に見出され、 図2に示されている、（スリーブ・アンド・パック）以下にすることができます。

図1
図1：代表的な結果を選択します。 （I）このパネルでは、基準19から変更されています。クーマシーブルーSDSポリアクリルアミドゲルを染色しました。 （LEFT）ミクロンスケールの磁気ビーズは、オフターゲットアガロースベースのメディアよりも結合低く表示されます。 （A）磁性ビーズ; （B）従来のアガロース; （C）鉄含浸（磁気）アガロース;それぞれ、抗FLAG M2抗体に結合され、FLAGタグ、細菌アルカリホスファターゼ（BAP;標識）を捕捉するために使用cryomilled HEK-293細胞から産生された抽​​出物に添加。アガロースベースの精製非特異的吸着（非標識バンド）のより高いレベルを示しました。内因性タンパク質複合体を精製するために使用される場合cryomilled HeLa細胞から産生される（右）の抽出物を超音波処理することによって製造されるものより抗体結合磁性ビーズ上に低いオフターゲットの吸着を示します。 LAPタグ44 RBM7はNEXT複合19,37（D）を精製するために、ポリクローナル抗GFP抗体に結合された磁気ビーズを用いて捕捉親和性cryomilled粉末から製造抽出しました。無傷の細胞の超音波処理によって生成さ（E）を抽出します。縦の黒いバーが高質量の非特異的相互作用は、超音波処理した試料に濃縮されていることが観察されるゲルの領域を強調しています。黒い矢印が予想される特定の相互作用を示した（ラベル）。レーンD及びEで〜50kDaの観察のバンドはラマIgG重鎖に起因しています。 （II）銀は、SDSポリアクリルアミドゲルを染色しました。 HEK-293上で行う（STD）モックアフィニティー捕捉T細胞は、標準的な方法で抽出します。捕捉した後、結合した物質の溶出は、（N）を1mg / mlの3xFLAGペプチドまたはSDS-PAGE試料緩衝液で溶出変性（D）と非変性溶出を介して達成されました。基準色として（PB 1）。しかし3xFLAGペプチドは、親和性媒体にα-FLAGのパラトープをブロックするために1μg/ mlの抽出液に含まれていました。 PB 1としてではなく、10 / mlの3xFLAGペプチドの存在下で（PB 10）。 IgGの関連バンドと3xFLAGペプチドは標識されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2：スリーブ・アンド・パックのPTFE絶縁体。 250mlのPTFEジャーが示されている（1）。 50 mlのステンレス鋼製ミリングジャー（2）PTFEジャー（3）の内側にフィットし、提供しますサイクル間の工場内に設置された製粉ジャーを残す機会。上側のPTFE絶縁体パック（2）は、クランプアセンブリと瓶のふたとの間で使用されています。インストールジャーと絶縁体アセンブリ（3）を冷却するために、LN 2は、瓶を囲む、絶縁体の体内に直接追加されます。ミリングの次のサイクルが開始することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

試薬 推奨濃度 ノート
塩化ナトリウム 0.1〜0.5 M 高濃度（> 300 mM）の全タンパク質の抽出を改善し、低バックグラウンドを維持する傾向があるが、いくつかの他の方法で安定した間を剥ぎ取ることができます俳優。 150mMの以下の濃度は、典型的には、非特異的バックグラウンドを減少させるのに有効ではありません。
酢酸アンモニウム 0.2〜2 M 二つのバッファからなる塩は、それは、中性pHの溶液57が得られます。より高い濃度は、いくつかのタンパク質複合体を安定化させます。酸性溶液は、アンモニア損失のアカウントに古い、不適切に保存された結晶性ストックから生じる可能性があります。追加のpH緩衝剤または塩は、酢酸アンモニウムを含む抽出に必要とされません。得られた結果を調節するために塩化ナトリウムと組み合わせてもよいです。
トゥイーン20 0.1％v / vの非イオン性界面活性剤58。典型的にはNaClで組み合わせます。
トリトンX-100 0.5から1パーセントv / vの非イオン性界面活性剤58。通常、NaClまたはNH 4 CH 3 CO 2 Hのいずれかと組み合わせ
CHAPS 5 mMの両性イオン界面活性剤58 </ SUP>。典型的にはNaClで組み合わせます。
サルコシル 1 mMのバックグラウンドを減少させ、潜在的にバイナリ接続性を明らかにし、安定な複合体の成分を取り除くことができる陰イオン界面活性剤58。典型的にはNaClで組み合わせます。
トリス-Cl 20 mMの pK aは4°C、25°Cで8.1で8.8の。
（pHは8.0）
HEPES-ナ 20 mMの pK aは4°C、25°Cで7.5で7.8の。 NaOHまたはKOHが抽出に使用される塩（ 例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、またはCH 3 CO 2 K）に応じたpH平衡化に用いました。
（pH7.4）で

表1：精製タンパク質複合体のために有用ないくつか提案さ試薬。この表リットル私たちが提案した作業濃度で、ヒト細胞株から精製タンパク質複合体のために有用であることが分かってきたいくつかの試薬をISTS。典型的な抽出剤製剤は、pH緩衝剤、塩、洗剤1,11,24,45-48が含まれています 。ベストプラクティスは、所望の結果をもたらす試薬の少なくとも複雑な組み合わせを識別することです。

図S1
図S1は：偽陽性の精製（MAP-）SILAC分析の後混ぜます。 I.概略図：この実験では（pLD401から発現）3xFLAGタグORF2pタンパク質複合体は、それぞれ、重鎖及び軽標識HEK-293T細胞7から精製しました。光標識細胞抽出物を、競合阻害によって3xFLAGタグ付きORF2pの親和性捕捉を防止するために、3xFLAGペプチドでスパイクしました。これは、非仕を発生する可能性があるタンパク質の結合をブロックすることが期待されていません磁気媒体または抗体の非paratopic構造に的。磁気ビーズから溶出した後、重鎖と軽サンプルは、混合後の精製および定量MSで分析したサンプルのいずれかに関連するタンパク質の割合を決定するために（39-SILAC MAP）。 表S1にあり、さらに方法論詳細。 II。銀は軽および重標識材料は同等の結果（HとLを比較）を得ていることを示すゲルを染色し、3xFLAGスパイクイン（LI）の存在下で実施精製が競争的に阻害されたこと。以下は、 表S1に記載されているように、混合H及び前ゲルベースプロテオーム解析にLI画分、からなるクマシーブルーG-250染色ゲルプラグ。 この図の拡大版をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

表S1：MAP-SILAC。このシートは、図S1で説明したMAP-SILAC実験の実行時に得られたデータが含まれています。 この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

Discussion

これら3つのプロトコルは、（1）、低温ミリングによって固体破壊のための細胞を調製（2）遊星ボールミルで破損を達成、及び（3）との複合体中の目的のタンパク質を捕獲アフィニティー細胞粉末からの抽出物を製造するために、タンデムで働きますその生理学的相互作用。多くの異なる細胞溶解技術は、破砕、衝撃、せん断、および/または圧力を用いて機械的/物理的なアプローチ、並びに化学/酵素的アプローチ、異なる長所と短所49,50と各含め、存在します。各研究者は、細胞破壊とタンパク質抽出のための任意の選択されたアプローチは、経験的な最適化（後述）を必要とバイアス51,52を導入する可能性があることを念頭に置いて、彼らの分析のために最も適切な方法を模索することを奨励されています。機械的方法は、タンパク質複合体を破壊することができ、高い熱および/または剪断力を生成することができます。低温ミリングはトンのための試料のLN 2冷却を採用したおかげで加熱効果を回避しますプロセスの彼の継続時間。遊星ボールミルは、粒子サイズ減少53,54の構成要素として、せん断応力などの衝撃や摩擦力、に依存することが理解されます。設定では、我々は、タンパク質複合体の変性を観察していないと報告しました。実際、我々は、抽出されたと明らかに無傷〜50 MDA核膜孔複合体11と「穏やかな」界面活性剤に基づく溶解7を採用する準備よりも高い比活性を示す酵素的に活性なレトロトランスポゾンを取得しました。細胞溶解の化学的/酵素的方法は、細胞の内容物は、 インビトロ環境、細胞膜と構造的高分子の破壊をサポートするが、タンパク質複合体の完全性の維持のために適していないかもしれない（ES中に放出されるという制限に悩まさ） 興味を持っている。しばしば、目的のタンパク質と形成された複合体の成分も標的複合体を安定化させるために必要な条件のいずれもは事前に知られています。固体製粉の主な利点は、破損や抽出がソース材料を可能にして、未結合であり、追加された液体の自由準備（または下-80℃で）保存され、集め、そして便利にオンデマンド実験のために取得することです。 例えば、親和性捕獲のためのインビトロの条件で最適化探索すること。タンパク質相互作用は、従って、抽出剤の量を最小限にする生理学的相互作用を維持するのに有利であることができ、高濃度55,56で最も安定です。一方、実用的な考慮事項があります - タンパク質複合体は、親和性媒体と標的複合体を付き合うためには、不溶性凝集体の自由、細胞外および非粘性水性相に分割する必要があります。さらに、 インビトロでの環境（pH、塩濃度など ）をある程度標準化と制御体系及び再現性のために必要とされます。広報抽出している私たちを見つけます希釈範囲でoduced 1：4-1：9（ワット：v）の品質の結果が得られる実用的かつ理論的な懸念を、満たします。さらに、親和性媒体に細胞抽出物の最適な割合を決定する必要があります。これは、親和性媒体の様々な量と抽出物の滴定により経験的に行われ、さらに以下に説明するように、実験の信号対雑音比で検出可能な効果を有し得ます。標的タンパク質の優れた減少は、典型的には、標的タンパク質の可溶性画分の≥70％であるが、> 90％であることが望ましいと抽出条件の慎重なパラメータで達成することができます。多くのこのような実用的な考慮事項は、参考文献1に記載されています。自家製の選択肢が生存可能であるが、常磁性ビーズは、特殊なマイクロチューブホルダーにネオジム磁石を使用して操作されています。ホルダ内に配置されたとき、ビーズは、磁場の影響下でチューブの側に集まります。次いで、溶液を、ジなしに除去することができますビーズをsturbing。

ここで使用される遊星ボールミルで開発提示低温ミリングプロトコルの1つの制限は、（ 材料の表を参照してください）、材料の最小量を効果的にミルに必要な、このデバイス（> 1グラム）を用いて細胞の粉末を回収していることです。このような量は容易に多くの微生物、細胞株、およびモデル生物を用いて得られ、また多くの場合、実験動物から切除した組織を用いて達成することができます。しかしながら、特定の細胞株が不足することができる量および動物の組織に成長することは非常に困難であり得ます。材料のより少ない量は比較的達成粉末繊度を犠牲にしているが、潜在的に、より小さなコンテナを利用し、他のデバイスを使用して粉砕することができます。また、メカニカルミリング装置のコストは、いくつかの研究室のために非常に高価であり得ます。害虫を用いて手で最も低コスト、を含む、代替的なセットアップ14-19の番号を使用して達成することができる低温ミリングルとモルタル、破損効率が大幅に低下したが。親和性捕捉プロトコルは、典型的には、溶液と標的タンパク質と複合体を捕捉するため、したがって、最大の潜在的に最大のタンパク質抽出を容易にするために、細胞溶解の高効率化を目指します。一方、それはインビトロスプライシング酵母のために実証されている最大の溶解が、インビトロ生化学的活性57,58 内で最大と等しくないことを抽出します。我々はこれまでにテストしたシステムでは、このような問題は認められておらず、低温ミリング時したがって、意図的に私たちの細胞破壊を限定するものではありません。 インビトロ酵素アッセイのために最適化する場合にもかかわらず、この可能性を念頭に置くべきです。典型的には：低温ミリングは、細胞を破壊するための極めて有効な方法であるが不均一な凝集体は、時には目視により観察することができるので、超音波処理の制限された量は、多くの場合、哺乳動物の組織から製造均質全細胞抽出物の利点抽出条件で塩（100から300 mM）の非イオン性界面活性剤（0.1から1パーセントv / v）の濃度を低〜中程度を使用。我々は、これらの凝集体の存在は、その後の親和性捕捉の収率および/または品質を低下させることができることが観察されているので、我々は日常的に（それらが肉眼で観察されていない場合であっても）、それらを分散させるために超音波処理を実施します。凝集体は、以前に粉砕された酵母細胞58からの抽出物で報告されたものに匹敵する凝集膜断片、と一致しています。超音波処理はまた、DNAを切断し、溶液中にクロマチン断片を遊離する、しかし、このプロトコルに適用される超音波処理の程度はかなりDNAを断片化しないためにいくつかのプロトコルで使用されています。関心のある特定のタンパク質に対する優れた親和性リガンドまたは抗体の限られた入手可能（または高コスト）が、別の障害であってもよいです。市販の親和性試薬の広い配列は、モデル生物ゲノムタグ付けやtrのに適しているときに活用することができますアフィニティータグ融合物として目的のタンパク質の発現を可能にする異所性発現ベクターでansfection。しかし、カスタム抗体の生産がますます可能になっており、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方は、アフィニティー捕捉用途に良好に行うことができます。これらの多くの考慮も参照1で詳細に説明します。

親和性媒体の細胞溶解法及び選択が結果に影響を与えることができる方法の例は、 図1に示されています。別の抽出剤によって発揮される効果の例は、参考文献1,11,24に見ることができます。これらおよび他の実験パラメータは、それが困難なのFPを識別すること、親和性捕捉の品質に影響を与える、非特異的な汚染物質を除去するために、「ビーズプロテオーム」と計算手法のリポジトリがFPを40〜43を識別するのを支援するために開発されているからです。それにもかかわらず、このようなアプローチだけsubstit限られた程度59に最適な試料調製のためのUTE。ベストプラクティスを観察し、経験的に親和性捕捉実験を最適化することはさらに後述する、下流の分析のために最高品質のサンプルを提供します。サンプル純度を向上させることができる容易に実現練習は、ネイティブの溶出です。天然の溶出は、最も頻繁に更なる実験のために、インタクトなアフィニティー単離されたタンパク質複合体を得るために使用されます。それはしばしば、サンプルの純度を向上させるように、それはまた、単独で、このために使用することができます。しかし、 図1、パネルIIに示されているように、サンプルの純度を向上させるために、ネイティブ溶出能力は、細胞抽出物中の標的タンパク質の存在量に対する親和性媒体の量を正確に滴定に依存してもよい-媒体が過剰である場合、空いパラトープはネイティブに溶出した画分で観察可能なFPタンパク質のオフターゲットの蓄積を可能にすることができます。ここに記載される試薬および手順を用いて、それは、h私たちの経験をされたよう我々の実験へのFPの唯一最大の貢献者は、かつて生きた細胞のコンテキストから削除標識タンパク質自身であること。 （ 図1.II及び図S1）。このような場合には、抗原の非存在下で無関係なプロテオームを生じる親細胞系コントロールはない実用的な価値があります。同様に、標的抗原以外のものを欠いているタグのみ、またはスパイクのコントロールのために。したがって、我々は直接定量MSを用いてポスト溶解タンパク質相互作用の蓄積を測定するI-DIRT 7,38を 、いつでも実用的に実装します。プロトコルのステップ3.2.7で述べたように、ネイティブの溶出のための手順は、使用する親和性システムの詳細によって異なります。天然の溶出は、最も一般的に親和性媒体から複合体を放出するタグのタグ付けされたタンパク質複合体またはタンパク質分解的切断の競合的置換により達成されます。小さなエピトープタグからなるいくつかの親和性システムがfoは、存在しますRエピトープ自体がタグ付けされたタンパク質複合体60の競合溶出のために有用なペプチドとして利用可能です。同様に、いくつかのプロテアーゼは、具体的には、戦略的に親和性タグを付けた融合タンパク質に61を置か同族部位を切断するために利用可能です。選択された親和性システムの仕様に応じて、適切な溶出方式を採用してもよいです。

一般に、得られた結果の品質を大幅に試料調製の品質によって影響を受けます。ケアと精度を維持しながら、可能な限り迅速にこれらのプロトコルの各ステップを慎重かつ正確に動作することが重要である、と。各操作の効率を理解するために、各工程を経て、目的のタンパク質の分配を追跡することをお勧めします。たとえば、次の問題の細胞または組織における目的のタンパク質がどのように豊富にありますか？おそらく、研究対象のタンパク質（およびその複合体）は、質量特徴づけるために挑戦されます低量による分析。精製された複合体は、一般的なタンパク質染色（約ナノグラム範囲）によって検出可能である場合には、質量分析が成功する可能性が高いです。関心の捕捉タンパク質のみ感受性増強化学発光ウェスタンブロッティング（約ピコグラム範囲）によって検出することができる場合には、質量分析法が有効である可能性が低いです。目的のタンパク質が細胞中で豊富であっても、それが作製された細胞抽出物中にどのように豊富ですか？溶液に、タンパク質のパーティションを行うか、ペレット中にいるのですか？後者の場合、新たな抽出溶液は、回復を改善することができることを考案することができます。細胞抽出物は、親和性媒体と組み合わされた後、どのように効果的にタンパク質が捕捉されますか？タンパク質は、その後の洗浄を介して結合したままでいますか？どのような他の同時精製タンパク質についてはどうですか？プロトコルの適切なステップで、各サンプルのアリコートを保存することにより、これらの質問は簡単に目的のタンパク質に対して、通常、ウェスタンブロッティングによって、答えることができますまたは一般的なタンパク質染色が、他のアッセイもまた、適切であり得ます。 1属性または他の最大化になされるべきトレードオフがあるかもしれませんが、各ステップを最適化することは、捕捉した複合体の収率および純度を向上させます。

多くの研究者のための親和性捕捉の典型的なアプリケーションは、目的のタンパク質の数が少ないためにin vivoでの相互作用に候補を同定することです。これらの候補は、一般に、物理的相互作用の生物学的重要性を実証するために、in vivoでの直交アプローチによって検証に供されます。親和性捕捉はまた、（ほぼ）プロテオーム全体に観察されたタンパク質を同時精製生体内複合体中の推定に関する計算推論を容易にリストを生成するための高スループットの研究によって採用されています。このような研究の多くの例が文献に見出すことができます。このアプローチは、探求人の賛成で任意のターゲットに対して捕獲の条件の最適化を見送りますyの目標;など、推論された複合体自体はほとんど完全に無傷で任意のサンプル中の高純度取得されていません。むしろ、多数の異なる親和性捕捉サンプルの間で観察された組成物中の部分的な重複が推論42の基礎として使用されています。両方のアプローチは、インタラクトームの我々の理解に貴重なデータを貢献します。それにもかかわらず、親和性捕捉の1つの主な利点は、それが頻繁に努力は手順を最適化するために行われることを条件とする、無傷で高度に精製された複合体を得る機会を提供しないことです。私たちは、アプローチの将来は生理的相互作用の色域をより正確に評価し、さらに下流の生化学的、酵素学、および構造研究でより頻繁に使用するために、内因性のタンパク質複合体11の捕獲を最適化する使いやすさと効率性を高めることにあると信じています例えば 、7,9,23を参照します。

Acknowledgments

私たちは彼の貴重なアドバイス、サポート、およびMS機器へのアクセスだけでなく、優れた技術サポートのためのさんケリーR.モロイのための教授ブライアンT. Chaitに感謝します。我々はコピー編集との支援のために氏ケリーベアに感謝します。この作品は、NIHの助成金P41GM109824、P41GM103314、およびP50GM107632によって部分的にサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2 L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62x44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 kPa pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5-2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)

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References

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Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ
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LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P.… More

LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).

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