Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54518
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Здесь мы описываем протоколы для срыва клетки млекопитающих твердотельного размола при криогенной температуре, производят клеточный экстракт из полученного порошка клеток, и изолируют белковые комплексы, представляющие интерес с помощью аффинной захвата на антителах в сочетании микронного масштаба парамагнитных бусинок.

Abstract

Affinity захват является эффективным методом выделения эндогенных белковых комплексов для дальнейшего изучения. При использовании в сочетании с антителом, этот метод также часто называют иммунопреципитации. Сродство захвата могут быть применены в стендовом масштабе и в контексте, с высокой пропускной способностью. В сочетании с белком масс-спектрометрии, сродства захвата оказалась рабочая лошадка анализа интерактомные. Хотя есть потенциально много способов, чтобы выполнить многочисленные этапы, следующие протоколы реализации наших благоволят методов. Две особенности являются отличительными: использование cryomilled порошка клеток для получения клеточных экстрактов, а также антитело в сочетании парамагнитными гранулами в качестве аффинной среды. Во многих случаях мы получили превосходные результаты с результатами, полученными при использовании обычных методов захвата сродства. Cryomilling позволяет избежать многочисленных проблем, связанных с другими формами клеточного обрыва. Это обеспечивает эффективное разрушение материала, избегая при этом denatвопросы, связанные с гурирование нагрева или вспенивания. Он сохраняет нативного белка концентрации вплоть до точки экстракции, смягчающие макромолекулярную диссоциации. Это уменьшает время, экстрагированные белки проводят в растворе, ограничивая пагубное ферментативной активностью, и это может привести к снижению неспецифической адсорбции белков с помощью аффинной среды. Микронных магнитного сродства СМИ стали все более распространенным явлением в течение последних нескольких лет, все чаще заменяют традиционную agarose- и сефароза-СМИ. Основные преимущества магнитных носителей включают в себя, как правило, более низкую неспецифической адсорбции белка; предельный размер исключения, потому что белок, связывающий комплекс не происходит на поверхности шарика, а не в порах; и легкость манипулирования и обработки с помощью магнитов.

Introduction

Типичное применение представленных процедур является стабилизация и получить высокий выход и чистоту эндогенных белковых комплексов , представляющих интерес для межатомного характеристик 1. Понятно , что динамические сети обоих стабильно и скоротечно , ассоциированных макромолекулярных комплексов, в основном состоящие из белков, оркестровать клеточные процессы 2,3. Хотя существует множество экспериментальных подходов для выявления белок-белковых взаимодействий, сродства захвата является одним из наиболее широко используемых методов выделения и рассекает физиологических белковых комплексов 4-6. Кроме того, этот метод имеет преимущество с получением макромолекулярных комплексов как физических лиц, а не только в качестве точек данных в считывани; Предпочтительно, чтобы полученные таким образом комплексы могут быть использованы в множество дополнительных вниз по течению биохимических, ферментативных и структурных анализов 7-9. Представленные протоколы были разработаны в ответ на необходимость карте PROTEIсетей взаимодействия н-белка и характеризуют высокомолекулярные комплексы в их роли в качестве эффекторных молекул клеточной биологии. Они подробно описаны в отношении их применения в клетках млекопитающих, выращенных в культуре ткани, но в равной степени применимы к широкому диапазону биологических образцов заданных соответствующей системой конкретных настроек.

История сродства захвата уходит корнями в начале двадцатого века с первыми экспериментами иммуноаффинной хроматографии - напоминающие то, что обычно называют в настоящее время, как иммунопреципитации (IP) - появление в литературе в начале 1950-х годов. Mainstream использование техники дальнейшее развитие через этого столетия к настоящему 10-13. Различные клетки и молекулярно - биологические исследования использовали механическое разрушение клеток путем измельчения при криогенных температурах , по крайней мере за последние сорок лет 14-19; и молекулярно-разделений, использующие (супер) парамагнитные шарики имеют клювОме все более распространенным в течение последних двух десятилетий 20. Сочетание этих различных технологий служит для синергического улучшить результаты , которые могут быть получены в экспериментах белкового комплекса захвата сродства 1, о чем свидетельствует обширный объем работы производимой нами и более широким научным сообществом 7,9,11,18,19,21 -23. Поддерживающие результаты представлены на рисунке 1.

Коллекция предостережений и соображений , применимых к выполнению эффективных экспериментов захвата сродства можно найти в ссылке 1. Как правило , этот подход является наиболее целесообразным: (I) каталогизировать interactors белка интереса, то есть, использовать белок масс - спектрометрии (MS) , чтобы идентифицировать неизвестные ранее copurifying белки (Поисковый анализ); (II) , анализ на присутствие конкретного взаимодействующего партнера, то есть, использовать MS или вестерн - блот для определения конкретного белка или ограниченный набор белков , подозреваемое вствлять с представляющим интерес белком (проверка гипотез); или (III) готовят эндогенно собранные белковые комплексы, содержащие белок, представляющий интерес для дальнейшего изучения с помощью дополнительных методов (препаративный) проработки. Прежде чем приступать к сродства захвата экспериментального режима абсолютно необходимо, чтобы иметь сродство реагента высокого качества, который связывается с белком-мишенью, обычно это IP-компетентны антитела против нативного белка-мишени интереса или по отношению к метке, приложенном к слитого белка. Также важно иметь соответствующие методы экспериментального считывания на месте: общее окрашивание белка (например, Кумасси синим, Sypro Ruby, или серебро, следуя SDS-PAGE), вестерн-блоттинга и белка MS все обычно используемые в сочетании с сродства захвата 1. Представленные протоколы используют антитела, конъюгированного магнитные гранулы в качестве аффинного среды. В то время как функция аффинной среды первоначально может быть подтверждено при проведении испытаний, которые используют несколько экспериментальных параметров, чтобыполучить наилучшие результаты каждого эксперимента должны быть эмпирически оптимизированы 1,11,24. Протоколы разделены на три отличительные фазы: (1) Получение замороженного клеточного материала; (2) поломка ячейки твердотельным размола при криогенной температуре; и (3) экстракции белка и захвата сродства с использованием антител связью парамагнитные шарики.

Protocol

1. Сотовый Заготовка и Замораживание

  1. Grow 1-8 г клеточного материала с использованием соответствующих условий культивирования для клеточной линии , представляющей интерес 25,26. Этот протокол оптимизирован до 8 г клеток (~ 10 9 клеток), модифицированный из ссылок 19,27,28. Как правило, ~ 5 г НЕК-293 или HeLa клетки могут быть получены из восьми 500 см 2 культуральных планшетах , выращенных до ~ 90% сплошности.
    ВНИМАНИЕ: Эти протоколы используют жидкий азот (LN 2), способного вызвать серьезные криогенные ожоги. Дон защитную одежду и применить соответствующие меры предосторожности при обращении.
  2. Слейте среду роста (отходов) в большой стакан.
  3. Место культуры блюдо на льду в большой прямоугольной ледяной сковороде.
  4. Добавьте 20 мл охлажденного на льду 1x фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS) в культуральную чашку и освободить клетки от чашки с помощью большого клеточным скребком; перенести клетки в 50 мл пробирку, предварительно охлажденным на льду; держать трубку на льду.
    ЗАМЕТКА: Для всех шагов обработки клетки используют электро-дозаторов набор на "низкий" и 25 мл пипеток, чтобы избежать чрезмерного стрижку клеток во время манипуляций переноса. Устройте 50 мл сбора трубок и 1x PBS в ведерке со льдом до начала процедуры.
  5. Добавить еще 10 мл охлажденного льдом 1x PBS к тому же блюдо. Соберите оставшиеся клетки и передавать их в 50 мл трубки.
  6. Повторите эти действия для каждого блюда; Клеточные суспензии из различных блюд могут быть объединены, чтобы уменьшить количество проб и пластиковых отходов.
    Примечание: Поскольку сами клетки не составляют большую часть объема суспензии, три пластины стоит клеточной суспензии могут быть объединены в две 50 мл пробирки. Из 50 мл пробирки провести на самом деле больше, чем номинальный объем, восемь пластин, как правило, могут быть распределены по пяти таких трубок.
  7. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 х г, 4 ° С.
  8. Тщательно слейте супернатант. Ресуспендируют каждую гранулу в 10 мл охлажденного на льду 1x PBS. Укрепить RESUтовар.Обращайте гранулы, до 5 в 50 мл пробирку, чтобы уменьшить количество образца.
  9. Центрифуга 5 мин при 1000 х г, 4 ° С.
  10. Тщательно слейте супернатант. Ресуспендируют осадок в 10 мл охлажденного на льду 1x PBS
  11. Извлекают поршень из шприца 20 мл и установить его в сторону. Закрывают сопло шприца и передачи клеточной суспензии к ней.
  12. Поместите шприц в 50 мл пробирку и центрифугируют 5 мин при 1000 х г, 4 ° С.
  13. Аспирируйте супернатант с тонким кончиком пипетки не прикрепленной к системе вакуумной ловушки, пока только верхний слой клеток начинает всасывать вверх. Это приводит к тому сырого осадка клеток.
  14. Открывать шприц, вставьте поршень и капать клетки непосредственно в большой пластиковый стакан , наполненный LN 2, состоявшейся в LN 2 ванны в пенопластовую коробку. Насильственно погрузить оставшиеся клетки из шприца.
  15. Передача замороженных клеток в пробирки по 50 мл путем заливки. Неплотно колпачок трубки , чтобы избыток LN 2 испаряться; держать трубчик в течение ночи при температуре -80 ° C. Затянуть крышки полностью на следующий день. Замороженную ячейка не может храниться таким образом, при -80 ° С до cryomilling.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не плотно закрыть трубы , прежде чем все LN 2 заметно испаряется, в противном случае избыточное давление может привести к взрыву трубки. Не закрывая трубы после того , как LN 2 испарится может привести к накоплению иней на материале клеток, добавление избыточного веса воды и эффективно уменьшая концентрацию белка при фрезеровании.

2. Криогенная Срыв замороженных клеток

Примечание: Все инструменты для фрезерования и манипуляций должны быть предварительно охлаждены с LN 2. Графинчик потребуется для добавления LN 2 внутри кувшина и для заливки LN 2 над верхней закрытой фрезерном баночке. Самодельный инструмент показан в ссылке 19. Криогенные перчатки будут необходимы , чтобы справиться с LN 2 охладили фрезерного устройства. фрезерныебаночка крышки , используемые здесь (см Таблицу материалов) , как правило , поставляются с резиновой прокладкой , установленной; это необходимо будет заменить коммерчески доступной крышкой прокладка Teflon надежно выполнить следующий протокол. Кроме того, поскольку давление газообразного N 2 можно построить до высоких уровней в банке во время фрезерования, мы рекомендуем установить имеющийся в продаже 5 бар / 500 кПа клапан давления в качестве выхода безопасности меры предосторожности 28.

  1. Удалить клеточные шарики из хранения -80 ° C и держите в держателе трубки 50 мл в LN 2 ванны.
  2. Предварительное охлаждение 50 мл баночку, два 20 мм шары, и крышка в чистой прямоугольной ведро льда , содержащего LN 2. Предварительное охлаждение (PTFE) изолятор политетрафторэтилен, если с помощью одного; либо набор шайб (см ссылку 27), или рукав и-шайба (рисунок 2). Предварительное охлаждение завершается , когда насильственный кипения LN 2 штилей.
  3. Установите соответствующий противовесом намельница.
    Примечание: Это будет равна массе банку, банку крышкой, фрезерные шары используются, а количество клеток, которые будут добавлены к банку. При использовании любых из PTFE изоляторов, также должны быть включены их массу. Мы предлагаем записи массы фляги, крышки, и шарики (а их суммарная масса, в том числе любого изолятора, используемого) заранее и записи их на информационном листе хранится около мельницы.
  4. Использование щипцов, поместите два предварительно охлажденный 20 мм помольных шаров и замороженных клеток внутри предварительно охлажденный фрезерного банку.
    Примечание: Из-за небольших потерь материала на банку и шаровых поверхностей при фрезеровании, процент выздоровевших материала увеличивается как масса клеток измельченной возрастает. По методу, описанному, материальные потери являются весьма скромными, будучи порядка ~ 0,3 г массы мокрого клеток (WCW). рекомендации изготовителя указывают максимальный объем выборки должен быть загружен ~ 1/3 объема кувшина. 29 Общий объем шаров должен быть ~ 1/3 и гemaining ~ 1/3 свободное пространство для свободного движения шаров.
  5. Добавить LN 2 к банку до ~ ½ полный, поместите крышку на банку и передать сборку на мельницу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала установите выбранный изолятор, если используется один.
  6. Зафиксируйте сборку на месте и выполняют три цикла фрезерования с помощью следующей программе: 400 оборотов в минуту, 3 мин, реверс вращения каждую минуту, без интервала перерыв. Охлаждают фрезерный банку с LN 2 между каждым циклом.
    Примечание: Во время фрезерования особым местом clunking шум генерируется, как шары сталкиваются в банке в планетарном движении. Если эти звуки не слышны, фрезеровка не происходит. Завершает цикл фрезерования, не считать этот цикл, переместить узел банку обратно LN 2 и изучить содержимое банки. Убедитесь в отсутствии льда образовала и если у него есть, чип его подальше от стен баночки с предварительно охлажденный шпателем. Начните заново с шага 2.5.
    Если не используя изолятора или изолятора шайбы, перемещения узла банку обратно LN 2 до ~ ½ полной каждый раз. LN 2 добавлено будет испаряться в банке , так как температура в банке увеличивается во время фрезерования. Это приводит к увеличения давления внутри банки. Поэтому, когда расцепления банку с мельницы, отпустите зажим очень медленно. Если зажим быстро высвобождается, порошок клетка может бежать с быстрым разгерметизации. Медленное высвобождение зажима позволяет давление, чтобы избежать из кувшина в нежном, контролируемым образом, и предотвращает потерю клеточного материала. Нежный побег газообразного N 2 часто можно услышать шипение , как зажим медленно высвобождается - это нормально.
    При использовании рукавного и-пака изолятор, узел сосуд может быть оставлен в мельнице и LN 2 добавили в сборку изолятор / баночки на месте.
  7. Переместить банку обратно в LN 2, и пусть отдых на мгновение , чтобы остыть. При использовании рукавного и-пака изолятор, сосуд может быть удален из рукава шIth при помощи двух шпателей, обеспечивая рычаги с обеих сторон. После того , как баночка отдыхает в LN 2, осторожно снимите крышку, удалите шары с помощью щипцов, и передать порошок предварительно охлажденный 50 мл пробирку с использованием предварительно охлажденного лопаточку. Добавление небольшого LN 2 к открытой банку / порошка может помочь вытеснять порошок , который запекшейся на шары, прежде чем удалить их.
    Примечание: После того , как сосуд был открыт, добавьте небольшое количество LN 2 к нему , прежде чем снимать шары. Это поможет восстановить порошок запекшейся на поверхности. порошок клеток следует проводить при температуре -80 ° C или ниже до использования. По нашему опыту, порошок клетка может храниться таким образом, по существу, на неопределенный срок, не влияя на производительность.

3. Affinity Захват белковых комплексов из клеточных экстрактов

Примечание: Следующий протокол реализует аффинные носители, состоящие из аффинного лиганда, наживку, или антитело, которое взаимодействует с представляющим интерес белком, товарищескойupled до микронных парамагнитные шарики. Они могут быть приготовлены в доме 19,30, с использованием коммерчески доступных наборов, или приобретенных в качестве готовых реагентов.

  1. Экстракт клеток Получение
    Примечание: При обращении порошка клеток, не забудьте использовать посуду и трубки предварительно охлажденный с LN 2. Трубки , содержащие порошок клеток всегда следует проводить на LN 2 , когда не при -80 ° С. Поместите 50 мл трубку (ы) , содержащий порошок клеток в стойку трубки, в пенопластовый контейнер с LN 2.
    1. Взвешивают 100 мг порошка клеток в пробирке с 1,5 или 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обнаружили, что это количество клеток является хорошей отправной точкой, которая обычно дает целевой белок в нескольких десятков до сотен нанограмм диапазона после сродства захвата для умеренно выраженного белка (~ 50 кДа масс, присутствует в тысячах экземпляров в клеток), предполагающее эффективность добычи и захвата цели являются ≳70%. Такие выходы обеспечивают прямой visualizданию очищенной фракции путем SDS-PAGE и окрашиванием белка.
    2. Таре аналитические весы с пустой пробирке. Разлить порошка клеток в пробирку с использованием LN 2 охладили ложкой или лопаточкой. Проверьте массу порошка дозируемого в трубке на аналитических весах.
      Примечание: Для того, чтобы облегчить взвешивание из клеточных порошков, могут быть использованы небольшие объемные мерные ложки. Установлено , что они дать воспроизводимые результаты (см ссылку 19). Мы нашли лучшие результаты, используя завинчивающейся крышкой или «безопасной блокировки 'микроцентрифужных трубки. Давление от испарения LN 2 , которые могут входить трубы может вызвать стандартные микроцентрифужных трубки к поп открытой во время последующего потепления непосредственно перед добавлением раствора для экстракции - потенциально может привести к потере образца.
    3. Откройте трубку (или ослабить завинчивающейся крышкой) с порошком клеток и дать постоять при комнатной температуре в течение 1 мин. Это ослабит давление внутри трубы и не допустить к немедленному замораживанию экстракциираствора при добавлении к порошку. Ни один оттаивании не наблюдается в течение этого 1 мин инкубации.
    4. Добавить 400 мкл экстрагентом с добавлением ингибиторов протеазы и вихрем кратко, а затем, удерживая на льду в то время как перейти к этапу 3.1.5. Образцы не должны проводиться на льду между все последующие манипуляции до вымывания.
      Примечание: Наилучший состав экстрагента будет зависеть от белкового комплекса (а), который должен быть очищен. Некоторые общие рекомендации представлены в таблице 1 и опорных ссылок.
    5. Используйте микроострия ультразвукового дезинтегратора, чтобы дать образца короткий низкий энергетический импульс, чтобы рассеять любые агрегаты. (Ultra) гомогенат с 4-импульсами (2 секунды каждый, 2 А, примерно 15-20 Дж полной энергии).
      Примечание: вортексе распыляет порошок клеток в экстрагент, но в зависимости от характера раствора, можно наблюдать некоторые агрегаты. Мы обнаружили, что диспергирование этих агрегатов обеспечивает лучший выход во время последующего захвата сродства. Краткий микронаконечником SoniКатион легко разгоняет эти агрегаты. Решение должно появиться полупрозрачный, но однородной, без видимых агрегатов. Водяная баня sonicators имеют тенденцию быть слишком низкой мощности, чтобы эффективно разгонять такие агрегаты без значительного более длительного времени обработки проб, но могут быть пригодны с соответствующими параметрами.
    6. Разъяснение экстракта центрифугированием (например, 20000 XG, 10 мин, 4 ° С).
      Примечание: аликвоту осветленного экстракта клеток может быть сохранена для сравнения с содержанием гранул, захват супернатанта после аффинной и фракции, полученные после элюирования из аффинной среды для определения эффективности экстракции и захвата целевого белка , например, с помощью Вестерн - блоттинга (см Обсуждение).
    7. Удалить супернатант (топленое экстракт) и приступить к захвату сродства.
      Примечание: Осадок может быть повторно экстрагируют в SDS-PAGE буфера загрузки образца при 70 ° С, чтобы определить степень высвобождения целевого белка Dйти во время начального неденатурирующих экстракции по сравнению с экстрактом, полученным на этапе 3.1.6.
  2. Affinity Capture
    1. Prewash магнитного сродства среды. Это может быть сделано в то время как клеточные экстракты центрифугированием.
    2. Поместите пробирку (ы) на магните. Шарики будут накапливаться на стороне трубки, в течение нескольких секунд, позволяя решение для хранения данных, которые будут удалены.
    3. Добавьте 500 мкл экстракционного раствора к гранулам. Вкратце вихревая смесь на средней скорости (достаточный для ресуспендирования). Пульс-спина трубки в мини-центрифуге, чтобы собрать все содержимое в нижней части. Это обеспечивает минимальное унос решений. Поместите трубки на магнит и аспирация решение.
      Примечание: Магнитные носители с отличительными характеристиками доступны из широкого спектра коммерческих поставщиков. Результаты могут варьироваться в зависимости от этих характеристик, в том числе размер гранул, равномерности покрытия поверхности, и химии сочетания антитела. Бок-сиде испытаний в приложении, рекомендуется, прежде чем остановиться на реактивом выбора.
    4. Начать захват сродства путем передачи осветленной клеточного экстракта в 1,5-2,0 мл пробирку, содержащую предварительно промытый сродства среды и вихрь кратко ресуспендирования.
    5. Инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при непрерывном осторожном перемешивании на вращающей колеса; гранулы должны оставаться взвешенными по всей инкубации.
    6. Пульс-спиновые пробирки в мини-центрифуге, чтобы собрать все содержимое в нижней части трубы. Аспирируйте супернатант и мыть бисером три раза с 1 мл раствора холодного отжима, как описано в шаге 3.2.3. Место труб на магните. Удалить решение. Продолжайте добавлять следующее решение и повторите. Во время стирки 2 - й, передают бусинки и моющий раствор вместе свежей пробирке с помощью пипетки. Это снижает степень загрязнения образца, в точке элюирования, случайными белки, адсорбированные на стенках трубки, используемых для инкубации с тон клеточного экстракта. После стирки 3 - й, гранулы должны быть пульс формуемых кратко в мини-центрифуге , чтобы собрать все содержимое на дно. Поместите трубку обратно на магнит, и удалить остатки жидкости. Это позволяет удалить последние несколько мкл раствора перед элюированием, обеспечивая Элюированные образцы будут иметь единые объемы. Это также гарантирует, элюирование будет эффективным, поскольку раствор элюции не будет разбавлен остаточной стирке; такие остатки могут также вносить вклад в их солевые эффекты и изменять миграцию белков в SDS-PAGE (см ниже).
      ПРИМЕЧАНИЕ: аликвоту пост-связывающим супернатанта может быть сохранен для сравнения с осветленной экстракта, генерируемого в 3.1.6. Вестерн-блот-. Результат будет указывать на степень истощения целевого белка из клеточного экстракта.
    7. Элюции либо нативный или денатурации способом; рассмотреть стратегию лучше всего подходит для применения ниже по течению 1.
      Примечание: Подробная информация о родном элюирования Strategies будет зависеть от используемого аффинной метки (обсуждение см). Для большинства пользователей, денатурирующих элюирование SDS-PAGE образца буфера с последующим анализом образца путем SDS-PAGE с окрашиванием белка 31, будет наиболее практичным первоначальным подходом.
      Примечание: Состав буфера для образца будет зависеть от системы электрофорез используется. Многие лаборатории бросают свои собственные Трис-глицин гели, используя разрывной электрофореза и системы 32-34 буфера Лэммли. Рецепт общего образца буфера (1x) включает в себя: 10% (вес / объем) сахарозы, 50 мМ ДТТ, 2% (вес / объем) SDS, 62,5 мМ Трис-Cl рН 8,8, 0,0004% (вес / объем) бромофенолового синий 31 , Мы предлагаем подготовку к 1.1x запас, который опускает DTT. 1/10 объема 500 мМ ДТТ должен быть добавлен к образцу до того SDS-PAGE (см ниже). Многие коммерчески доступные системы SDS-PAGE также доступны; они могут включать в себя специфические для данной системы буферов выборок.
    8. Добавить SDS-PAGE буфера для образцов без восстанавливающего агента (для уменьшения высвобожденияцепей антител, полученных из гранул) и инкубируют в течение 5-10 мин при комнатной температуре при перемешивании.
      Примечание: Это будет мешать большинству аффинности на основе взаимодействий, освобождая захваченные белки в супернатант. Более стойкие взаимодействия могут получить выгоду от повышенной температуры для высвобождения (обычно 70 ° C достаточно).
    9. Собрать и сохранить супернатант. Образцы могут быть заморожены при -20 ° С в течение короткого хранения (несколько дней) или -80 ° С в течение длительного хранения, пока анализ не требуется.
    10. Тема образцов в SDS-PAGE с последующим окрашиванием белка с использованием стандартных методик 31. МС может быть использована для характеристики состава образца 1. Отдельные полосы белка могут быть вырезаны для идентификации или весь образец можно охарактеризовать в одном анализе с помощью электрофореза пробы только на короткое время (4-6 мм в гель) и обработку всех белков в образце вместе как "гель пробки.
      Примечание: Добавить DTT перед тем Первотин-электрофорез. Если планируете приступить к MS, образцы могут быть алкилируют после электрофореза 35; Тем не менее, она часто удобнее алкилата перед электрофорезом 36.

Representative Results

На рисунке 1, панель ввода показывает , что cryomilling и магнитные шарики могут работать вместе , чтобы улучшить качество образца. Панели IA-С показывают , что материал , содержащий нерастворимый носитель , используемый для захвата сродства могут влиять на восстановленную протеом 19. Белок, представляющий интерес, очищенный FLAG-меченный бактериальной щелочной фосфатазы (БАТ), был обработан в экстрактах клеток человека. БАП не ожидается специфически взаимодействовать с и copurify человеческие белки. Сигнатура copurifying белков, что определяется по SDS-PAGE и окрашиванием Кумасси варьироваться в зависимости от используемой среды. Микронных магнитные шарики показали чистейшую профиль, что указывает на относительно низкий уровень неспецифической адсорбции белка. Панели ID и IE иллюстрируют, что метод лизиса клеток также может влиять на восстановленную протеом. В приведенном примере, эндогенный сложный белок (следующий комплекс 37), подвергали аффинной captuповторно из cyromilled или озвученная клетка добывает 19. Меньшее наблюдались высокие массовые загрязняющие вещества, когда клеточный экстракт был получен из порошка cryomilled клеток.

Задача при использовании захвата сродства для изучения эндогенных белковых комплексов является то, что это может быть трудно различить добросовестных физиологические interactors белка интереса со стороны ложных срабатываний (ФПС). Рамочные могут возникнуть из многих источников, в том числе неспецифической адсорбции на трубах и сосудах, сродство среды, антитело или аффинного лиганда, и / или к белку самого интереса. В результате, значительные усилия должны быть направлены на оптимизацию процесса захвата. Обнаружение FPs остается одной из центральных задач , для которых были разработаны большое количество различных инструментов, в том числе экспериментальной 38-40 и вычислительные подходы 41-43, каждый с различными плюсы и минусы. В наших опытах мы ранее отмечали образец FР связывание белка, полученный после инкубации α-FLAG магнитной среды с экстрактами клеточного контроля, который был отличен от рисунка, полученного в присутствии 3xFLAG-меченных белков. Кроме того, эти Рамочные могут быть освобождены из среды путем инкубации с 3xFLAG пептида 7. Это наблюдение согласуется с оппортунистическими связывания РЗУ к α-FLAG паратоп при отсутствии родственного эпитоп. Понимание природы этого FP фоне очень важно, поскольку многие исследования используют немаркированного 'родительской линии клеток "в качестве притворной контроля за сродства захвата; поэтому эти элементы управления могут оказаться неподходящими для определения специфичности взаимодействия с меченым белком. Для определения фонового связывания вклад нашей аффинной среды, когда paratopes антител заняты или нет, мы провели имитировали эксперименты захвата сродства с использованием α-FLAG магнитной среды и клеточных экстрактов НЕК 293T (не выразил меченый белок) в присутствии или в отсутствие 3xFLAGПептид шип-в. Результаты показаны на рисунке 1, панель II. Если коротко, то α-ФЛАГ магнитный носитель инкубировали в клеточных экстрактах (из ≳10 мг / мл белка), содержащем 500 мМ NaCl и 1% об / об Тритона Х-100 в 20 мМ HEPES-Na, рН 7,4 в течение 30 мин. Среду затем инкубировали с 1 мг / мл пептида 3xFLAG конкурентно замещать любые белки, которые связываются с α-FLAG паратоп нативно или с SDS-PAGE образца буфера для достижения денатурации элюции. Кроме того, тот же самый эксперимент проводили, когда клеточные экстракты подсыпали 1 мкг / мл и 10 мкг / мл 3xFLAG пептида. Все Элюированные фракции подвергали SDS-PAGE и окрашиванием серебром. Мы наблюдали , что при отсутствии родственным эпитопом, α-ФЛАГ среда действительно представляет собой обнаруживаемый уровень фоновых белков , которые можно элюировать с 3xFLAG пептида - в приведенном примере на рисунке 1-II, доминирующий вид наблюдался при температуре от 37 и 50 кД. Образец элюировалиSDS-PAGE буфера образца была сравнима с дополнительными известными видами. Тем не менее, в присутствии 1 мкг / мл пептида 3xFLAG, FP связывания с аффинной среды было устранено до уровня ниже уровня обнаружения и не наблюдалась ни в одном нативных или денатурирующих элюированных фракций. Этот результат позволяет предположить, что незанятые paratopes антител могут быть беспорядочные при отсутствии их родственными эпитоп и вносят значительный вклад в протеомом, полученного во время близости захвата даже на наличие антител, которые связываются с их эпитоп на высокой аффинностью, как это имеет место для 3xFLAG / & alpha; FLAG M2 спаривание. Он также suggestd, что очень строгие условия с использованием высокой концентрации соли, часто выбирают для снижения неспецифического связывания, может оказаться неэффективным при отсутствии взаимодействия антиген / антитело. Для того, чтобы последующие мы провели аналогичный эксперимент , включая анализ с помощью SDS-PAGE, а также количественного MS (рис. S1). Из 347 белков количественно, мы наблюдали, что каждый белок за исключением одного (ложной дискотекеочень скорость = 1%; Таблица S1) был связан с 3xFLAG-меченой приманки белка по сравнению с пептидом 3xFLAG шипами контрольного образца. Эти результаты указывают на то, что в наших экспериментах подавляющее большинство белков наблюдается, скорее всего, совместно очищают с меченым белком или вне цели побочные продукты незанятых α-FLAG paratopes. По нашему опыту, высокие результаты захвата сродства сигнала к шуму являются проиллюстрировано в SDS-PAGE и окрашиванием белка дискретным рисунком острых, обильными и примерно стехиометрических полос, а также малочисленность фонового окрашивания из других тусклых полос; многочисленные примеры этого принципа можно увидеть в ссылке 11.

Мотивом использованием PTFE изолятор (рекомендуемом) , когда cryomilling является снижение скорости потепления кувшина при фрезеровании, смягчить бремя повторного охлаждения LN 2 во время процесса измельчения, и уменьшить степень льдаобразование в банке. Это облегчает последовательную работу фрезерного и облегчает обработку порошка клеток. Пример изоляторов можно найти в ссылке 27 (шайбы) и показано на рисунке 2, ниже (рукав и-шайбы).

Рисунок 1
Рисунок 1: Выберите Представитель Результаты. (I) Эта панель была изменена из ссылки 19. Кумасси синим окрашивают в SDS-полиакриламидном геле. (СЛЕВА) микронных магнитные шарики показывают ниже пределы связывания мишени, чем агарозы на основе средств массовой информации. (A) , магнитные шарики; (В) традиционные агарозы; (C) железо пропитанные (магнитный) агарозы; каждый из которых соединен с антителами анти-FLAG M2 и используется для захвата FLAG-меченого бактериальной щелочной фосфатазой (BAP; маркированы) в экстрактах с шипами, полученных из cryomilled клеток НЕК-293. Агарозы на основе очищенийпоказали более высокие уровни неспецифической адсорбции (немаркированные полос). (справа) Экстракты, полученные из клеток HeLa cryomilled демонстрируют более низкую адсорбцию вне цели на антитело в сочетании магнитных шариков, чем произведенные озвучивания, когда используется для очистки эндогенного белкового комплекса. LAP-меченый 44 RBM7 аффинно захвачено с использованием магнитных шариков , соединенных с поликлональных анти-GFP антител очистить СЛЕДУЮЩИЙ комплексную 19,37 (D) Экстракт получают из cryomilled порошка; (Е) экстракты получают путем обработки ультразвуком интактных клеток. Вертикальная черная полоса выделяет область геля, где наблюдаются обогащены образца, полученного путем обработки ультразвуком высокой массовой неспецифические interactors. Черные стрелки показали ожидаемые конкретные interactors (маркированы). Полосы, наблюдаемые ~ 50 кД в полосах D и Е связаны с тяжелыми цепями IgG ламу. (II) , окрашенных серебром SDS-полиакриламидном геле. (Std.) Макет захвата сродством осуществляется на НЕК-293Т-клеток экстрактов стандартным способом. После захвата, элюирование связанного материала было достигнуто с помощью (N) неденатурирующем элюции с 1 мг / мл 3xFLAG пептида или (г) денатурирующих элюирование в SDS-PAGE образца буфера; (РВ 1) в качестве Std. но пептид 3xFLAG был включен в экстракционный раствор при 1 мкг / мл, чтобы блокировать α-FLAG paratopes на аффинной среды; (PB 10) в качестве PB 1, но в присутствии 10 мкг / мл 3xFLAG пептида. IgG-связанные группы и 3xFLAG пептид помечены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Рукав-и-шайба PTFE изолятор. ПТФЭ баночка 250 мл показан (1). 50 мл из нержавеющей стали фрезерование сосуд (2) помещается внутрь ПТФЭ банку (3) и обеспечиваетвозможность оставить фрезерного банку, установленной внутри мельницы между циклами. Верхняя шайба из PTFE изолятор (2) используется между узлом зажима и крышке банки. Для того, чтобы охладить установленную банку и изолятор в сборе (3), LN 2 добавляется непосредственно в корпус изолятора, окружающий сосуд. Следующий цикл фрезерования затем может быть начато. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

реактив Похожие Концентрация Заметки
хлористый натрий 0,1-0,5 М Высокие концентрации (> 300 мм), как правило, улучшают экстракцию общего белка и сохранить фон низкий, но может стирают некоторые иначе стабильную Интеромактеры. Концентрации ниже 150 мм не являются, как правило, эффективны в снижении неспецифического фона.
ацетат аммония 0,2-2 M Соль, состоящая из двух буферов, что дает нейтральный рН раствора 57. Более высокие концентрации стабилизировать некоторые белковые комплексы. Кислотные растворы могут возникнуть в результате старых, неправильно хранящихся кристаллических запасов по причине потери аммиака. Никакого дополнительного буфера, рН или соли не требуется в экстрагентов, содержащих ацетат аммония. Может быть объединен с NaCl модулирует полученные результаты.
твина 20 0,1% об / об Неионогенного моющего средства 58; как правило, в сочетании с NaCl.
Тритон Х-100 0,5-1% об / об Неионогенного моющего средства 58; как правило , в сочетании либо с NaCl или NH 4 CH 3 CO 2 H
CHAPS 5 мМ Цвиттерионного моющее средство 58 </ SUP>; как правило, в сочетании с NaCl.
саркозила 1 мМ Анионный детергент 58 , что уменьшает фон и может сдирать устойчивые комплексные компоненты, потенциально открывая бинарного соединения; как правило, в сочетании с NaCl.
Трис-Cl 20 мМ рК а 8,8 при 4 ° С, 8,1 при 25 ° С.
(РН 8,0)
HEPES-Na 20 мМ рК а 7,8 при 4 ° С, 7,5 при 25 ° С. NaOH или KOH использовали для рН уравновешивания в зависимости от соли (например, NaCl, KCl, или СН 3 СО 2 К) , используемый в экстрагент.
(РН 7,4)

Таблица 1: Несколько предложил реагенты полезны для очистки белковых комплексов. Эта таблица лISTS некоторые реагенты, которые мы нашли полезными для очистки белковых комплексов из клеточных линий человека, с предложенными рабочими концентрациями. Типичный экстрагент препарат содержит рН буфер, соль и моющее средство 1,11,24,45-48. Лучшая практика заключается в определении наименее сложной комбинации реагентов, что приводило к получению желаемого результата.

Рисунок S1
Рисунок S1: Смешать После очистки (MAP - ) SILAC анализ ложных срабатываний. I. Принципиальная схема: В этом эксперименте 3xFLAG-меченый белковых комплексов ORF2p (выраженные из pLD401) были очищены от тяжелых и легких меченых клеток НЕК-293Т 7 соответственно. Свет меченый экстракт клеток подсыпали 3xFLAG пептида, чтобы предотвратить сродства захват 3xFLAG-меченого ORF2p путем конкурентного ингибирования; это не ожидается, блокировать связывание белков, которые могут произойти не-Удельныйчески с магнитной среде или не-paratopic структур антитела. После элюирования из магнитных шариков, тяжелые и легкие образцы были смешаны после очистки и анализировали с помощью количественного МС (MAP-SILAC 39) для определения доли белков , ассоциированных с каждой пробе; далее методологическая деталь находится в таблице S1. II. Серебро окрашивали гель, иллюстрирующий, что легких и тяжелых меченных материалы дают сравнимые результаты (сравните с L H), а также о том, что очистка проводится в присутствии 3xFLAG шип-в (LI) был конкурентно тормозится. Ниже приводится кумасси синий G-250 гель , окрашенный штекер , состоящий из смешанного Н и LI фракций, перед гелевой основе протеомики анализа, как описано в таблице S1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить большую версию этой фигуры.

Таблица S1:MAP-SILAC. Этот лист содержит данные , полученные при выполнении MAP-SILAC эксперименте , описанном на рисунке S1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

Эти три протокола работают в тандеме, чтобы (1) подготовить клетки для твердотельного поломки по cryomilling, (2) достичь поломки в планетарной шаровой мельнице, и (3) производят экстракты из порошка клеток аффинной захватить интерес белок в комплексе с его физиологические interactors. Существует много различных методов лизиса клеток, в том числе с применением механических / физических подходов , использующих сокрушительного удара, механические ножницы, и / или давления, а также химических / ферментативных подходов, каждый с различными плюсы и минусы 49,50. Каждый исследователь предлагается изучить методы , наиболее подходящих для их анализа, имея в виду , что любой выбранный подход к разрушению клеток и экстракции белка, вероятно, ввести уклоны 51,52 , требующими эмпирической оптимизации (обсуждается ниже). Механические методы могут производить высокую температуру и / или сдвигающие силы, которые могут разрушить белковые комплексы. Cryomilling избегает эффектов нагревания в силу использования LN 2 охлаждения образцов для тон длительность процесса. Планетарные шаровые мельницы понимаются полагаться на воздействия и силы трения, в том числе напряжения сдвига, как компоненты уменьшения размера частиц 53,54. В настройках сообщили мы не наблюдали дегенерацию белковых комплексов. Действительно , мы извлекли и извлекаются по- видимому , интактные 50 ~ МДА ядерных пор комплексы 11 и ферментативно активные ретротранспозоны , обладающие большей удельной активностью , чем препараты , использующих "нежный" моющее средство на основе лизис 7. Химические / ферментативные методы лизиса клеток , страдают от ограничений , что содержимое клетки выбрасываются в в пробирке среды , которая поддерживает разрушение клеточных мембран и структурных макромолекул , но не могут быть пригодны для поддержания целостности белкового комплекса (ES ) представляет интерес. Часто, ни составляющих комплексов не образуются с интересующим белком, ни условий, необходимых для стабилизации целевые комплексыизвестны заранее. Основным преимуществом твердотельных размола является то, что поломки и извлечение расцепкой, что позволяет исходный материал, который будет подготовлен бесплатно добавленной жидкости, хранить (при -80 ° С или ниже), накопил, и удобно извлекать для экспериментов по требованию; например, изучить оптимизированные в лабораторных условиях для аффинного захвата. Белковое взаимодействие наиболее стабильны при высокой концентрации 55,56, следовательно , свести к минимуму объем экстрагента может быть полезным для сохранения физиологических взаимодействий. С другой стороны, существуют практические соображения - белковые комплексы действительно должны быть разделены из клеток и в невязкой водной фазы, свободной от нерастворимых агрегатов, для того, чтобы смешаться целевые комплексы с аффинной среды. Кроме того, некоторые стандартизация и контроль за экстракорпоральное среды (рН, концентрации соли и т.д.) необходим для систематизации и воспроизводимости. Мы находим, что экстракты прoduced в диапазоне разбавления 1: 4-1: 9 (вес: v) удовлетворяют практические и теоретические проблемы, дающие качественные результаты. Кроме того, оптимальное соотношение экстракта клеток аффинной средних должна быть определена. Это делается эмпирически путем титрования экстрактов с различными количествами аффинной среды и может иметь обнаруживаемые эффекты от отношения сигнал-шум эксперимента, обсуждается ниже. Отличным истощение белка-мишени, как правило, ≥70% от растворимой фракции белка-мишени, но> 90%, желательно и может быть достижима при тщательном параметризацию условий экстракции. Многие такие практические соображения , рассматриваются в качестве ссылки 1. Парамагнитные шарики манипулируют с использованием неодимовых магнитов в специальном держателе микроцентрифужных трубки, хотя домашние альтернативы жизнеспособны. При размещении в держателе, бусы собирают на стороне трубки под действием магнитного поля. Растворы могут затем быть удалены без диsturbing бусы.

Одно ограничение представленного протокола cryomilling, разработанный с планетарной шаровой мельнице , используемой здесь (см Таблицу материалов), является то , что минимальное количество материала требуется для эффективной мельницы и восстановить порошок клеток с помощью этого устройства (> 1 г). Такие величины легко получить с большим количеством микробов, клеточных линий, а также модельных организмов, и могут также часто быть достигнуто с тканями, вырезанных из лабораторных животных. Тем не менее, некоторые клеточные линии могут быть очень трудно выращивать в изобилии и животных тканях может быть дефицитным. Небольшие количества материала могут быть сравнительно измельчали ​​с помощью других устройств, использующих контейнеры меньшего размера, хотя потенциально в жертву порошка мелкости достигнута. Кроме того, стоимость механического размола устройств могут быть слишком дорогими для некоторых лабораторий. Cryomilling может быть достигнуто с помощью ряда альтернативных установок 14-19, в том числе, наиболее доступной цене вручную с помощью вредителяле и миномета, хотя эффективность поломки значительно снижается. Affinity протоколы захвата, как правило, направлены на высокую эффективность лизиса клеток, чтобы облегчить максимальное извлечение белка в растворе и, следовательно, максимальный потенциал для захвата целевых белковых комплексов. С другой стороны, было показано , для дрожжей в пробирке сплайсинга экстрактов , что максимальная лизис не может приравнять с максимальным экстракорпорального биохимической активности 57,58. Мы не наблюдали таких проблем в системах, которые мы тестировали до сих пор, и поэтому целенаправленно не ограничивают нашу клеточную поломку при cryomilling. Тем не менее, такая возможность , следует иметь в виду при оптимизации для ферментативных анализов в лабораторных условиях . Хотя cryomilling является весьма эффективным методом для разрушения клеток, ограниченное количество озвучивания часто приносит пользу производства однородных целых клеточных экстрактов из тканей млекопитающих, так как неоднородные агрегаты иногда могут наблюдаться при визуальном осмотре: как правило,в условиях экстракции с использованием низкой до умеренной соли (100-300 мм) и неионогенного детергента (0,1-1% об / об) концентрации. Поскольку мы наблюдали, что присутствие этих агрегатов может снизить урожайность и / или качество последующего захвата сродства, мы обычно осуществить ультразвуковую обработку, чтобы рассеять их (даже если они не наблюдали невооруженным глазом). Эти агрегаты соответствуют агломерированных фрагментов мембраны, сопоставимые с теми , которых ранее сообщалось в экстрактах из измельченных дрожжевых клеток 58. Ультразвуком также используется в некоторых протоколах к сдвиговым ДНК и высвобождать фрагменты хроматина в раствор, однако степень озвучивания применяется в этом протоколе не заметно фрагмент ДНК. Ограниченная доступность (или высокая стоимость) превосходного аффинного лиганда или антитела против конкретного интересующего белка может стать еще одним препятствием. Широкий спектр коммерчески доступных аффинных реагентов могут быть использованы, когда модель организма поддается геномного мечения или трansfection с внематочной векторы экспрессии, разрешающих экспрессию белков, представляющих интерес как аффинная меченных слитых. Тем не менее, производство заказных антител становится все более возможным и как поликлональные, так и моноклональные антитела могут выполнять превосходно в аффинных приложений для захвата. Эти много соображений , также рассматриваются более подробно в ссылке 1.

Примеры того , как метод лизиса клеток и выбор аффинной среды могут влиять на результаты анализа показаны на рисунке 1. Примеры эффектов , оказываемого различными экстрагентов можно увидеть в ссылках 1,11,24. Поскольку эти и другие экспериментальные параметры влияют на качество захвата сродства, что делает его трудно различить FPs, хранилищами "Борт протеомов" и вычислительных методов для устранения неспецифические примеси были разработаны с целью оказания помощи в выявлении Fps 40-43. Тем не менее, такие подходы только substitЮт для оптимальной подготовки проб в ограниченной степени 59. Соблюдение наилучшей практики и опытным путем оптимизации эксперимента захвата сродства обеспечит самые высокие образцы качества для последующих анализов, обсуждается ниже. Легко реализуется практика, которая может улучшить чистоту образца является родным элюирования. Родной элюирование наиболее часто используется для получения аффинной белкового изолята комплекс, неповрежденную, для дальнейших экспериментов; но, как это часто повышает чистоту образца, он также может быть использован только по этой причине. Тем не менее, как показано на фиг.1, панель II, способность нативного элюции улучшить образец чистоты , может зависеть от точного титрования количества аффинной среды к обилию целевого белка в экстракте клеток - когда среда находится в избытке , незанятые paratopes может разрешить офф-мишени накопление FP белков, наблюдаемых в изначально элюированных фракций. С использованием реагентов и процедур, описанных здесь, это ча наш опыт показал, что единственный наибольший вклад ФПС в наших опытах является меченый белок сам по себе, как только удаляется из контекста живой клетки. (Рис. 1.II и рис. S1). В таких случаях система родительского контроля клеточной линии, которые дают нерелевантные протеомов в отсутствие антигена, не имеют практического значения; Точно так же для тегов или только спайкоподобных в контрольной группе, которые лишены ничего, кроме антигена-мишени. Поэтому, когда мы реализуем практические I-DIRT 7,38, который непосредственно измеряет накопление после лизиса белковых взаимодействий с использованием количественных MS. Как уже упоминалось в пункте 3.2.7 протокола, процедуры для нативного элюирования будет изменяться в зависимости от конкретных деталей системы, используемой сродства. Родной элюирование обычно достигается за счет конкурентного вытеснения меченого белкового комплекса или протеолитическим расщеплением тега, отпуская комплекс из аффинной среды. Несколько систем сродства состоят из небольших тегов эпитопными существуют, FOR , который сам по себе эпитоп доступен как пептид , применимый для конкурентного элюирования меченых белковых комплексов 60. Кроме того, несколько протеаз доступны специфически расщепляют сайты родственных стратегически расположенных в сродства меченой слитые белки 61. В зависимости от специфики выбранных систем сродства, соответствующая схема элюирование может быть принят.

В целом, качество полученных результатов, будут в значительной степени зависеть от качества приготовления образца. Важно тщательно и точно работать через каждый шаг этих протоколов, и как можно быстрее, сохраняя при этом точно и аккуратно. Желательно, чтобы отслеживать разбиение интересующего белка через каждый шаг, чтобы понять эффективность каждой манипуляции. Например: как обильное является белка в клетке или ткани, о котором идет речь? Возможно, этот белок при исследовании (и его комплексов) будет сложно охарактеризовать по массеспектрометрия из-за низкой численности. Если очищенные комплексы могут быть обнаружены с помощью общего окрашивания белка (примерно нанограмм диапазоне), масс-спектрометрия, скорее всего, удастся. Если захваченный интерес белок может быть обнаружен только чувствительной повышенной хемилюминесценции вестерн-блоттинга (приблизительно пикограмм диапазон), масс-спектрометрия, менее вероятно, чтобы быть эффективными. Даже если интерес белок в изобилии в клетке, как в изобилии он в клеточном экстракте Произведенный? Имеет ли раздел белка в растворе, или это в осадке? Если последнее, новое решение экстракции может быть разработана, что может улучшить восстановление. После того, как экстракт клеток в сочетании с аффинной среды, как эффективно улавливается белок? Есть ли белок остаются связанными последующими промывками? А как насчет других copurifying белков? Сохраняя аликвоты каждого образца при соответствующих шагов протокола эти вопросы легко можно ответить, как правило, с помощью вестерн-блоттинга против белка, представляющего интересили общего белка окрашивания, но и другие анализы могут быть также пригодны. Оптимизация каждый шаг будет способствовать повышению урожайности и чистоты захваченных комплексов, хотя может быть компромисс, чтобы быть в максимизации одного атрибута или другого.

Типичное применение сродства захвата для многих исследователей заключается в определении кандидата в естественных условиях interactors для небольшого количества белков , представляющих интерес; эти кандидаты, как правило , подвергают проверке ортогональными подходов в естественных условиях , чтобы продемонстрировать биологическое значение физических interactors. Affinity захвата также применяется в исследованиях с высокой пропускной способностью генерировать списки copurifying белков , наблюдаемых на (почти) протеома масштабе всей, что облегчает вычислительные выводы относительно предполагаемого в естественных комплексов. Многочисленные примеры таких исследований можно найти в литературе. Такой подход отказывается от оптимизации условий захвата для любой цели в пользу изучения человекау цели; как таковой, предполагаемыми комплексы сами по себе редко извлекаются полностью неповрежденным и высокой степенью чистоты в любом данном образце. Скорее всего , частичные совпадения в композициях , наблюдаемых между многочисленными различными аффинно захваченный образцов используют в качестве основы из выводов 42. Оба подхода способствуют ценные данные для понимания интерактома. Тем не менее, одним из основных преимуществ сродства захвата является то, что она часто предлагают возможность получить комплексы неповрежденными и высокоочищенные, при условии, что усилия по оптимизации процедуры. Мы считаем , что будущее подхода заключается в повышении легкость и эффективность оптимизации захвата эндогенных белковых комплексов 11, для более точной оценки цветового охвата физиологических interactors и более частого использования в дальнейшем вниз по течению биохимических, энзимологических и структурных исследований, например, ссылается на 7,9,23.

Acknowledgments

Мы благодарим профессора Брайана Т. Хаит за его неоценимые советы, поддержку и доступ к MS-измерительных приборов, а также г-жа Келли Р. Моллой за отличную техническую поддержку. Мы благодарим г-жу Келли Bare за поддержку при редактировании копии. Эта работа была частично поддержана NIH гранты P41GM109824, P41GM103314 и P50GM107632.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2 L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62x44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 kPa pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5-2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
  2. Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
  3. Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
  4. Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  5. Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
  6. Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
  7. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
  8. Liu, J. -J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -Y., Ke, A., Wang, H. -W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
  9. Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
  10. Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
  11. Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
  12. Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
  13. Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
  14. Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
  15. Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
  16. Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
  17. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
  18. Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
  19. Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. 0 (0), 1-6 (2012).
  20. Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
  21. Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
  22. Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
  23. Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
  24. LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
  25. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells. , John Wiley & Sons. (2011).
  26. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Basic Cell Culture Protocols. 946, Humana Press. (2013).
  27. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
  28. Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
  29. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. , 1–3at Retsch GmbH. http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/ (2014).
  30. Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  31. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
  32. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
  33. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
  34. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A. N., Padovan, J. C., Zhang, W. MALDI Sample Preparation. , Available from: rockefeller.edu at http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html (2006).
  37. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  38. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
  39. Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
  40. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
  41. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
  42. Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
  43. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
  44. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1 (2005).
  45. Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839 (1999).
  46. Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
  47. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
  48. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
  49. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
  50. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
  51. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
  52. Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  53. Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
  54. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201 (2012).
  55. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345 (1982).
  56. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  57. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, City of Hope. (2003).
  58. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , Retsch GmbH. (2005).
  59. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
  60. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
  61. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).

Tags

Биохимия выпуск 118 сродства захвата аффинной очистки иммунопреципитация IP cryomilling разрушение клеток белковый комплекс очистки

Erratum

Formal Correction: Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells
Posted by JoVE Editors on 01/20/2017. Citeable Link.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:

  1. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  2. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  3. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  4. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  5. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  6. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  7. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  8. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  9. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  10. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  11. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  12. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  13. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  14. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  15. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  16. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  17. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  18. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  19. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  20. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  21. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  22. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  23. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  24. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  25. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  26. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  27. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  28. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).
  29. Williams, R. J., & Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911–1912 (1932).
  30. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).
  31. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  32. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  33. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  34. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).

to:

  1. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1–3at <http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/> Retsch GmbH (2014).
  2. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  3. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  4. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  5. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  6. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  7. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  8. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  9. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  10. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  11. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  12. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  13. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  14. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  15. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  16. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  17. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  18. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  19. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  20. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).
  21. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  22. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  23. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  24. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  25. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  26. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  27. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  28. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  29. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  30. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  31. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  32. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  33. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).
Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P.… More

LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter