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Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54518
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Nous décrivons ici les protocoles pour perturber les cellules de mammifères par fraisage à l'état solide à une température cryogénique, produire un extrait de cellule à partir de la poudre cellulaire résultante, et isoler des complexes de protéines d'intérêt par capture par affinité sur anticorps couplé micrométriques billes paramagnétiques.

Abstract

capture d'affinité est une technique efficace pour isoler des complexes de protéines endogènes pour complément d'étude. Lorsqu'il est utilisé conjointement avec un anticorps, cette technique est également souvent appelé immunoprécipitation. capture par affinité peut être appliquée dans un banc échelle et dans un contexte de haut débit. Lorsque couplée à la spectrométrie de masse de protéines, capture par affinité est avérée être un bourreau de travail d'analyse de interactome. Bien qu'il existe potentiellement de nombreuses façons d'exécuter les nombreuses étapes, les protocoles suivants mettent en œuvre nos méthodes favorisées. Deux traits distinctifs sont: l'utilisation d'une poudre de cellules cryomilled pour produire des extraits cellulaires et les billes paramagnétiques anticorps couplé comme milieu d'affinité. Dans de nombreux cas, nous avons obtenu des résultats supérieurs à ceux obtenus avec d'autres méthodes classiques de capture par affinité. Cryobroyage évite de nombreux problèmes associés à d'autres formes de rupture des cellules. Il fournit une rupture efficace de la matière, tout en évitant denatles questions de URÉE associés au chauffage ou moussage. Il conserve la protéine native concentration jusqu'au point d'extraction, atténuant la dissociation macromoléculaire. Il réduit le temps des protéines extraites passent en solution, ce qui limite les activités enzymatiques délétères, et il peut réduire l'adsorption non spécifique des protéines par le support d'affinité. médias d'affinité magnétique Micron-échelle sont devenus plus courants au cours des dernières années, en remplacement de plus en plus la agarose- traditionnelle et les médias basés sur Sepharose. Les principaux avantages de supports magnétiques comprennent généralement plus faible adsorption des protéines non-spécifique; aucune limite d'exclusion de taille, car la liaison complexe protéique se produit sur la surface de la bille plutôt qu'à l'intérieur des pores; et la facilité de manipulation et de manutention à l'aide d'aimants.

Introduction

Une application typique des procédures présentées est de stabiliser et d' obtenir un rendement élevé et la pureté des complexes de protéines endogènes d'intérêt pour la caractérisation interactomic 1. Il est entendu que les réseaux dynamiques des deux complexes macromoléculaires de manière stable et transitoire associées, principalement constituées de protéines, d' orchestrer les processus cellulaires 2,3. Bien qu'il existe de nombreuses approches expérimentales pour l' identification des interactions protéine-protéine, la capture d' affinité est parmi les méthodes les plus utilisées pour isoler et disséquer des complexes de protéines physiologiques 4-6. De plus, cette technique a l'avantage de donner les complexes macromoléculaires comme des entités physiques, et pas seulement en tant que points de données dans une lecture; Avantageusement, les complexes obtenus peuvent donc être utilisés dans une multitude de biochimiques supplémentaires en aval, enzymatiques et les essais structuraux 7-9. Les protocoles présentés ont été mis au point en réponse à la nécessité de la carte proteiréseaux d'interaction n-protéine et de caractériser des complexes macromoléculaires dans leurs rôles en tant que les molécules effectrices de la biologie cellulaire. Ils sont détaillés en ce qui concerne leur application à des cellules de mammifères cultivées dans une culture tissulaire, mais sont également applicables à un large éventail d'échantillons biologiques donnés tweaks spécifiques au système appropriés.

L'histoire de la capture par affinité remonte au début du XXe siècle avec les premières expériences de chromatographie d'immunoaffinité - ressemblant à ce que l'on appelle communément de nos jours comme immunoprécipitation (IP) - apparaissant dans la littérature au début des années 1950. Utilisation Mainstream de la technique développée davantage à travers le tour de ce siècle à nos 10-13. Cellulaire Diverse et des études de biologie moléculaire ont utilisé la rupture mécanique des cellules par broyage à des températures cryogéniques pour au moins les quarante dernières années 14-19; et les séparations moléculaires utilisant (super) billes paramagnétiques ont become plus en plus fréquent au cours des deux dernières décennies 20. La combinaison de ces différentes technologies a permis d'améliorer de manière synergique les résultats qui peuvent être obtenus dans des expériences complexes de protéines de capture d'affinité 1, comme en témoigne un vaste corpus de travail produit par nous - mêmes et la communauté de recherche plus large 7,9,11,18,19,21 -23. Les résultats sont présentés à l' appui de la figure 1.

Une collection de mises en garde et les considérations applicables à l' exécution des expériences efficaces de capture par affinité peut être trouvée dans la référence 1. En général , cette approche est la plus appropriée pour: (I) catalogue interacteurs d'une protéine d'intérêt, à savoir, utiliser des protéines par spectrométrie de masse (MS) pour identifier les protéines copurifying jusqu'alors inconnues (analyse exploratoire); (II) analyse pour la présence d'un partenaire interagissant particulier, à savoir, utiliser MS ou western blot pour détecter une protéine particulière ou un ensemble limité de protéines soupçonnées dansinteragissent avec la protéine d'intérêt (de tests d'hypothèses); ou (III) préparer des complexes protéiques contenant assemblés de manière endogène la protéine d'intérêt pour une étude plus approfondie par des techniques supplémentaires (bonne évaluation préparative). Avant de se lancer dans un régime expérimental de capture par affinité, il est absolument essentiel d'avoir un réactif d'affinité de haute qualité qui se lie à la protéine cible, généralement un anticorps IP-compétent contre la protéine cible native d'intérêt ou contre une étiquette jointe à une protéine de fusion. Il est également essentiel de disposer de méthodes appropriées de lecture expérimentale en place: la coloration générale des protéines (comme le bleu de Coomassie, Sypro Ruby, ou d'argent, après SDS-PAGE), western blot, et de protéines MS sont tous couramment utilisés en conjonction avec capture par affinité 1. Les protocoles présentés utilisent des billes magnétiques conjuguées anticorps comme milieu d'affinité. Alors que la fonction du support d'affinité peut d'abord être validé dans des tests qui utilisent certains paramètres expérimentaux, afin deobtenir les meilleurs résultats de chaque expérience doit être empiriquement optimisé 1,11,24. Les protocoles sont séparés en trois phases distinctes: (1) la préparation du matériel cellulaire congelée; (2) cellules de rupture par solide mouture de l'état à température cryogénique; et (3) l'extraction des protéines et la capture d'affinité en utilisant des billes paramagnétiques anticorps couplé.

Protocol

1. Cellule de récolte et de congélation

  1. Cultiver 08.01 g de matière cellulaire en utilisant les conditions de culture appropriées pour la lignée cellulaire d'intérêt 25,26. Ce protocole est optimisé pour un maximum de 8 grammes de cellules (~ 10 9 cellules), modifiées de références 19,27,28. Typiquement, environ 5 g de cellules HEK-293 ou HeLa peut être obtenu à partir de huit plaques de 500 cm2 de culture cultivées à ~ 90% de confluence.
    ATTENTION: Ces protocoles utilisent l' azote liquide (LN2), capable de provoquer des brûlures cryogéniques graves. vêtements de protection Don et l'exercice approprié précautions de manipulation.
  2. Verser le milieu de croissance (déchets) dans un grand bêcher.
  3. Placez la boîte de culture sur la glace dans une grande casserole de glace rectangulaire.
  4. Ajouter 20 ml de glace-froid 1x tampon phosphate salin (PBS) à la boîte de culture et de libérer les cellules de la boîte en utilisant un grand racleur de cellules; transférer les cellules à un tube de 50 ml, pré-refroidi sur la glace; maintenir le tube sur la glace.
    REMARQUE: Pour toutes les étapes de manipulation cellulaire utilisent un ensemble électro-pipeteur à «faible» et 25 ml pipettes pour éviter le cisaillement excessif des cellules lors des manipulations de transfert. Disposer 50 ml tubes de collecte et 1x PBS dans un seau à glace avant de lancer la procédure.
  5. Ajouter 10 ml supplémentaires de glace-froid 1x PBS pour le même plat. Recueillir les cellules restantes et de les transférer dans le tube de 50 ml.
  6. Répétez l'opération pour chaque plat; suspensions cellulaires provenant de différents plats peuvent être combinés pour réduire le nombre échantillon et déchets plastiques.
    NOTE: Parce que les cellules elles-mêmes ne constituent pas une part importante du volume de suspension, trois plaques d'une valeur de suspension de cellules peuvent être combinées en deux tubes de 50 ml. Parce que tubes de 50 ml détiennent effectivement plus que le volume nominal, huit plaques peuvent généralement être réparties sur cinq de ces tubes.
  7. Centrifugeuse pendant 5 min à 1000 xg, 4 ° C.
  8. Versez délicatement le surnageant. Resuspendre chaque pastille dans 10 ml glacée 1x PBS. Consolider le resupellets spended, jusqu'à 5 pour tube de 50 ml, pour réduire le nombre d'échantillons.
  9. Centrifugeuse 5 min à 1000 xg, 4 ° C.
  10. Versez délicatement le surnageant. Reprendre le culot dans 10 ml glacée 1x PBS
  11. Retirez le piston d'une seringue de 20 ml et le mettre de côté. Coiffer l'embout de la seringue et transférer la suspension cellulaire à elle.
  12. Placer la seringue dans un tube de 50 ml et on centrifuge 5 min à 1000 x g, 4 ° C.
  13. Aspirer le surnageant avec une pointe pipette bien attaché à un système de piège à vide jusqu'à ce que la couche supérieure de cellules commence à être aspiré. Cela se traduit par un culot cellulaire humide.
  14. Déboucher la seringue, insérez le piston et égoutter les cellules directement dans un grand récipient en plastique rempli de LN 2, tenue dans un LN 2 salles de bain dans une boîte en polystyrène. Forcer plonger les cellules restantes de la seringue.
  15. Transférer les cellules congelées à tubes de 50 ml en versant. Plafonner légèrement les tubes pour permettre l' excès de LN 2 à évaporer; maintenez them nuit à -80 ° C. Serrer bouchons entièrement le lendemain. La cellule congelée peut être stockée de cette manière à -80 ° C jusqu'à cryobroyage.
    REMARQUE: Ne pas fermer hermétiquement les tubes avant tout le LN 2 a visiblement évaporée, sinon une pression excessive peut provoquer le tube d'exploser. Non fermer les tubes après la LN 2 est dissipée peut entraîner l'accumulation de givre sur la matière des cellules, en ajoutant l'excès d'eau et de réduire efficacement la concentration en protéines sur le broyage.

2. Perturbation Cryogenic de cellules congelées

REMARQUE: Tous les outils de fraisage et de manipulations doivent être pré-refroidis avec de LN 2. Un petit décanteur sera nécessaire pour ajouter LN 2 dans le pot et pour verser LN 2 sur le dessus du pot de broyage fermé. Un outil maison est représenté en référence 19. Gants cryogéniques seront nécessaires pour gérer le LN 2 refroidi appareil de broyage. le broyagecouvercles de bocaux utilisés ici (voir le tableau des matériaux) expédier généralement avec un joint en caoutchouc installé; cela devra être remplacé par un couvercle en téflon joint disponible dans le commerce pour exécuter de manière fiable le protocole suivant. En outre, parce que la pression du gaz N 2 peut construire jusqu'à des niveaux élevés dans le pot pendant le broyage, nous recommandons l' installation d' un 5 bar / 500 kPa soupape de pression disponible dans le commerce en tant que mesure de libération de sécurité 28.

  1. Retirer billes de cellules de -80 ° C stockage et maintenir un porte-tube de 50 ml dans un LN 2 salles de bain.
  2. Pré-refroidir le pot de 50 ml, deux 20 balles de mm, et le couvercle dans un seau à glace rectangulaire propre contenant LN 2. Pré-refroidir le polytétrafluoroéthylène (PTFE) isolant si l'on utilise une; soit un ensemble de rondelles (voir référence 27), ou d' un manchon et-puck (voir Figure 2). Pré-refroidissement est terminée lorsque l'ébullition violente de LN 2 calme.
  3. Set contrepoids approprié sur lemoulin.
    NOTE: Ce sera égale à la masse du pot, couvercle du bocal, les billes de broyage utilisé, et la quantité de cellules à ajouter au pot. Si des isolants en PTFE sont utilisés, leur masse devrait également être inclus. Nous conseillons d'enregistrer les masses du pot, le couvercle et boules (et leur masse combinée, y compris tout isolant utilisé) à l'avance et l'enregistrement sur une feuille d'information stocké près du moulin.
  4. En utilisant des pinces, placer les deux 20 boules mm de fraisage pré-refroidi et les cellules congelées dans le pot pré-refroidi fraisage.
    Remarque: En raison de petites pertes de matière sur les surfaces jar et billes pendant le fraisage, le pourcentage d'augmentation des matières récupérées que la masse des cellules augmente blanchi. Par la méthode décrite, les pertes matérielles sont très modestes, étant de l'ordre de ~ 0,3 g de poids de cellules humides (WCW). Les directives du fabricant indiquent le volume maximal d'échantillon chargé devrait être ~ 3/1 du volume du pot. 29 Le volume total des billes devrait être environ 1/3 et remaining ~ 03.01 espace libre est pour la libre circulation des billes.
  5. Ajouter LN 2 dans le pot jusqu'à ~ ½ plein, placez le couvercle sur le pot et transférer l'assemblage à l'usine.
    NOTE: Tout d'abord installer l'isolant choisi si vous utilisez un.
  6. Fixer l'ensemble en place et effectuer trois cycles de fraisage en utilisant le programme suivant: 400 rpm, 3 min, la rotation inverse de chaque minute, pas de rupture d'intervalle. Refroidir le pot de fraisage avec LN 2 entre chaque cycle.
    NOTE: Lors du fraisage d'un bruit sourd distinct est généré comme les billes entrent en collision dans le pot dans le mouvement planétaire. Si ces sons ne sont pas entendus, le broyage ne se produit pas. Termine le cycle de fraisage, ne comptez pas ce cycle, déplacer l'ensemble de jar revenir à LN 2 et examiner le contenu du bocal. Veiller à ce pas de glace a formé et si elle a, ébrécher loin des murs jar avec une spatule pré-refroidie. Recommencez à l'étape 2.5.
    Si vous utilisez aucun isolant ou isolant rondelles, déplacer l'ensemble de pot retour à LN 2 à ~ ½ plein à chaque fois. Le LN 2 ajouté va s'évaporer dans le bocal comme la température du pot augmente au cours du broyage. Cela se traduit par une accumulation de pression à l'intérieur du bocal. Par conséquent, lors du désengagement du bocal du moulin, relâchez la pince très lentement. Si la pince est relâchée rapidement, poudre de cellule peut échapper à une dépressurisation rapide. Une lente libération de la pince permet à la pression de s'échapper du pot dans une manière contrôlée douce et empêche la perte de matériel cellulaire. L'évasion douce de gaz N 2 peut souvent être entendu siffler que la pince est libérée lentement - ce qui est normal.
    Si vous utilisez un isolant de manchon et-puck, l'ensemble de pot peut être laissé dans le moulin et LN 2 ajouté à l'ensemble isolant / jar in situ.
  7. Déplacer le pot vers LN 2, et laisser reposer momentanément refroidir. Si l'on utilise un manchon isolant et-rondelle, le récipient peut être retiré de la douille wvec l'aide de deux spatules, fournissant un effet de levier de chaque côté. Une fois que le pot se repose dans LN 2, retirez le couvercle avec précaution, enlever les boules à l' aide de pinces, et de transférer la poudre dans un tube pré-refroidi 50 ml à l' aide d' une spatule pré-refroidie. Ajout d' un peu de LN 2 à l'air libre pot / poudre peut aider à déloger la poudre qui est durci sur les balles, avant de les retirer.
    NOTE: Une fois que le pot a été ouvert, ajouter une petite quantité de LN 2 avant de retirer les boules. Cela vous aidera à récupérer la poudre agglomérée sur les surfaces. poudre cellulaire doit être maintenu à -80 ° C ou moins jusqu'à utilisation. Dans notre expérience, la poudre cellulaire peut être stocké de cette manière, essentiellement indéfiniment, sans affecter les performances.

3. Affinity capture des complexes de protéines à partir d'extraits cellulaires

NOTE: Le protocole suivant met en oeuvre des milieux d'affinité comprenant un ligand d'affinité, des appâts, ou un anticorps qui interagit avec la protéine d'intérêt, coupled à l'échelle du micron des billes paramagnétiques. Ceux - ci peuvent être préparés en interne 19,30, en utilisant des kits disponibles dans le commerce, ou achetés comme réactifs prêts à l'emploi.

  1. Préparation de l'extrait cellulaire
    REMARQUE: Lors de la manipulation de poudre cellulaire, pensez à utiliser des ustensiles et des tubes pré-refroidis avec LN 2. Les tubes contenant la poudre cellulaire devraient toujours avoir lieu sur LN 2 lorsqu'ils ne sont pas à -80 ° C. Placer le tube (s) de 50 ml contenant de la poudre de cellule dans un support de tubes dans un récipient en polystyrène expansé avec LN2.
    1. Peser 100 mg de poudre de cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ou 2 ml.
      NOTE: Nous avons observé que cette quantité de cellules est un bon point de départ qui donne habituellement la protéine cible des dizaines à des centaines de nanogrammes gamme après la capture d'affinité pour une protéine modérément exprimée (~ 50 kDa de masse, présent à des milliers d'exemplaires par cellulaire), en supposant que l'extraction et capture l'efficacité de la cible sont ≳70%. Ces rendements prévoient visualiz directeation de la fraction purifiée par SDS-PAGE et coloration des protéines.
    2. balance analytique Tare avec le tube microfuge vide. Distribuer poudre cellulaire dans un tube en utilisant un LN 2 refroidi cuillère ou une spatule. Vérifiez la masse de la poudre distribuée dans le tube sur la balance analytique.
      NOTE: Pour faciliter la pesée des poudres de cellules, petites cuillères de mesure volumétriques peuvent être utilisés. Ceux - ci ont été trouvés pour donner (voir référence 19) des résultats reproductibles. Nous avons trouvé de meilleurs résultats à l'aide de bouchon à vis ou microtubes 'Safe-Lock ». La pression exercée par évaporation LN 2 qui peut pénétrer dans les tubes peut provoquer des microtubes standards de pop ouvert pendant le réchauffement ultérieur , juste avant l'addition de la solution d'extraction , - ce qui pourrait entraîner une perte de l'échantillon.
    3. Ouvrir le tube (ou desserrer la vis-bouchon) avec de la poudre cellulaire et laisser reposer à température ambiante pendant 1 min. Ceci libère la pression dans le tube et empêcher la congélation immédiate de l'extractionla solution lorsqu'elle est ajoutée à la poudre. Aucun dégel est observé pendant cette 1 min incubation.
    4. Ajouter 400 ul de extractant additionné d'inhibiteurs de la protéase et vortex brièvement, puis maintenez sur la glace tout en procédant à l'étape 3.1.5. Les échantillons doivent être maintenus sur la glace entre toutes les manipulations ultérieures jusqu'à élution.
      REMARQUE: La meilleure composition de l'agent d'extraction dépendra du complexe protéique (ES) à purifier. Certaines orientations générales sont fournies dans le tableau 1 et les références à l' appui.
    5. Utilisez un appareil à ultrasons à micropointes pour donner l'échantillon une impulsion de faible énergie brève pour disperser des agrégats. (Ultra) sonication avec 4 impulsions (2 sec chacune, 2 A, environ 15-20 J de l'énergie totale).
      NOTE: vortexer distribue la poudre cellulaire dans l'extraction, mais en fonction de la nature de la solution, certains agrégats peuvent être observés. Nous avons constaté que la dispersion de ces agrégats fournit le meilleur rendement lors de la capture d'affinité ultérieure. Un bref micropointe sonication se disperse facilement ces agrégats. La solution doit être semi-translucide, mais homogène, sans agrégats évidents. sonicateurs de bain d'eau ont tendance à être trop faible puissance pour disperser efficacement ces agrégats sans significativement plus longs temps de traitement des échantillons, mais peuvent convenir avec les paramètres appropriés.
    6. Clarifier l'extrait par centrifugation (par exemple, 20 000 x g, 10 min, 4 ° C).
      Remarque: Une aliquote de l'extrait cellulaire clarifié peuvent être enregistrées pour la comparaison avec le contenu de la pastille, la période post-capture par affinité surnageant et les fractions obtenues après élution à partir du milieu d'affinité pour déterminer l'efficacité de l'extraction et la capture de la protéine cible, , par exemple, par western blot (voir Discussion).
    7. Retirer le surnageant (extrait clarifié) et procéder à la capture d'affinité.
      NOTE: Le culot peut être extraite à nouveau dans un tampon échantillon de chargement SDS-PAGE à 70 ° C afin de déterminer le degré de libération de la protéine cible dendant l'extraction initiale non dénaturant par rapport à l'extrait obtenu à l'étape 3.1.6.
  2. capture d' affinité
    1. Prélavage milieu d'affinité magnétique. Cela peut être fait alors que les extraits cellulaires sont centrifugés.
    2. Placer le tube (s) sur l'aimant. Les perles vont s'accumuler sur le côté du tube en quelques secondes, ce qui permet la solution de stockage d'être enlevé.
    3. Ajouter 500 pi de solution d'extraction à des billes. Brièvement vortex mélange à vitesse moyenne (suffisante pour remettre en suspension). Pulse-tourner les tubes dans un mini-centrifugeuse pour recueillir tout le contenu vers le bas. Cela assure le report minimum de solutions. Placer les tubes sur l'aimant et aspirer la solution.
      REMARQUE: Les supports magnétiques avec des caractéristiques distinctives sont disponibles à partir d'une grande variété de fournisseurs commerciaux. Les résultats peuvent varier en fonction de ces caractéristiques, y compris la taille des billes, l'uniformité, le revêtement de surface et de chimie de couplage d'anticorps. Side-by-side procès dans votre application sont recommandés avant de se fixer sur un réactif de choix.
    4. Initier la capture par affinité en transférant l'extrait cellulaire clarifié dans un tube de 1,5 à 2,0 ml contenant du milieu d'affinité prélavées et le vortex brièvement pour remettre en suspension.
    5. Incuber pendant 30 min à 4 ° C en mélangeant doucement en continu sur une roue des rotateurs; les billes doivent rester en suspension tout au long de l'incubation.
    6. Centrifuger brièvement les tubes dans une mini-centrifugeuse pour collecter tout le contenu au fond du tube. Aspirer le surnageant et laver les billes trois fois avec 1 ml de solution d'extraction à froid, comme décrit dans l'étape 3.2.3. Placer les tubes sur l'aimant. Retirer la solution. Continuer à ajouter la solution suivante et répéter. Au cours de la 2 e lavage, transférer les perles et la solution de lavage ensemble pour un tube de microcentrifugation frais par pipetage. Ceci réduit la contamination de l'échantillon, au moment de l'élution, par des protéines aléatoires adsorbées sur les parois du tube utilisé pour l'incubation avec du til extrait cellulaire. Après la 3 ème lavage, les billes doivent être brièvement d'impulsion filée dans une mini-centrifugeuse pour recueillir tout le contenu vers le bas. Placer le tube de retour sur l'aimant, et éliminer tout liquide résiduel. Ce qui permet l'élimination de ces derniers ul de la solution avant d'éluer, assurant les échantillons élues auront des volumes uniformes. Elle assure également l'élution sera efficace, comme la solution d'élution ne sera pas diluée par lavage résiduelle; ces résidus peuvent également contribuer aux effets de sel et de modifier la migration des protéines en SDS-PAGE (voir ci-dessous).
      NOTE: Une partie aliquote du surnageant de post-liaison peut être enregistrée à titre de comparaison à l'extrait clarifié généré en 3.1.6. par Western Blot. Le résultat indique le degré d'appauvrissement de la protéine cible à partir de l'extrait cellulaire.
    7. Eluer soit d'une manière native ou dénaturant; envisager la meilleure stratégie pour l'application en aval 1.
      NOTE: Les détails de l'élution native STRATEGIEs dépendra de l'étiquette d'affinité utilisée (voir la discussion). Pour la plupart des utilisateurs, dénaturants élution avec un tampon d'échantillon SDS-PAGE suivie d' une analyse de l'échantillon par SDS-PAGE avec coloration des protéines 31, sera la première approche la plus pratique.
      REMARQUE: La composition du tampon d'échantillon dépendra du système d'électrophorèse utilisé. De nombreux laboratoires se projettent les gels de Tris-glycine, ce qui rend l' utilisation de l' électrophorèse discontinue et le système tampon de Laemmli 32-34. Une recette de tampon d'échantillon commun (1x) comprend: 10% (p / v) de saccharose, 50 mM de DTT, 2% (p / v) de SDS, 62,5 Tris-Cl mM , pH 8,8, 0,0004% (p / v) de bleu de bromophénol 31 . Nous vous suggérons de préparer un 1.1x stock qui omet la TNT. 1/10 volume de 500 mM de DTT doit être ajouté à l'échantillon avant SDS-PAGE (voir ci - dessous). De nombreux systèmes disponibles dans le commerce SDS-PAGE sont également disponibles; ceux-ci peuvent inclure des échantillons de tampons spécifiques au système.
    8. Ajouter un tampon d'échantillon SDS-PAGE sans agent réducteur (pour atténuer la libérationdes chaînes d'anticorps à partir des billes) et incuber pendant 5 à 10 min à température ambiante sous agitation.
      NOTE: Ce sera interférer avec la plupart des interactions basées sur l'affinité, libérant les protéines capturées dans le surnageant. Des interactions plus persistants peuvent bénéficier d'une température élevée pour la libération (typiquement 70 ° C est suffisante).
    9. Collecter et enregistrer le surnageant. Les échantillons peuvent être congelés à -20 ° C pour une brève stockage (quelques jours) ou -80 ° C pour un stockage prolongé jusqu'à ce que l'analyse est souhaitée.
    10. Soumettre les échantillons à une SDS-PAGE suivie d' une coloration des protéines en utilisant des techniques standard 31. MS peut être utilisée pour caractériser la composition d'échantillon 1. des bandes protéiques individuelles peuvent être excisées pour l'identification ou la totalité de l'échantillon peuvent être caractérisées en une seule analyse par électrophorèse de l'échantillon brièvement (4-6 mm dans le gel) et le traitement de toutes les protéines dans l'échantillon en même temps comme un «bouchon de gel.
      NOTE: Ajouter DTT avant initiaélectrophorèse ting. Si la planification de procéder à MS, les échantillons peuvent être alkylée après électrophorèse 35; Cependant, il est souvent plus commode pour alkyler avant l'électrophorèse 36.

Representative Results

Figure 1, panneau I montre que cryobroyage et des billes magnétiques peuvent travailler ensemble pour améliorer la qualité de l' échantillon. Panneaux IA-C montrent que le matériau comprenant le milieu insoluble utilisé pour la capture d'affinité peut affecter le protéome récupéré 19. La protéine d'intérêt, purifié étiquetée FLAG phosphatase alcaline bactérienne (BAP), a été enrichi dans des extraits de cellules humaines. PAB ne devrait pas interagir spécifiquement avec les protéines humaines et copurify. La signature de protéines copurifying, jugées par SDS-PAGE et coloration de Coomassie, variait en fonction du support utilisé. des billes magnétiques Micron-échelle ont montré le profil le plus propre, ce qui indique un niveau d'adsorption des protéines non spécifique relativement faible. Panneaux ID et IE montrent que la méthode de la lyse cellulaire peut également affecter le protéome récupéré. Dans l'exemple fourni, un complexe d' une protéine endogène (NEXT complexe 37), est soumis à une affinité capture de la cellule cyromilled ou soniqué extraits 19. Moins de contaminants de masse élevées ont été observées lors de l'extrait cellulaire a été produite à partir de poudre de cellule cryomilled.

Un défi lors de l'utilisation capture par affinité pour étudier des complexes de protéines endogènes est qu'il peut être difficile de distinguer bona fide interacteurs physiologiques de la protéine d'intérêt à partir de faux positifs (PC). MF peut provenir de nombreuses sources, y compris l'adsorption non spécifique sur les tubes et les vaisseaux, le milieu d'affinité, le ligand d'affinité ou un anticorps, et / ou pour la protéine d'intérêt lui-même. Par conséquent, des efforts importants doivent être consacrés à l'optimisation du processus de capture. La détection des MF reste un défi central pour lequel un grand nombre de différents outils ont été développés, y compris expérimentale 38-40 et computationnelle approches 41-43, chacune avec des avantages et des inconvénients. Dans nos propres expériences, nous avons déjà noté un modèle de FP la liaison aux protéines, obtenu après incubation du support magnétique α-FLAG avec des extraits cellulaires de contrôle, qui était distinct du motif obtenu en présence de protéines 3xFLAG-marquées. En outre, ces PCR pourraient être libérés dans le milieu par une incubation avec un peptide 3xFLAG 7. Cette observation est cohérente avec la liaison opportuniste de MF au paratope α-FLAG en l'absence de l'épitope apparenté. Comprendre la nature de ce FP fond est important puisque de nombreuses études utilisent une «lignée cellulaire parentale 'untagged comme un contrôle simulé pour la capture d'affinité; ces contrôles peuvent donc inapproprié de déterminer la spécificité des interactions avec la protéine marquée. Pour déterminer la liaison de fond contribué par notre milieu d'affinité lorsque paratopes anticorps sont occupés ou non, nous avons effectué des simulations d'expériences de capture par affinité en utilisant un milieu α-FLAG magnétique et des extraits de cellules HEK 293T (aucune protéine marquée exprimée) en présence ou en l'absence d'un 3xFLAGpeptide spike-in. Les résultats sont présentés sur la figure 1, tableau II. En bref, le milieu magnétique α-FLAG a été mis en incubation dans des extraits cellulaires (de ≳10 mg / ml de protéine totale) contenant 500 mM de NaCl et 1% v / v de Triton X-100 dans 20 mM de HEPES-Na, pH 7,4 pendant 30 minutes. Le milieu a été ensuite mis en incubation avec 1 mg / ml de peptide à déplacer 3xFLAG manière compétitive toutes les protéines liées au paratope α-FLAG natif ou avec un tampon d'échantillon SDS-PAGE pour obtenir une élution dénaturant. Par ailleurs, la même expérience a été réalisée lorsque les extraits cellulaires ont été mélangés avec 1 ug / ml et 10 pg / ml de peptide 3xFLAG. Toutes les fractions éluées ont été soumises à une SDS-PAGE et coloration à l'argent. Nous avons observé qu'en l'absence de son epitope apparenté, le milieu α-FLAG ne saisit un niveau détectable de protéines de fond qui peut être élue avec 3xFLAG peptide - dans l'exemple donné par la figure 1-II, une espèce dominante a été observée à entre 37 et 50 kDa. Le motif en éluant avectampon d'échantillon SDS-PAGE était comparable, avec des espèces de premier plan supplémentaires. Cependant, en présence de 1 pg / ml de peptide 3xFLAG, la liaison FP sur le support d'affinité a été éliminée au-dessous du niveau de détection et n'a pas été observé ni dans les fractions d'élution natives ou dénaturantes. Ce résultat suggère que paratopes anticorps inoccupées peuvent être la promiscuité en l'absence de leur épitope apparenté et contribuent de manière significative au protéome obtenu lors de la capture d'affinité même pour des anticorps qui se lient leur épitope à haute affinité, comme cela est le cas pour le 3xFLAG / α-FLAG M2 appariement. Il a également suggestd que des conditions très strictes en utilisant haute teneur en sel, souvent choisi pour atténuer la liaison non spécifique, peuvent être inefficaces en l'absence de l'interaction antigène / anticorps. Pour le suivi nous avons effectué une expérience similaire , y compris l' analyse par SDS-PAGE ainsi que quantitative MS (Fig. S1). Sur les 347 protéines quantifiées, nous avons observé que toutes les protéines sauf pour une (fausse discothèquetaux très = 1%; Tableau S1) est associée à la protéine appât 3xFLAG étiquetée par rapport à un peptide 3xFLAG dopés échantillon témoin. Ces résultats indiquent que, dans nos expériences, l'écrasante majorité des protéines observées sont susceptibles de co-purifient avec la protéine marquée ou sont hors cible des sous-produits de inoccupées paratopes α-FLAG. Dans notre expérience, des résultats élevés signal-bruit d'affinité capture sont illustrées dans SDS-PAGE et coloration des protéines par un motif discret de bandes vives, abondantes et à peu près stoechiométriques ainsi qu'un manque de coloration de fond des autres groupes plus faibles; de nombreux exemple de ce principe peut être vu dans la référence 11.

Le motif de l' utilisation d' un isolant en PTFE ( ce qui est recommandé) lorsque cryobroyage est de réduire le taux de réchauffement du pot pendant le broyage, d' atténuer la charge de la répétition LN 2 refroidissement pendant le processus d'usinage, et de réduire le degré de glaceformation dans le bocal. Ceci facilite l'exécution de fraisage constante et facilite la manipulation de la poudre cellulaire. Exemple isolateurs peuvent être trouvés dans la référence 27 (rondelles) et représentées sur la figure 2 ci-dessous (manchon et-puck).

Figure 1
Figure 1: Sélectionnez résultats représentatifs. (I) Ce panneau a été modifié par la référence 19. Coloré au bleu de Coomassie du gel de polyacrylamide-SDS. perles (GAUCHE) Micron échelle magnétique montrent inférieure hors-cible de liaison que les médias d'agarose-base. (A) des billes magnétiques; (B) agarose traditionnel; (C) le fer imprégné (magnétique) agarose; couplés chacun à des anticorps anti-FLAG M2 et utilisé pour capturer la phosphatase alcaline bactérienne FLAG-tagged (BAP, étiquetés) dopés dans des extraits produits à partir de cryomilled cellules HEK-293. purifications à base d'agaroseont montré des niveaux plus élevés d'adsorption non spécifique (bandes non marquées). (à droite) produites à partir d'extraits de cellules HeLa cryomilled présentent une faible adsorption hors cible sur des billes magnétiques d'anticorps couplés à celles produites par traitement par ultrasons lorsqu'il est utilisé pour purifier un complexe de protéine endogène. LAP-tagged 44 RBM7 a été capturé par affinité en utilisant des billes magnétiques couplées à des anticorps anti-GFP polyclonaux pour purifier le complexe SUIVANTE 19,37 (D) extrait produit à partir de poudre cryomilled; (E) des extraits produits par sonication des cellules intactes. La barre verticale noire met en évidence une région du gel où les hautes interacteurs non spécifiques de masse sont observées pour être enrichi dans l'échantillon préparé par sonication. Les flèches noires indiquent interacteurs spécifiques attendus (étiquetés). Les bandes observées ~ 50 kDa dans les voies D et E sont imputables à llama IgG chaînes lourdes. (II) colorés à l' argent sur gel SDS-polyacrylamide. (Std.) Une capture d'affinité maquette réalisée sur HEK-293T extraits cellulaires de façon standard. Après la capture, l'élution du matériau lié a été obtenue par (N) non dénaturant élution avec 1 mg / ml de peptide ou 3xFLAG (D) dénaturant élution dans un tampon d'échantillon SDS-PAGE; (PB 1) Std. mais le peptide 3xFLAG a été inclus dans la solution d'extraction à 1 pg / ml pour bloquer les paratopes α-FLAG sur le support d'affinité; (PB 10) PB 1, mais en présence de 10 pg / ml 3xFLAG peptide. bandes IgG liées et 3xFLAG peptide sont marqués. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: manches et-rondelle PTFE isolant. Une fiole de 250 ml en PTFE est représenté (1). Une inoxydable pot de broyage en acier de 50 ml (2) correspond à l' intérieur du pot de PTFE (3) et fournit lapossibilité de laisser le pot de broyage installé à l'intérieur de l'usine entre les cycles. Une rondelle en PTFE isolante supérieure (2) est utilisé entre l'ensemble de pince et le couvercle du bocal. Refroidir le récipient et l' isolant installé ensemble (3), LN 2 est ajouté directement dans le corps de l'isolateur, qui entoure le pot. Le prochain cycle de fraisage peut alors être lancé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Réactif Concentration suggérée Remarques
Chlorure de sodium 0,1-0,5 M Des concentrations élevées (> 300 mM) ont tendance à améliorer l'extraction des protéines totales et de garder fond faible, mais peut dépouiller un certain inter ailleurs stableacteurs. Les concentrations inférieures à 150 mM ne sont généralement pas efficaces pour réduire la fond non spécifique.
L'acétate d'ammonium 0,2-2 M Un sel, composé de deux tampons, qui donne une solution de pH neutre 57. Des concentrations plus élevées de stabiliser des complexes protéiques. Des solutions acides peuvent résulter de vieux, les stocks cristallins mal entreposés à cause de la perte d'ammoniac. Aucun tampon supplémentaire du pH ou de sels sont nécessaires extractants contenant de l'acétate d'ammonium. Peut être combiné avec NaCl pour moduler les résultats obtenus.
Tween 20 0,1% v / v Un détergent non-ionique 58; typiquement combiné avec du NaCl.
Triton X-100 0,5 à 1% v / v Un détergent non-ionique 58; généralement combiné avec soit NaCl ou NH 4 CH 3 CO 2 H
CHAPS 5 mM Un détergent zwitterionique 58 </ Sup>; typiquement combiné avec du NaCl.
Sarkosyl 1 mM Un détergent anionique 58 qui réduit de fond et peut dépouiller des composants complexes stables, potentiellement révélant la connectivité binaire; typiquement combiné avec du NaCl.
Tris-Ci 20 mM, pK a de 8,8 à 4 ° C, 8,1 à 25 ° C.
(PH 8,0)
Na-HEPES 20 mM, pK a de 7,8 à 4 ° C, 7,5 à 25 ° C. NaOH ou KOH utilisé pour le pH équilibration en fonction du sel (par exemple NaCl, KCl ou CH 3 CO 2 K) utilisé dans l'agent d' extraction.
(PH 7,4)

Tableau 1: Quelques proposé des réactifs utiles pour la purification de complexes protéiques. Ce tableau lists certains réactifs que nous avons trouvé utile pour des complexes de protéines de purification de lignées cellulaires humaines, avec des concentrations de travail proposées. Une formulation typique contient l' agent d' extraction un tampon de pH, un sel et un détergent 1,11,24,45-48. La meilleure pratique consiste à identifier la combinaison moins complexe de réactifs qui donne le résultat désiré.

Figure S1
Figure S1: Mélanger Après analyse Purification (MAP-) de SILAC de faux positifs. I. Schéma: Dans cette expérience 3xFLAG-tagged complexes protéiques ORF2p (exprimées à partir de pLD401) ont été purifiés à partir de cellules grosses que les petites étiquetés HEK-293T 7, respectivement. L'extrait cellulaire de lumière marquée a été ensemencé avec 3xFLAG peptide pour empêcher la capture par affinité de l'ORF2p 3xFLAG étiquetée par inhibition compétitive; cela ne devrait pas bloquer la liaison de protéines qui peuvent se produire non spécifiCally avec le support magnétique ou les structures non-paratopiques de l'anticorps. Après élution à partir des billes magnétiques, les échantillons lourdes et légères ont été post-épuration mixte et analysé par MS quantitative (MAP SILAC 39) pour déterminer la fraction de protéines associées à chaque échantillon; plus en détail méthodologique situé dans le tableau S1. II. Argent gel coloré illustrant que les matériaux légers et lourds marqués donnent des résultats comparables (comparer avec L H), et que la purification réalisée en présence du 3xFLAG spike-in (LI) a été inhibée de façon compétitive. Ci - dessous, un G-250 bouchon de gel coloré au bleu de Coomassie constitué de H mixtes et fractions LI, avant l'analyse protéomique à base de gel, comme décrit dans le tableau S1. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger une version plus grande de cette figure.

Tableau S1:MAP-SILAC. Cette feuille contient les données obtenues lors de l' exécution de l'expérience MAP-SILAC décrit à la figure S1. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Ces trois protocoles fonctionnent en tandem pour (1) préparer des cellules pour l'état solide rupture par cryobroyage, (2) réaliser la rupture dans un broyeur à boulets planétaire, et (3) produire des extraits de poudre de cellule à capture par affinité d'une protéine d'intérêt dans un complexe avec ses interacteurs physiologiques. Beaucoup de différentes techniques de lyse cellulaire existent, y compris les approches mécaniques / physiques employant l' écrasement d' impact, cisaillement, et / ou de pression, ainsi que des approches / enzymatiques chimiques, chacune avec des avantages et des inconvénients 49,50. Chaque chercheur est encouragé à explorer les méthodes les plus appropriées pour leurs analyses, en gardant à l' esprit que toute approche retenue pour la rupture des cellules et l' extraction des protéines est susceptible d'introduire des biais 51,52 nécessitant l' optimisation empirique (discuté ci - dessous). Les méthodes mécaniques peuvent produire la chaleur élevée et / ou des forces de cisaillement qui peut perturber les complexes protéiques. Cryobroyage évite les effets de chauffage en raison de l' emploi LN 2 refroidissement des échantillons pour til durée du processus. Les broyeurs planétaires , on entend compter sur l' impact et de frottement des forces, y compris la contrainte de cisaillement, en tant que composants de particules réduction de la taille 53,54. Les paramètres que nous avons signalé pas observé la dégénérescence des complexes protéiques. En effet , nous avons extrait et récupéré apparemment intacts ~ 50 MDa complexes des pores nucléaires 11 et enzymatiquement rétrotransposons actifs présentant une activité spécifique plus élevée que les préparations employant lyse 'doux' à base de détergent 7. Chimiques et / ou des procédés enzymatiques de lyse cellulaire souffrent de la limitation que le contenu de la cellule sont libérés dans une étude in vitro milieu qui favorise la rupture des membranes cellulaires et des macromolécules structurales mais peut ne pas être approprié pour le maintien de l'intégrité du complexe protéique (s ) d'intérêt. Fréquemment, ni les constituants des complexes formés avec la protéine d'intérêt, ni les conditions nécessaires pour stabiliser les complexes sont ciblésconnu à l'avance. Un avantage majeur de broyage à l'état solide est que la rupture et l'extraction sont découplées, ce qui permet un matériau source pour être préparés sans liquide ajouté, stockés (à -80 ° C ou au-dessous), amassé, et commodément récupérés pour l'expérimentation à la demande; par exemple, pour explorer optimisée dans des conditions in vitro pour la capture d' affinité. Les interactions protéiques sont les plus stables à forte concentration 55,56, donc en minimisant le volume de l' agent d' extraction peut être avantageux pour la conservation des interactions physiologiques. D'autre part, il existe des considérations pratiques - les complexes protéiques ne doivent être partagés par les cellules et en une phase aqueuse non visqueuse, exempte d'agrégats insolubles, afin de mélanger les complexes de cibles avec le support d'affinité. En outre, une certaine normalisation et de contrôle sur l'environnement in vitro (pH, concentration en sel, etc.) est nécessaire pour la systématisation et la reproductibilité. Nous constatons que des extraits produced dans la gamme de dilution de 1: 4-1: 9 (w: v) de répondre aux préoccupations pratiques et théoriques, ce qui donne des résultats de qualité. En outre, la proportion optimale de l'extrait cellulaire d'affinité besoins moyens à déterminer. Ceci est fait de manière empirique par titrage des extraits avec des quantités variables de milieu d'affinité et peut avoir des effets détectables sur le rapport signal sur bruit de l'expérience, en outre discuté ci-dessous. Un excellent appauvrissement de la protéine cible est typiquement ≥70% de la fraction soluble de la protéine cible, mais> 90% est souhaitable et peut être obtenue avec un paramétrage minutieux des conditions d'extraction. Beaucoup de ces considérations pratiques sont couvertes en référence 1. perles paramagnétiques sont manipulées en utilisant des aimants néodyme dans un support de tube de microcentrifugation spécialisée, bien que des alternatives maison sont viables. Lorsqu'il est placé dans le support, les perles collect au niveau du côté du tube sous l'influence du champ magnétique. Les solutions peuvent ensuite être retirés sans disturbing les billes.

Une limitation du protocole cryobroyage présenté, développé avec le broyeur à boulets planétaire utilisé ici (voir le tableau des matériaux), est qu'une quantité minimale de matériel est nécessaire pour efficacement moulin et récupérer la poudre de cellule en utilisant ce dispositif (> 1 g). De telles quantités peuvent être facilement obtenus avec de nombreux microbes, des lignées cellulaires et des organismes modèles, et peuvent souvent être obtenus avec des tissus excisés des animaux de laboratoire. Cependant, certaines lignées cellulaires peuvent être très difficiles à cultiver dans des tissus d'abondance et d'animaux peuvent être rares. De petites quantités de matière peuvent être comparables broyés en utilisant d'autres dispositifs utilisant des contenants plus petits, bien que potentiellement au détriment de la finesse de la poudre obtenue. En outre, le coût des dispositifs de broyage mécanique peut être prohibitif pour certains laboratoires. Cryobroyage peut être réalisé en utilisant un certain nombre de configurations alternatives 14-19, y compris, plus abordable à la main en utilisant un ravageurle mortier, bien que l'efficacité de la rupture diminue considérablement. les protocoles de capture par affinité sont généralement destinés à une grande efficacité de la lyse des cellules pour faciliter l'extraction maximale de la protéine dans la solution et, par conséquent, le potentiel maximal pour la capture des complexes de protéines cibles. D'autre part, il a été démontré pour la levure dans des extraits d' épissage in vitro que la lyse maximale ne peut pas assimiler à une activité maximale dans biochimique in vitro 57,58. On n'a pas observé de tels problèmes dans les systèmes que nous avons testés jusqu'à présent, et donc ne limitent pas volontairement notre rupture cellulaire lorsque cryobroyage. Néanmoins, cette possibilité devrait garder à l' esprit lors de l' optimisation pour les dosages enzymatiques in vitro. Bien que cryobroyage est une méthode très efficace pour briser les cellules, une quantité limitée de sonication profite souvent la production homogènes extraits de cellules entières à partir de tissus de mammifères, car les agrégats hétérogènes peuvent parfois être observés par une inspection visuelle: généralementdans des conditions d'extraction à l'aide de faible à modérée de sel (100-300 mM) et un détergent non-ionique (0,1-1% v / v) des concentrations. Parce que nous avons observé que la présence de ces agrégats peut réduire le rendement et / ou la qualité de la capture d'affinité ultérieure, nous mettons en œuvre systématiquement sonication pour les disperser (même quand ils ne sont pas observées à l'œil nu). Les agrégats sont compatibles avec des fragments de membranes agglomérées, comparables à ceux rapportés précédemment dans des extraits de cellules de levure 58 fraisées. Sonication est également utilisé dans certains protocoles pour cisailler l'ADN et de libérer des fragments de chromatine en solution, mais le degré de sonication appliqué dans ce protocole ne pas sensiblement fragment d'ADN. La disponibilité limitée (ou le coût élevé) d'un excellent ligand d'affinité ou de l'anticorps contre la protéine d'intérêt particulier peuvent être un autre obstacle. Un large éventail de disponibles dans le commerce des réactifs d'affinité peut être mis à profit lorsque l'organisme modèle se prête à l'étiquetage génomique ou transfection avec des vecteurs d'expression ectopique, permettant l'expression de protéines d'intérêt sous forme de fusion par affinité étiquetée. Cependant, la production d'anticorps sur mesure est devenu de plus en plus réalisable et les anticorps polyclonaux et monoclonaux peuvent excellentes performances dans les applications de capture par affinité. Ces nombreuses considérations sont également couverts de façon plus détaillée en référence 1.

Des exemples de la façon dont la méthode de la lyse cellulaire et le choix du milieu d' affinité peuvent affecter les résultats sont illustrés sur la figure 1. Des exemples d'effets exercés par les différents agents d' extraction peuvent être vus dans les références 1,11,24. Parce que ces et d' autres paramètres expérimentaux affectent la qualité de la capture d'affinité, ce qui rend difficile de discriminer ips, les référentiels de "protéomes de perles» et des approches computationnelles pour éliminer les contaminants non-spécifiques ont été développés pour aider à identifier MF 40-43. Néanmoins, ces approches ne substitute pour la préparation optimale de l' échantillon à un degré limité 59. Observer les meilleures pratiques et l'optimisation de l'expérience empirique de capture d'affinité fournira les échantillons de haute qualité pour des analyses en aval, en outre discuté ci-dessous. Une pratique facilement mis en œuvre qui peut améliorer la pureté échantillon est élution native. élution native est le plus fréquemment utilisé pour obtenir le isolé complexe protéique d'affinité, intacte, pour une expérimentation plus poussée; mais il améliore souvent la pureté de l'échantillon, il peut également être utilisé pour cette seule raison. Cependant, comme le montre la figure 1, le panneau II, la capacité d'élution native pour améliorer la pureté échantillon peut dépendre d'un dosage précis de la quantité de milieu d' affinité pour l'abondance de la protéine cible dans l'extrait cellulaire - lorsque le milieu est en excès , paratopes inoccupées peuvent permettre l'accumulation hors cible de protéines FP observables dans les fractions éluées nativement. En utilisant les réactifs et les procédures décrites ici, il hcomme cela a été notre expérience que le plus grand contributeur de MF à nos expériences est la protéine marquée se fois retiré du contexte de la cellule vivante. (Fig. 1.II et Fig. S1). Dans de tels cas, les contrôles de lignées cellulaires parentales qui donnent protéomes non pertinentes en l'absence de l'antigène ne sont d'aucune valeur pratique; De même pour la balise seule ou pic dans les contrôles qui sont dépourvues de tout sauf l'antigène cible. Par conséquent, chaque fois que nous mettons en œuvre pratique I-DIRT 7,38, qui mesure directement l'accumulation des interactions protéiques post-lyse en utilisant MS quantitatives. Comme mentionné dans l'étape 3.2.7 du protocole, les procédures d'élution native varieront selon les détails du système d'affinité utilisé. élution natif est le plus souvent réalisée par déplacement compétitif de la protéine marquée clivage protéolytique complexe ou de l'étiquette, la libération du complexe à partir du milieu d'affinité. Plusieurs systèmes d'affinité comprenant des petites étiquettes d'épitopes existent, for laquelle l'épitope lui - même est disponible en tant que peptide utile pour l' élution compétitive des complexes protéiques étiquetés 60. De même, plusieurs protéases sont disponibles pour cliver spécifiquement des sites parentes placés stratégiquement dans affinité tagged protéines de fusion 61. Selon les spécificités des systèmes d'affinité choisis, le système d'élution approprié pourrait être adopté.

En règle générale, la qualité des résultats obtenus sera considérablement affectée par la qualité de la préparation de l'échantillon. Il est important de travailler avec soin et précision à chaque étape de ces protocoles, et aussi rapidement que possible tout en maintenant soin et précision. Il est conseillé de suivre la répartition de la protéine d'intérêt dans chaque étape de comprendre l'efficacité de chaque manipulation. Par exemple: comment abondante est la protéine d'intérêt dans la cellule ou le tissu en question? Peut-être la protéine à l'étude (et ses complexes) sera difficile à caractériser en masseSpectrométrie en raison de la faible abondance. Si les complexes purifiés sont détectables par coloration générale des protéines (environ nanogrammes gamme), la spectrométrie de masse est susceptible de réussir. Si la protéine capturée d'intérêt ne peut être détectée par western blot sensible chimioluminescent renforcé (environ de gamme picogramme), la spectrométrie de masse est moins susceptible d'être efficace. Même si la protéine d'intérêt est abondant dans la cellule, la façon dont elle est abondante dans l'extrait cellulaire produite? Est-ce que la partition de la protéine à la solution ou est-il dans le culot? Si celui-ci, une nouvelle solution d'extraction peut être mis au point qui peut améliorer la récupération. Une fois que l'extrait cellulaire est combiné avec le milieu d'affinité, dans quelle mesure la protéine est capturée? Est-ce que la protéine reste lié par les lavages suivants? Qu'en est-il d'autres protéines copurifying? En enregistrant une aliquote de chaque échantillon à des étapes appropriées du protocole ces questions peuvent facilement répondre, typiquement par western blot contre la protéine d'intérêtou la coloration des protéines en général, mais d'autres dosages peuvent également être appropriés. Optimisation de chaque étape permettra d'améliorer le rendement et la pureté des complexes capturés, mais il peut y avoir un compromis à faire pour maximiser un attribut ou l'autre.

Une application typique de capture par affinité pour de nombreux chercheurs est d'identifier le candidat dans interacteurs vivo pour un petit nombre de protéines d'intérêt; ces candidats sont fréquemment soumis à la validation par des approches orthogonales in vivo pour démontrer l'importance biologique des interacteurs physiques. Capture d' affinité est également utilisé par des études à haut débit pour générer des listes de copurifying protéines observées sur une base (presque) protéomique à l' échelle, ce qui facilite les inférences de calcul concernant putative dans les complexes in vivo. De nombreux exemples de telles études peuvent être trouvées dans la littérature. Cette approche renonce à l'optimisation des conditions de capture pour une cible donnée en faveur de l'homme à explorerles cibles y; Par conséquent, les complexes eux-mêmes sont inférés rarement récupéré intact et très pur dans un échantillon donné. Au contraire, les chevauchements partiels dans les compositions observées entre les nombreux échantillons d'affinité capturés distincts sont utilisés comme base des conclusions 42. Les deux approches fournissent des données précieuses à notre compréhension de l'interactome. Néanmoins, l'un des principaux avantages de capture par affinité est qu'il ne propose souvent la possibilité d'obtenir les complexes intacts et hautement purifiée, à condition que des efforts sont faits pour optimiser la procédure. Nous croyons que l'avenir de l'approche réside dans l' augmentation de la facilité et l' efficacité de l' optimisation de la capture des complexes de protéines endogènes 11, pour une évaluation plus précise de la gamme des interacteurs physiologiques et une utilisation plus fréquente dans plus biochimique aval, enzymologiques et études structurales, par exemple, fait référence à 7,9,23.

Acknowledgments

Nous remercions le Professeur Brian T. Chait pour son précieux conseils, du soutien et de l'accès à MS instrumentation, ainsi que Mme Kelly R. Molloy pour un excellent support technique. Nous remercions Mme Kelly Bare pour le support avec copie édition. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH P41GM109824, P41GM103314 et P50GM107632.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2 L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62x44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 kPa pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5-2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)

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References

  1. LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
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Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled
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LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P.… More

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