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एक उच्च Throughput, मल्टिप्लेक्स और लक्षित प्रोटिओमिक सीएसएफ परख Neurodegenerative Biomarkers और apolipoprotein ई isoforms स्थिति यों

Published: October 20, 2016 doi: 10.3791/54541
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 3, 4, 5, 1
1Centre for Translational Omics, Genetics and Genomic Medicine Deptartment, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Dementia Research Centre, Institute of Neurology, University College London, 3Clinical Neurochemistry Laboratory, Institute of Neuroscience and Physiology, Department of Psychiatry and Neurochemistry, The Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 4Neurology Unit, Department of Pathophysiology and Transplantation, University of Milan, 5Great Ormond Street Hospital for Children, University College London
* These authors contributed equally

Summary

हम एक उच्च throughput, मल्टीप्लेक्स, और लक्षित प्रोटिओमिक मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) परख नैदानिक ​​अनुवाद के लिए क्षमता के साथ विकसित का वर्णन है। परीक्षण ऐसे apolipoprotein ई वेरिएंट (E2, E3 और इ 4) के रूप में neurodegeneration के लिए संभावित मार्करों और जोखिम वाले कारकों, quantitate, और उनके allelic अभिव्यक्ति उपाय कर सकते हैं।

Abstract

कई neurodegenerative रोगों अभी भी प्रभावी उपचार कमी कर रहे हैं। की पहचान करने और इन रोगों को वर्गीकृत करने के लिए विश्वसनीय बायोमार्कर भविष्य उपन्यास उपचारों के विकास में महत्वपूर्ण होगा। अक्सर संभावित नए बायोमार्कर उनके विकास और उच्च लागत में सीमाओं के कारण क्लिनिक में यह नहीं बनाते हैं। हालांकि, लक्षित एकाधिक रिएक्शन मॉनिटरिंग तरल क्रोमैटोग्राफी-मिलकर का उपयोग कर प्रोटिओमिक्स / मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस), विशेष रूप से, ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर एक तरीका है कि तेजी से मूल्यांकन और नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में नैदानिक ​​अनुवाद के लिए बायोमार्कर मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । परंपरागत रूप से, इस मंच नैदानिक ​​प्रयोगशालाओं में छोटे अणुओं की माप के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह संभावित प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए है, कि यह बनाता है एलिसा (एंजाइम से जुड़ी Immunosor लिए एक आकर्षक विकल्पतुला हुआ परख) आधारित तरीकों। हम यहाँ वर्णन कैसे लक्षित प्रोटिओमिक्स मनोभ्रंश का मल्टिप्लेक्स मार्कर, का पता लगाने और ज्ञात जोखिम कारक ई isoform 4 (ApoE4) apolipoprotein के quantitation सहित मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आदेश में अनुवाद के लिए परख उपयुक्त बनाने के लिए, यह तेजी से सरल, अत्यधिक विशिष्ट हो सकता है और लागत प्रभावी करने के लिए बनाया गया है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, परख के विकास में हर कदम व्यक्तिगत प्रोटीन और ऊतकों वे में विश्लेषण कर रहे हैं के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इस पद्धति का अनुवाद के लिए एक लक्षित प्रोटिओमिक्स एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस के विकास के लिए विभिन्न सुझावों और ट्रिक सहित एक विशिष्ट कार्यप्रवाह का वर्णन ।

विधि विकास tryptic quantotypic पेप्टाइड्स, जो पता लगाने के लिए एमएस जांचना का रिवाज संश्लेषित संस्करणों का उपयोग कर अनुकूलित है और फिर सीएसएफ में नुकीला chromatographic जुदाई एमएस में विश्लेषण करने से पहले में अंतर्जात पेप्टाइड की सही पहचान निर्धारित करने के लिए। Absolu प्राप्त करने के लिएते quantitation, लघु अमीनो एसिड अनुक्रम टैग और एक trypsin दरार साइट युक्त के साथ पेप्टाइड्स के स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक संस्करणों, परख में शामिल किए गए हैं।

Introduction

अल्जाइमर रोग, Lewy शरीर पागलपन और पार्किंसंस रोग, के रूप में neurodegenerative रोगों के बढ़ते प्रभाव के कई देशों 1 में एक सामाजिक आर्थिक मुद्दा बनता जा रहा है। अतिरिक्त बायोमार्कर कि पहचान करने और रोग की प्रारंभिक अवस्था में रोगियों को वर्गीकृत, और किसी भी संभावित नए उपचार पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में एक की जरूरत है। इस विधि के समग्र लक्ष्य neurodegeneration की क्षमता सीएसएफ मार्कर मान्य करने के लिए एक, सुव्यवस्थित आर्थिक और तेजी से रास्ते के लिए एक सामान्य पाइपलाइन बनाने के लिए है। तर्क यह एक आसानी से संशोधनीय विधि के रूप में लक्षित प्रोटिओमिक्स या पेप्टाइड एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस का उपयोग करने की खोज के प्रयोगों से कई संभावित प्रोटीन बायोमार्कर का आकलन करने के लिए है। ये आगे एक तेजी से chromatographic जुदाई (<10 मिनट) और मूल्यांकन के ऊपर मल्टिप्लेक्स जा सकता है। neurodegenerative बायोमार्कर के लिए इस मल्टीप्लेक्स स्क्रीन के भीतर, हम जानते मनोभ्रंश जोखिम कारक apolipoprotein isoform इ 4 (ApoE4) को शामिल किया है तो हम can एक साथ अपनी स्थिति और अभिव्यक्ति के स्तर पर, तय है कि अलग जीनोटाइपिंग परीक्षण 2 के लिए आवश्यकता को नष्ट करने के द्वारा। नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस नियमित तौर पर सही तरह के एलिसा या radioimmunoassay (रिया) के रूप में अन्य तरीकों पर छोटे अणुओं quantitating के लिए पसंद की विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है। विश्लेषण करने के प्रोटीन के लिए एमएस प्रौद्योगिकी के उपयोग में यह बदलाव, इम्युनो आधारित प्रौद्योगिकियों के साथ मुद्दों को प्रेरित मुख्य रूप से किया गया है। ये पार विशिष्टता, बैच बैच बदलाव के लिए, सीमित शैल्फ जीवन है, और उच्च लागत शामिल है। इसलिए, लक्षित प्रोटिओमिक्स तेजी से इस तरह पश्चिमी सोख्ता, रिया और एलिसा के रूप में एंटीबॉडी आधारित तरीकों के लिए एक से बढ़ विकल्प बनता जा रहा है। हालांकि, एक परख में कई मार्करों मल्टीप्लेक्स करने की क्षमता इम्युनो आधारित विधियों 3 पर इस तकनीक का बड़ा फायदा है। तकनीक कई ऊतकों के लिए लागू है और प्लाज्मा 4 और मूत्र 5,6 सहित कई प्रोटिओमिक्स के अध्ययन के लिए एक मान्यता रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया गया है।

जीवन दर्शनchnique ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करने में उपयोग और विशेषज्ञता है कि किसी भी प्रयोगशाला के लिए लागू किया जा सकता है। पेप्टाइड डिजाइन खुला स्रोत डेटाबेस के बढ़ते उपयोग के साथ अपेक्षाकृत सरल है। कस्टम पेप्टाइड्स संश्लेषण के प्रतिस्पर्धी बाजार उन्हें बहुत अधिक किफायती बनाता है। भारी पेप्टाइड्स, हालांकि, महंगे हैं और इसलिए मार्कर एक बड़े पैमाने में जाने से पहले एक छोटे से पलटन पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए। वहाँ बढ़ती क्षमता के लिए तकनीक सबसे बड़े अस्पतालों ट्रिपल quadrupole आधारित प्लेटफॉर्म है जो आसानी से निशाना बनाया प्रोटिओमिक assays चलाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता होने के साथ, नैदानिक ​​नैदानिक ​​सेटिंग में इस्तेमाल किया जा रहा है। विधि से एक इस तरह के आवेदन, दिनचर्या नैदानिक सेटिंग में इसे बनाने, सिकल सेल एनीमिया 7 के लिए नवजात शिशु के रक्त जगह स्क्रीनिंग के लिए अपने हाल के आवेदन पत्र है।

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Protocol

नोट:। यहाँ वर्णित समग्र प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध फाई आंकड़ा 1 में दी गई है इस पद्धति के विकास के लिए इस्तेमाल सभी नमूने अधिशेष नैदानिक नैदानिक नमूने हैं और लंदन ब्लूम्सबरी आचार समिति से नैतिक अनुमोदन किया है।

आकृति 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध मूल्यांकन के लिए एक लक्षित सीएसएफ एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस परख। उम्मीदवार मार्कर पेप्टाइड्स बनाने की समग्र प्रक्रिया illustrating प्रोटीन लक्ष्य से चुने गए हैं। कस्टम संश्लेषित पेप्टाइड्स के उपयोग के माध्यम से, एक लक्षित नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस मल्टीप्लेक्स विधि बनाई गई है। मूल्यांकन के बाद, परख neurodegeneration के संभावित मार्कर की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

1. पेप्टाइड चयन और डिजाइन

नोट: एक मार्कर पेप्टाइड के लिए मानदंड है कि यह अनूठा होना चाहिए (proteotypic (quantotypic) के मात्रात्मक बहुतायत का प्रतिनिधित्व। यदि एक पेप्टाइड अद्वितीय है या नहीं, Uniprot वेबसाइट पर बम धमाके की खोज उपकरण का निर्धारण करने के लिए (http://www.uniprot.org/blast/) का इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. लक्ष्य प्रोटीन (मार्कर), यानी की एक सूची निर्धारित, ApoE (2 टेबल देखें)।
    नोट: मार्कर पिछले प्रोटिओमिक की रूपरेखा प्रयोगों 8 से पहचान की गई है, तो पेप्टाइड है कि उस डेटा सेट से अच्छी प्रतिक्रिया देता है का चयन करें।
  2. यदि यह जानकारी उपलब्ध नहीं है, इस तरह के लक्ष्य प्रोटीन की सिलिको trypsin पाचन में के रूप में खुला स्रोत वेबसाइटों के लिए, ऐसे एमएस-डाइजेस्ट के रूप में एक सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग करने का उपयोग करें।
  3. पेप्टाइड जो tryptic और अतिसंवेदनशील translational संशोधनों पोस्ट करने के लिए नहीं है चुनें।
    नोट: यह जानकारी Uniprot वेबसाइट www.uniprot.org पर जाँच की जा सकती है। नियंत्रण रेखा एमएस नमूना तैयार करने के दौरान रासायनिक संशोधन होने का खतरा पेप्टाइड्स से बचें।
    4. <ली> आदेश चुना पेप्टाइड्स के कस्टम संश्लेषण।
    नोट: मार्कर पेप्टाइड्स कस्टम विभिन्न वाणिज्यिक कंपनियों द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है। ApoE लिए quantotypic कुल ApoE के स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया पेप्टाइड AATVGSLAGQPLQER होने के लिए निर्धारित किया गया था। proteotypic पेप्टाइड E2 और इ 4 वेरिएंट निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया दृश्यों स्थिति 158 (RLAVYQAGAR और CLAVYQAGAR) और स्थिति के 112 (LGADMEDVCGR और LGADMEDVR) के लिए tryptic पेप्टाइड्स, क्रमशः रहे हैं।

2. मानक पेप्टाइड्स की तैयारी

नोट: क्रम में सबसे अच्छा मात्रात्मक संक्रमण का चयन करने के लिए, मैट्रिक्स (सीएसएफ) का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। मल्टिप्लेक्स पेप्टाइड्स के अनुकूलन के लिए सबसे कारगर तरीका ज्ञात सांद्रता में पेप्टाइड्स के पूल बनाने के लिए है। ये ताल तो विधि विकास और मानक घटता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. सिंथेटिक पेप्टाइड्स Resuspend (पेप्टाइड विवरण तालिका 2 में दिए गए हैं) 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर करने के लिएके अनुसार एकाग्रता निर्देश बनाती है। डिफ़ॉल्ट रूप से, अगर निर्देश उपलब्ध नहीं हैं, में 50:50 (वी / वी) acetonitrile (ACN) resuspend पेप्टाइड्स / एच 2 ओ
  2. एक कम बाध्यकारी microcentrifuge ट्यूब में शेयर एकाग्रता और प्रत्येक पेप्टाइड के पूल 1,000 pmol से पेप्टाइड 1:10 dilutions तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम पूल और दुकान गति-VAC concentrator में नीचे सूखी। भविष्य में उपयोग के लिए कई पूल तैयार करें।
  3. अशेष कम बाध्यकारी ट्यूबों में सीएसएफ के 100 μl। फ्रीज सूखे सीएसएफ।
  4. पाचन बफर (100 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.8, 6 एम यूरिया, 2 एम Thiourea, 2% ASB14) 10 और 1 pmol / μl की सांद्रता प्राप्त करने के लिए जमा 1,000 pmol पेप्टाइड्स के एक विभाज्य Resuspend।
  5. 0, 1, 2, 5, 10 और 15 बजे सांद्रता में सीएसएफ के फ्रीज सूखे 100 μl aliquots में जमा पेप्टाइड्स स्पाइक। बरकरार असंबंधित प्रोटीन की 20 एनजी ऐसे खमीर enolase टीआर की पाचन क्षमता के लिए एक आंतरिक मानक और नियंत्रण के रूप में कार्य करने के लिए के रूप में जोड़ेंypsin।
  6. 20 μl के अंतिम राशि के लिए बफर पचाने के साथ सीएसएफ aliquots ऊपर। भंवर।
  7. (100 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.8 से 1 मिलीलीटर में 30 मिलीग्राम) dithiothreitol के 1.5 μl जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिला।
  8. (100 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.8 से 1 मिलीलीटर में 35 मिलीग्राम) iodoacetamide के 3 μl जोड़ें और अंधेरे में 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिला।
  9. DDH 2 ओ के 165 μl जोड़े
  10. अनुक्रमण ग्रेड संशोधित trypsin समाधान 50 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट बफर, पीएच 7.8 में resuspended μl 0.1 माइक्रोग्राम के 10 μl जोड़ें /। 37 डिग्री सीओ / एन पर एक पानी के स्नान में सेते हैं और ठंड के नमूने से पाचन बंद करो। विश्लेषण करने के लिए तैयार है जब तक स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर हज़म।

3. एमएस पेप्टाइड का पता लगाने के अनुकूलन

  1. कॉपी और पेस्ट पेप्टाइड के अनुक्रम अनुकूलित किया जाना, एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर, जैसे, क्षितिज 9 में। जानकारी प्राप्त करने के लिए पेप्टाइड अनुक्रम पर क्लिक करेंउम्मीद अग्रदूत आयन मास और उत्पाद आयनों की।
  2. शेयर एकाग्रता से पेप्टाइड्स पतला 1 एनजी / एमएस पद्धति के विकास के लिए मिलीलीटर एकाग्रता के लिए (धारा 2.1 देखें) आगे।
  3. सीधे अनुकूलित प्रवाह दर पर मास स्पेक्ट्रोमीटर में पेप्टाइड्स दिखे (आमतौर पर 0.1 - 0.8 मिलीलीटर / मिनट) और 0 के साथ - 5% टक्कर ऊर्जा।
  4. आदेश प्रयोगात्मक गुणा आरोप लगाया अग्रदूत आयनों 8 की पहचान करने में एमएस स्पेक्ट्रम मोल। अग्रदूत आयन (मी / z) है कि सबसे अधिक तीव्रता (doubly- या triply आरोप लगाया अग्रदूत आयनों सलाह दी जाती है) देता है चुनें।
  5. पेप्टाइड Reinfuse और टक्कर प्रेरित-हदबंदी (सीआईडी) ने पेप्टाइड टुकड़ा करने के लिए टक्कर ऊर्जा लागू होते हैं। कोन और टकराव ऊर्जा का अनुकूलन सबसे अच्छा विखंडन पैटर्न प्राप्त करने के लिए (टुकड़ा आयनों अकेले या दोगुना आरोप लगाया, और टुकड़ा आयन माता पिता आयन से अधिमानतः बड़ा की बड़े पैमाने पर, सलाह दी जाती है)।
  6. सत्यापित करें कि प्रायोगिक तौर पर प्राप्त संक्रमण सिलिको में उत्पन्न संक्रमण से मेल </ Em> (3.1 कदम के रूप में वर्णित)। कम से कम 2 अग्रदूत आयन प्रति सबसे तीव्र संक्रमण का उपयोग MRM विधि फ़ाइल में संक्रमण सूची सहेजें। quantitation के लिए 1 और 1 अंतिम परख में पुष्टि के लिए: 2 बदलाव शामिल करें।
    नोट: कुछ एमएस निर्माताओं के लिए एक समारोह है (यानी, जल Intellistart) स्वचालित एमआरएम या एसआरएम विश्लेषण अनुकूलन के लिए। 0.1% एफए के साथ 70% ACN - यदि संभव हो तो 50 में संयुक्त मोबाइल चरणों के साथ पेप्टाइड्स दिखे।

4. नियंत्रण रेखा MRM विधि विकास

नोट: एक अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (UPLC) प्रणाली ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित द्वारा सिंथेटिक पेप्टाइड्स के मिश्रण का विश्लेषण। सुनिश्चित स्रोत साफ है। विलायक एक DDH 2 0 0.1% एफए के साथ है; विलायक बी 0.1% एफए के साथ ACN है।

  1. नियंत्रण रेखा एमएस एक UPLC स्तंभ एक ही चरण के एक पूर्व स्तंभ के लिए सी -18 चरण (1.6 मीटर व्यास, 90 A pores, 2.1 मिमी x 50 मिमी लंबाई) के साथ पैक किया और संलग्न के साथ सुसज्जित प्रणाली का प्रयोग करें। </ Li>
  2. Defrost सीएसएफ 300 μl कांच डालने शीशियों में 10 मिनट और हस्तांतरण 60 μl के लिए 16,000 ग्राम पर बर्फ, सेंट्रीफ्यूज पर हज़म और ओ सी -20 पर वापस बाकी स्टोर
  3. मानक वक्र दृष्टि से सर्वोच्च एकाग्रता 10 मिनट 1 का उपयोग कर इंजेक्षन - 40% ACN रैखिक ढाल (ढाल सेटिंग्स के लिए 1 टेबल देखें)
  4. जिसके परिणामस्वरूप वर्णलेख और टिप्पणी अवधारण समय और शीर्ष दो सबसे तीव्र (मात्रात्मक) पेप्टाइड प्रति संक्रमण चरण 3 में बनाए गए सभी बदलाव के साथ खुला।
  5. इस जानकारी के आधार पर, पेप्टाइड्स (उदाहरण के लिए देखें चित्र 2) को मापने के लिए एक 10 मिनट का समय समाप्त एम आर एम चैनलों के साथ (3.6 कदम में बनाया) विधि का अद्यतन करें। संवेदनशीलता को बनाए रखने के लिए, 8 से अधिक चोटी प्रति अंक के साथ प्रत्येक चैनल रखने के लिए और प्रत्येक पेप्टाइड के लिए कम से कम एक संक्रमण के लिए 0.01 सेकंड से अधिक समय ध्यान केन्द्रित करना।
  6. पहली शिखर क्षालन से पहले 10 सेकंड और जब तक शुरुआत में एक: शामिल MRM विधि में 'विलायक देरी'विधि, पिछले शिखर क्षालन के बाद 20 सेकंड के अंत में एक और। एमएस विधि फ़ाइल में विधि की घटनाओं में "विलायक देरी" का चयन करके यह मत करो।
  7. समय पर एमआरएम पद्धति के माध्यम से मानक वक्र चलाने के लिए और यह सुनिश्चित संक्रमण (3.6 कदम में उत्पन्न) के साथ कोई हस्तक्षेप अविशिष्ट चोटियों linearity के लिए जाँच करके देखते हैं।
  8. निर्धारित करती है कि पेप्टाइड्स विधि के माध्यम से गैर नुकीला जमा नियंत्रण और रोग सीएसएफ चलाने के द्वारा detectable हैं।
  9. पेप्टाइड्स कि परख से पता लगाने की सीमा से नीचे हैं निकालें।

चित्र 2
पेप्टाइड बदलाव की चित्रा 2. एक गतिशील एम आर एम एम एस विधि का उदाहरण है। समय पर चैनल की स्थापना प्रतिधारण समय के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है। MRMs को सक्षम करने से एक समय पर फैशन में शामिल होने के रूप में चयनित मार्कर पेप्टाइड्स क्रोमैटोग्राफी स्तंभ से elute, टीआरए की संख्या को कम करता हैएक समय अवधि में nsitions और परख की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. आंतरिक मानकों के अलावा

ध्यान दें: पहले 10 में वर्णित के रूप में, स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानकों परख में शामिल किया जा सकता है। इन मानकों के खर्च के कारण, यह पहली मैट्रिक्स में पेप्टाइड्स का आकलन करने की सलाह दी है।

  1. निर्धारित बनाने के लिए आदर्श सीएसएफ में पता लगाने के लिए अनुकूलित पेप्टाइड्स: उच्चतम तीव्रता के साथ और हस्तक्षेप के बिना चोटियों, पेप्टाइड्स जो सबसे आवर्तक हैं चुनें।
  2. डिजाइन इसी पेप्टाइड्स भारी 13 सी 15 एन एमिनो एसिड लेबल है कि द्वारा अंतर्जात पेप्टाइड के लिए कम से कम 6 दा रिश्तेदार पेप्टाइड की बड़े पैमाने पर बढ़ाने के लिए शामिल करने के लिए। भारी जोश के 6 अतिरिक्त अमीनो एसिड या तो एन या सी टर्मिनस - इसके अलावा, 4 की एक और टैग को जोड़नेज्वार tryptic पाचन के लिए नियंत्रित करने के लिए।
  3. पाचन बफर में स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानकों पतला (2.4 कदम देखें)। स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक के आदर्श राशि जो सीएसएफ में abundancies पहले विकास के दौरान मनाया के आधार पर विभिन्न स्तरों में spiking द्वारा नुकीला हो जाएगा निर्धारित करते हैं। अंतर्जात पेप्टाइड को स्थिर आइसोटोप लेबल मानक की: 1 के अनुपात लगभग 1 प्राप्त करने के लिए निशाना लगाओ।
    ध्यान दें: स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानकों विभिन्न वाणिज्यिक कंपनियों द्वारा संश्लेषित किया जा सकता है।

6. नियंत्रण रेखा एम आर एम सीएसएफ रोगी के नमूने की परख

  1. स्पाइक सीएसएफ के 100 μl में अनुकूलित स्थिर आइसोटोप लेबल मानकों की राशि और मिश्रण फ्रीज सूखे।
  2. डाइजेस्ट के 20 μl में सीएसएफ Resuspend बफर और 2.7 अंक में वर्णित के रूप में पाचन प्रदर्शन - 2.10।
  3. चरण 4 में विकसित नियंत्रण रेखा एम आर एम पद्धति का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण।
  4. मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, मानक पेप चलानेएक मानक वक्र में 0 -15 pmol की सांद्रता में ज्वार। मानक वक्र की तैयारी के लिए 2.5 कदम देखें।

7. डेटा विश्लेषण

नोट: मात्रात्मक डेटा आधारभूत चोटी आंतरिक मानकों (भारी लेबल पेप्टाइड्स) की तीव्रता अनुपात पर आधारित है। एसआरएम / MRM डेटा विश्लेषण के बारे में विस्तृत जानकारी पहले 10 में वर्णित किया गया था। अनुपात डेटा तो एक मानक की अवस्था में इस्तेमाल किया जा सकता पूर्ण स्तर का निर्धारण या उन्हें भारी लेबल पेप्टाइड का जोड़ा एकाग्रता से गणना करने के लिए।

  1. मास स्पेक्ट्रोमीटर 'निर्माताओं मानक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 10 नियंत्रण रेखा MRM डेटा का विश्लेषण। वैकल्पिक रूप से, क्षितिज सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रात्मक MRM डेटा 10 विश्लेषण करने के लिए।
  2. ऐसे नुकीला खमीर enolase या प्रत्येक समय में एक स्थिर आइसोटोप लेबल मानक के रूप में एक आंतरिक मानक की प्रतिक्रिया की जाँच करके रन की संवेदनशीलता की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि भिन्नता (सीवी) के गुणांक से बड़ा नहीं है25%।
  3. मैन्युअल रूप से डेटा एनोटेशन की समीक्षा सटीकता सुनिश्चित करने के लिए। एक उचित स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक करने के लिए प्रत्येक पेप्टाइड और अनुपात का विश्लेषण करें, यानी, पेप्टाइड के स्थिर आइसोटोप लेबल संस्करण का उपयोग करें यदि उपलब्ध है।
  4. सीएसएफ के 100 μl प्रति pmol की निरपेक्ष मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, उचित मानक घटता है कि एक ही समय में चलाए जा रहे थे माध्यम अनुपात डेटा चलाते हैं।
  5. भिन्नता (सीवी) के गुणांक की गणना। प्रत्येक पेप्टाइड के लिए CV उच्च प्रचुर मात्रा में पेप्टाइड्स के लिए 25% से नीचे और 15% से नीचे होना चाहिए।
    नोट: प्रति 100 μl सीएसएफ मूल्यों निरपेक्ष मूल्य pmol बाद के बहाव के सांख्यिकीय विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है।

8. apolipoprotein ई isoform स्थिति

ध्यान दें: ApoE isoform स्थिति का निर्धारण करने के लिए, इसी पेप्टाइड्स की उपस्थिति प्रत्येक isoform की उपस्थिति का निर्धारण करके किया जा सकता है।

  1. > 1,000 संकेत के सीएसएफ सीमा के 100 μl में ApoE पर विचारकि पेप्टाइड के लिए सकारात्मक रूप में करने वाली शोर। पेप्टाइड्स आवश्यक / एक मरीज की isoform स्थिति निर्धारित करने के लिए अनुपस्थित चित्रा 5 देखें। कुल ApoE अभिव्यक्ति प्रत्येक isoform के% की गणना के द्वारा allelic अभिव्यक्ति का निर्धारण करते हैं।

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Representative Results

ऊपर वर्णित विधि का उपयोग करना, एक उच्च throughput 10 मिनट मल्टीप्लेक्स 54 प्रोटीन से 74 पेप्टाइड्स से मिलकर परख neurodegenerative विकारों अल्जाइमर रोग और Lewy शरीर मनोभ्रंश (LBD) 8। चित्रा 3 के मार्करों के लिए एक परख के रूप में विकसित किया गया था प्रकाशित एक मल्टीप्लेक्स वर्णलेख चलता पहले 8 परख से महत्वपूर्ण पेप्टाइड मार्कर की। परख और उनकी मात्रात्मक बदलाव में शामिल पेप्टाइड्स तालिका 2 में दिया जाता है। इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा प्रासंगिक स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानक के लिए मानकीकृत अनुपातों देता है। इन मूल्यों को तो निरपेक्ष pmol / 100 μl सीएसएफ सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र के माध्यम से रखा जा सकता है। इन मूल्यों उन्हें सांख्यिकी नैदानिक ​​नमूनों में परिवर्तन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है।

पहले से वर्णित के रूप में 8, 74 पीई के quantitationइस सीएसएफ परख में शामिल ptides से पता चला है कि इन मार्करों के 25 मनोभ्रंश रोगियों के सीएसएफ में काफी बदल गया था। इस परख के प्रभाव को समझने के लिए पहले से परिणाम मनोभ्रंश मार्कर समर्थक orexin और YKL काइटिनेस 3-जैसे प्रोटीन वर्णित (YKL-40) 11,12 चित्रा 4 में दिया जाता है। एकीकृत ApoE परख के ApoE isoform / एलील स्थिति को दिखाता है साथ ही मरीज। ए पी ओ इ 4 अल्जाइमर रोग के लिए एक ज्ञात जोखिम कारक है, इसलिए परख में इस एकीकृत करने में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करेगा। ApoE isoforms का पता लगाने के चित्रा 5 में विस्तार से बताया है और isoforms के लिए एमिनो एसिड में परिवर्तन के लिए इसी पेप्टाइड का पता लगाने पर आधारित है E2 (R158C) और इ 4 (C112R)। चित्रा 5 ए चोटी पैटर्न प्रत्येक isoform संयोजन के लिए उम्मीद से पता चलता है और चित्रा 5 ब एक सीएसएफ रोगी के नमूने पर परख के साथ परीक्षण के परिणाम से पता चलता।


चित्रा 3. प्रतिनिधि मढ़ा एमआरएम chromatograms। हेवुड एट अल। Neurodegenerative विकारों Lewy शरीर पागलपन और अल्जाइमर रोग 8 एक 10 मिनट नियंत्रण रेखा ढाल पर दिखाया जाता है के लिए 8 Biomarkers महत्वपूर्ण से पुनर्मुद्रण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. उदाहरण डेटा। हेवुड एट अल से पुनर्मुद्रण। 8 रेखांकन बताएंगे कि कैसे वर्णित एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विधि मज़बूती quantitate और ऐसे YKL काइटिनेस 3-जैसे प्रोटीन के रूप में जाना जाता है neurodegenerative मार्कर (YKL-40) 11 नियंत्रण से भेदभाव कर सकते हैं 12 और ई मार्कर पीआर ओ-orexin 13। ई = अल्जाइमर रोग, LBD = Lewy शरीर मनोभ्रंश और पीडी = पार्किंसंस रोग। डेटा पहले प्रकाशित किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. कैसे एक मरीज की ए पी ओ ई isoform स्थिति निर्धारित किया जा सकता का चित्रण। ए पेप्टाइड्स RLAVYQAGAR तटस्थ पता लगाने के लिए E4 की और स्थिति के लिए 158 उपस्थिति के लिए तटस्थ (e3a) के लिए 112 अमीनो एसिड अनुक्रम LGADMEDVCGR या LGADMEDVR को कवर इंगित करता है (E3B) या ApoE अनुक्रम से E2 isoform। बी पेप्टाइड्स के लिए CLAVYQAGAR बाएं हाथ पैनल में दिखाया जाता है। पेप्टाइड्स सीएसएफ में पता चला के विभिन्न संयोजनों ApoE isoform स्थिति का संकेत कर सकते हैं।फ़ाइलें / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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पहर फ्लो (मिलीग्राम / मिनट) % ए % बी वक्र
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0.2 0.8 97 3 6
0.8 60 40 6
7.01 0.8 0.1 99.9 6
8 0.8 0.1 99.9 6
8.01 0.8 97 3 1
10 0।8 97 3 1

टेबल एक 10 मिनट के लिए विधि 1. UPLC ढाल सेटिंग्स। एक = DDH 2 0 0.1% एफए, बी = एसीएन, 0.1% एफए

तालिका 2 पेप्टाइड्स सीएसएफ एमआरएम नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस परख में शामिल हैं। दिखाए गए सभी शामिल विधि में इस्तेमाल पेप्टाइड्स, जो वर्णन किया और 8 प्रकाशित कर रहे हैं। कि क्या मार्कर मज़बूती से सीएसएफ के 100 μl में पाया गया था के संकेत संकेत दिया है। बोल्ड में लेबल बदलाव मात्रात्मक डेटा के लिए इस्तेमाल होते हैं। इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सभी एमएस आधारित assays के साथ के रूप में, विधि में महत्वपूर्ण कदम आंतरिक मानकों का उचित और सटीक मात्रा के निर्धारण कर रहे हैं। पूर्ण quantitation इस्तेमाल किया जा रहा है, तो मानक वक्र में नुकीला पेप्टाइड्स की सही मात्रा में भी महत्वपूर्ण हैं।

हमारे परख सीएसएफ या एमएस विश्लेषण करने से पहले साफ ऊपर या desalting कदम के किसी भी प्रकार के उपयोग की वर्षा की आवश्यकता नहीं है - यह एक पूरी तरह से एक पॉट प्रतिक्रिया विधि है। सीएसएफ की छोटी मात्रा और अपने सीमित जटिलता (प्लाज्मा की तुलना में) के कारण, यह पाया गया है कि इन कदमों अंतिम प्रोटोकॉल से हटाया जा सकता है, जिससे परख सरल बनाने और नैदानिक ​​सेटिंग में अनुवाद के लिए यह अधिक उपयुक्त बनाने। मुख्य विश्लेषणात्मक स्तंभ के लिए और एमएस विधि में विलायक देरी की एक पूर्व स्तंभ के समावेशन, एमएस के दौरान संवेदनशीलता बनाए रखने के लिए 500 से अधिक नमूनों के लिए चलाने के लिए पर्याप्त होना दिखाई देते हैं। जैसा कि परख-UPLC runniएनजी समय कम है, यह महत्वपूर्ण है कि वास्तव में सीएसएफ में सही चोटी की पहचान करने के लिए मैट्रिक्स पचाने।

यह केवल नुकीला संश्लेषित पेप्टाइड्स के उपयोग और एक मानक की अवस्था के साथ प्राप्त किया जा सकता है। अगर वहाँ एक पेप्टाइड सही chromatographic पीक करने के लिए मिलान के एक अनिश्चितता है तो यह कई बदलाव के माध्यम से नमूना चलाने के लिए और सिंथेटिक मानकों के साथ संक्रमण तीव्रता पैटर्न की जांच करने के लिए उपयोगी हो सकता है। हमारे assays के सभी पेप्टाइड की पहचान की पुष्टि करने के लिए कम से कम 2 पेप्टाइड्स संक्रमण होते हैं।

परख सीएसएफ के ऊपर से 100 μl में पता चला मार्करों के लिए विकसित किया गया है। पागलपन के कुछ अन्य मार्करों के लिए, सीएसएफ की एक बड़ी मात्रा की जरूरत हो सकती है। परख की एक और सीमा प्रोटीन अभिव्यक्ति के गतिशील रेंज का मुद्दा है। कुछ प्रचुर मात्रा में मार्कर एक छोटी मात्रा में मास स्पेक्ट्रोमीटर पर इंजेक्शन जा whilst कुछ कम प्रचुर मात्रा में मार्कर एक बड़ा इंजेक्शन की मात्रा की आवश्यकता की जरूरत है। इसलिए samplई दो बार इंजेक्शन होना पड़ सकता है।

इस तकनीक का महत्व मल्टीप्लेक्स करने की क्षमता और एंटीबॉडी के ऊपर पहचान के 3 स्तरों की वृद्धि की विशिष्टता (अवधारण समय, अग्रदूत और उत्पाद मी / z) है। नैदानिक ​​अनुवाद के नजरिए से सबसे बड़ा फायदा हालांकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण और प्रशिक्षित कर्मियों के लिए एक प्रारंभिक परिव्यय की आवश्यकता है, संभावित लागत एंटीबॉडी पर बचत है। एक अन्य संपत्ति, जिसमें गति विधि ट्रिपल quadrupole आधारित सिस्टम पर अनुवाद किया जा सकता है। यह काफी सभी इम्युनो-आधारित तकनीकों की तुलना में अनुवाद और एक परख को मान्य करने की क्षमता को गति। अंत में, के रूप में इस मंच और विशेषज्ञता को नियमित चिकित्सकीय छोटे अणुओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, कई बड़े अस्पताल केन्द्रों पहले से ही जगह में इस बुनियादी ढांचा है। neurodegeneration के क्षेत्र में ध्यान केंद्रित करने और सीएसएफ और सीरम में नए बायोमार्कर के लिए जरूरत के एक बहुत कुछ है। इस पद्धति का एक पीएलए प्रदान करता हैएक उच्च throughput परख जहां भविष्य मार्कर जोड़ा जा सकता है (और हटाया) के लिए tform, आदि प्रभावकारिता के लिए मूल्यांकन किया जाना है। यह तकनीक है जो पहले से ही 2 और यहां तक कि bloodspots वर्णित किया गया है ऐसे प्लाज्मा के रूप में ApoE isoform पहचान के लिए अन्य ऊतकों, के लिए आगे आवेदन किया है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade  Fisher A955-1
Formic acid, LC-MS grade, Fisher A117-50
Dithiothreitol (DTT) Sigma  D5545 - 5 g
Hydrochloric acid, 37% w/w VWR  BDH3028 - 2.5 LG
Iodoacetamide   Sigma  I1149 - 5 g
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher S318-500
Trypsin, sequencing grade, modified Promega V5113
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade Fisher A116-50
Urea Sigma U0631- 500 g
Water, LC-MS ULTRA Chromasolv Fluka 14263
Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg Genscript custom
heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides Genscript custom
ASB 14 Merck Millipore 182750 - 25 g
Thiourea Sigma T7875 - 500 g
Tris base Sigma T6066
VanGuard precolumn Waters 186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm  2.1 x 50 mm column Waters 186007114
Yeast Enolase  Sigma E6126
300 μl clear screw top glass vials Fisher scientific 03-FISV
Y slit screw caps  Fisher scientific 9SCK-(B)-ST1X
Freeze dryer Edwards Mudulyo  Mudulyo system
Concentrator/Speed vaccum Eppendof  concentrator plus 5301
Xevo -TQ-S mass spectrometer Waters
Acquity UPLC system Waters

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References

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चिकित्सा अंक 116 सीएसएफ लक्षित प्रोटिओमिक्स मल्टीपल रिएक्शन मॉनिटरिंग apolipoprotein ई isoform पागलपन बायोमार्कर मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री मल्टीप्लेक्स
एक उच्च Throughput, मल्टिप्लेक्स और लक्षित प्रोटिओमिक सीएसएफ परख Neurodegenerative Biomarkers और apolipoprotein ई isoforms स्थिति यों
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Heywood, W. E., Baud, A., Bliss, E., … More

Heywood, W. E., Baud, A., Bliss, E., Sirka, E., Schott, J. M., Zetterberg, H., Galimberti, D., Sebire, N. J., Mills, K. A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status. J. Vis. Exp. (116), e54541, doi:10.3791/54541 (2016).

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