En højt gennemløb, Multipleksede og målrettet proteomiske CSF Assay at kvantificere neurodegenerative Biomarkører og apolipoprotein E Isoformer status

Summary

Vi beskriver en high-throughput, multiplex, og målrettet proteomik cerebrospinalvæske (CSF) assay udviklet med potentiale for klinisk oversættelse. Testen kan kvantificere potentielle markører og risikofaktorer for neurodegeneration, såsom apolipoprotein E-varianter (E2, E3 og E4), og måle deres allel udtryk.

Abstract

Mange neurodegenerative sygdomme mangler stadig effektive behandlinger. Pålidelige biomarkører til at identificere og klassificere disse sygdomme vil være vigtig i udviklingen af ​​fremtidige nye behandlingsformer. Ofte potentielle nye biomarkører ikke gøre det til klinikken på grund af begrænsninger i deres udvikling og høje omkostninger. Men målrettede proteomics ved hjælp af flere Reaction Monitoring væskekromatografi-tandem / massespektrometri (MRM LC-MS / MS), specielt ved hjælp af tredobbelt kvadrupol massespektrometre, er en metode, der kan bruges til hurtigt at vurdere og validere biomarkører for klinisk oversættelse til diagnostiske laboratorier . Traditionelt har denne platform vid udstrækning blevet anvendt til måling af små molekyler i kliniske laboratorier, men det er muligt, at analysere proteiner, der gør det til et attraktivt alternativ til ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent assay) -baserede metoder. Vi beskriver her, hvordan målrettet proteomics kan anvendes til at måle multipleksede markører for demens, herunder detektion og kvantificering af den kendte risikofaktor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).

For at gøre assayet egnet til oversættelse, er det designet til at være hurtig, enkel, meget specifikke og omkostningseffektiv. For at opnå dette, skal hvert skridt i udviklingen af ​​analysen være optimeret til de individuelle proteiner og væv de er analyseret i. Denne metode beskriver en typisk arbejdsgang herunder forskellige tips og tricks til at udvikle en målrettet proteomics MRM LC-MS / MS til oversættelse .

udvikling Metoden er optimeret ved hjælp af brugerdefinerede syntetiserede versioner af tryptiske quantotypic peptider, der kalibrere MS til påvisning og derefter tilsat til CSF for at bestemme korrekt identifikation af det endogene peptid i kromatografiske separation inden analyse i medlemsstaterne. For at opnå absolute kvantificering, isotopmærkede interne standard versioner af peptiderne med korte aminosyresekvensvarianter tags og indeholder en trypsin-spaltningssted, er inkluderet i assayet.

Introduction

Den voksende betydning af neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom, Lewy body demens og Parkinsons sygdom, er ved at blive en samfundsøkonomisk problem i mange lande ^1. Der er et behov i yderligere biomarkører, der kan bruges til at identificere og klassificere patienter i de tidlige stadier af sygdommen, og at overvåge eventuelle nye behandlinger. Det overordnede mål med denne metode er at skabe en generisk pipeline for en strømlinet, økonomisk og hurtigere måde at validere potentielle CSF markører for neurodegeneration. Rationalet er at bruge målrettede proteomics eller peptid MRM LC-MS / MS som en let amendable metode til at vurdere flere potentielle protein biomarkører fra discovery eksperimenter. Disse kan yderligere multiplekset over en hurtig kromatografisk separation (<10 min) og vurderes. Inden for denne multiplex skærm for neurodegenerative biomarkører, har vi inkluderet den kendte demens risikofaktor apolipoprotein isoform E4 (ApoE4) så vi can samtidig bestemme dens status og udtryk, som denne eliminerer behovet for separate genotypebestemmelserne ^2. LC MS / MS anvendes rutinemæssigt som den foretrukne metode til nøjagtig kvantificering af små molekyler i forhold til andre metoder, såsom ELISA eller radioimmunoassay (RIA). Dette skift i brugen af ​​MS-teknologi til at analysere proteiner, er hovedsagelig blevet drevet af problemer med immuno-baserede teknologier. Disse omfatter cross-specificitet, batchdivergens, begrænset holdbarhed, og høje omkostninger. Derfor er målrettede proteomics hurtigt bliver en voksende alternativ til antistofbaserede metoder, såsom Western blotting, RIA og ELISA. Men evnen til at multiplekse mange markører i ét assay er den største fordel ved denne teknik igen immuno-baserede metoder ^3. Teknikken kan anvendes på mange væv og har været brugt som en validering strategi for mange proteomics undersøgelser, herunder plasma ⁴ og urin ^5,6.

Den technique kan anvendes på alle laboratorier, der har adgang og ekspertise i at bruge tredobbelt kvadrupol massespektrometre. Peptid design er relativt enkelt med den stigende brug af open source-databaser. Den konkurrenceprægede marked for brugerdefinerede peptider syntese gør dem langt mere overkommelig. Heavy peptider, men er dyre og derfor markørerne bør vurderes på en lille kohorte før du flytter til en større skala. Der er voksende potentiale for teknikken, der skal anvendes i kliniske diagnostiske indstillinger, med de fleste store hospitaler med tripel kvadrupol-baserede platforme, som let kan tilpasses til at køre målrettede proteom assays. En sådan anvendelse af metoden, hvilket gør det til den rutinemæssige diagnostiske indstilling, er dens seneste ansøgning til nyfødte blod spot screening for seglcelleanæmi ^7.

Protocol

BEMÆRK:. En skematisk af den samlede protokollen beskrevet her er givet i Fi gur 1 Alle prøver, der anvendes til udvikling af denne metode er overskydende kliniske diagnostiske prøver og har etisk godkendelse fra London Bloomsbury Etik udvalg.

Figur 1. Skematisk Illustrerer den overordnede proces for oprettelse af en målrettet CSF MRM LC-MS / MS-analyse. Candidate markør peptider til evaluering er udvalgt fra protein-targets. Gennem brug af brugerdefinerede syntetiserede peptider, er skabt en målrettet LC-MS / MS multiplex-metode. Efter evalueringen kan assayet anvendes til at vurdere effektiviteten af ​​potentielle markører for neurodegenerering.

1. Peptid Valg og Design

BEMÆRK: Kriterier for en markør peptid er, at det skal være entydigt (proteotypic (quantotypic). At afgøre, om et peptid er unik eller ej, 'blast' search værktøj på UniProt hjemmeside (http://www.uniprot.org/blast/) kan anvendes.

1. Definer en liste over mål proteiner (markører), dvs., ApoE (se tabel 2).
   BEMÆRK: Hvis markøren er blevet identificeret fra tidligere proteom profilering eksperimenter ^8, og vælg derefter peptid, der giver den bedste respons fra det pågældende datasæt.
2. Hvis denne information ikke er tilgængelig, kan du bruge open source hjemmesider, såsom i silico trypsin fordøjelse af target proteiner, ved hjælp af en software-værktøj som MS-Digest.
3. Vælg den peptid, som er tryptiske og ikke modtagelig for at skrive translationelle modifikationer.
   BEMÆRK: Disse oplysninger kan kontrolleres på UniProt hjemmeside www.uniprot.org. Undgå peptider tilbøjelige for kemiske forandringer i løbet af LC-MS prøveforberedelse.
<li> Bestil skik syntese af de valgte peptider.
BEMÆRK: Marker peptider kan brugerdefinerede syntetiseret af forskellige kommercielle selskaber. For ApoE den quantotypic peptid, der anvendes til at måle total ApoE niveauer blev bestemt til at være AATVGSLAGQPLQER. De proteotypic peptidsekvenser anvendes til bestemmelse af E2 og E4 varianter er de tryptiske peptider til position 158 (RLAVYQAGAR og CLAVYQAGAR) og position 112 (LGADMEDVCGR og LGADMEDVR), hhv.

2. Udarbejdelse af Standard peptider

BEMÆRK: For at udvælge de bedste kvantitative overgange, skal optimeres påvisning af matricen (CSF). Den mest effektive måde at optimere multipleksede peptider er at skabe puljer af peptiderne ved kendte koncentrationer. Disse pools kan derefter anvendes til metodeudvikling og standardkurver.

1. Resuspender syntetiske peptider (peptid detaljer er givet i tabel 2) til 1 mg / ml stamopløsningkoncentration i henhold til fabrikantens instruktioner. Som standard, hvis instruktionerne ikke er tilgængelige, resuspender peptider i 50:50 (v / v) acetonitril (ACN) / H ₂ O.
2. Forbered 1:10 fortyndinger af peptidet fra bestanden koncentration og pool 1.000 pmol af hvert peptid i en lav binding mikrocentrifugerør. Tør ned i en speed-vac koncentrator den endelige pool og opbevares ved -20 ° C. Forbered flere pools til fremtidig brug.
3. Portion 100 ul CSF i lave bindende rør. Frysetørre CSF.
4. Resuspender en alikvot af poolede 1.000 pmol peptider i digestionspuffer (100 mM Tris-HCI, pH 7,8, 6 M urinstof, 2 M thiourinstof 2% ASB14) til opnåelse koncentrationer på 10 og 1 pmol / pl.
5. Spike de samlede peptider i de frysetørrede 100 ul portioner af CSF ved 0, 1, 2, 5, 10 og 15 pM koncentrationer. Tilsæt 20 ng af intakt ubeslægtet protein, såsom gær enolase at virke som en intern standard og kontrol for fordøjelsen effektivitet trypsin.
6. Fyld FSR portioner med fordøje buffer til et endeligt beløb på 20 pi. Vortex.
7. Tilføj 1,5 pi dithiothreitol (30 mg i 1 ml 100 mM Tris-HCI, pH 7,8) og omrystes ved stuetemperatur i 1 time.
8. Tilsæt 3 pi af iodacetamid (35 mg i 1 ml 100 mM Tris-HCI, pH 7,8) og omrystes ved stuetemperatur i 45 minutter i mørke.
9. Tilføj 165 pi Hedeselskabet ₂ O.
10. Tilsæt 10 pi af 0,1 pg / pl sekventeringskvalitet modificeret trypsin opløsning resuspenderet i 50 mM ammoniumbicarbonat, pH 7,8. Inkuber i et vandbad ved 37 ° CO / N og stoppe fordøjelsen ved frysning prøver. Opbevar fordøjer ved -20 ° C indtil den er klar til at analysere.

3. Optimering af MS Peptid Detection

1. Kopiere og indsætte sekvensen af peptidet, der skal optimeres, i en passende software, f.eks Skyline ^9. Klik på peptidsekvensen at indhente de oplysningeraf forventede forstadie ion masse og produkt-ioner.
2. Fortynd peptiderne fra lager koncentration (se afsnit 2.1) yderligere til 1 ng / ml koncentration for metodeudvikling MS.
3. Direkte infusion af peptiderne i massespektrometret ved optimeret strømningshastighed (sædvanligvis 0,1 - 0,8 ml / min) og til 0 - 5% kollisionsenergi.
4. Erhverve MS-spektrum med henblik på at identificere de eksperimentelle formere ladede precursor ioner ^8. Vælg precursor ion (m / z), der giver den mest intensitet (doubly- eller tredobbelt ladede precursor ioner rådes).
5. Reinfuse peptidet og anvende kollision energi til at fragmentere peptidet ved kollision-induceret-dissociation (CID). Optimer kegle og kollisionsenergier at opnå den bedste fragmentering mønster (fragment ioner enkeltvis eller dobbelt ladede, og masse af fragment ion helst større end forælder ion, rådes).
6. Kontroller, at de eksperimentelt opnåede overgange matche overgange genereret i silico </ Em> (som beskrevet i trin 3.1). Gem overgangen listen i MRM metoden fil ved hjælp af mindst 2 mest intense overgange pr forløber ion. Omfatter 2 overgange: 1 for kvantificering og en bekræftelse i den endelige analyse.
   BEMÆRK: Nogle MS producenter har en funktion (dvs. Waters Intellistart) til automatiseret MRM eller SRM analyse optimering. Hvis det er muligt indgyde peptider med kombineret mobile faser ved 50 - 70% ACN med 0,1% FA.

4. LC-MRM Method Development

BEMÆRK: Analyser af blandingen af ​​syntetiske peptider ved en Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) koblet til tripel kvadrupol massespektrometer. Sørg kilden er ren. Opløsningsmiddel A er Hedeselskabet ₂ 0 med 0,1% FA; Opløsningsmiddel B er ACN med 0,1% FA.

1. Brug LC-MS-system udstyret med en UPLC søjle pakket med C-18 fase (1,6 um diameter, 90 en porer, 2,1 mm x 50 mm længde) og fastgjort til en for-søjle af den samme fase. </ Li>
2. Optøning CSF fordøjer på is, centrifugeres ved 16.000 g i 10 min og overføre 60 pi i 300 pi glasindsats hætteglas og gemme resten tilbage ved -20 ^° C.
3. Sprøjt den højeste koncentration fra standardkurve point ved hjælp af 10 min 1 - 40% ACN lineær gradient (se tabel 1 for gradient indstillinger)
4. Åbn den resulterende kromatogram og note opholdstid og top to mest intense (kvantitative) overgange pr peptid med alle overgange oprettet i trin 3.
5. Baseret på disse oplysninger, opdatere et 10 min MRM metode (oprettet i trin 3.6) med timede kanaler til at måle peptider (se figur 2 for et eksempel). For at opretholde følsomhed, holde hver kanal med point pr peak større end 8 og dvæletid større end 0,01 sek for mindst én overgang for hvert peptid.
6. Medtag "opløsningsmiddel forsinkelser 'i MRM metode: et i begyndelsen, indtil 10 sekunder før den første top eluering oganden ved slutningen af ​​fremgangsmåden, 20 sek efter den sidste top eluering. Gør dette ved at vælge "solvent forsinkelser" i metode begivenheder i MS-metode fil.
7. Kør standardkurven gennem tidsindstillede MRM metode og sikre, at der ikke er nogen forstyrrende uspecifikke toppe med overgange (genereret i trin 3.6) ved at kontrollere for linearitet.
8. Bestem hvis peptider kan påvises ved at køre ikke-spidse poolede kontrol og sygdom CSF gennem metoden.
9. Fjern de peptider, som er under detektionsgrænsen fra analysen.

Figur 2. Eksempel på en dynamisk MRM MS Method. Tidsindstillede kanaler peptid overgange kan grupperes efter etablerede opholdstider. Aktivering MRMs skal indarbejdes en tidsindstillet måde som de udvalgte markør peptider elueres fra kromatografisøjlen, minimerer antallet af transitions over en tidsperiode og øger følsomheden af analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.

5. Tilsætning af interne standarder

BEMÆRK: Som tidligere ¹⁰ beskrevet, kan isotopmærkede interne standarder indarbejdes i assayet. Grundet bekostning af disse standarder, anbefales det først at vurdere peptiderne i matrixen.

1. Bestem de ideelle peptider optimeret til detektion i CSF: vælge de peptider, som er de mest tilbagevendende, med den højeste intensitet og uden interferens toppe.
2. Design tilsvarende peptider til at omfatte tunge ¹³ C ¹⁵ N aminosyre-etiketter, der øger massen af peptidet med mindst 6 Da forhold til endogent peptid. Også tilføje et tag på 4 - 6 yderligere aminosyrer til enten den N- eller C-terminalen af ​​den tunge peptidevand at kontrollere for tryptisk fordøjelse.
3. Fortynd isotopmærkede interne standarder i fordøjelse buffer (se trin 2.4). Bestem den ideelle mængde af stabile isotop-mærkede interne standard, som vil blive tilsat i CSF ved at tilsætte i forskellige niveauer afhængigt af abundancies tidligere observeret under udvikling. Sigter mod at nå ca. 1: 1-forhold mellem stabile isotop-mærket standard til endogent peptid.
   BEMÆRK: Stabile isotopmærkede interne standarder kan syntetiseres ved forskellige kommercielle selskaber.

6. LC-MRM Analyse af FSR Patient Prøver

1. Spike optimeret mængde af isotopmærkede standarder i 100 ul CSF og frysetørre blandingen.
2. Resuspender CSF i 20 ul digest buffer og udfører fordøjelsen, som beskrevet i punkt 2.7 - 2.10.
3. Analyser af prøverne ved hjælp af LC-MRM metode udviklet i trin 4.
4. Til kvantitativ analyse køre standard peptidevand i koncentrationer på 0 -15 pmol i en standardkurve. Se trin 2.5 til fremstilling af standardkurven.

7. Data Analysis

BEMÆRK: Kvantitative data er baseret på intensiteten forholdet mellem baseline peak interne standarder (heavy mærkede peptider). Detaljerede oplysninger om SRM / MRM dataanalyse blev beskrevet tidligere ^10. Ratio data kan derefter anvendes i en standardkurve for at bestemme absolutte niveauer eller beregne dem fra den tilsatte koncentration af tung-mærket peptid.

1. Analyser LC-MRM data ved hjælp af massen spektrometre fabrikanternes standardsoftware ^10. Alternativt kan du bruge Skyline software til at analysere kvantitative MRM data ^10.
2. Check følsomheden af ​​spil ved at kontrollere reaktionen af ​​en intern standard såsom spiked gær enolase eller en stabil isotop-mærket standard i hver kørsel. Sørg for, at variationskoefficienten (CV) ikke er større end25%.
3. Manuelt gennemgå data anmærkning for at sikre nøjagtighed. Analysere hvert peptid og forholdet til en passende stabil isotop-mærkede interne standards, dvs. bruge den stabile isotop-mærket udgave af peptidet hvis tilgængelig.
4. At opnå absolutte værdier af pmol pr 100 pi CSF, køre forholdet data gennem passende standardkurver, der blev kørt på samme tid.
5. Beregn variationskoefficienten (CV). CV for hvert peptid bør være under 25% og under 15% for høje rigelige peptider.
   BEMÆRK: Absolut værdi pmol pr 100 pi CSF-værdier kan anvendes i efterfølgende nedstrøms statistiske analyse.

8. Apolipoprotein E isoform status

BEMÆRK: For at bestemme ApoE isoform status, kan tilstedeværelsen af ​​de tilsvarende peptider udføres ved bestemmelse af tilstedeværelsen af ​​hver isoform.

1. Overvej ApoE i 100 ul CSF tærskel på> 1000 signal-til-støj som positive for at peptid. I figur 5 peptiderne kræves / fraværende at bestemme en patients isoform status. Bestem allele ekspression ved at beregne% af hver isoform til total ApoE ekspression.

Representative Results

Ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet ovenfor, blev udviklet en højt gennemløb 10 min multiplex assay bestående af 74 peptider fra 54-proteiner, som et assay for markører af de neurodegenerative lidelser Alzheimers sygdom og Lewy body demens (LBD) ^8. Figur 3 viser en multiplex kromatogram offentliggjort tidligere ⁸ af de betydelige peptid markører fra assayet. Peptiderne inkluderet i assayet, og deres kvantitative overgange er givet i tabel 2. De data, der genereres ved denne metode giver standardiserede forhold til den relevante stabile isotop-mærkede interne standard. Disse værdier kan derefter føres gennem en standardkurve for at bestemme absolutte pmol / 100 pi CSF koncentrationer. Disse værdier kan derefter analyseres statistisk for ændringer i kliniske prøver.

Som tidligere beskrevet ^8, kvantificering af de 74 peptides inkluderet i denne CSF analyse viste, at 25 af disse markører blev ændret betydeligt i CSF af demenspatienter. For at illustrere effektiviteten af dette assay resultater fra tidligere beskrevet demens markører Pro-orexin og YKL chitinase 3-lignende protein (YKL-40) ^11,12 er givet i Figur 4. Den integrerede ApoE assay identificerer ApoE iso / allel status patienten samt. Apo E4 er en kendt risikofaktor for Alzheimers sygdom, derfor integrere dette i analysen vil give værdifulde oplysninger. Påvisningen af ApoE isoformer er forklaret i figur 5 og er baseret på påvisning af de tilsvarende peptider for aminosyre-ændringer for isoformer E2 (R158C) og E4 (C112R). Figur 5A viser toppens mønster forventes for hver isoform kombination og Figur 5B viser resultatet af en testet med assayet på patientprøver CSF.

Figur 3. Repræsentant overlejret MRM Chromatogrammer. Genudskrivning fra Heywood et al. ⁸ Biomarkører betydning for de neurodegenerative sygdomme Lewy body demens og Alzheimers sygdom ⁸ er vist over en 10 min LC gradient. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Eksempel data. Genudskrivning fra Heywood et al. ⁸ Grafer viser, hvordan den beskrevne MRM LC-MS / MS metode kan pålideligt kvantificere og skelne fra kontroller de kendte neurodegenerative markører såsom YKL chitinase 3-lignende protein (YKL-40) ^{11 , 12} og AD markør Pr o-Orexin ^13. AD = Alzheimers sygdom, LBD = Lewy body demens og PD = Parkinsons sygdom. Data, tidligere publiceret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Illustration af hvordan Apo E Isoform Status for en patient kan bestemmes. A. Angiver peptider dækker 112 aminosyresekvens LGADMEDVCGR for neutral (E3a) eller LGADMEDVR for tilstedeværelse af E4 og position 158 til at opdage RLAVYQAGAR den neutrale (E3b) eller CLAVYQAGAR for E2 isoformen. B. Peptider fra ApoE-sekvensen er vist i panelet til venstre. De forskellige kombinationer af de konstaterede i CSF peptider kan indikere ApoE isoform status.filer / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

<td height = "22" style = "height: 22px; width: 64px;"> 7

Tid	Flow (ml / min)	% A	% B	Kurve
Initial	0,8	97	3	initial
0.2	0,8	97	3	6
0,8	60	40	6
7,01	0,8	0,1	99,9	6
8	0,8	0,1	99,9	6
8,01	0,8	97	3	1
10	0.8	97	3	1

Tabel 1. UPLC Gradient Indstillinger for en 10 min metode. A = Hedeselskabet ₂ 0 0,1% FA, B = ACN, 0,1% FA

Tabel 2. Peptider Inkluderet i CSF MRM LC MS / MS-analyse. Vist er alle de inkluderede peptider, der anvendes i den metode, som er beskrevet og offentliggjort ^8. Angivelse af, om markøren pålideligt blev påvist i 100 pi CSF er indiceret. Overgange mærket med fed er dem, der anvendes til kvantitativ data. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Som med alle MS baserede analyser, de kritiske trin i metoden er bestemmelse af de relevante og præcise mængder af interne standarder. Hvis der anvendes absolut kvantificering, så de korrekte mængder af spidse peptider i standardkurven er også kritisk.

Vores assay kræver ikke udfældning af CSF eller anvendelsen af ​​enhver type rengøringstiden eller afsaltning trin før MS-analyse - det er en helt one-pot reaktion metode. På grund af det lille volumen af ​​CSF og dens begrænsede kompleksitet (sammenlignet med plasma), har det vist sig, at disse trin kan fjernes fra det endelige protokol, hvilket forenkler assayet og gøre den mere egnet til oversættelse til diagnostisk indstilling. Medtagelse af en præ-kolonne til den vigtigste analytisk søjle og af opløsningsmidlet forsinkelser i MS-metode, synes at være tilstrækkelig til at opretholde følsomhed i MS kørt i over 500 prøver. Som assayet-UPLC running tiden er kort, er det vigtigt at entydigt identificere den korrekte top i CSF fordøje matrix.

Dette kan kun opnås ved at anvende spidse syntetiserede peptider og en standardkurve. Hvis der er en usikkerhed på et peptid tilpasset til den korrekte kromatografiske top, så kan det være nyttigt at køre prøven gennem flere overgange og tjekke overgange intensitet mønster med de syntetiske standarder. Alle vores assays indeholder mindst 2 peptider overgange til at bekræfte identiteten af ​​peptidet.

Assayet er udviklet til markører detekteret i op til 100 pi CSF. For nogle andre markører for demens, kan være behov for en større volumen af ​​CSF. En anden begrænsning af assayet er spørgsmålet om dynamikområde af protein-ekspression. Nogle rigelige markører skal injiceres på massespektrometer i et mindre beløb, mens nogle lave rigelige markører kræver en større injektionsvolumener. Derfor sample muligvis injiceres to gange.

Betydningen af ​​denne teknik er evnen til at multiplekse og den øgede specificitet af de 3 niveauer af identifikation løbet antistoffer (retentionstid, precursor og produktet m / z). Set fra kliniske oversættelse, den største fordel er de potentielle omkostninger besparelse på antistoffer, selvom en indledende udlæg for massespektrometri udstyr og uddannet personale er påkrævet. En anden aktiv er den hastighed, hvor metoden kan oversættes på de tredobbelt kvadrupol baserede systemer. Dette fremskynder markant evnen til at oversætte og validere et assay sammenlignet med alle immuno-baserede teknikker. Endelig, som denne platform og ekspertise er blevet rutinemæssigt anvendes til at måle små molekyler klinisk, mange store hospital centre allerede har denne infrastruktur på plads. Inden for neurodegenerering der er en masse af fokus og behov for nye biomarkører i CSF og serum. Denne metode giver en platform for en high-throughput assay, hvor der kan tilsættes fremtidige markører (og fjernet), der skal vurderes for virkningsfuldhed, osv. Denne teknik har yderligere anvendelse til andre væv for ApoE isoform identifikation, såsom plasma, som allerede er beskrevet ² og endda blodpletter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
Formic acid, LC-MS grade,	Fisher	A117-50
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545 - 5 g
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028 - 2.5 LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149 - 5 g
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Urea	Sigma	U0631- 500 g
Water, LC-MS ULTRA Chromasolv	Fluka	14263
Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg	Genscript	custom
heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides	Genscript	custom
ASB 14	Merck Millipore	182750 - 25 g
Thiourea	Sigma	T7875 - 500 g
Tris base	Sigma	T6066
VanGuard precolumn	Waters	186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm  2.1 x 50 mm column	Waters	186007114
Yeast Enolase	Sigma	E6126
300 μl clear screw top glass vials	Fisher scientific	03-FISV
Y slit screw caps	Fisher scientific	9SCK-(B)-ST1X
Freeze dryer	Edwards Mudulyo	Mudulyo system
Concentrator/Speed vaccum	Eppendof	concentrator plus 5301
Xevo -TQ-S mass spectrometer	Waters
Acquity UPLC system	Waters