En høy gjennomstrømning, multiplekset og målrettet proteomikk CSF-analyse for å kvantifisere nevrodegenerative Biomarkører og apolipoprotein E-isoformer Status

Summary

Vi beskriver en high-throughput, multipleks, og målrettet proteomikk cerebrospinalvæsken (CSF) assay utviklet med potensial for klinisk oversettelse. Testen kan kvantifisere mulige markører og risikofaktorer for nevrodegenerasjon, så som apolipoprotein-E-variantene (E2, E3 og E4), og måle deres allelisk uttrykk.

Abstract

Mange nevrodegenerative sykdommer er fremdeles mangelfull effektive behandlinger. Pålitelige biomarkører for å identifisere og klassifisere disse sykdommene vil være viktig i utviklingen av fremtidige nye behandlingsformer. Ofte potensielle nye biomarkører ikke gjøre det i klinikken på grunn av begrensninger i deres utvikling og høye kostnader. Men målrettet proteomikk bruker flere Reaction Monitoring væskekromatografitandem / massespektrometri (MRM LC-MS / MS), spesielt ved bruk av triple kvadrupol massespektrometre, er en metode som kan brukes til å raskt evaluere og validere biomarkører for klinisk oversettelse til diagnoselaboratorier . Tradisjonelt har denne plattformen blitt brukt i stor utstrekning for måling av små molekyler i kliniske laboratorier, men det er mulighet for å analysere proteiner, som gjør det til et attraktivt alternativ til ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbøyd analyse) -baserte metoder. Vi beskriver her hvordan målrettet proteomforskning kan brukes til å måle multipleksede markører for demens, inkludert påvisning og kvantifisering av det kjent risikofaktor apolipoprotein E isoform 4 (apoE4).

For å gjøre analysen egnet for translasjon, er den utformet for å være rask, enkel og meget spesifikk og kostnadseffektivt. For å oppnå dette, må hvert trinn i utviklingen av analysen være optimalisert for de individuelle proteiner og vev de er analysert i. Denne metoden beskriver en typisk arbeidsflyt inkludert ulike tips og triks for å utvikle en målrettet proteomikk MRM LC-MS / MS for oversettelse .

Metodeutviklingen er optimalisert ved hjelp av tilpassede syntetiserte versjoner av tryptiske quantotypic peptider, som kalibrere MS for deteksjon og deretter tilsatt i CSF bestemme riktig identifikasjon av endogent peptid i kromatografisk separasjon før analyse i MS. For å oppnå absolute kvantifisering, stabil isotop-merket intern standard versjoner av peptidene med kort aminosyresekvens koder og inneholdende et trypsin-spaltingssete, er inkludert i analysen.

Introduction

Den økende betydningen av nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom, Lewy Body Demens og Parkinsons sykdom, blir et samfunnsøkonomisk problem i mange land ^1. Det er et behov i flere biomarkører som kan brukes til å identifisere og klassifisere pasienter i de tidlige stadier av sykdommen, og for å overvåke eventuelle nye behandlinger. Det overordnede målet med denne metoden er å lage en generell rørledning for en strømlinjeformet, økonomisk og raskere måte å validere potensielle CSF markører for nevrodegenerasjon. Begrunnelsen er å bruke målrettede proteomikk eller peptid MRM LC-MS / MS som et lett amendable metode for å vurdere flere potensielle protein biomarkører fra oppdagelse eksperimenter. Disse kan ytterligere multiplekset over en rask kromatografisk separasjon (<10 min) og vurdert. Innenfor denne multiplex skjermen for nevrodegenerative biomarkører, har vi inkludert den kjente demens risikofaktor apolipoprotein isoform E4 (apoE4) så vi can bestemme samtidig sin status og nivå av uttrykk, ved at eliminerer behovet for separate genotyping tester ^2. LC MS / MS blir rutinemessig brukt som den foretrukne metode for å nøyaktig kvantifisering av små molekyler sammenlignet med andre metoder slik som ELISA eller radioimmunoassay (RIA). Dette skiftet i anvendelse av MS-teknologi for å analysere proteiner, har vært drevet hovedsakelig av problemer med immuno-baserte teknologier. Disse omfatter kryss-spesifisitet, sats til sats variasjon, begrenset holdbarhet, og høye kostnader. Derfor er rettet proteomforskning raskt å bli en økende alternativ til antistoff-baserte metoder som Western-blotting, RIA og ELISA. Imidlertid er evnen til å multiplekse flere markører inn i én analyse er den store fordelen med denne teknikk immuno-baserte metoder ^3. Teknikken er anvendelig til mange vev og har vært brukt som en validerings strategi for mange proteomics studier, inkludert plasma og urin ^{4 5,6.}

den technique kan brukes på alle laboratorier som har tilgang og kompetanse i å bruke trippel kvadrupol massespektrometre. Peptide design er relativt enkelt med den økende bruken av åpen kildekode-databaser. Den konkurranseutsatte markedet tilpassede peptider syntese gjør dem mye mer overkommelig. Tunge peptider, men er dyrt og derfor markørene bør vurderes på en liten kohort før du flytter til en større skala. Det er en økende potensiale for den teknikk som skal brukes i de kliniske diagnostiske innstillinger, med de fleste store sykehus som har trippel kvadrupol-baserte plattformer som lett kan tilpasses til å kjøre målrettede proteomic analyser. En slik anvendelse av fremgangsmåten, slik at det inn i rutinen diagnostiske omgivelser, er dens siste anvendelse til nyfødt blod sted screening for sigdcelleanemi ^7.

Protocol

MERK:. En skjematisk av den samlede protokollen beskrevet her er gitt i Fi gur 1 Alle prøver som brukes til utvikling av denne metoden er overtallige kliniske diagnostiske prøver og ha etisk godkjenning fra London Bloomsbury etikkomité.

Figur 1. Skjematisk illustrerer den totale prosessen med å lage en målrettet CSF MRM LC-MS / MS-analyse. Kandidat markør peptider for evaluering er valgt fra protein mål. Gjennom bruk av tilpassede syntetiserte peptider, er opprettet en målrettet LC-MS / MS-multipleksing. Etter evaluering, kan analysen bli anvendt for å vurdere effekten av mulige markører for nevrodegenerasjon.

1. Peptide Utvalg og design

MERK: Kriterier for en markør peptid er at det må være unikt (proteotypic (quantotypic). For å avgjøre om et peptid er unik eller ikke, 'blast' søkeverktøy på Uniprot nettsted (http://www.uniprot.org/blast/) kan brukes.

1. Definer en liste over target proteiner (markører), dvs. ApoE (se tabell 2).
   MERK: Hvis markøren er blitt identifisert fra tidligere proteomikk profilering eksperimenter ^8, og velg deretter peptid som gir best respons fra det datasettet.
2. Hvis denne informasjonen er tilgjengelig, bruker åpen kildekode nettsteder, for eksempel i silico trypsin fordøyelsen av target proteiner, ved hjelp av et verktøy som MS-Digest.
3. Velg peptid som er tryptiske og ikke utsatt for posttranslasjonell modifikasjoner.
   MERK: Denne informasjonen kan sjekkes på Uniprot nettstedet www.uniprot.org. Unngå peptider er utsatt for kjemisk modifisering under LC-MS prøveopparbeidelse.
<li> Bestill tilpassede syntese av de utvalgte peptider.
MERK: Marker peptider kan være skredder syntetisert av ulike kommersielle selskaper. For ApoE den quantotypic peptidet anvendt for å måle total ApoE-nivåer ble bestemt til å være AATVGSLAGQPLQER. De proteotypic peptidsekvenser som brukes til å bestemme E2 og E4 varianter er de tryptiske peptider for posisjon 158 (RLAVYQAGAR og CLAVYQAGAR) og posisjon 112 (LGADMEDVCGR og LGADMEDVR), henholdsvis.

2. Utarbeidelse av Standard Peptider

NB: For å velge den beste kvantitative overganger, må påvisning av matriksen (CSF) som skal optimaliseres. Den mest effektive måten å optimalisere multipleksede peptider er å skape bassenger av peptidene i kjente konsentrasjoner. Disse bassengene kan deretter brukes for metodeutvikling og standardkurver.

1. Resuspender syntetiske peptider (peptid-detaljer er gitt i tabell 2) til 1 mg / ml stamkonsentrasjonen i henhold til produsentens anvisninger. Som standard, dersom instruksjonene ikke er tilgjengelige, resuspender peptider i 50:50 (v / v) acetonitril (ACN) / H ₂ O.
2. Fremstille 1:10 fortynninger av peptidet fra lager-konsentrasjon og basseng 1000 pmol av hvert peptid i en lav bindings mikrosentrifugerør. Tørk ned i en speed-vac konsentrator den endelige bassenget og oppbevar ved -20 ° C. Forbered flere bassenger for fremtidig bruk.
3. Delmengde 100 ul CSF til lave bindende rør. Fryse-tørke CSF.
4. Resuspender en delmengde av sammenslåtte 1.000 pmol peptider i fordøyelsen buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 6 M urea, 2 M Thiourea, 2% ASB14) til å gi konsentrasjoner på 10 og 1 pmol / pl.
5. Spike oppsamlede peptider inn i frysetørkede 100 ul porsjoner av CSF på 0, 1, 2, 5, 10 og 15 pM konsentrasjoner. Tilsett 20 ng av intakte ikke-relaterte protein slik som gjær enolase for å virke som en intern standard og kontroll for fordøyelse effektivitet av trypsin.
6. Topp opp CSF porsjoner med fordøye buffer til en endelig mengde på 20 ul. Vortex.
7. Tilsett 1,5 mL av ditiotreitol (30 mg i 1 ml av 100 mM Tris-HCl, pH 7,8) og ristes ved romtemperatur i 1 time.
8. Tilsett 3 ul av jodacetamid (35 mg i 1 ml av 100 mM Tris-HCl, pH 7,8) og ristes ved romtemperatur i 45 min i mørket.
9. Legg 165 mL av DDH ₂ O.
10. Tilsett 10 pl av 0,1 pg / pl sekvense grad modifisert trypsin oppløsning ble resuspendert i 50 mM ammoniumbikarbonat, pH 7,8. Inkubasjon i et vannbad ved 37 ° CO / N og stoppe den fordøyelse ved å fryse prøvene. Lagres fordøyer ved -20 ° C inntil de er klare til å analysere.

3. Optimalisering av MS Peptide Detection

1. Kopier og lim sekvensen av peptidet som skal optimaliseres, i en passende programvare, for eksempel, Skyline ^9. Klikk på peptidsekvens å innhente opplysningeneav forventede forløperion masse og produktioner.
2. Vanne ut peptider fra lager konsentrasjon (se avsnitt 2.1) videre til en ng / ml konsentrasjon for MS metodeutvikling.
3. Direkte sette mot peptidene i massespektrometeret ved optimal strømningshastighet (vanligvis 0,1 til 0,8 ml / min) og med til 0 - 5% kollisjonsenergi.
4. Acquire MS spektrum for å identifisere de eksperimentelle multiplisere ladede forløperionene ^8. Velg forløperion (m / z) som gir mest intensitet (doubly- eller triply ladde forløperionene rådes).
5. Reinfuse peptidet og gjelder kollisjonsenergi for å fragmentere peptid ved kollisjon-indusert-dissosiasjon (CID). Optimalisere kjegle og kollisjonsenergier for å oppnå best fragmentering mønster (fragmentioner enkeltvis eller dobbelt belastet, og masse av fragment ion helst større enn moder ion, rådes).
6. Kontroller at eksperimentelt innhentet overganger matche overganger generert i silico </ Em> (som beskrevet i trinn 3.1). Lagre overgangen listen i MRM metoden filen ved hjelp av minst 2 mest intense overganger per forløperion. Består av 2 overganger: 1 for kvantifisering og en bekreftelse på den endelige analysen.
   MERK: Noen MS produsenter har en funksjon (dvs. Waters Intellistart) for automatisert MRM eller SRM analyse optimalisering. Hvis det er mulig å sette mot peptider med kombinert mobile faser på 50 - 70% ACN med 0,1% FA.

4. LC-MRM Metodeutvikling

MERK: Analyser blanding av syntetiske peptider med en Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) system koplet til trippel kvadrupol massespektrometer. Kontroller at kilden er ren. Solvent A er DDH ₂ 0 med 0,1% FA; Solvent B ACN med 0,1% FA.

1. Bruk LC-MS system utstyrt med et UPLC kolonne pakket med C-18-fase (1,6 um diameter, 90 Å porer, 2,1 mm x 50 mm lengde) og festet til en pre-kolonne av den samme fase. </ Li>
2. Tining CSF fordøyer på is, sentrifuger ved 16 000 g for 10 min og overføre 60 mL til 300 mikroliter glass innsatshetteglass og oppbevar resten tilbake på -20 ^o C.
3. Injisere den høyeste konsentrasjonen av standardkurve punktet med 10 min 1 - 40% ACN lineær gradient (se tabell 1 for gradient innstillinger)
4. Åpne den resulterende kromatogrammet og note oppholdstid og topp to mest intense (kvantitative) overganger pr peptid med alle overgangene som er opprettet i trinn 3.
5. Basert på denne informasjonen, oppdatere en 10 min MRM-metoden (opprettet i trinn 3.6) med tidsbestemt kanaler for å måle peptider (se Figur 2 for et eksempel). For å opprettholde følsomhet, holde hver kanal med punkter pr topp er større enn 8 og holdetid som er større enn 0,01 sek for i det minste en overgang for hvert peptid.
6. Inkluder 'løsemiddel forsinkelser "i MRM-metoden: en i begynnelsen inntil 10 sek før den første toppen eluering ogen annen ved slutten av fremgangsmåten, 20 sekunder etter siste toppen eluering. Gjør dette ved å velge "løsemiddel forsinkelser" i metode hendelser i MS metode fil.
7. Kjør standardkurve gjennom timet MRM-metoden og at det ikke er noen forstyrrende uspesifikke topper med overganger (generert i trinn 3.6) ved å sjekke for linearitet.
8. Finn ut om de peptidene kan påvises ved å kjøre non-piggete sammenslåtte kontroll og sykdom CSF gjennom metoden.
9. Fjern de peptider som er under deteksjonsgrensen fra analysen.

Figur 2. Eksempel på en dynamisk MRM MS metode. Tidsbestemt kanaler av peptid overganger kan grupperes i henhold til etablerte retensjonstider. Aktivering MRMs for å bli inkorporert i en tidsbestemt måte som de valgte markør peptidene ble eluert fra kromatografikolonnen, reduserer antall transitions over en periode og øker følsomheten til analysen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

5. Tilsetting av interne standarder

MERK: Som beskrevet tidligere ¹⁰ kan stabile isotop-merkede interne standarder inkluderes i analysen. På grunn av bekostning av disse standardene, er det anbefalt å først vurdere peptider i matrisen.

1. Bestem de ideelle peptider optimalisert for deteksjon i CSF: velge de peptider som er den mest tilbakevendende, med høyest intensitet og uten forstyrrelser topper.
2. Design svarende peptider for å inkludere tunge ¹³ C ¹⁵ N aminosyrer etiketter som øker massen av peptidet ved hjelp av minst seks Da i forhold til endogent peptid. Også legge til en kode på 4 - 6 flere aminosyrer til enten N- eller C-terminalen av den tunge futttide å kontrollere for tryptisk fordøyelse.
3. Fortynnet stabile isotop-merkede interne standarder i fordøyelsen buffer (se trinn 2.4). Finne den ideelle mengden av stabile isotoper-merket intern standard som vil bli tilsatt i cerebrospinalvæsken ved å tilsette i ulike nivåer avhengig av abundancies tidligere observert under utvikling. Tar sikte på å oppnå tilnærmet 1: 1 forhold av stabile isotop-merkede standard for endogent peptid.
   MERK: Stabil isotop-merkede interne standarder kan syntetiseres av ulike kommersielle selskaper.

6. LC-MRM analyse av CSF pasientprøver

1. Spike optimal mengde av stabile isotopen-merket standarder i 100 mL av CSF og fryse-tørke blandingen.
2. Resuspender CSF i 20 pl digest buffer og utføre fordøyelsen, som beskrevet i punkt 2.7 - 2.10.
3. Analysere prøvene ved hjelp av LC-MRM metode utviklet i trinn 4.
4. For kvantitativ analyse, kjører standard peptidevannet i konsentrasjoner på 0 -15 pmol på en standardkurve. Se trinn 2,5 for fremstilling av standardkurven.

7. Data Analysis

MERK: Kvantitative data er basert på intensiteten forholdet mellom baseline peak interne standarder (tung merkede peptider). Detaljert informasjon om SRM / MRM dataanalysen ble tidligere beskrevet ^10. Forholdsdata kan så brukes i en standardkurve for å bestemme absolutte nivåer eller beregne dem fra den tilsatte konsentrasjon av tung-merket peptid.

1. Analyser LC-MRM data ved hjelp av masse spektrometre produsentens standard programvare ^10. Alternativt kan du bruke Skyline programvare for å analysere kvantitative MRM data ^10.
2. Sjekk følsomheten av forsøket ved å kontrollere responsen av en intern standard så som den piggete gjær enolase eller en stabil isotop-merket standard i hvert forsøk. Sørg for at variasjonskoeffisienten (CV) er ikke større enn25%.
3. gjennomgang manuelt data merknaden for å sikre nøyaktighet. Analyser hvert peptid og forholdet til en passende stabil isotop-merket intern standard, det vil si ved å bruke den stabile isotop-merket versjon av peptidet hvis tilgjengelig.
4. For å oppnå absolutte verdiene pmol pr 100 ul CSF, drevet forholdet data ved hjelp av egnede standardkurver som ble kjørt samtidig.
5. Beregn variasjonskoeffisienten (CV). CV for hvert peptid bør være under 25% og under 15% for høye rikelig peptider.
   MERK: Absolutt verdi pmol per 100 mL CSF verdier kan brukes i påfølgende nedstrøms statistisk analyse.

8. Apolipoprotein E isoform Status

MERK: For å bestemme ApoE isoform status, kan tilstedeværelsen av de tilsvarende peptidene bli utført ved å bestemme tilstedeværelsen av hver isoform.

1. Tenk ApoE i 100 ul CSF terskelen> 1000 signal-til-støy som positivt for det peptid. Se figur 5 for peptidene som kreves / fraværende for å bestemme en pasients isoform status. Bestem allel uttrykk ved å beregne% av hver isoform til totalt ApoE uttrykk.

Representative Results

Ved å bruke fremgangsmåten beskrevet ovenfor, ble en høy gjennomstrømning 10 min multipleks-analysen består av 74 peptider fra 54 proteiner utviklet, som en analyse for markører av neurodegenerative lidelser Alzheimers sykdom og Lewy Body Dementia (LBD) ⁸ Fig. 3 viser en multipleks kromatogram publisert tidligere ^åtte av de betydelige peptid markørene fra analysen. Peptidene som er inkludert i analysen, og deres kvantitative overganger er gitt i Tabell 2. De data som genereres av denne metoden gir standardiserte forhold til det aktuelle stabil isotop-merket intern standard. Disse verdiene kan så bli satt gjennom en standardkurve for å bestemme absolutte pmol / 100 ul CSF-konsentrasjoner. Disse verdiene kan så statistisk analysert for endringer i kliniske prøver.

Som beskrevet tidligere ^8, kvantifisering av 74 peptides inkludert i denne CSF analysen viste at 25 av disse markørene ble endret betydelig i cerebrospinalvæsken hos demente. For å illustrere effektiviteten av denne analyse, resultatene fra tidligere beskrevne demens markører Pro-orexin og YKL chitinase-3-lignende protein (YKL-40) ^11,12 er vist i figur 4. Den integrerte ApoE analysen identifiserer ApoE isoformen / allelet statusen pasienten også. Apo E4 er en kjent risiko for Alzheimers sykdom, derfor integrere dette inn i den analysen vil tilveiebringe verdifull informasjon. Påvisningen av ApoE isoformer blir forklart i figur 5, og er basert på deteksjon av de tilsvarende peptider for aminosyre-endringer for isoformer E2 (R158C) og E4 (C112R). Figur 5A viser toppen mønsteret forventet for hver isoform kombinasjon og Figur 5B viser resultatet av en CSF testet med analysen på pasientprøver.

Figur 3. Representative kledde MRM Kromatogrammer. Gjenbruk fra Heywood et al. ⁸ Biomarkører betydning for nevrodegenerative lidelser Lewy Body Demens og Alzheimers sykdom ⁸ er vist over en 10 min LC gradient. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Eksempel data. Gjenbruk fra Heywood et al. ⁸ Grafer viser hvordan den beskrevne MRM LC-MS / MS-metoden kan sikkert kvantifisere og diskriminere fra kontrollene de kjente nevrodegenerative markører som YKL kitinase 3-lignende protein (YKL-40) ^{11 , 12} og AD markør Pr o-orexin ^13. AD = Alzheimers sykdom, LBD = Lewy Body Demens og PD = Parkinsons sykdom. Data tidligere utgitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Illustrasjon av hvordan Apo E isoform Status for en pasient kan bestemmes. A. Indikerer peptider som dekker 112 aminosyresekvens LGADMEDVCGR for nøytral (E3A) eller LGADMEDVR for tilstedeværelse av E4 og for posisjon 158 til å oppdage RLAVYQAGAR nøytral (E3B) eller CLAVYQAGAR for E2 isoform. B. peptider fra ApoE sekvensen vises i panelet til venstre. De forskjellige kombinasjoner av peptidene detektert i CSF kan indikere ApoE isoformen status.filer / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

<td height = "22" style = "height: 22px; width: 64px;"> 7

Tid	Strøm (ml / min)	% A	% B	Kurve
Første	0.8	97	3	første
0.2	0.8	97	3	6
0.8	60	40	6
7,01	0.8	0.1	99.9	6
8	0.8	0.1	99.9	6
8.01	0.8	97	3	1
10	0.8	97	3	1

Tabell 1. UPLC Gradient Innstillinger for en 10 min metode. A = DDH ₂ 0 0,1% FA, B = ACN, 0,1% FA

Tabell 2. Peptider Inkludert i CSF MRM LC MS / MS-analyse. Vist er alle de inkluderte peptider brukes i metoden som er beskrevet og publisert ^åtte. Angivelse av om markøren var pålitelig påvist i 100 mL av CSF er indikert. Overganger merket med fet skrift er de som brukes for kvantitative data. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Som med alle MS baserte analyser, de kritiske trinn i fremgangsmåten er å bestemme de riktige og nøyaktige mengder av interne standarder. Hvis absolutt kvantifisering blir brukt, er de korrekte mengder av tilsatte peptider i standardkurven er også kritisk.

Våre assay krever ikke utfellingen av CSF eller bruk av hvilken som helst type av rene opp eller avsaltingstrinn før MS-analyse - det er en helt one-pot reaksjonsmetode. På grunn av det lille volum av CSF og dens begrenset kompleksitet (i forhold til plasma), er det blitt funnet at denne fremgangsmåten kan fjernes fra det endelige protokollen, for derved å forenkle analysen og gjør den mer egnet for oversettelse til diagnostisk innstilling. Inneslutninger av en pre-kolonne til hoved analytisk kolonne og løsningsmidlet forsinkelser i MS-metode, ser ut til å være tilstrekkelig til å opprettholde følsomhet under MS kjøre i mer enn 500 prøver. Som analysen-UPLC Running tiden er kort, er det viktig å utvetydig identifisere den korrekte toppen i CSF fordøye matrisen.

Dette kan bare oppnås ved bruk av piggete syntetiserte peptider og en standardkurve. Hvis det er en usikkerhet på et peptid tilpasset den riktige kromatografiske topp så kan det være nyttig å kjøre prøven gjennom flere overganger og kontroller overganger intensitetsmønsteret med de syntetiske standarder. Alle våre analyser inneholde minst 2 peptider overganger for å bekrefte identiteten av peptidet.

Analysen er utviklet for markører påvist i opptil 100 mL av CSF. For enkelte andre markører for demens, kan et større volum av CSF være nødvendig. En annen begrensning av analysen er spørsmålet om dynamiske område for proteinekspresjon. Noen rikelig markører må injiseres på massespektrometer i en mindre mengde, mens noen lave rikelig markører krever større injeksjonsvolumer. Derfor sample kan trenge å bli injisert to ganger.

Betydningen av denne teknikk er muligheten til å multiplekse og økt spesifisitet av de 3 nivåer av identifisering over antistoffer (retensjonstid, forløper og produkt m / z). Fra perspektivet til klinisk oversettelse, er den største fordelen de potensielle kostnadene spare på antistoffer, men en første utlegget for massespektrometri utstyr og fagpersonell er påkrevd. En annen ressurs er hastigheten i hvilken fremgangsmåten kan oversettes til de tre kvadrupol-baserte systemer. Dette gjør betydelig evne til å oversette og validere en analyse i forhold til alle immuno-baserte teknikker. Til slutt, som denne plattformen og kompetanse er blitt rutinemessig brukt til å måle små molekyler klinisk, mange store sykehus sentre har allerede denne infrastrukturen på plass. I feltet av neurodegenerering er det mye fokus og behov for nye biomarkører i CSF og serum. Denne metoden gir en plaTForm for en high-throughput analysen hvor fremtidige markører kan legges (og fjernet) for å bli vurdert for effekt, osv. Denne teknikken har videre anvendelse til andre vev for ApoE isoform identifikasjon, slik som plasma, som allerede er blitt beskrevet og ² til og med blood.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile (ACN), LC-MS grade	Fisher	A955-1
Formic acid, LC-MS grade,	Fisher	A117-50
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545 - 5 g
Hydrochloric acid, 37% w/w	VWR	BDH3028 - 2.5 LG
Iodoacetamide	Sigma	I1149 - 5 g
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	S318-500
Trypsin, sequencing grade, modified	Promega	V5113
Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade	Fisher	A116-50
Urea	Sigma	U0631- 500 g
Water, LC-MS ULTRA Chromasolv	Fluka	14263
Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg	Genscript	custom
heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides	Genscript	custom
ASB 14	Merck Millipore	182750 - 25 g
Thiourea	Sigma	T7875 - 500 g
Tris base	Sigma	T6066
VanGuard precolumn	Waters	186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm  2.1 x 50 mm column	Waters	186007114
Yeast Enolase	Sigma	E6126
300 μl clear screw top glass vials	Fisher scientific	03-FISV
Y slit screw caps	Fisher scientific	9SCK-(B)-ST1X
Freeze dryer	Edwards Mudulyo	Mudulyo system
Concentrator/Speed vaccum	Eppendof	concentrator plus 5301
Xevo -TQ-S mass spectrometer	Waters
Acquity UPLC system	Waters