Summary
Nós descrevemos um de alto rendimento, multiplex, e ensaio de líquido cefalorraquidiano proteômica alvo (CSF) desenvolvido com potencial para a tradução clínica. O teste pode quantificar potenciais marcadores e os factores de risco para a neurodegeneração, tais como as variantes de apolipoproteína E (E2, E3 e E4), e medir a sua expressão alélica.
Abstract
Muitas doenças neurodegenerativas ainda faltam tratamentos efetivos. biomarcadores confiáveis para a identificação e classificação destas doenças será importante para o desenvolvimento de futuras terapias inovadoras. Muitas vezes, os potenciais novos biomarcadores não torná-lo para a clínica devido a limitações no seu desenvolvimento e custos elevados. No entanto, proteômica alvo utilizando a reação múltipla Monitoramento Cromatografia Líquida-tandem / Espectrometria de Massa (MRM LC-MS / MS), especificamente usando triplos espectrômetros de massa quadrupolo, é um método que pode ser utilizado para avaliar rapidamente e validar biomarcadores para a tradução clínica em laboratórios de diagnóstico . Tradicionalmente, esta plataforma tem sido amplamente utilizado para a medição de pequenas moléculas em laboratórios clínicos, mas que é o potencial para analisar proteínas, que faz com que seja uma alternativa atractiva para ELISA (Enzyme-Linked Immunosordobrado Assay) baseados em métodos. Descrevemos aqui como proteómica direccionada pode ser usada para medir os marcadores multiplexados de demência, incluindo a detecção e quantificação do factor de risco conhecido apolipoproteína E isoforma 4 (ApoE4).
A fim de tornar o ensaio adequado para a tradução, que se destina a ser rápido, simples, altamente específica e de custo eficaz. Para conseguir isso, cada etapa no desenvolvimento do ensaio tem de ser optimizado para as proteínas individuais e os tecidos são analisados. Este método descreve um fluxo de trabalho típico incluindo várias dicas e truques para o desenvolvimento de um proteómica alvo MRM LC-MS / MS para a tradução .
O desenvolvimento do método é otimizado usando versões costume sintetizados de peptídeos quantotypic trípticos, que calibrar o MS para detecção e, em seguida, cravado no CSF para determinar a identificação correta do peptídeo endógeno na separação cromatográfica antes da análise no MS. Para atingir absolute de quantificação, padrão interno de versões marcadas com isótopos estáveis de péptidos com marcadores de sequências curtas de aminoácidos e de ácido contendo um local de clivagem de tripsina, são incluídas no ensaio.
Introduction
O impacto cada vez maior de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, demência de Lewy e Doença de Parkinson, está se tornando um problema sócio-económico em muitos países 1. Há uma necessidade em biomarcadores adicionais que podem ser utilizados para identificar e classificar os pacientes nas fases iniciais da doença, e para monitorizar quaisquer potenciais novos tratamentos. O objetivo geral deste método é criar um pipeline genérico para uma forma simplificada, econômico e rápido de validação de marcadores CSF potenciais de neurodegeneração. O objecto consiste em utilizar a proteómica orientadas ou péptido MRM LC-MS / MS como um método facilmente modificável para avaliar múltiplas proteínas biomarcadores potenciais a partir de experiências de descoberta. Estes podem ainda ser multiplexados através de uma separação cromatográfica rápida (<10 minutos) e avaliados. Dentro desta tela multiplex de biomarcadores neurodegenerativas, incluímos a demência conhecido fator de risco apolipoproteína isoforma E4 (ApoE4), de modo que você pn determinar, simultaneamente, o seu estatuto e nível de expressão, pelo que eliminando a necessidade de testes de genotipagem separados 2. LC MS / MS é rotineiramente usado como o método de escolha para a quantificação exacta moléculas pequenas em relação aos outros métodos, tais como ELISA ou radioimunoensaio (RIA). Esta mudança no uso da tecnologia MS para análise de proteínas, tem sido impulsionada principalmente por problemas com as tecnologias baseadas em imuno. Estes incluem cruzada especificidade, variação entre lotes, a vida útil limitada, e o custo elevado. Portanto, proteômica alvo está rapidamente se tornando uma alternativa cada vez maior aos métodos de anticorpos baseados tais como Western blot, RIA e ELISA. No entanto, a capacidade de multiplexar diversos marcadores em um ensaio, é a principal vantagem desta técnica em relação aos métodos baseados em imuno 3. A técnica é aplicável a muitos tecidos e tem sido utilizada como uma estratégia de validação para estudos diversos proteomics, incluindo o plasma e urina 4 5,6.
o technique pode ser aplicado a qualquer laboratório que tenha acesso e experiência no uso de espectrômetros de massa triplo quadrupolo. projeto peptídeo é relativamente simples, com o crescente uso de bancos de dados de código aberto. O competitivo mercado de síntese de peptídeos personalizados torna muito mais acessível. peptídeos pesados, no entanto, são caros e, portanto, os marcadores devem ser avaliadas em um pequeno grupo antes de se mudar para uma escala maior. Existe um potencial de crescimento para a técnica a ser utilizado nas configurações de diagnóstico clínico, com a maioria dos grandes hospitais tendo plataformas baseadas em triplo quadrupolo, que pode ser facilmente adaptado para executar os ensaios proteomic segmentados. Um exemplo desta aplicação do método, tornando-se na definição de diagnóstico de rotina, é a sua aplicação recente de rastreio mancha de sangue recém-nascido para a anemia falciforme 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA:. Um esquema do protocolo geral descrito aqui é dada na figura 1 Todas as amostras utilizadas para o desenvolvimento deste método são amostras de diagnóstico clínico excedentes e ter aprovação ética do comitê de Londres Bloomsbury Ética.
Figura 1. Esquema ilustrando o processo geral de criação de um CSF MRM direcionados LC-MS / MS ensaio. Peptídeos marcador candidato para avaliação são seleccionados a partir de proteínas alvo. Através da utilização de péptidos sintetizados costume, um método de multiplex de LC-MS / MS de destino é criado. Após a avaliação, o ensaio pode ser utilizado para avaliar a eficácia de potenciais marcadores de neurodegeneração.
1. Peptide Selection and Design
NOTA: Critérios para um péptido marcador é que ele deve ser exclusivo (proteotípicos (quantotypic). Para determinar se um peptídeo é único ou não, a ferramenta 'explosão' busca no site da UniProt (http://www.uniprot.org/blast/) pode ser usado.
- Definir uma lista de proteínas-alvo (marcadores), ou seja, da ApoE (ver Tabela 2).
NOTA: Se o marcador foi identificado a partir de anteriores experiências de perfis proteômicos 8, em seguida, selecione o peptídeo que lhe dá a melhor resposta a partir desse conjunto de dados. - Se esta informação não estiver disponível, usar sites de código aberto, como in silico digestão com tripsina de proteínas-alvo, usando uma ferramenta de software como o MS-Digest.
- Escolha do péptido que é tríptica e não suscetíveis a modificação pós-traducional.
Nota: Esta informação pode ser verificada no site da UniProt www.uniprot.org. Evitar péptidos propensas a modificação química durante a preparação da amostra de LC-MS. <li> Ordenar a síntese de costume dos peptídeos escolhidos.
NOTA: peptídeos marcador pode ser personalizado sintetizado por várias empresas comerciais. Para o péptido ApoE quantotypic utilizado para medir os níveis totais de ApoE foi determinada como sendo AATVGSLAGQPLQER. As sequências peptídicas proteotípicos utilizados para determinar as variantes E2 e E4 são os péptidos trípticos para a posição 158 (RLAVYQAGAR e CLAVYQAGAR) e a posição 112 (LGADMEDVCGR e LGADMEDVR), respectivamente.
2. Preparação de ptidos
NOTA: Para selecionar as melhores transições quantitativos, a detecção da matriz (CSF) precisa ser otimizado. A maneira mais eficiente de optimizar péptidos multiplexados é criar conjuntos de péptidos em concentrações conhecidas. Estes agrupamentos podem, então, ser utilizado para o desenvolvimento de métodos e curvas padrão.
- Ressuspender péptidos sintéticos (detalhes de péptidos são apresentados na Tabela 2) a 1 mg estoque / mlconcentração de acordo com instruções do fabricante. Por padrão, se as instruções não estão disponíveis, os péptidos ressuspender em 50:50 (v / v) de acetonitrilo (ACN) / H 2 O.
- Preparar as diluições 1:10 do péptido a partir da concentração da piscina e 1,000 pmol de cada péptido para um tubo de microcentrífuga de ligação baixa. Seca-se para baixo num concentrador Speed-Vac o conjunto final e armazenar a -20 ° C. Prepare várias piscinas para uso futuro.
- Alíquota de 100 ml de CSF em tubos de ligação baixas. Liofilizar a CSF.
- Ressuspender uma alíquota de 1,000 pmol de péptidos combinados em tampão de digestão (Tris HCl a 100, pH 7,8, 6 M de ureia, 2 M tioureia, 2% ASB14) para se obter concentrações de 10 e 1 pmol / uL.
- Pico a péptidos reunidos numa das mL alíquotas liofilizados de 100 CSF a 0, 1, 2, 5, 10 e 15 concentrações de pM. Adiciona-se 20 ng de proteína não relacionada intacto, tais como enolase levedura para actuar como um padrão interno e de controlo para a eficiência da digestão de trypsin.
- Encher as alíquotas de LCR com digerir tampão a um valor final de 20 mL. Vórtice.
- Adicionar 1,5 uL de ditiotreitol (30 mg em 1 ml de Tris-HCl 100, pH 7,8) e agitar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Adiciona-se 3 ul de iodoacetamida (35 mg em 1 ml de Tris-HCl 100, pH 7,8) e agitar à temperatura ambiente durante 45 min no escuro.
- Adicionar 165 ul de ddH 2 O.
- Adicionar 10 ul de 0,1 ug / ul de solução de tripsina modificada de grau de sequenciação ressuspensas em tampão de 50 mM de bicarbonato de amónio, pH 7,8. Incubar em um banho de água a 37 ° CO / N e parar a digestão por congelação amostras. Loja digere a -20 ° C até estar pronto para análise.
3. Optimização de MS Detecção Péptido
- Copiar e colar a sequência do péptido a ser optimizada, para um software apropriado, por exemplo, Horizonte 9. Clique sobre a sequência do péptido para obter as informaçõesde iões de massa ião precursor e produto esperado.
- Diluir os peptídeos de concentração de ações (ver secção 2.1) ainda mais para 1 ng / ml de concentração para o desenvolvimento do método MS.
- Diretamente infundir os peptídeos no espectrômetro de massa a uma taxa de fluxo otimizado (normalmente 0,1-0,8 ml / min) e com 0-5% de energia de colisão.
- Adquirir espectro de MS, a fim de identificar os íons precursores de cargas múltiplas experimentais 8. Escolha o íon precursor (m / z) que dá mais intensidade (doubly- ou íons precursores triplamente carregados são aconselhados).
- Reinfuse o péptido e aplicar a energia de colisão para fragmentar o péptido por induzida por colisão-dissociação (CID). Otimizar as energias cone e colisão para obter o melhor padrão de fragmentação (iões do fragmento unicamente ou duplamente carregadas e massa de iões de fragmento de preferência maior do que ion pai, são aconselhados).
- Verifique se as transições obtidos experimentalmente corresponder transições geradas in silico </ Em> (tal como descrito no passo 3.1). Salvar a lista de transição no arquivo método MRM usando pelo menos 2 transições mais intensos por íon precursor. Incluem 2 transições: 1 para a quantificação e 1 para a confirmação no ensaio final.
NOTA: Alguns fabricantes de MS têm uma função (ou seja, Waters Intellistart) para MRM automatizado ou otimização análise SRM. Se possível infundir peptídeos com fases móveis combinados a 50 - 70% ACN com 0,1% de FA.
4. LC-MRM Desenvolvimento Método
NOTA: Analisar a mistura de péptidos sintéticos por um sistema de cromatografia líquida (UPLC) acoplado ao triplo espectrómetro de massa de quadrupolo Ultra Performance. Certifique-se a fonte está limpo. Solvente A é DDH 2 0 com 0,1% de FA; Solvente B é ACN com 0,1% de FA.
- Usar o sistema de LC-MS equipado com uma coluna UPLC embalado com C-18 de fase (1,6 um de diâmetro, 90 poros Å, 2,1 mm x 50 mm de comprimento) e ligado a uma pré-coluna da mesma fase. </ Li>
- Degelo digere CSF no gelo, centrifugar a 16.000 g durante 10 minutos e de transferência de 60 mL em 300 ml frascos de pastilhas de vidro e armazenar o resto de volta a -20 o C.
- Injectar a concentração mais elevada de ponto da curva padrão, utilizando 10 min 1 - gradiente ACN linear de 40% (ver Tabela 1 para definições de gradiente)
- Abra o cromatograma e retenção nota tempo resultante e duas transições (quantitativo) de topo mais intensos por peptídeo com todas as transições criadas na etapa 3.
- Com base nessas informações, atualizar um método MRM 10 min (criado no passo 3.6) com canais cronometrados para medir peptídeos (ver Figura 2 para um exemplo). Para manter a sensibilidade, manter cada canal com pontos por pico superior a 8 e tempo de permanência superior a 0,01 seg para, pelo menos, uma transição para cada péptido.
- Incluir 'atrasos de solventes' no método MRM: uma no início, até 10 segundos antes da primeira eluição de pico eoutra no final do método, 20 segundos depois do último pico de eluição. Faça isso selecionando "atrasos de solventes" em eventos de método no arquivo método MS.
- Executar a curva padrão através do método MRM cronometrado e garantir que não haja interferência picos inespecíficos com transições (gerados no passo 3.6) por verificação de linearidade.
- Determinar se os péptidos são detectáveis através da execução de controle de pool não-cravado e CSF doença através do método.
- Remover os péptidos que se encontram abaixo do limite de detecção do ensaio.
Figura 2. Exemplo de uma dinâmica MRM MS Method. Temporizado canais de transições de peptídeos podem ser agrupados de acordo com os tempos de retenção estabelecidos. Activar MRMs deve ser incorporada uma forma temporizada como os péptidos marcadores seleccionados eluir a partir da coluna de cromatografia, minimiza o número de TRAnsitions ao longo de um período de tempo e aumenta a sensibilidade do ensaio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. A adição de padrões internos
NOTA: Como descrito anteriormente 10, padrões internos marcados com isótopos estáveis podem ser incluídos no ensaio. Devido à custa destes padrões, é aconselhável primeiro avaliar os peptídeos na matriz.
- Determinar os peptídeos ideais otimizados para detecção no LCR: escolher os péptidos que são as mais recorrentes, com maior intensidade e sem picos de interferência.
- Desenho péptidos correspondente para incluir 13 C 15 N etiquetas de aminoácidos pesados que aumentam a massa do péptido de pelo menos 6 Da relação ao peptídeo endógeno. Além disso, adicionar uma marca de 4 - 6 aminoácidos adicionais, quer ao N ou C-terminal da cadeia pesada pepmaré de controlar para a digestão tríptica.
- Diluir padrões internos marcados com isótopos estáveis em tampão de digestão (veja o passo 2.4). Determinar a quantidade ideal de padrão interno marcada com isótopo estável, que será cravada em CSF por cravação em vários níveis, dependendo dos abundancies anteriormente observados durante o desenvolvimento. Destinam-se a atingir cerca de 1: 1 proporção de padrão marcado com isótopo estável de péptido endógeno.
NOTA: padrões internos marcados com isótopos estáveis podem ser sintetizados por várias empresas comerciais.
6. LC-MRM Ensaio de amostras de doentes CSF
- Pico optimizado quantidade de padrões marcados com isótopos estáveis em 100 uL de CSF e liofilizar a mistura.
- Ressuspender o CSF em 20 ul de tampão digest e realizar a digestão conforme descrito nos pontos 2.7 - 2.10.
- Analisar as amostras utilizando o método LC-MRM desenvolveu na etapa 4.
- Para a análise quantitativa, execute o pep padrãomarés em concentrações de 0 -15 pmol de uma curva padrão. Ver passo 2.5 para a preparação da curva padrão.
Análise 7. Os dados
NOTA: quantitativo de dados baseia-se na relação da intensidade da linha de base de padrões internos de pico (péptidos marcados) pesado. Informações detalhadas sobre a análise de dados / MRM SRM foi previamente descrito 10. dados de relação pode então ser utilizado numa curva padrão para determinar os níveis absolutos ou calcular-los a partir da concentração de péptido adicionado pesada-rotulados.
- Analisar dados LC-MRM utilizando software padrão dos espectrômetros de massa dos fabricantes 10. Como alternativa, use software Skyline para analisar os dados quantitativos MRM 10.
- Verifique a sensibilidade do prazo, verificando a resposta de um padrão interno, tais como a enolase levedura cravado ou um padrão marcado com isótopos estáveis em cada corrida. Assegure-se que o coeficiente de variação (CV) não é maior do que25%.
- rever manualmente a anotação de dados para garantir a precisão. Analisar cada péptido e relação a um padrão interno marcada com isótopo estável adequada, ou seja, utilizar a versão marcada com isótopo estável do péptido, se disponível.
- Para obter os valores absolutos de 100 pmol por uL de CSF, executar o rácio de dados através de curvas padrão apropriadas que foram executados ao mesmo tempo.
- Calcular o coeficiente de variação (CV). CV para cada péptido deve ser inferior a 25% e inferior a 15% para péptidos elevados abundantes.
NOTA: valor pmol Absolute por 100 valores CSF ul pode ser usado na análise estatística jusante subsequente.
8. A apolipoproteína E isoformas Estado
NOTA: Para determinar o estado de isoforma ApoE, a presença dos péptidos correspondentes pode ser realizada pela determinação da presença de cada isoforma.
- Considere o ApoE em 100 ul de limiar CSF de> 1.000 de sinal-to-ruído como positivo para esse péptido. Ver Figura 5 para os péptidos necessários / ausentes para determinar o estado de um paciente isoforma. Determinar a expressão alélica através do cálculo da% de cada uma das isoformas da ApoE ao total de expressão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizando o método descrito acima, um ensaio multiplex alto rendimento de 10 minutos consistindo de 74 peptídeos de 54 proteínas foi desenvolvido, como um ensaio para os marcadores dos distúrbios neurodegenerativos doença de Alzheimer e demência de Lewy (LBD) 8. A Figura 3 mostra um cromatograma em multiplex publicada previamente 8 dos marcadores peptídicos significativos do ensaio. Os péptidos incluídos no ensaio e as suas transições quantitativos são dadas na Tabela 2. Os dados gerados por este método dá proporções normalizados em relação ao padrão interno marcada com isótopo estável relevante. Estes valores podem então ser colocada através de uma curva padrão para determinar pmoles / 100 jil de CSF concentrações absolutas. Estes valores podem então ser analisados estatisticamente para alterações nas amostras clínicas.
Como descrito anteriormente 8, a quantificação dos 74 PEptides incluídos neste ensaio CSF revelou que 25 desses marcadores foram alteradas de forma significativa no CSF de pacientes com demência. Para ilustrar a eficácia deste ensaio, os resultados a partir de marcadores anteriormente descrito demência Pro-orexina e quitinase YKL-3 como a proteína (YKL-40) 11,12 são apresentados na Figura 4. O ensaio da ApoE integrada identifica o estado da ApoE isoforma / alelo de o paciente bem. Apo E4 é um conhecido fator de risco para a doença de Alzheimer, portanto, integrar esta no ensaio fornecerá informações valiosas. A detecção das isoformas da ApoE é explicado na Figura 5 e é baseado na detecção dos péptidos correspondentes para as alterações de aminoácidos para as isoformas E2 (R158C) e E4 (C112R). A Figura 5A mostra o padrão de pico esperado para cada combinação isoforma e a Figura 5B mostra o resultado de um LCR testado com o ensaio em amostras de doentes.
Figura 3. Representante sobrepostos MRM cromatogramas. Reimpressão de Heywood et al. 8 Biomarkers significativo para as doenças neurodegenerativas demência de Lewy e Doença de Alzheimer 8 são mostrados ao longo de um gradiente de LC 10 min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Exemplo de dados. Reimpressão de Heywood et al. 8 Os gráficos mostram como o MRM LC-MS método / MS descrito pode confiavelmente quantificar e discriminar de controles os conhecidos marcadores neurodegenerativas, como YKL quitinase proteína 3-like (-40 YKL) 11 , 12 e o Pr AD marcador o-Orexin 13. AD = Doença de Alzheimer, LBD = Demência do Corpo de Lewy e doença de Parkinson = PD. Os dados anteriormente publicados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Ilustração de como o Estado Apo E de isoformas de um paciente pode ser determinada. A. Indica os peptídeos que cobre o LGADMEDVCGR 112 sequência de aminoácidos para o neutro (E3a) ou LGADMEDVR para presença de E4 e para a posição 158 para detectar RLAVYQAGAR o neutro (E3b) ou CLAVYQAGAR para a isoforma E2. B. os péptidos da sequência de ApoE são mostrados no painel do lado esquerdo. As diferentes combinações dos péptidos detectados no LCR podem indicar o estado de isoforma ApoE.files / ftp_upload / 54541 / 54541fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo | Fluxo (ml / min) | % UMA | % B | Curva |
| Inicial | 0,8 | 97 | 3 | inicial |
| 0,2 | 0,8 | 97 | 3 | 6 |
| 0,8 | 60 | 40 | 6 | |
| 7,01 | 0,8 | 0,1 | 99,9 | 6 |
| 8 | 0,8 | 0,1 | 99,9 | 6 |
| 8,01 | 0,8 | 97 | 3 | 1 |
| 10 | 0.8 | 97 | 3 | 1 |
Tabela 1. Configurações Gradiente UPLC para a 10 min Método. A = DDH 2 0 0,1% FA, B = ACN, 0,1% de FA
Tabela 2. Péptidos Incluídos no LCR MRM LC MS / MS ensaio. Apresentados são todos os péptidos incluídos utilizados no método, que são descritos e publicados 8. Indicar se o marcador foi detectado de forma confiável em 100 ml de CSF é indicado. Transições marcados em negrito são os usados para dados quantitativos. Por favor clique aqui para baixar esta tabela.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tal como acontece com todos os ensaios baseados em MS, os passos críticos no método são a determinação das quantidades apropriadas e exactas dos padrões internos. Se quantificação absoluta está sendo usado, então as quantidades corretas de peptídeos cravado na curva padrão também são fundamentais.
O nosso ensaio não requer a precipitação do CSF ou o uso de qualquer tipo de limpa degraus ou de dessalinização antes da análise por MS - é um método inteiramente reacção de um só recipiente. Devido ao pequeno volume de CSF e a sua complexidade limitado (em comparação com o plasma), verificou-se que estes passos podem ser removidos a partir do protocolo final, simplificando, assim, o ensaio e tornando-o mais adequado para a tradução para definição de diagnóstico. As inclusões de uma pré-coluna para a coluna analítica principal e dos atrasos de solventes no método MS, parece ser suficiente para manter a sensibilidade durante a MS executado por mais do que 500 amostras. Como o ensaio de UPLC runnitempo ng é curto, é importante identificar de forma inequívoca o pico correto no CSF digerir matriz.
Isto só pode ser conseguido com a utilização de péptidos sintetizados artificialmente e uma curva padrão. Se existe uma incerteza de um péptido combinado com o pico cromatográfico correcta, então ele pode ser útil para executar a amostra através de múltiplas transições e verificar o padrão de transições de intensidade, com os padrões sintéticos. Todos os nossos ensaios de conter, pelo menos, 2 péptidos transições para confirmar a identidade do péptido.
O ensaio foi desenvolvido para os marcadores detectados em cerca de 100 ml de CSF. Para alguns outros marcadores de demência, pode ser necessário um maior volume de CSF. Outra limitação do ensaio é a questão da gama dinâmica da expressão da proteína. Alguns marcadores abundantes precisa ser injetado no espectrômetro de massa em uma menor quantidade, enquanto algumas baixas marcadores abundantes requerem um maior volume de injeção. Por conseguinte, a sample pode necessitar de ser injectados duas vezes.
O significado desta técnica é a capacidade para multiplexar e o aumento da especificidade dos 3 níveis de identificação sobre anticorpos (tempo de retenção, precursor e produto m / z). Do ponto de vista clínico de tradução, a maior vantagem é o potencial de economia de custos em anticorpos, embora seja necessário um investimento inicial para o equipamento de espectrometria de massa e de pessoal treinado. Outra activo é a velocidade na qual o método pode ser traduzido para os sistemas baseados em triplo quadrupolo. Isso acelera significativamente a capacidade de traduzir e validar um ensaio em comparação com todas as técnicas baseadas em imuno. Finalmente, como esta plataforma e experiência tem sido rotineiramente usado para medir pequenas moléculas clinicamente, muitos centros hospitalares grandes já têm esta infra-estrutura no local. No campo da neurodegeneração existe uma grande quantidade de foco e necessidade de novos biomarcadores no CSF e no soro. Este método proporciona um PLATForm para um ensaio de elevado débito, onde marcadores futuros podem ser adicionados (e removida) a ser avaliado quanto à eficácia, etc. Esta técnica tem ainda uma aplicação para outros tecidos para identificação de ApoE isoforma, tais como o plasma, que já foi descrita e até mesmo 2 manchas de sangue.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| Formic acid, LC-MS grade, | Fisher | A117-50 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2.5 LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Urea | Sigma | U0631- 500 g | |
| Water, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Custom synthesised peptides desalted 1-4 mg | Genscript | custom | |
| heavy labeled amino acid [13C; 15N] custom peptides | Genscript | custom | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Thiourea | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| VanGuard precolumn | Waters | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μm 2.1 x 50 mm column | Waters | 186007114 | |
| Yeast Enolase | Sigma | E6126 | |
| 300 μl clear screw top glass vials | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y slit screw caps | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Freeze dryer | Edwards Mudulyo | Mudulyo system | |
| Concentrator/Speed vaccum | Eppendof | concentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S mass spectrometer | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
References
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V.
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64 (2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959 (2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032 (2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
