Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التحت خلوية تسجيلات التصحيح، المشبك من المجال Somatodendritic من سودائي الدوبامين العصبية

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

التشعبات من الخلايا العصبية الدوبامين يتلقى وينقل مدخلات متشابك، دعم العمل إمكانية العودة إكثار وإطلاق الناقلات العصبية. إن فهم هذه الوظائف الأساسية تسليط الضوء على نقل المعلومات في هذه الخلايا العصبية. توفر شجيري تسجيلات التصحيح المشبك إمكانية لفحص مباشر على الخواص الكهربائية من التشعبات والقنوات الأيونية الجهد بوابات الأساسية. ومع ذلك، هذه الهياكل الدقيقة ليست بسهولة الوصول إلى ماصات التصحيح بسبب قطرها صغير. ويصف هذا التقرير إجراء خطوة بخطوة لجمع التسجيلات مستقرة وموثوق بها من التشعبات من الخلايا العصبية الدوبامين في شرائح حادة. يتم الجمع بين القياسات الكهربية مع اللاحق التعافي من مورفولوجيا الخلايا. التجارب الناجحة تعتمد على تحسين إعداد شرائح والحلول والماصات، والتكيف الملائم للبصريات واستقرار ماصة في اتصال مع هيكل المسجلة. مبادئ القياسية سوموتطبق آتيك تسجيل التصحيح، المشبك إلى التشعبات ولكن مع نهج ألطف من ماصة. هذه التقنيات تنوعا يمكن تنفيذها لمعالجة مختلف المسائل المتعلقة خصائص منفعل من التشعبات.

Introduction

تتلقى الخلايا العصبية المعلومات متشابك الغالب على التشعبات. مثير وإشارات متشابك المثبطة نشر من موقعهم من جيل إلى الموقع التكامل حيث أثار امكانات العمل (الجزائرية) كما إشارة خرج. في طريقهم، وتتأثر إمكانات متشابك من قبل كل من هيكل من التشعبات والتفاعل بين خصائص الغشاء السلبية والإيجابية. الجمع بين هذه المعايير اختلافا كبيرا يتسع الطاقة الحسابية من الخلايا العصبية 1،2. ومع ذلك، فإن قطره صغير من التشعبات يعيق لكن دراسة خواصها الكهربائية. التطوير المستمر لتقنية التصحيح، المشبك 3، والبصريات 4 وصقل طرق تحضير شريحة 5 خلال العقود الماضية مكنت التسجيلات من رقيقة جدا (0،7-3 ميكرون Ø) التشعبات 6،7. وكانت هذه الأساليب، و، لا تزال تستخدم إلى حد كبير لفحص استثارة التشعبات في مجموعة سالخلايا العصبية و 8. التسجيلات شجيري المباشرة ضرورية لتحديد التوزيع 9-19 والاختلافات في الخصائص الفنية 20-22 من القنوات الأيونية في مقصورات العصبية متميزة. هذه البيانات هي تكملة ضرورية لتوزيعات القناة الايونية الكشف مع المناعية مجتمعة للضوء والإلكترون المجهري 23،24. وقد تم تنفيذ تسجيلات somatodendritic المزدوجة لاستكشاف انتشار إمكانات العمل 9،13-15،21،22،25-27 ونشر إمكانات متشابك 13،16،18 على نطاق somatodendritic من الخلايا العصبية، الحصول على نماذج كابل السلبي مفصلة 28- 30 والتحقيق في القرار الزماني التكامل الخلايا العصبية 31.

المادة السوداء (SN) هي منطقة تقع في الدماغ المتوسط ​​تشارك في عدة وظائف مثل السيطرة على الحركة، والترميز الثواب والسلوكيات المعتادة. انخفاض الدوبامين يرجع إلى الخاصويرتبط فقدان الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في SN مع الاضطرابات الحركية لوحظ في المرضى الذين يعانون من مرض باركنسون 32. وتتكون الدائرة سودائي اثنين من أنواع الخلايا الرئيسية: الدوبامين وGABAergic الخلايا العصبية. ومن المثير للاهتمام، وهذه الخلايا العصبية لها العديد من الميزات الخاصة التي تميزها عن غيرها من الخلايا العصبية. محور عصبي نسبة كبيرة من الخلايا العصبية DA وبعض الخلايا العصبية GABA تنبع من موقع شجيري مشيرا إلى أن جذع شجيري هي غير متجانسة (محور عصبي الحمل والتشعبات، تفتقر إلى محور عصبي) 25،26،33. وبالتالي فإن التشكل من هذه الخلايا العصبية يتناقض مع منظمة نموذجية من الخلايا العصبية التي نقل المعلومات يتبع قانون الاستقطاب الديناميكي المنبعثة من كاجال: بدءا من التشعبات، إلى سوما وأخيرا إلى أكسون 34. ومن المعروف أن الخلايا العصبية DA أيضا لإطلاق الدوبامين من التشعبات 35، وتوليد النشاط انفجار 36 و اللدونة 37 NMDA مستقبلات. وdissecنشوئها من هذه الظواهر هو بعيد المنال دون التسجيلات مباشرة من موقع حيث يتم البدء فيها. للحصول على نظرة ثاقبة للعلاقة بين الموقع الدقيق والخصائص الفنية للقنوات ايون ودورها في استثارة والمعلومات شجيري نقل في الخلايا العصبية سودائي والتسجيلات شجيري المباشرة هي الأسلوب المفضل.

ويصف هذا التقرير إجراءات تفصيلية والتي يمكن استخدامها للحصول على تسجيلات التصحيح المشبك واحد أو اثنين من التشعبات من الخلايا العصبية سودائي واللاحق biocytin وضع العلامات المقابلة. المبادئ الأساسية لترميم جسدية وغشاء شجيري متشابهة جدا. عمليا إلا أن التسجيلات من المواقع شجيري تتطلب الأمثل محددة بالمقارنة مع تسجيلات الجسدية. التسجيلات الجذعية الناجحة تعتمد على نوعية الشرائح، والتكيف الأمثل للبصريات، نهج طيف من ماصة التصحيح والاستقرار في التسجيلات.

Protocol

جميع الإجراءات التجريبية وصفها هنا تتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية، توجيهات الاتحاد الأوروبي لحماية الحيوانات والمبادئ التوجيهية للاتحاد مختبر الرابطة الأوروبية علم الحيوان.

1. إعداد حلول

  1. معيار السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF، الجدول 1)
    1. استخدام أملاح عالية النقاء 38 والأكواب الزجاجية النظيفة تشطف سابقا مع الماء المقطر المزدوج لإعداد حل جديد. استخدام عالية الجودة الماء المقطر المزدوج لإعداد جميع الحلول من خارج وداخل الخلايا.
    2. خذ كوب 2 لتر إلى حل NaHCO 3 في 500 مل من الماء وآخر لإذابة الأملاح الأخرى من أجل منع ترسب أيونات ثنائي التكافؤ 39 وفقا للجدول 1. تنظيف ملعقة منتظم مع الماء المقطر المزدوج وجففها قبل اتخاذ الملح . استخدام محرك مغناطيسي إلى التجانس dissolutioن. إضافة الحلول من كل من الأكواب إلى قارورة حجمية المناسبة وتقديمهم إلى حجم مناسب.
    3. تأكد من أن حل خارج الخلية النهائي هو شفاف تماما وبدون أي أثر لهطول الأمطار.
    4. تطبيق خليط الغاز يتكون من 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 (الغاز كربوجين) مع شمعة الزجاج ميكروفلتر (13 ملم) 20 - 30 دقيقة قبل perfusing شرائح 38،40. السيطرة بعناية الأسمولية (2-3 قياسات متتالية) من ACSF مع مقياس التناضح (المدى الأمثل: 314-325 mOsmol / L). تخزين الحل المتبقية بعد إعداد في 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون 3 أيام.
  2. حل القطع (السكروز-ACSF، الجدول 2) 5،13
    1. إعداد 3 L من حل جديد. استخدام 1 L لإعداد شرائح الدماغ من حيوان واحد. تخزين الحل المتبقية في 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون 3 أيام.
      وتستخدم المغنيسيوم عالية 2+ وانخفاض الكالسيوم 2+ تركيزات إلى د: ملاحظةانتقال متشابك ecrease واستبدال بعض كلوريد الصوديوم مع السكروز للحفاظ على النسيج 5،40.
  3. الحلول داخل الخلايا
    1. إعداد مقدما 100 مل حل للتسجيلات خلية كاملة المزدوجة (الجدول 3).
    2. تشمل ميثيل 13،15،21 للحصول على الانتعاش الجيد للمورفولوجيا الخلايا. إضافة biocytin (0،1-0،4٪) لفحص في وقت لاحق مورفولوجيا الخلايا العصبية. تشمل صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال، اليكسا 594 أو 101 Sulforhodamine 41) لمتابعة تمديد التشعبات خلال تسجيل (اختياري).
    3. إعداد مقدما 100 مل حل الكهربائي للتسجيلات الخلية المرفقة (الجدول 4). في هذه الحالة الحل الداخلي هو-K + عالية الحلول المصممة لعزل العيانية تنشيط فرط الموجبة الحالية (أنا ح) ويحتوي على مثبطات للقنوات الأيونات الأخرى بوابات الجهد.
    4. متجر داخلحلول الخلوية في 2 مليلتر مأخوذة في -20 درجة مئوية. استخدام قسامة جديدة لكل جلسة تسجيل جديدة. تحقق الأسمولية من كل قسامة إذابة بعناية مع مقياس التناضح. اتخاذ قسامة جديدة إذا لم الأسمولية تتوافق مع القيمة الأولية.
    5. نقل الحل من قسامة مل حقنة 3 في الجزء العلوي من التي يتم وضعها 0.22 ميكرون مرشح محقنة معقمة. الحفاظ على حقنة على الجليد خلال الدورة تسجيل للحد من تدهور مركباته (ATP، GTP أو فسفوكرياتين).

2. تصنيع وتعبئة البقعة ماصة

  1. سحب
    1. استخدام مجتذب القطب أفقي وسميكة الجدران أنابيب الزجاج البورسليكات. لكامل الخلية والتسجيلات الخلية المرفقة، واستخدام 2 مم القطر الخارجي / 1 مم القطر الداخلي. تأكد من أن أنابيب الزجاج نظيفة تماما 38.
    2. إذا لم تكن هذه هي الحالة، تزج الزجاج الشعيرات الدموية في مذيب عضوي (مثل الإيثانول) أولا ثم في الماء المقطر المزدوج. تسخين لفترة وجيزة النهايات الشعرية مع موقد بنسن. بدلا من ذلك، وأنابيب الزجاج أجل غسلها ويسخن مباشرة من الشركة المصنعة (انظر قائمة المواد).
    3. للحصول على تسجيلات somatodendritic المزدوجة، وضمان أن المقاومة ماصة الجسدية ما بين 6 و 10 MΩ 6،11 وبين 8 و 19 MΩ لماصات شجيري عندما تمتلئ حل داخل الخلايا (الجدول 3). توحيد المقاومة ماصة للتسجيلات الخلية المرفقة لمقاومة 10 MΩ لتحقيق نتائج مماثلة على طول نطاق somatodendritic من الخلايا العصبية 16،18،42،43.
    4. إعداد الماصات الطازجة قبل كل جلسة تسجيل (كل يوم) أو مباشرة قبل الترقيع واستخدامها 5-8 ساعة بعد تصنيعها 39. متجر الماصات في وعاء زجاجي مغطاة لحمايتهم من الغبار وعرقلة طرف.
  2. تلميع
    1. تفقد وهيئة التعليم العاليتي البولندية كل طرف ماصة مع microforge للحصول على أختام أفضل مع الغشاء. قبل استخدام microforge، تذوب قطعة صغيرة من الزجاج على خيوط البلاتين التدفئة. استبدال هذا طلاء الزجاج على خيوط البلاتين يوميا لثبات (بيتر جوناس، اتصال شخصي).
      ملاحظة: الماصات المستخدمة في التسجيلات الخلية المرفقة يمكن أن تطلى قبل الخطوة تلميع الحرارة للحد من الضوضاء الخلفية. طلاء يمكن أن يتحقق مع وكيل العازلة مثل المنصهر الشمع الأسنان 22،44 أو المطاط الصناعي سيليكون 39.

3. إعداد الدماغ شرائح

  1. استخدام الفئران ويستار صحية الذين تتراوح أعمارهم بين 16-19 يوما. لا تستخدم الحيوانات المريضة أو الحيوانات التي تعاني من انخفاض حرارة الجسم أو الجفاف. قبل البدء في إعداد شرائح حفاظ على الحيوانات في مكان آمن والصمت. تجنب وجود أي حيوان آخر في الغرفة بينما تستعد حيوان. التعامل مع الحيوانات برفق.
  2. صب السكروز-ACSF الى قسمين 400مل البولي بروبلين (PP) الأكواب ووضعها في الثلاجة -80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. مزيج الحل للحصول على الجليد الباردة السائل / حل المجمدة متجانسة ووضع الأكواب على الجليد. توريد حل السكروز-ACSF مع غاز كربوجين باستخدام شمعة ميكروفلتر (13 ملم) في كل كوب PP.
  3. إعداد تقطيع اللحم وغرفة الاحتياطي
    1. استخدام تقطيع اللحم الأنسجة ذات جودة عالية مع انخفاض للغاية الاهتزازات العمودية 5،38 للحد من الأضرار التي لحقت الطبقات السطحية من شرائح قدر الإمكان. إصلاح شفرة حلاقة جديدة وكلها على تقطيع اللحم.
    2. استخدام شفرة حلاقة جديدة لكل دورة القطع. تجنب الانحناء للشفرة حلاقة. لا تقم بإزالة الفيلم الدهنية على سطح شفرة حلاقة (جوزيف Bischofberger، اتصال شخصي).
    3. إذا كانت متوفرة، والتحقق من الاهتزاز العمودي مع vibroprobe المقدمة من قبل الشركة المصنعة. بدلا من ذلك، استخدم vibroprobe حسب الطلب 5. تقليل الاهتزازات الرأسية للشفرة الصورةس لتكون أقرب وقت ممكن ل0 ميكرون.
    4. إعداد غرفة 150 مل الاحتياطي 45،46 لشرائح كما هو مبين في ص. 201 في الرقم 39. صب ACSF القياسية في غرفة الاحتياطي وضعه في حمام مائي. توفير الحل غرفة احتياطي مع كربوجين يستخدم شمعة ميكروفلتر (ط 6 ملم). تأكد من أن فقاعات كربوجين ضئيلة قدر الإمكان.
      ملاحظة: بناء غرفة احتياطي جديدة كل 2-3 أشهر للحفاظ على ثبات جودة شريحة.
  4. قطع شرائح
    1. في غرفة صامتة التي لا تشعر بالانزعاج المجرب أو وشدد، قطع رأس الحيوان مع مقص جراحة (طول 150 ملم) على مستوى النخاع عنق الرحم.
    2. قطع الجلد في الجزء العلوي من رأس الحيوان في الأنف إلى الاتجاه الذيلية مع مشرط وإزالته أفقيا. قطع الجزء العلوي من الجمجمة من الذيلية إلى الجزء الأنفي من الرأس مع مقص الجميلة وإزالة كل أجزاء من الجمجمة أفقيا. إزالة بالمطر مع ملعقة رقيقة وأسقطه بعناية في كوب PP تحتوي على الجليد الباردة (0-4 درجة مئوية) والسكروز-ACSF معايرتها مع كربوجين 38.
      ملاحظة: هذه سلسلة من الخطوات يجب القيام به في أسرع وقت ممكن، ولكن أيضا بدقة (<< 1 دقيقة، ما يقرب من 40 ق).
    3. إبقاء المخ في حل الكأس PP ل~ 2-5 دقيقة. ضبط ضغط كربوجين لتجنب الحركات من الدماغ. استبدال شمعة ميكروفلتر إذا فقاعات كربوجين كبيرة جدا مع واحدة جديدة.
    4. وضع الدماغ على 9 سم طبق بتري التي تغطي الجزء السفلي داخل مع طبقة من ~ 0.5 سم Sylgard سميكة 38. إعداد هذا الطبق بتري مقدما.
    5. تحيط بالدماغ مع الجليد الباردة السكروز-ACSF. تأكد من أن بعض الطور السائل من حل ACSF السكروز يغطس الدماغ. لشرائح الإكليلية، وقطع الجزء الأمامي من الدماغ في الطائرة الاكليلية مع مشرط أو شفرة حلاقة. إزالة المخيخ مع خفض الاكليلية.
    6. تطبيق cyanoالغراء أكريليت على علبة العينة (منطقة ~ 1 سم 2). لصق كتلة الدماغ بحيث الجزء الأمامي يواجه مرحلة التقطيع. بالتنقيط بعناية السكروز-ACSF على الجزء العلوي من الدماغ لصق باستخدام فتحة كبيرة من ماصة باستير الزجاج، وبعد ذلك يغرق ببطء الغرفة القطع من تقطيع اللحم. مناورة صينية العينة بحيث سطح القطع (أي الأنسجة الأولى لتصل إلى شفرة) هو السطح البطني من الدماغ 40.
    7. تطبيق كربوجين مع محني شمعة الزجاج ميكروفلتر (ط 6 ملم) إلى غرفة قطع (اختياري).
    8. ضبط شفرة حلاقة في زاوية من ~ 15 درجة مع الإشارة إلى المستوى الأفقي 5. قطع شرائح الدماغ الاكليلية من ~ 500 ميكرون في الذيلية إلى الاتجاه الأنف قبل الوصول إلى المادة السوداء. تقليل سماكة لخفض 300-350 ميكرون شرائح سميكة تحتوي على منطقة الفائدة.
    9. شرائح منفصلة عن كتلة الأنسجة مع إبرة نضح رقيقة جدا المرفقةوبالتوازي حقنة إلى حافة شفرة حلاقة. ينحني الإبرة وذلك ليكون زاوية 90 درجة بين الإبرة والحقنة. ضمان أن يتم تطبيق أي ضغط لشفرة الحلاقة أثناء إزالة شريحة من كتلة الأنسجة.
  5. متجر شرائح
    1. نقل شرائح باستخدام أكبر افتتاح ماصة باستير الزجاج (تعلق على لمبة) في غرفة الاحتياطي. مرة واحدة يتم نقل جميع الشرائح في غرفة الاحتياطي (كريستوف شميت-هيبر، والاتصالات الشخصية) تحقيق درجة حرارة حمام الماء إلى 34 درجة مئوية لمدة 0،5-1 ساعة.
    2. بعد هذه الفترة إيقاف حمام المياه والحفاظ على شرائح في درجة حرارة الغرفة. ضبط ضغط كربوجين من أجل تجنب تحركات شرائح في غرفة الاحتياطي. الحفاظ على شرائح لمدة 10 إلى 20 دقيقة أخرى قبل بدء التسجيلات.
    3. تنظيف المعدات والشموع ميكروفلتر بعناية بعد جيدا بالماء المقطر المزدوج في نهاية سليالوراثة الإجراء.

4. المزدوج الجسدية وSomatodendric تسجيلات في سودائي الخلايا العصبية وBiocytin الإيداع

  1. اتبع الوصف لتجميع الإعداد التصحيح، المشبك لشرائح معينة في الدليل أكسون وفي المرجعان 39،40،47. المعلومات المتعلقة الجوانب الأكثر أساسية من الترقيع هي في المرجع. 48.
  2. إعداد غرفة تسجيل
    1. ضع 1-2 مل من الماء المقطر المزدوج في غرفة تسجيل. تحقق من أنه لا تتسرب منه. المكان غرفة تسجيل على الطاولة س ص التحول.
    2. تغذية ACSF القياسية من خلال نظام نضح أنابيب الأكسجين بردة (تترافلوروإيثيلين) إلى غرفة تسجيل. استقرار تدفق نضح في غرفة بمعدل 4-5 مل دقيقة -1. حافظ على طول الأنبوب الانضمام إلى دورق يحتوي على ACSF وغرفة تسجيل قصيرة قدر الإمكان (1 م).
    3. اختيار شريحة الدماغ من غرفة الاحتياطي وتحويلها إلىغرفة تسجيل باستخدام أكبر افتتاح ماصة باستير الزجاج. تغطية شريحة مع حلقة البلاتين لتثبيته في الجزء السفلي من غرفة تسجيل كما هو مبين في ص. 201 في الرقم 39. استخدام خاتم البلاتين مسطحة (Ø 1.5 سم) والغراء خيوط النايلون موازية (تباعد> 2 ملم) على ذلك.
  3. تعديل وتحسين البصريات
    1. تصور شرائح باستخدام المجهر الأشعة تحت الحمراء (IR) فيديو 4،47،49،50. ضبط الإضاءة كولر (51) وتحسين النقيض التفاضلية تدخل (DIC) 51 البصريات أو إضاءة مائلة (Dodt النقيض التدرج - نادي دبي للجواهر) 52،53. يتم إعطاء المزيد من التفاصيل حول هذا الإجراء في المرجعان 40،49.
    2. التحقق من جودة شريحة. تبقي فقط شرائح مع الأسطح الملساء وحتى التي لا يتناقض بقوة جدا وليس لها سوى صغيرة، الحفر المتناثرة.
    3. ملء 2 جديدة وغير مستعملة ماصات التصحيح مع حل داخل الخلايا (
  4. ضع الماصات فوق سطح شريحة
    1. تحقق من وجود طلاء كلوريد على الأسلاك الفضية (حمام القطب المرجعية والتصحيح الكهربائي، لمزيد من التفاصيل، انظر دليل أكسون والحكام 39،54).
    2. إدراج بالتتابع الماصات إلى أصحاب ماصة وتطبيق الضغط الايجابي (~ 70 م بار) باستخدام الدائرة أنابيب يربط بين حامل ماصة، ثلاثي الصنبور ومقياس ضغط الدم 40. انخفاض ماصة في الحمام من غرفة تسجيل.
    3. تأكد من أن قيمة الضغط على مقياس ضغط الدم ثابتة ل~ 1-2 دقيقة. إذا كان ضغط آخذ في التناقص، والتحقق من الأنابيب أو الختم O-خواتم داخل حامل ماصة.
    4. مكان غيض ماصة في منتصف شاشة فيديو والتأكد من عدم وجود عقبات ذلك. تأكد من أن الرأس ماصة لا يتحرك عند تطبيق أو الإفراج عن الضغط على ماصة.
    5. تحقق من الانجراف والاهتزازات من طرف ماصة عن طريق رسم صليب صغير في وسط الشاشة بالضبط في موقف الطرف ماصة ومراقبة حركات 5 دقائق الممكنة من طرف.
    6. تطبيق خطوة الجهد (5 فولت) لمراقبة المقاومة ماصة على الذبذبات. تعيين المحتمل عقد مكبر للصوت التصحيح، المشبك 0 بالسيارات. إلغاء ماصة تعويض محتمل بحيث ماصة العاصمة الحالية يقرأ الصفر في متر مكبر للصوت 39،51.
    7. نقل الماصات وصولا الى شريحة والحفاظ عليها من فوق السطح.
  5. تحديد وتصحيح الخلايا العصبية مع التشعبات طويلة
    1. داخل المادة السوداء اختيار الخلايا العصبية السليمة مع التشعبات الطويلة التي يمكن اتباعها على مسافة طويلة في حوالي نفس ررانو (الشكل 1A و 1B) باستخدام الأشعة تحت الحمراء Dodt التدرج التباين (IR-نادي دبي للجواهر). اختيار خلايا الجسم على نحو سلس ومتجانس. تجنب اثنين من الخلايا يتناقض بقوة على سطح شريحة (الشكل 1C و1D)، لأنه من الصعب لكسر في والحفاظ على ظروف التسجيل مستقرة على مر الزمن (مستقرة سلسلة المقاومة). تحديد الخلايا العصبية التي لديها من سوما 10-30 ميكرومتر تحت سطح شريحة.
    2. نقل القطب الجسدية مقرب من سوما (40-50 ميكرون بعيدا) والقطب على مقربة شجيري إلى التغصنات على مسافة واحدة. استخدام التكبير 2X (أربعة أضعاف المغير) لتحديد وتصحيح جزء من التغصنات. الحصول على رصد والتكبير المطلق لل2،100X بدون تكبير (1X) و5،500X مع التكبير 2X.
    3. قليلا الافراج عن الضغط من ماصة جسدية بنسبة 10 مليبار. إذا لزم الأمر، وتنظيم شجيري والجسدية الضغط ماصة لتجنب تشريد جهيكل الذراع (سوما والتغصنات) ضمن شريحة.
    4. ضع ماصة شجيري قريبة من الغشاء في لنرى والتنقير صغير. الافراج عن الضغط على الطرف ماصة وتصحيح التغصنات في حين تسيطر على المقاومة ماصة. في الظروف المثالية، فقط شفط طفيف جدا غير كافية للحصول على ختم جيدة.
    5. الحفاظ على ماصة الجذعية في وضع الخلية المرفقة. نقل على مقربة ماصة الجسدية لغشاء الجسدية وتصحيح غشاء الجسدية. ضمان أن يتم الحصول على مقاومة عالية الختم قبل تمزق غشاء الخلية (> 1 GΩ) 39. قليلا يتراجع كلا الماصات بعيدا عن غشاء من قبل اثنين من ميكرون لتجنب تشويه للجسم الخلية والتغصنات.
    6. لكل من الماصات، والحد قدر الإمكان من اتساع العابرين ماصة السعة على رأس الخطوة الحالية باستخدام نبض الجهد مع مكاسب عالية وقليل الترشيح (51) والذبذبات. الدخول في وضع واي خلية كاملةعشر ماصة الجذعية وفي وقت لاحق مع ماصة الجسدية.
    7. القضاء على العابرين السعة خلية كاملة والتعويض عن سلسلة المقاومة. رصد وتوثيق المقاومة الوصول في بداية وأثناء بانتظام، والتجربة. إذا المقاومة سلسلة مرتفعة جدا (> 50 MΩ)، إعادة المحاولة مع آخر ماصة.
    8. جمع الصور IR-نادي دبي للجواهر (الشكل 1A و 1B) مع طابعة فيديو الرسم 25، المختطف الإطار أو كاميرا رقمية في تكبير العالية والمنخفضة.
      ملاحظة: تورم الخلايا العصبية أثناء التسجيل (الشكل 1E و1F) لوحظ بشكل متقطع، ولكن نادرا عندما يتم ضبط الأسمولية ودرجة الحموضة من الحلول بشكل صحيح 39.
    9. الحصول مزدوجة تسجيلات خلية كاملة الجسدية (سوما - سوما) مع نفس الإجراء (الشكل 2A).
  6. تطبيق طويلة (عدة مئات من مللي ثانية) زيادة depolarizing الخطوات الحالية بالتتابعمع ماصة الجسدية وشجيري لاستحضار نقاط وصول (الأرقام 2B، 3C و 3D). تسجيل القدرة الناتجة في شجيري وماصة الجسدية في وقت واحد.
  7. دراسة انتشار إمكانات بعد المشبكي مثير الاصطناعية (aEPSPs) في الخلايا العصبية الدوبامين
    1. إنشاء الموجي مثير الحالية بعد المشبكي (EPSC) لحقن كأمر الحالي خلال تسجيلات المشبك الحالي المزدوجة (الأرقام 4A و 4B). للقيام بذلك، وبناء الدالة الأسية مزدوجة مع السعة ودوام القيم المناظرة إلى القيم الحقيقية تقاس لEPSCs في الخلايا العصبية من الفائدة 55. بعناية السيطرة على معدلات أخذ العينات من EPSC شيدت والموجي EPSC حقن للحفاظ على مسار الوقت الأصلي.
      ملاحظة: قبل تطبيق الموجي في الخلايا العصبية الحقيقية، اختبار باستخدام خلية نموذج.
    2. بالتتابع حقن الموجي عبر شجيري وماصة الجسدية وسجل إمكانات كل من الماصات الجسدية وشجيري بالتزامن الناتجة عن ذلك. تحقق بانتظام عن الانجراف ممكن من الماصات.
  8. إنهاء تسجيل من الخلايا العصبية
    1. أخذ صورة الأشعة تحت الحمراء نادي دبي للجواهر في التكبير المنخفض (الهدف: 5X أو 10X) لتوثيق الموقف من الخلايا العصبية داخل شريحة والأقطاب.
    2. ببطء وبلطف سحب شجيري وماصات الجسدية من بالتتابع غشاء الخلايا العصبية من أجل تشكيل خارج من بقع مع كل من الماصات. إزالة ماصة باستخدام سلسلة من الحركات الجانبية-التصاعدي 38. يجب أن تكون هذه قصيرة في البداية ثم تزداد تدريجيا في الطول. هذا التكوين تسجيل تفضل إغلاق السليم للغشاء الخلية.
    3. رصد انخفاض التيارات بالسعة (زيادة في المقاومة وصول) ردا على 5 بالسيارات الجهد نبض في الجهد المشبك في حين سحب ماصة.
    4. وبمجرد أن الغشاء البحرقاد حول الطرف ماصة، أعتبر تماما من غرفة تسجيل. إزالة الهدف من الحمام. حافظ على شريحة في غرفة تسجيل ل15-20 دقيقة في معيار ACSF للسماح للموازنة من biocytin (من الحل داخل الخلايا) في الخلايا العصبية المسجلة.
    5. نقل بلطف شريحة باستخدام فتحة كبيرة من ماصة باستير إلى 25 مل اسع الفم زجاجة العنبر (البني) زجاجية تحتوي ACSF القياسية. إغلاق زجاجة مع غطاء. انظر الفقرة 6 للخطوة التثبيت.

5. تسجيلات الخلية المرفقة

  1. حدد الخلايا العصبية مع التغصنات تمتد على مسافة طويلة في نفس الطائرة. تأكد من أن التغصنات من الفائدة يمكن اتباعها لسوما واضحة المعالم.
  2. ملء ماصة التصحيح مع حل الكهربائي (الجدول 4). تصميم الحل لتسجيل تيار الفائدة في تكوين الخلية المرفقة من قبل بما في ذلك وكلاء الدوائية محددة لمنع تشا أيون أخرىnnels.
  3. تصحيح التغصنات في وضع الخلية المرفقة
    1. تصور جزء من التغصنات والاقتراب من ماصة إعادة ترميز باستخدام مناور. التكيف مع الضغط على طرف ماصة عن طريق التحقق من مقياس (70-80 م بار) لتجنب النزوح من التغصنات. تصحيح التغصنات كما هو موضح في 4.5.4.
    2. تسجيل بعض الصور IR-نادي دبي للجواهر (الشكل 5A). محاولة الحصول على المقاومة ختم كبيرة قدر الإمكان (> 1 GΩ 39)، في أحسن الأحوال بين 3-10 GΩ للتسجيلات الخلية المرفقة 18 (الشكل 5B). التراجع عن ماصة بعيدا عن غشاء من قبل اثنين من ميكرون لتجنب تشويه من التغصنات.
    3. مراقبة تيارات العمل في وضع الخلية المرفقة تعكس إمكانات العمل عفوية من الخلايا العصبية سودائي. تكملة ACSF مع الكالسيوم 2+ والصوديوم + حاصرات قناة (CdCl 2 و TTX، على التوالي) لقمع التيارات عمل.
    4. تطبيق اس 2خطوة oltage من -90 بالسيارات من المحتمل عقد 0 بالسيارات إلى التصحيح لاستحضار أنا ح (الشكل 5C). نضع في اعتبارنا أن إمكانات ماصة وإمكانات غشاء يستريح هي في سلسلة في تكوين الخلية المرفقة 56. لمزيد من التفاصيل، انظر دليل أكسون والرقم 39.
    5. تحقق بانتظام عن الانجراف ممكن من ماصة.
    6. وفي نهاية التسجيل، تمزق التصحيح للذهاب في وضع خلية كاملة واتخاذ قراءات من غشاء المحتملة على الفور. التراجع عن ماصة كما هو موضح في أقسام 4.8.2 و4.8.3 للحصول على التصحيح الخارجي بها.
  4. سجل من سوما المقابل في وضع خلية كاملة
    1. نظرة على طول التغصنات وتحديد سوما المقابلة. استخدام ماصة عالية المقاومة (5-10 MΩ) 6،14،57 مليئة K + حل داخل الخلايا المستندة (الجدول 3). تطبيق الشفط وجيزة (الضغط السلبي) لماصة لتمزق الغشاء من أجل الدخول في وضع خلية كاملة.
    2. تحقق من هوية الخلايا العصبية في المشبك الحالي من خلال تطبيق فرط طويلة وdepolarizing الخطوات الحالية (الشكل 5D) والسماح biocytin بالانتشار على طول التشعبات. تطبيق الخطوات الحالية depolarizing قصيرة لتصور دوام AP.
    3. بعد ≤10 دقيقة، سحب ماصة للحصول على التصحيح الخارجي خارج كما هو موضح في أقسام 4.8.2 - 4.8.3. نقل بلطف شريحة باستخدام فتحة كبيرة من ماصة باستير في زجاجة 25 مل العنبر الزجاج التي تحتوي على ACSF القياسية. إغلاق زجاجة مع غطاء.
    4. بدلا من ذلك، أولا الحصول على الجسدية كامل الخلية مع الحل ماصة تحتوي بالإضافة إلى صبغة الفلورسنت. السماح للنشر الصبغة وتحديد جزء من التغصنات 26. مع ماصة الثانية، تصحيح التغصنات في وضع الخلية المرفقة. استخدام المجهر متحد البؤر إذا كان متوفرا لتحسين التصور التسمية fluorescentlyإد التغصنات 14،22.
    5. أداء التسجيلات الجذعية في تكوين خارج التدريجي، بدلا من ذلك أو بالإضافة إلى التسجيلات الخلية المرفقة 10،22. انظر على سبيل المثال من التيارات الجهد بوابات سجلت من التصحيح الخارجي في الشكل 5E و5F.

6. Biocytin وسمها سودائي الخلايا العصبية

  1. تثبيت الأنسجة
    1. إذا كان ذلك ممكنا، استخدام غرف منفصلة للتسجيل شريحة / معالجة النسيجية 38.
    2. إصلاح شرائح بالاستعاضة عن ACSF مع بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات المالحة (PBS، ودرجة الحموضة = 7.4) مع ماصة باستور. دائما استخدام الطازجة حل تثبيتي (<< 1 أسبوع من العمر).
      تنبيه: استخدام قفازات اليد المناسبة وغطاء الكيميائية وضعت في مختبر الأنسجة لمعالجة امتصاص العرق بسبب سميتها. قراءة ورقة بيانات السلامة من هذا المنتج الخطير قبل الاستخدام وجهيك يعتقد أن الأنظمة المتعلقة بالسلامة الكيميائية (المواد الخطرة التوجيه (67/548 / EEC) من لجنة الاتحاد الأوروبي)، وهذا المسحوق للحث على السرطان. تفاصيل أخرى في المرجع. 58.
    3. وضع شرائح في 4 درجات مئوية خلال الليل. تجنب التلوث من الإعداد التصحيح، المشبك أو أي معدات تستخدم لالكهربية عن طريق امتصاص العرق.
    4. بعد التثبيت، واستبدال الحل تثبيتي مع برنامج تلفزيوني. استخدام مختلفة ماصات باستور لإزالة الحل تثبيتي وتطبيق برنامج تلفزيوني. متجر الشرائح في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية قبل مزيد من المعالجة (1-2 أسابيع). في هذه الحالة، استبدال برنامج تلفزيوني مرتين في الأسبوع. دائما استخدام الطازجة PBS (<< 1 أسبوع من العمر).
  2. تلطيخ من الأنسجة
    1. إعداد 24 جيدا لوحة الثقافة خلية للخطوات تلطيخ. استخدام المعدات النظيفة لنقل شرائح. شطف شرائح 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني جديد.
    2. تطبيق فلوريسئين أفيدين DCS (أفيدين D، خلية فارز الصف (1)؛ fluores ميكرولترcein / مل تريتون X-100) و 0.3٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية خلال الليل. حماية الشرائح من الضوء في جميع أنحاء تلطيخ. كبديل لمضان، الخلايا العصبية التسمية عبر 3،3'-diaminobenzidine للضوء أو الإلكترون التحليل المجهري 21،58.
      تنبيه: تريتون X-100 أمر خطير. قراءة ورقة بيانات السلامة وتوجيهات المفوضية الأوروبية قبل استخدام هذه المادة.
    3. شطف 3 × 30 دقيقة مع برنامج تلفزيوني وفي وقت لاحق مع PB (الفوسفات عازلة، لتجنب تكوين بلورات على سطح شريحة).
  3. تركيب شرائح على الشرائح الزجاجية القياسية. تغطية شرائح بعناية مع وسيلة التضمين. تجنب فقاعات الهواء في المتوسط ​​التضمين. وضع ساترة بلطف لتغطية كامل شريحة. الهواء الجاف الشرائح بين عشية وضحاها قبل تصور لهم المجهر.
  4. تخزين شرائح المسمى عند 4 درجة مئوية بعد التصور. حيل مفيدة عن الإجراءات النسيجية هي في المرجعان 58،59.
  5. تنظيف المعدات المستخدمة في علم الأنسجة والكهربية بشكل منفصل. لا تخلط الأنسجة والمعدات الكهربية معا.

التصور 7. المشاركة المخصصة من الخلايا العصبية شغل Biocytin-

  1. استخدام المجهر متحد البؤر لتصور مورفولوجيا الخلايا العصبية استردادها.
    1. تحديد ما يقرب من الخلايا العصبية fluorescently المسمى في شريحة مع epifluorescence. فحص جذع شجيري من الخلايا العصبية وتحديد محور عصبي وفقاعة محور عصبي (2-4 ميكرون Ø) باستخدام الهدف 10X أو 20X. توثيق مسار محور عصبي.
    2. التبديل إلى المجهر متحد البؤر وحدد ليزر ديود 488 نانومتر لإثارة فلوريسئين الواردة في الخلايا العصبية المسمى. اتبع تمديد محور عصبي والتشعبات في محور ض.
    3. تسجيل الصور المتعاقبة من أجل الحصول على ض المكدس للخلية بأكملها. ضبط حل ض محور (المسافة بين الصور متتالية) إلى 0،5-1 ميكرون. جمع الصور مبائر من النقيب خليةز المنخفض (الهدف 10X) وارتفاع (الهدف 60X، النفط الغمر) التكبير.
    4. فتح ملف صورة من الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها مع المجهر متحد البؤر مع برامج التصوير (يماغيج) 60. مقارنة صورة ض الإسقاط مع صورة IR-نادي دبي للجواهر التي كتبها العين لتحديد الموضع الدقيق للماصات التصحيح خلال تسجيل الكهربية (الشكلان 1، 2A، 3A، 4A، 5A و5E).
    5. تحديد morphometries من الخلايا العصبية المسماة: قياس محور عصبي - المسافة سوما، المسافات بين تسجيل ماصات على نطاق somatodendritic وبين ماصة الجذعية ومحور عصبي باستخدام وظيفة "القياس" في ImageJ.
    6. إعادة بناء بعض الخلايا العصبية مع NeuronJ (يماغيج)، Imaris 29 أو Neuromantic 61.

8. تحليل البيانات الكهربية

  1. استخدام حزمة البرامج المرتبطة مكبر للصوت لتحليل صارخا للبيانات (على سبيل المثال، Clampfit) أو مباشرة منالبرامج الأخرى لتحليل البيانات مثل Stimfit، البرمجيات مفتوحة المصدر 62،63 كما في منطقتنا نشر مؤخرا 13 أو على سبيل المثال WinWCP.

Representative Results

يعتزم بروتوكول المذكورة أعلاه من أجل تسهيل جمع البيانات باستخدام شجيري تسجيلات التصحيح المشبك. هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع اللاحق الكيمياء النسيجية، ويساعد على اكتساب فهم أعمق للآليات العديد من الإشارات الكهربائية التي تنشأ أو نشر في التشعبات. الوصول المباشر إلى التشعبات مع ماصات التصحيح أمر صعب، ولكن سوف اهتماما خاصا لعدة جوانب المنهجية تحسين معدل نجاح التسجيلات. مجرب من ذوي الخبرة بما فيه الكفاية في تسجيل الجسدية مستقرة يمكن أن نتوقع الحصول على مقاومة عالية (GΩ) الأختام وتجارب كاملة على معظم المحاولات. واحد إلى اثنين التسجيلات الجذعية ذات جودة عالية يمكن جمعها في تشريح.

توافر شرائح الدماغ عالية الجودة تحتوي على somata صحي والتشعبات هو شرط أساسي للوصول إلى هذه الهياكل الدقيقة (الشكل 1). وcriteriواختيار هذه الخلايا العصبية هي سطح أملس ومتجانس في جميع أنحاء الخلية وسوما والتشعبات مع تباين منخفض عندما لاحظ مع الأمثل تعديل البصريات (الشكل 1A و 1B). الخلايا العصبية اختيار تتناقض بشدة جدا عموما يؤدي إلى التسجيلات غير مستقرة (الشكل 1C و1C). لذلك ينبغي تجنب مثل هذه الخلايا العصبية.

بالمقارنة مع الخلايا العصبية الأخرى، الخلايا العصبية DA سودائي عرض الخصائص المورفولوجية والكهربية محددة. ويمكن أيضا أن هذه الميزات المقررة عادة مع ماصة جسدية واحدة يمكن ملاحظتها في جسدي المزدوج (الشكل 2) والتسجيلات somatodendritic (الشكل 3). طويلة الحقن الحالية hyperpolarizing لحث على تصحيح محتمل غشاء يسمى "الترهل" (الأرقام 2B و5D). ينشأ المحور، في معظم الحالات، على موقع شجيري على النحو المحددباستخدام معايير تكميلية 13،25،26، مشيرا إلى أن مقصورة الجذعية في هذه الخلايا العصبية هي غير متجانسة (الشكل 3A - 3B). ونتيجة لذلك، فإن مقصورة حيث لوحظ وكالة اسوشييتد برس أول يتوافق مع مقصورة فيها محور عصبي يظهر (الشكل 3C - 3D) 13،25،26. يتم إنهاء محور عصبي عموما من قبل فقاعة محور عصبي سببه قطع محور عصبي تشريح 64 خلال، ولكن لم يتم الكشف عن هذا الهيكل بشكل منهجي.

تبلد وضوحا لوحظ في الخلايا العصبية DA سودائي على التوالي إلى تفعيل أنا ح يشير تعبير عال من مفارز HCN. لتحديد تأثير أنا ح على دمج إشارات متشابك، تم إنشاء (EPSC) الطول الموجي مثل متشابك الحالية وحقن عن طريق تسجيل الكهربائي شجيري خلال التسجيلات المزدوجة somatodendritic 55 (<قوي> الشكل 4). واستندت حركية هذه EPSCs محاكاة في الارتفاع والوقت اضمحلال ثوابت EPSCs عفوية حقيقية. وسجلت aEPSP الناتج مع القطب الجسدية. تطبيق حمام من أنا ح مانع ZD 7288 زادت مدة aEPSP، مشيرا إلى مساهمة أنا ح لمدار الساعة من الإشارات متشابك (الشكل 4B). ZD 7288 ألغى أيضا الغشاء تصحيح محتمل مؤكدا أن نتائج تبلد من تفعيل أنا ح (الشكل 4C). النتائج المتحصل عليها مع EPSPs محاكاة يمكن أن ترتبط إلى التجارب باستخدام EPSPs أثار كهربائيا 65. لرسم خريطة للتوزيع الدقيق للقناة في المجال somatodendritic من الخلايا العصبية DA، تم تنفيذ التسجيلات الخلية المرفقة (الشكل 5). ختم عالية المقاومة (>> 1 GΩ) ضرورة مطلقة للتسجيلات الخلية المرفقة (الشكل 5B قوية>). في التشعبات من الخلايا العصبية DA، أنا ح ينشط ببطء مع الخطوات hyperpolarizing الجهد طويلة وحققت في حالة من الثبات الحالية بعد مئات مللي ثانية (الشكل 5C)، كما هو موضح سابقا 66. وتشير هذه الملاحظة أن القنوات HCN أعرب في التشعبات من الخلايا العصبية DA لها مفارز مختلفة بالمقارنة مع تلك الموجودة في الخلايا العصبية الهرمية أو أنواع أخرى من الخلايا 10،16،66. كما توزيع القناة قد تكون nonhomogeneous في المقصورة الجذعية وكما مقصورة الجذعية هي في حد ذاتها غير متجانسة، وكشف هوية التغصنات (محور عصبي الحمل أو التغصنات nonaxon الحاملة) بمقارنة صورة IR-DGC مع صورة مبائر بعد تلطيخ biocytin (الشكل 3A وباء). التعافي من مورفولوجيا الخلايا وبالتالي من الضروري لكل من التسجيلات somatodendritic المزدوجة والتسجيلات الخلية المرفقة عبر تسجيلات خلية كاملة جسدية لاحقة.

الآثار البيئية-together.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1. تصور سوما والدانية التشعبات من سودائي الدوبامين العصبية عن طريق الأشعة تحت الحمراء Videomicroscopy. (A) IR-نادي دبي للجواهر صورة من الخلايا العصبية DA سودائي تبين سوما والتغصنات الداني وكل من الماصات الجسدية وشجيري. تم إجراء تسجيل somatodendritic المزدوج بنجاح على هذه الخلايا العصبية السليمة. نلاحظ انخفاض التباين وسطح أملس في جميع أنحاء المجال somatodendritic للخلية. (ب) مثال آخر من الخلايا العصبية DA صحية. (C) DA الخلايا العصبية مع سطح عورة وغير منتظم وعلى النقيض من أقوى. في حين تم الحصول على تسجيل مزدوج، كان الاستقرار دون المستوى الأمثل، وكان مدة تسجيل قصيرة (~ 15 دقيقة) بسبب الزيادة التدريجية للمقاومة الوصول في كل من الماصات. (D) المثال الثاني من الخلايا العصبية DA تظهر يتناقض بشدة سوما والتغصنات القريبة. في هذه الحالة، لوحظ وجود زيادة كبيرة في مقاومة الوصول بعد وقت قصير من نهاية الشوط الاول في وضع خلية كاملة. وكانت محاولة لتقليل المقاومة وصول الضغط السلبي ناجحة. قد تضررت الخلايا العصبية في لوحة C و D أثناء إجراء تشريح وينبغي تجنبها للتجارب. (E) في وقت واحد مزدوج تسجيل الجسدية في الخلايا العصبية DA صحية في بداية التسجيل. (F) نفس الخلايا العصبية كما في لوحة E مع لخلايا الجسم وتورم بعد ~ 17 دقيقة. لاحظ غياب كامل على النقيض من ذلك، فإن ظهور مثل الكرة من سوما وجود نواة كبيرة وهي ليست واضحة في الخلايا العصبية السليمة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. الجسدية تسجيل في وقت واحد مزدوج من DA العصبية. (A) IR-نادي دبي للجواهر صورة أثناء تسجيل الجسدية مزدوج من الخلايا العصبية DA. (ب) Hyperpolarizing وdepolarizing 1 ق الحقن الحالية طويلة (-160 إلى 80 السلطة الفلسطينية، زيادة 80 سنويا) و التغييرات الجهد المقابلة سجلت في وقت واحد مع كل من ماصات التصحيح. لاحظ وجود الترهل في تتبع الجهد مع الخطوة الحالية hyperpolarizing طويلة وكبيرة بعد فرط الاستقطاب بعد AP خلال نبض الحالية depolarizing. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. المزدوج S تسجيل omatodendritic في DA العصبية. (أ) صورة IR-نادي دبي للجواهر من الخلايا العصبية DA. المسافة بين شجيري وسوماماصة التشنج هي 29 صورة ميكرون. (ب) متحد البؤر ض الإسقاط من الخلايا العصبية في لوحة وصفت مع أفيدين مترافق إلى ثيوسيانات فلوريسئين (FITC). وقد شغل الخلايا العصبية مع biocytin أثناء التسجيل. محور عصبي نشأت من التغصنات الداني قريبة من سوما كما يدل على ذلك السهم. (C) في وقت واحد مزدوج تسجيل somatodendritic خلية كاملة الجهد من الخلايا العصبية في لوحة أ ف ب المسجلة في سوما (آثار الجهد الأسود) والتغصنات (الجهد الأحمر آثار) ردا على 1 ق خطوة حقن الحالية طويلة عبر جسدية (يسار، أسود أثر الحالي) وماصة الجذعية بدلا من ذلك (الصحيحة، أحمر أثر الحالي) (D) الجسدية وAP شجيري هو موضح في النطاق الزمني الموسع. إما جسدية أو حقن الحالي شجيري، وكالة اسوشييتد برس الجسدية (أسود) سبقت AP شجيري (الحمراء). وكان التأخير بين نقاط في هذه الخلايا العصبية 120 ميكرو ثانية و 210 ميكرو ثانية مع جسدية وحقن الحالي شجيري، على التوالي. التأخيرتم قياس في AP السعة نصف القصوى خلال مرحلة ارتفاع وكالة اسوشييتد برس. لوحظ وكالة اسوشييتد برس للمرة الأولى في حجرة قريبة من التي يظهر محور عصبي، مؤكدا الملاحظات السابقة 25،26. في هذه الحالة، يتم تسجيل شجيري من التغصنات-تفتقر إلى محور عصبي. مثال على تسجيل من التغصنات محور عصبي تحمل في الرقم 13 (في الشكل بهم. 1). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. تأمرون EPSPs الاصطناعي على طول Somatodendritic محور DA الخلايا العصبية. (أ) صورة IR-نادي دبي للجواهر من الخلايا العصبية DA. المسافة بين شجيري وماصة الجسدية هي 45 ميكرون. كل من ماصات التصحيح هي في وضع خلية كاملة تسجيل المشبك الحالي. (ب) الحاليسجلت مع ماصة الجذعية في المشبك الحالي واستخدامها لتوليد EPSP الاصطناعي (أعلى). يتم الحصول على التيار من قبل حقن لالموجي EPSC مثل (τ ارتفاع = 0.6 مللي ثانية. τ تسوس = 3 مللي، السعة = 100 باسكال) عن طريق تسجيل شجيري ماصة 55. في الجزء السفلي، نشر aEPSPs سجلت في سوما في السيطرة الشروط (أسود) وبعد تطبيق حمام من ZD7288 أنا ح مانع (30 ميكرومتر، أثر الأحمر). كل أثر الجهد المتوسط ​​من 40 الاحتلالات واحدة. نلاحظ الزيادة الكبيرة في مدة EPSP بحضور ZD7288 مما يدل على مساهمة أنا ح لمدار الساعة من EPSPs. (C) الجهد آثار المسجلة من سوما في ظروف التحكم (أسود) وبعد تطبيق 30 ميكرومتر ZD 7288 ( الأحمر) استجابة لفترة طويلة (30 السلطة الفلسطينية، 1 ثانية) الخطوة الحالية hyperpolarizing. لاحظ عدم وجود غشاء التصحيح المحتمل (تبلد) بعد انسداد I <فرعية> ح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. وجود أنا ح في التشعبات من DA العصبية. (A) IR-نادي دبي للجواهر صورة من الخلايا العصبية DA وماصة على التغصنات القريبة. (ب) بالسعة وتسرب التيارات خلال 5 بالسيارات قيادة الجهد في تكوين الخلية المرفقة. كانت المقاومة ختم 5 GΩ في هذا المثال خطوة (C) hyperpolarizing الجهد. (90 فولت، أعلى) من إمكانات غشاء 0 بالسيارات التي يسببها تفعيل ببطء أنا ح. كان مقلوب التتبع الحالي ومزودة الدالة الأسية واحدة مما يعطي ثابت وقت τ = 632 مللي ثانية. (D) الجهدردود خلية كاملة سوما سجلت (لوحة أ) لفرط 1 ق وdepolarizing البقول الحالية (-160 إلى 120 في السلطة الفلسطينية، 40 السلطة الفلسطينية الزيادة). تم إجراء تسجيل كامل الخلية الجسدية بعد تسجيل الخلية المرفقة. لاحظ عدم وجود نقاط وصول نتيجة لتطبيق خارج الخلية من TTX والكادميوم 2+ لقمع اطلاق عفوية أثناء تسجيل الخلية المرفقة. هذه الجهد بوابات نا + والكالسيوم وأضيفت 2+ حاصرات الحالية لقمع التيارات عمل. لوحات أ - D هم من نفس الخلايا العصبية (E) صورة IR-مدينة دبي للإنترنت من الخلايا العصبية DA آخر وماصة شجيري التيارات (F) الجهد التي تعتمد على تفعيلها من خلال نبض اختبار ل0 بالسيارات من prepulse 50 مللي ثانية في -120 بالسيارات. في التصحيح الخارجي من استئصاله من التغصنات القريبة من الخلايا العصبية في لوحة E. القابضة المحتملة -80 بالسيارات. لاحظ تعطيل تعتمد على الوقت للتيار. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

مادة ز / مول تركيز ل1 L
كلوريد الصوديوم 58،443 125 ملي 7.305 غرام
NaHCO 3 84،007 25 ملي 2.100 غرام
بوكل 74،551 2.5 ملم 0.186 غرام
ناه 2 ص 4 137.99 1.25 ملي 0.172 غرام
جلوكوز 198.17 25 ملي 4.95 ز
MgCl 2 1 M (الحل) 1 ملم 1 مل
CaCl 2 1 M (الحل) 2 مم 2 مل
الأسمولية: ~ 310 mOsmol / L (المدى الأمثل: 314-325 mOsmol / L)، ودرجة الحموضة = 7.4

الجدول 1: السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF).

مادة ز / مول تركيز ل1 L
كلوريد الصوديوم 58،443 87 ملي 5.084 غرام
NaHCO 3 84،007 25 ملي 2.1001 ز
بوكل 7،551 2.5 ملم 0.18637 غرام
ناه 2 ص 4 137.99 1.25 ملي 0.17248 غرام
MgCl 2 1 M (الحل) 7 ملم 7 مل
جلوكوز 198.17 10 ملي 1.9817 ز </ td>
سكر القصب 342.29 75 ملي 25،672 ز
CaCl 2 1 M (الحل) 0.5 ملم 0.5 مل
الأسمولية: ~ 326 mOsmol / L، ودرجة الحموضة = 7.4

الجدول 2: السكروز-ACSF لإعداد شرائح.

مادة ز / مول تركيز 100 مل
KMeSO 4 150.2 120 ملي 1.8024 ز
بوكل 74.56 20 ملي 0.14912 غرام
MgCl 2 1 M (الحل) 2 مم 200 ميكرولتر
نا 2 ATP 551.1 2 مم 0.1102 ز
نا 2 GTP 523.2 0.5 ملم 0.02661 غرام
نا 2 -Phosphocreatine 255.1 5 ملم 0.1275 ز
EGTA 380.4 0.1 ملم 3،803 ملغ
HEPES 238.31 10 ملي 0.23831 غرام
Biocytin 1 ملغ / مل 0.1 غرام
الأسمولية: ~ 302 mOsmol / L، ودرجة الحموضة = 7.2 تعديلها مع KOH

الجدول 3: الحل بين الخلايا للتسجيلات المزدوجة.

مادة ز / مول تركيز 100مل
بوكل 74.56 120 ملي 0.8947 ز
CaCl 2 1 M (الحل) 2 مم 200 ميكرولتر
MgCl 2 1 M (الحل) 1 ملم 100 ميكرولتر
HEPES 238.31 10 ملي 0.23831
TEA-CL 165.7 20 ملي 0.3314 ز
4-AP 94.11 5 ملم 0.04705 غرام
بووتون 2 244.26 1 ملم 0.02443 غرام
CdCl 2 183.32 0.02 ملي 0.3666 ملغ
TTX 1 ملم 200 نانومتر 20 ميكرولتر
الأسمولية: ~ 290 mOsmol / L، تعديل مع مد الجلوكوز (المرجع 16)؛ الرقم الهيدروجيني = 7.4

الجدول 4: الحل الكهربائي للتسجيلات الخلية المرفقة.

Discussion

ويصف هذا التقرير بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ المزدوجة somatodendritic تسجيلات خلية كاملة والتسجيلات شجيري المحلية. ومن المفيد لتحديد تأثير القنوات الأيونية (أي أنا ح) على مدار الساعة من إمكانات بعد المشبكي ورسم خرائط توزيع القناة الايونية (أنا ح) على نطاق somatodendritic من الخلايا العصبية DA سودائي، على التوالي. يتم الجمع بين الناتج القياسات الكهربية للنشر الكيمياء النسيجية خاصة لاسترداد مورفولوجيا الخلايا. كان يعمل الإجراء للتحقيق في الخلايا العصبية DA الموجودة في المادة السوداء، ولكن يمكن تعميمها على الخلايا العصبية المجاورة سودائي GABA، منطقة الجوفية السقيفية الخلايا العصبية DA أو غيرها من الخلايا العصبية الدماغ المتوسط. كما يمكن اتباع جميع الخطوات اللازمة لفحص القنوات الأيونية أخرى أعرب في التشعبات من الخلايا العصبية سودائي دون تعديلات هامة. اللاحق التصور هو أهمية خاصة لالخلايا العصبية مع محور عصبي الحملالتشعبات، مثل الخلايا العصبية سودائي 25،26، الحصين interneurons oriens-شكوة 21 أو بعض الخلايا العصبية CA1 الهرمي 67. ومن المثير للاهتمام، ويبدو أن الخلايا العصبية تقاسم هذه الميزة لتكون أكثر شيوعا مما يعتقد عموما 67. ويكشف التحليل الصرفي أيضا الموضع الدقيق للأقطاب ومحور عصبي. قد يكون الأمثل للكشف عن هذا الأخير من قبل وضع العلامات على البروتينات وأعرب في هذا الجزء محور عصبي الأولي (قنوات الصوديوم الجهد بوابات أو Ankyrin G) باستخدام المناعية 68،69.

موثوقية البيانات التي تم جمعها مع التسجيلات الجذعية ووضع العلامات العصبية اللاحقة يعتمد دائما على نوعية شريحة. لذا أقصى الجهود يجب أن تطبق للحفاظ على سلامة الخلايا داخل الأنسجة. ويتحقق ذلك مع التعامل مع لطيف من الحيوانات السليمة، وأدوات ذات جودة عالية والكواشف، الأوكسجين الكافي لدرجات حرارة الأنسجة والجليد الباردة خلال فترة إعداد شرائح. تعتمد ظروف التسجيل مستقرة على اختيار الخلايا العصبية السليمة. في وضع خلية كاملة، يجب سلسلة المقاومة في بادئ الأمر عند أدنى مستوى ممكن وحافظت ثابتة في كافة مراحل التجربة. استقرار التسجيلات يعتمد كذلك على المتلاعبين ذات جودة عالية خالية من الانجراف والاهتزازات. يمكن تخفيض هذه الاضطرابات عن طريق تحسين الاستقرار ماصة: التحقق من اتصال حامل ماصة وheadstage، الذي يسيطر على تلك الكابلات micromanipulator هي الركود، وتجنب التغيرات المفاجئة في درجة الحرارة أو حركة المسرح وفحص آلية مناور. للحصول على تسجيلات مزدوجة، أدرج ميثيل 13،15،21 في حل داخل الخلايا، ولكن غلوكونات 9،14،25 يمكن بدلا من ذلك أن تستخدم. ومع ذلك، فإن أنيون الرئيسي قد يغير غشاء المحتملة 70،71 وبعض التيارات التي تعتمد على الجهد 72. يمكن استكمال حل داخل الخلايا مع ATP، GTP وفسفوكرياتين للحفاظ على physioloوظائف gical من الخلايا العصبية. بالإضافة إلى ذلك، إضافة صبغة الفلورسنت في حل ماصة (على سبيل المثال، اليكسا 594 أو Sulforhodamine 101 41) لتصور التشعبات خلال تسجيل الجسدية يمكن أن تكون مفيدة على سبيل المثال لوضع تطبيق الضغط (الشكل 7 في المرجع 41) أو تحفيز كهربائي ماصة. الحل ماصة للتسجيلات الخلية المرفقة يحتوي على تركيز K + عالية ولا نا + لتسجيل كبيرة أنا ح. الجدير بالذكر أن نسبة تركيز الصوديوم + / K + يؤثر على السعة الحالية 10، واحتمال انعكاس لل11 الحالي والمحاصرة من أنا ح 73. بدلا من ذلك، ح يمكنني أيضا أن يسجل استخدام خارج الرافضة 10. في هذا التكوين تسجيل ومع ذلك، قد يكون أقلقت الوسط بين الخلايا في القرب من القنوات. ونتيجة لذلك، فإن الاختلافات في تفعيل تعتمد على الجهد I <لوحظ الفرعية> ح عندما حصلت التيارات مقارنة باستخدام بقع الخلية المرفقة وخارج الرافضة 10. واجه تورم الخلايا العصبية في بعض الأحيان أثناء تسجيل التصحيح، المشبك، وغالبا ما ينشأ من أسباب واضحة مثل تدني نوعية المياه، وعدم التوازن القوي في الأسمولية أو درجة الحموضة بين حلول 39 أو أخطاء في داخل وخارج الخلية في تكوين الحلول. جودة التسجيلات الكهربية لديها حالات مباشر على نوعية مورفولوجيا الخلايا العصبية استردادها. وتستخدم عالية المقاومة الماصات الجسدية للتسجيلات المزدوجة (6-10 MΩ، كما هو الحال في المراجع 6،11) وللتسجيلات الجسدية واحدة بعد التسجيلات الخلية المرفقة للحد من التخفيف من الوسط بين الخلايا 14. ولذا فإن خلية كاملة تسجيل الجسدية بعد تسجيل الخلية المرفقة تظل قصيرة (<10 دقيقة). بقع خارج التدريجي من كل من جسدي وشجيري الماصات ضرورية لإقفال السليم للجغشاء الذراع وانتعاش لاحق من مورفولوجيا الخلايا. بالإضافة إلى بنية الخلية، يمكن تحديد محتوى الكيميائية العصبية للخلايا العصبية سجلت 59،74. على سبيل المثال، فإن الخلايا بروتين تيروزين هيدروكسيلاز يمكن immunolabeled لتحديد قاطع للخلايا العصبية DA 13.

وتتركز أساسا الخلايا العصبية DA في SN بارس المكتنزة، ذات كثافة أقل بكثير موجودة في SN بارس الشبكي، حيث اختلط أنها تحتوي على عدد أكبر من الخلايا العصبية GABA 75. في حين أن خلايا الجسم من الخلايا العصبية DA غالبا ما تكون أكبر من أن الخلايا العصبية GABA، وتحديد البصرية من هذه الخلايا مع IR-videomicroscopy غير مؤكد وعرقلت جزئيا التعتيم على المكتنزة بارس. وللتغلب على هذه القيود، وانتقاء ما قبل الخلايا العصبية DA يمكن أن يتيسر من خلال استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن علامة فلوري في مجموعة سكانية محددة من الخلايا العصبية (TH 65 أو DAT لالخلايا العصبية DA، GADلالخلايا العصبية GABA) والإضاءة epifluorescence. بدلا من ذلك، قد يتم تضمين صبغة الفلورسنت في حل من القطب الجسدية لتسهيل التصور من التشعبات. يتم إحضارها عن قرار زيادة الخلية الفلورسنت التي كتبها نيبكو الغزل القرص مبائر 14،22،30 أو اثنين الفوتون المجهري 7 مجتمعة لIR-DGC 6. ترتبط العديد من المزايا لنادي دبي للجواهر بالمقارنة مع مدينة دبي للإنترنت. أولا، كما لا يطلب رشة عمل مدينة دبي للإنترنت، وصورة IR-DGC يمكن مضافين مع 49،52،53،76 صورة مضان. ثانيا، نادي دبي للجواهر يمكن الجمع بين ضوئي وعلم البصريات الوراثي 77.

والعيب من إعداد شريحة هو الحفاظ على سلامة الخلايا العصبية. الخلايا العصبية DA تمتد التشعبات في الطائرات المكانية الثلاثة 78،79 وبالتالي اقتطاع مقصورة شجيري لا يمكن تجنبها تماما في شرائح 80. اختيار اتجاه شرائح (الاكليلية، أفقي أو الفقرةالسهمي) هو المفاضلة. يجب النظر في أصل تعصيب والتصميم التجريبي لتحديد الاتجاه الصحيح للشرائح.

الترقيع شجيري المباشر هو أسلوب يستخدم لرسم خريطة للتوزيع القنوات الأيونية وظيفية في مقصورات مختلفة من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية تتيح لتحديد التغير في الخصائص الفنية للقنوات 20. واستكمالا للموقع وكثافة من القنوات الأيونية يمكن التأكد باستخدام المناعية في مستويات الضوء والمجهر الالكتروني 17،23. كما يوفر هذا النهج إمكانية تحديد كثافة قناة في الهياكل عيار الصغيرة التي لا يمكن الوصول إليها لماصات التصحيح. ولكن هذه القنوات قد يكون في حالة وظيفية متميزة 24 أو حتى غير نشطة مقارنة مع تلك المسجلة باستخدام تقنيات التصحيح، المشبك. ولذلك فإن الضرورية للحصول على صورة كاملة للموقع وخصائص كل من تقنياتالقنوات الأيونية في منطقة خلوية معينة (17). مع تطور الأصباغ الحساسة الجهد، وقد استخدم التصوير الجهد لدراسة انتشار نقاط وصول وEPSPs في الخلايا العصبية في مواقع متعددة 81. كبديل لالمزدوجة التسجيلات التصحيح، المشبك، ويمكن هذا النهج حتى يتم تنفيذ لالتشعبات رقيقة التي لا يمكن الوصول إلى ماصات التصحيح ولكن يتطلب معايرة دقيقة للإشارة والمتوسط.

بينما الخلايا العصبية DA في SN ومنطقة الجوفية السقيفية يتم التحقيق فيها على نطاق واسع عبر تسجيلات الجسدية في سياق الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، والخصائص الفنية للالتشعبات لا تزال مجهولة إلى حد كبير في كل الظروف. الترقيع من التشعبات تم تنفيذه لالخلايا العصبية الدوبامين سودائي من قبل العديد من الجماعات مع نجاح 13،25،26 ويبقى الأسلوب المفضل لتشريح خصائص منفعل من هذه الهياكل التحت خلوية غرامة 8. توفر تسجيلات شجيري مزيد من opportuNITY للتدقيق كفاءة ومرونة انتقال متشابك واللدونة من استثارة شجيري 82،83.

Disclosures

يعلن صاحب البلاغ أنه لا يوجد لديه المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

أشكر الدكتور فنسنت Seutin على دعمه المستمر، كريستيل Gillissen ولوران Massotte للحصول على مساعدة فنية ممتازة، الدكاترة جان Defourny وساندرا Ormenese للالنصائح مع المجهر متحد البؤر، الدكتور جاك خصص لهبة الثاني مكبر للصوت Axopatch 200B، وGIGA-التصوير منصة لتبادل المجهر متحد البؤر والبرمجيات Imaris والدكتور ستيفن فريمان لقراءة نقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من FRS البلجيكية - FNRS (U.N002.13 وT.N0015.13) ونشر بدعم من مؤسسة جامعة البلجيكي (Publié AVEC LE المناظرات دي لا مؤسسة الجامعي دو بلجيك).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93 (2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50 (2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4 (2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54 (2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Tags

علم الأعصاب، العدد 117، التغصنات، والتصحيح، المشبك، والتسجيلات المزدوجة، الخلية المرفقة، ووضع العلامات biocytin، مورفولوجيا الخلايا العصبية، المادة السوداء، الدوبامين العصبية، القناة الايونية
التحت خلوية تسجيلات التصحيح، المشبك من المجال Somatodendritic من سودائي الدوبامين العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engel, D. Subcellular Patch-clamp… More

Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter