Abstract
Дендриты дофаминергических нейронов получают и передают синаптическую вход, поддержка потенциала действия обратного распространения и высвобождения нейромедиаторов. Понимание этих основных функций будет пролить свет на передачу информации в этих нейронов. Дендритные записи патч-зажим обеспечивают возможность непосредственного изучения электрических свойств дендритов и лежащих в основе напряжения закрытого ионных каналов. Тем не менее, эти тонкие структуры не являются легко доступными для патч-пипеток из-за их малого диаметра. В настоящем докладе описывается процедура шаг за шагом собрать стабильные и надежные записи из дендритов дофаминергических нейронов в острых срезов. Электрофизиологические измерения объединены с постфактум восстановлением морфологии клеток. Успешные эксперименты опираются на повышении качества подготовки срезов, растворов и пипеток, адекватной регулировки оптики и стабильности пипетке в контакте с записанной структурой. Стандартные принципы сомаА.Т.И.Ц. записи патч-зажим применяются к дендритов, но с более мягким подходом пипетку. Эти универсальные методы могут быть реализованы для решения различных вопросов, касающихся возбудимых свойств дендритов.
Introduction
Нейроны получают синаптическую информацию преимущественно на их дендритов. Возбуждающие и тормозные синаптические сигналы распространяются от их места производства к месту интеграции, где потенциалы действия (AP) вызываются в качестве выходного сигнала. На их пути, синаптические потенциалы влияют как структуры дендритов и взаимодействия между пассивными и активными свойствами мембраны. Сочетание этих параметров сильно изменяющимися расширяет вычислительные мощности нейронов 1,2. Тем не менее, малый диаметр дендритов мешает однако исследование их электрических свойств. Непрерывное развитие техники патч-зажим 3, оптика 4 и уточнение способов получения срезов 5 в течение последних десятилетий позволили записи с очень тонким (0,7 - 3 мкм Ø) дендриты 6,7. Эти методы были, и, по-прежнему в основном используются для изучения возбудимость дендритов в различных OF нейроны 8. Прямые дендритные записи имеют важное значение для определения распределения 9-19 и различия в функциональных свойствах 20-22 ионных каналов в различных нейрональных отсеков. Эти данные являются необходимым дополнением распределений каналов ионов , обнаруженных с помощью иммуногистохимии в сочетании с легкой и электронной микроскопии 23,24. Двойные somatodendritic записи были реализованы для изучения распространения потенциалов действия 9,13-15,21,22,25-27 и расширяющих синаптических потенциалов 13,16,18 вдоль somatodendritic области нейронов, получить детальные пассивные модели кабельных 28- 30 и исследовать временное разрешение нейрональной интеграции 31.
Черной субстанции (SN) является область, расположенная в среднем мозге, участвующих в нескольких функций, таких как контроль движения, кодирование вознаграждения и привычных форм поведения. Снижение дофамина в связи с особенностямипотеря дофаминергических (DA) нейронов в SN связано с двигательных нарушений , наблюдаемых у пациентов , страдающих болезнью Паркинсона 32. Черной субстанции схема состоит из двух основных типов клеток: дофаминергические и ГАМКергических нейронов. Интересно, что эти нейроны имеют ряд специфических особенностей, которые отличают их от других нейронов. Аксон большой долей DA нейронов и некоторых ГАМК нейронов происходит от дендритной сайта , указывая , что дендритов неоднородна (аксонов несущих и аксонов-дендриты отсутствуют) 25,26,33. Морфология этих нейронов контрастирует поэтому с типичной организации нейронов , в которых передача информации следует закон динамической поляризации испускаемого Кахалем: начиная от дендритов к соме и , наконец , к аксона 34. DA нейроны также известно, высвобождение дофамина из своих дендритов 35, генерируют разрывной активность 36 и NMDA-рецептор пластичностью 37. dissecние этих явлений неуловим без прямых записей с того места, где они зарождаются. Для того, чтобы получить представление о взаимосвязи между точным местоположением и функциональных свойств ионных каналов и их роли в дендритных возбудимости и передачи информации в нигральных нейронов, прямые дендритные записи являются методом выбора.
В этом докладе описывается подробная процедура , которая может быть использована для получения одно- и двойной записи патч-зажим с дендритах нейронов черной субстанции и соответствующего Постфактум biocytin маркировки. Основные принципы латание соматического и дендритных мембраны очень похожи. Практически, однако, записи с дендритных сайтов требуют специальной оптимизации по сравнению с соматическими записей. Успешные дендритные записи полагаться на качество срезов, оптимальная регулировка оптики, мягкий подход патч пипетку и стабильности записей.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные здесь, следуют институциональные и национальные директивы, директивы ЕС по защите животных и Руководства Федерации Европейской лабораторных животных научной ассоциации.
1. Приготовление растворов
- Стандартный искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF; Таблица 1)
- Используйте соли высокой чистоты 38 и чистые стеклянные мензурки предварительно промыты дважды дистиллированной водой , чтобы приготовить свежий раствор. Используйте высококачественную бидистиллированной воды для приготовления всех внеклеточном и внутриклеточном решений.
- Взять 2 л лабораторный стакан для растворения NaHCO 3 в 500 мл воды , а другой , чтобы растворить другие соли, чтобы предотвратить осаждение двухвалентных ионов 39 в соответствии с таблицей 1. Очистки подноса систематически с дважды дистиллированной водой и высушить его , прежде чем принимать соль , С помощью магнитной мешалки гомогенизировать dissolutioп. Добавьте решения от обоих стаканах на соответствующую мерную колбу и доводят до нужного объема.
- Убедитесь в том, что окончательное внеклеточной решение полностью прозрачным и без каких-либо следов осадков.
- Нанесите газовую смесь , состоящую из 95% O 2 и 5% CO 2 (карбогена газа) со стеклянной микрофильтра свечи (Ø 13 мм) 20 - 30 мин до перфузируя ломтики 38,40. Тщательно контролировать осмолярность (2 - 3 последовательных измерений) от ACSF с осмометре (оптимальный диапазон: 314 - 325 мОсм / л). Хранить остатки раствора после приготовления при температуре 4 ° С и используют его в течение 3-х дней.
- Раствор для резки (сахароза-ACSF; Таблица 2) 5,13
- Приготовьте 3 л свежего раствора. Используйте 1 л для приготовления срезов мозга от одного животного. Хранить остатки раствора при 4 ° С и используют его в течение 3-х дней.
Примечание: Высокий Mg 2+ и низкие концентрации Ca 2+ используются для гecrease синаптической передачи и замена некоторых NaCl с сахарозой , чтобы сохранить ткани 5,40.
- Приготовьте 3 л свежего раствора. Используйте 1 л для приготовления срезов мозга от одного животного. Хранить остатки раствора при 4 ° С и используют его в течение 3-х дней.
- Внутриклеточные растворы
- Приготовьте заранее 100 мл раствора для двойной записи целых клеток (таблица 3).
- Включите метилсульфат 13,15,21 , чтобы получить хорошее восстановление клеточной морфологии. Добавить biocytin (0,1 - 0,4%) для изучения впоследствии морфологии нейроне. Включите флуоресцентный краситель (например, Alexa 594 или 101 сульфородамина 41) следить за расширением дендритов во время записи ( по желанию).
- Приготовьте заранее 100 мл раствора электрода для клеток подключаемых записей (таблица 4). В этом случае внутреннее решение является высокой К + решение , предназначенное для изоляции макроскопический гиперполяризации активированный катионом ток (I H) и содержит блокираторы для других напряжения закрытого ионных каналов.
- Хранить внутриклеточные растворы в 2 мл аликвотах при -20 ° C. Используйте новую аликвоту для каждой новой сессии записи. Проверьте осмолярность каждой талой аликвоты тщательно с осмометре. Возьмем новую аликвоты, если осмолярность не соответствует исходному значению.
- Переносят раствор из аликвоты в 3 мл шприц на верхней части которой фильтр 0,22 мкм стерильный шприц помещен. Держите шприц на льду во время сеанса записи, чтобы ограничить деградацию его соединений (АТФ, ГТФ или фосфокреатина).
2. Изготовление и заполнение Patch Пипетка
- тянущий
- С помощью горизонтального электрода съемник и толстостенных боросиликатного стекла трубки. Для всей-клетка и клетка-прикрепленный записи, используйте 2 мм наружный диаметр / 1 мм внутренний диаметр. Убедитесь в том, что стеклянная трубка является абсолютно чистым 38.
- Если это не так, погружают стеклянные капилляры , в органическом растворителе (например, этаноле), А затем в дважды дистиллированной воде. Кратко нагреть капиллярные окончаний с горелкой Бунзена. В качестве альтернативы, заказать стеклянные трубки промывают и нагревают непосредственно от производителя (см список материалов).
- Для двойных somatodendritic записей, убедитесь , что соматические сопротивление пипеток составляет от 6 до 10 МОм 6,11 и между 8 и 19 МОм дендритных пипеток при заполнении внутриклеточных раствором (таблица 3). Стандартизируйте сопротивление пипеток для клеточных подключенных к записи сопротивления 10 МОм для достижения сопоставимых результатов вдоль somatodendritic области нейроне 16,18,42,43.
- Подготовьте свежие пипетки перед каждой записью сессии (каждый день) или непосредственно перед выравниванием и использовать их 5 - 8 ч после их изготовления 39. Храните пипеток в закрытой стеклянной посуде, чтобы защитить их от пыли и закупорке наконечника.
- Полировка
- Осмотрите и АЭМт-польский каждый наконечник пипетки с microforge, чтобы получить лучшие уплотнения с мембраной. Перед использованием microforge, растопить небольшой кусочек стекла на платиновой нити нагрева. Заменить это стеклянное покрытие на платиновой нитью ежедневно на постоянстве (Peter Jonas, личное сообщение).
Примечание: Пипетки, используемые для клеточных подключаемых записей могут быть покрыты до тепловой полировки шаг, чтобы уменьшить фоновый шум. Покрытие может быть достигнуто с изолирующим средством , таким как расплавленный воск зубной 22,44 или силиконового эластомера 39.
- Осмотрите и АЭМт-польский каждый наконечник пипетки с microforge, чтобы получить лучшие уплотнения с мембраной. Перед использованием microforge, растопить небольшой кусочек стекла на платиновой нити нагрева. Заменить это стеклянное покрытие на платиновой нитью ежедневно на постоянстве (Peter Jonas, личное сообщение).
3. Подготовка мозга Ломтики
- Используйте здоровые крысы Wistar в возрасте от 16 - 19 дней. Не следует использовать вредные для здоровья животных или животных, страдающих от гипотермии или обезвоживания. Перед тем как начать подготовку срезов держать животное в безопасном и тихом месте. Избегайте любое другое животное в комнате во время подготовки животного. Манипулирование животных мягко.
- Налейте сахароза-ACSF на две части 400мл полипропилен (PP) мензурки и поместите их в -80 ° C морозильнике в течение 45 мин. Приготовьте раствор, чтобы получить однородную жидкость / замороженного раствора лед холодной и поместите мензурки на льду. Поставка раствора сахарозы ACSF с карбогена газа с использованием микрофильтра свечу (Ø 13 мм) в каждом стакане ПП.
- Подготовьте слайсер и резервную камеру
- Используйте слайсер ткани высокого качества с очень низким вертикальных колебаний 5,38 , чтобы свести к минимуму повреждение поверхностных слоев срезов в максимально возможной степени . Fix свежий и весь лезвие бритвы на резателя.
- Используйте новый лезвие бритвы для каждой режущей сессии. Избегайте изгиба лезвия бритвы. Не снимайте жировую пленку на поверхности лезвия бритвы (Josef Bischofberger, личное сообщение).
- Если есть возможность, проверьте вертикальную вибрацию с виброщуп, предоставленного производителем. В качестве альтернативы, использовать заказные виброщуп 5. Уменьшение вертикальных колебаний лопасти сO, чтобы быть как можно ближе к 0 мкм.
- Подготовьте 150 мл резервную камеру 45,46 а для срезов , как показано на стр. 201 в работе. 39. Налейте стандартный ACSF в резервную камеру и поместить его на водяной бане. Поставка решение резервной камеры с карбогена использованием микрофильтра свечу (Ø 6 мм). Убедитесь в том, что карбогена пузырьки, как крошечные, как это возможно.
Примечание: Создайте новую резервную камеру каждые 2 - 3 месяца, чтобы сохранить постоянное качество среза.
- Вырезать ломтики
- В тихой комнате, в которой экспериментатор не нарушается или напряженном, обезглавить животное с хирургией ножницами (длина 150 мм) на уровне шейного отдела продолговатого мозга.
- Разрежьте кожу в верхней части головы животного в носовой к каудальном направлении с скальпелем и снимите ее с боков. Отрежьте верхнюю часть черепа от хвостового к носовой части головы с мелкими ножницами и удалить обе части черепа в боковом направлении. Удалите бдождь с тонким шпателем и поместите его осторожно в стакан , содержащий PP ледяная (0 - 4 ° С) , сахароза-ACSF , уравновешенную карбогена 38.
Примечание: Эта последовательность шагов должно быть сделано как можно быстрее, но и придирчиво (<< 1 мин, примерно 40 лет). - Держите мозг в растворе стакана ПП для ~ 2 до 5 мин. Отрегулировать давление карбогена, чтобы избежать движений мозга. Заменить свечу микрофильтра, если карбогена пузырьки слишком велики с новым.
- Поместите мозг на 9 см чашки Петри , в котором внутренняя дно покрыто ~ 0,5 см толщиной Sylgard слоя 38. Готовят эту чашку Петри заранее.
- Окружите мозг с ледяной сахароза-ACSF. Убедитесь, что некоторое количество жидкой фазы из ACSF-раствор сахарозы погружает мозг. Для корональных срезов, отрезали лобную часть мозга во фронтальной плоскости с помощью скальпеля или лезвия бритвы. Удалить мозжечок с корональной разреза.
- Применить цианоакрилатный клей на образец лоток (площадь ~ 1 см 2). Вставьте блок мозга таким образом, что передняя часть обращена к стадии нарезки. Тщательно капать сахароза-ACSF поверх наклеенной головного мозга с использованием большого открытия стеклянной пипетки Пастера и затем медленно погружаются режущую камеру резателя. Маневр лоток образца таким образом , чтобы режущая поверхность (то есть, первая ткань ударить лезвие) является вентральной мозга 40.
- Применяют карбогена с гнутым стеклом микрофильтра свечи (Ø 6 мм) до режущей камеры (по желанию).
- Отрегулируйте лезвие под углом ~ 15 ° , со ссылкой на горизонтальную плоскость 5. Вырезать корональные срезы мозга от ~ 500 мкм в каудально направлении носа до достижения черной субстанции. Уменьшение толщины сократить 300 - 350 мкм срезы толщиной, содержащие интересующую область.
- Отдельные кусочки из блока ткани с очень тонкой иглой перфузионной прикрепленной кшприц параллельно кромке лезвия бритвы. Изгиб иглы так, чтобы иметь угол 90 ° между иглой и шприцем. Убедитесь, что давление не применяется к бритвенным лезвием, удаляя Срез от блока ткани.
- ломтики магазин
- Перенесите ломтики, используя наибольшее отверстие стеклянной пипетки Пастера (прилагается к лампочке) в резервной камере. После того, как все срезы переносят в резервную камеру (Кристофа Шмидт-Хибер, личное сообщение) довести температуру воды в ванне до 34 ° C в течение 0,5 - 1 ч.
- По истечении этого периода выключите ванну воды и держать ломтики при комнатной температуре. Отрегулировать давление карбогена, чтобы избежать перемещения ломтиков в резервной камере. Держите ломтики в течение еще 10 до 20 минут до начала записи.
- Очистите оборудование и микрофильтра свечи тщательно пока тщательно с дважды дистиллированной водой в конце SLICing процедуру.
4. Двойные соматические и Somatodendric Записи в нигральных Нейроны и Biocytin Filing
- Следуйте описания для сборки установки патч-зажим для срезов данных в аксона руководстве и в работах. 39,40,47. Информация о более основные аспекты внесения исправлений в работе. 48.
- Подготовка записи камеры
- 1-е место - 2 мл дважды дистиллированной воды в камере записи. Убедитесь в том, что это не дырявая. Поместите камеру записи на зыбкую ху таблицы.
- Поток стандартных ACSF через кислородонепроницаемой перфузионной системы насосно-компрессорных труб (политетрафторэтилена) в записи камеры. Стабилизировать поток перфузионной в камере со скоростью 4 - 5 мл мин - 1. Хранить длину трубки, соединяющей химический стакан, содержащий ACSF и запись камеры как можно более коротким (1 м).
- Выберите срез мозга из резервной камеры и передавать его во записи камеры, используя наибольшее отверстие стеклянной пипетки Пастера. Накройте срез с платиновым кольцом, чтобы закрепить ее в нижней части записи камеры, как показано на стр. 201 в работе. 39. Используйте плоскую платиновое кольцо (Ø 1,5 см) и клей параллельные нейлоновые резьбу (расстояние> 2 мм) на нем.
- Настройка и оптимизация оптики
- Визуализируйте срезы с помощью инфракрасного (ИК) видеомикроскопия 4,47,49,50. Отрегулируйте освещение Колер 51 и оптимизировать дифференциальный интерференционный контраст (DIC) 51 оптикой или косое освещение (Dodt градиент контрастности - DGC) 52,53. Более подробно об этой процедуре приведены в работах. 40,49.
- Проверьте качество среза. Только держать ломтики с гладкой и ровной поверхности, которые не слишком сильно контрастируют и имеют лишь небольшие, рассредоточенные кратеры.
- Заполните 2 свежие и неиспользованные пипетки патч с внутриклеточным раствором (
- Расположите пипеток над поверхностью среза
- Проверьте наличие хлорида покрытия на серебряных проволок (ванна электрода сравнения и патч - электрода, для получения дополнительной информации смотрите в Руководстве и Refs Axon 39,54.).
- Вставьте пипетки последовательно в держатели пипетки и применять положительное давление (~ 70 мбар) с использованием схемы трубопровода , соединяющего держатель пипетки, трехходовой кран и манометр 40. Опустить пипетку в ванну записи камеры.
- Убедитесь, что значение давления на манометре постоянна в течение ~ 1 - 2 мин. Если давление падает, проверьте трубки или уплотнительные кольца круглого сечения внутри держателя пипетки.
- Поместите кончик пипетки в середине видео монитора и убедитесь, что он не мешает. Убедитесь в том, что кончик пипетки не двигается при подаче или снятии давления на пипетку.
- Проверьте дрейфа и колебаний кончика пипетки, нарисовав небольшой крест в центре монитора точно в положении наконечника пипетки и наблюдать за 5 мин возможных перемещений наконечника.
- Применить шаг напряжения (5 мВ), чтобы контролировать сопротивление пипетки на осциллографе. Установить удерживающий потенциал пэтч-кламп усилителя до 0 мВ. Отменить пипетку смещение потенциала таким образом, что пипетка ток считывает ноль на метр усилителя 39,51.
- Перемещение пипетки вниз к срезу и поддерживать их над поверхностью.
- Выберите и залатать нейрон с длинными дендритов
- В черной субстанции выбрать здоровый нейрон с длинными дендритов, которые могут быть затем на большом расстоянии примерно в той же плане (рис 1А и 1В) с использованием ИК-Dodt Градиент Контраст (ИК-DGC). Выберем гладкую и однородную тело клетки. Избегайте двух сильно контрастировали клеток на поверхности среза (рис 1C и 1D), так как трудно взломать и сохранить стабильные условия записи с течением времени (устойчивое сопротивление серии). Выберите нейроны, которые имеют свои сома 10 - 30 мкм под поверхностью среза.
- Переместить соматическую электрод близко к сомы (40 - 50 мкм) и расстояние дендритов электрода близко к дендритов на том же расстоянии. Используйте увеличение 2X (четырехкратное чейнджером), чтобы выбрать и патч часть дендритов. Получить на мониторе абсолютного увеличения 2,100X без увеличения (1X) и 5,500X с увеличением 2X.
- Слегка ослабить давление соматического пипеткой на 10 мбар. При необходимости, регулировать дендритов и соматический давление пипетки, чтобы избежать смещения CСтруктура ELL (сомы и дендритов) в срезе.
- Поместите дендритных пипетку близко к мембране, чтобы увидеть небольшую рябь. Ослабить давление на кончик пипетки и патч дендриты, контролируя сопротивление пипеток. В идеальных условиях, лишь очень небольшое отсасывания достаточно, чтобы получить хорошее уплотнение.
- Держите дендритных пипетку в режиме клеточного прилагается. Переместить соматическую пипетки близко к соматической мембране и залатать соматической мембраны. Убедитесь в том, что высокое сопротивление уплотнение получено до разрывания клеточной мембраны (> 1 ГОм) 39. Слегка втягивать обе пипеток от мембраны на несколько мкм, чтобы избежать деформации тела клетки и дендритов.
- Для обоих пипеток, уменьшить в максимально возможной амплитуды пипетку емкости переходными поверх текущего шага с использованием импульса напряжения с высоким коэффициентом усиления и мало фильтрации 51 и осциллографом. Войти в режим Wi цельноклеточнаяй дендритной пипеткой, а затем с соматическим пипеткой.
- Исключите емкости переходными цельноклеточная и компенсировать последовательное сопротивление. Мониторинг и документирование сопротивления доступа в начале, и регулярно во время эксперимента. Если последовательное сопротивление слишком велико (> 50 МОм), повторите с другой пипеткой.
- Сбор фотографий IR-DGC (рис 1А и 1В) с Видеографический принтер 25, видеозахвата или цифровой камеры при высоких и низких увеличениях.
Примечание: Отек нейронов во время записи (рис 1E и 1F) спорадически наблюдается, но редко когда осмолярность и рН растворов отрегулирована правильно 39. - Получить двойные соматические записи целой клетки (сомы - Сома) с той же процедурой (рис 2А).
- Применяют длинные (несколько сотен миллисекунд) увеличение тока деполяризующими шаги последовательнос соматической и дендритных пипеткой , чтобы вызвать точки доступа (фигуры 2B, 3C и 3D). Запишите полученный потенциал на дендритные и соматической пипеткой одновременно.
- Изучить распространение искусственных возбуждающих постсинаптических потенциалов (aEPSPs) в дофаминергических нейронов
- Создание возбуждающих постсинаптических ток (EPSC) Форма волны , чтобы впрыснуть в качестве текущей команды во время двойной записи ток-зажим (Фигуры 4A и 4B). Чтобы сделать это, построить двойную экспоненциальную функцию со значениями амплитуды и времени , конечно , соответствующих реальным значениям измеренных для EPSCs в нейроне интереса 55. Тщательно контролировать частоту дискретизации построенного EPSC и закачиваемой EPSC сигнала, чтобы сохранить оригинальный ход времени.
Примечание: Перед использованием формы сигнала в реальном нейроне, протестировать его с помощью модели клетки. - Последовательная впрыскивать сигнала с помощью дендритных исоматическая пипетку и записывать в результате чего потенциалы для обоих соматические и дендритные пипеток одновременно. Регулярно проверяйте на предмет возможного дрейфа пипеток.
- Создание возбуждающих постсинаптических ток (EPSC) Форма волны , чтобы впрыснуть в качестве текущей команды во время двойной записи ток-зажим (Фигуры 4A и 4B). Чтобы сделать это, построить двойную экспоненциальную функцию со значениями амплитуды и времени , конечно , соответствующих реальным значениям измеренных для EPSCs в нейроне интереса 55. Тщательно контролировать частоту дискретизации построенного EPSC и закачиваемой EPSC сигнала, чтобы сохранить оригинальный ход времени.
- Расторжение запись с нейроном
- Возьмем картину ИК-DGC при малом увеличении (объектив: 5x или 10x) документировать положение нейрон в срезе и электродами.
- Медленно и осторожно вывести дендритной и соматические пипеток из нейрональные мембраны последовательно, чтобы сформировать снаружи из пластырей с обеих пипеток. Удалите пипетку с помощью последовательности бокового движения вверх 38. Они должны быть короткими сначала, а затем постепенно увеличивать в длину. Эта конфигурация записи способствует надлежащего закрытия клеточной мембраны.
- Монитор уменьшение емкостных токов (увеличение сопротивления доступа) в ответ на 5 мВ импульса напряжения в напряжение-зажим при выводе пипетки.
- После того, как мембрана морепривело вокруг кончика пипетки, возьмите его полностью из записи камеры. Удалить задачу из ванны. Держите ломтик в записи камеры в течение 15 - 20 мин в стандартном ACSF, чтобы позволить уравновешивание biocytin (из внутриклеточного раствора) в записанном нейроне.
- Аккуратно перенести срез используя большое отверстие пипетки Пастера в 25 мл широкий рот желтый (коричневый) бутыль из стекла, содержащего стандартный ACSF. Закройте бутылку с крышкой. См пункт 6 для фиксации шага.
5. Клеточные прилагается Recordings
- Выберите нейрон с дендрит простираясь на большие расстояния в одной плоскости. Убедитесь в том, что дендрит интерес может следовать к хорошо определенной сомы.
- Заполните патч пипетки с электрода раствором (таблица 4). Дизайн решение для записи текущего интереса к конфигурации соты прикреплены путем включения конкретных фармакологических средств для блокирования других ионных тяnnels.
- Патч дендритов в режиме клеточного прилагается
- Визуализируйте часть дендритов и подход перекодирование пипетку с помощью манипулятора. Адаптировать давление на кончике пипетки, проверяя манометр (70 - 80 мбар), чтобы избежать смещения дендритов. Патч дендриты, как описано в 4.5.4.
- Запишите несколько снимков ИК-DGC (рис 5А). Постарайтесь , чтобы получить сопротивление уплотнения , как большой , насколько это возможно (> 1 ГОм 39), в лучшем случае от 3 - 10 ГОм для мобильных подключенных записей 18 (рис 5б). Отвести пипетку от мембраны на несколько мкм, чтобы избежать деформации дендритов.
- Соблюдайте биотоки в режиме клеточного прилагается отражающий спонтанные потенциалы действия нигральных нейронов. Дополнение к ACSF с Са 2+ и блокаторов Na + каналов (CdCl 2 и ТТХ, соответственно) для подавления биотоки.
- Нанесите 2 SVoltage шаг -90 мВ от удерживающей потенциала 0 мВ до патча , чтобы вызвать у меня ч (5С). Имейте в виду , что потенциал пипетки и мембранный потенциал покоя в серии в конфигурации 56-клеточной прилагается. Более подробную информацию можно найти в руководстве Axon и Ref. 39.
- Регулярно проверяйте на предмет возможного дрейфа пипеткой.
- В конце записи, разорвать патч, чтобы идти в режиме целых клеток и сразу же взять отсчет мембранного потенциала. Отвести пипеткой, как описано в разделах 4.8.2 и 4.8.3, чтобы получить вне-аут патч.
- Запись с соответствующей сомы в режиме цельноклеточная
- Посмотрите вдоль дендритов и найдите соответствующий сому. С помощью высокоомного пипетку (5 - 10 МОм) 6,14,57 , наполненную K + основанное внутриклеточных решение (таблица 3). Применить краткое всасывание (отрицательное давление) кнаконечник пипетки для разрыва мембраны, чтобы войти в режим целых клеток.
- Проверьте идентичность нейрон в текущем зажимом путем применения длинный гипер- и деполяризующими ступенек тока (рис 5D) и позволяют biocytin диффундировать вдоль дендритов. Применить короткие текущие шаги деполяризующими визуализировать время курс AP.
- После ≤10 мин, снять пипетку, чтобы получить внешний выход патч, как описано в разделах 4.8.2 - 4.8.3. Аккуратно перенести срез используя большое отверстие пипетки Пастера в 25 мл из янтарного стекла бутылки, содержащей стандартный ACSF. Закройте бутылку с крышкой.
- В качестве альтернативы, сначала получить соматический поклеточного с пипеткой раствором, содержащим дополнительно флуоресцентного красителя. Разрешить диффузию красителя и выбрать часть дендритов 26. Со вторым пипеткой, залатать дендриты в режиме клеточного прилагается. С помощью конфокальной микроскопии, если доступны, чтобы улучшить визуализацию флуоресцентно этикеткеред дендритов 14,22.
- Выполните дендритные записи в конфигурации вне-вне, в качестве альтернативы или дополнительно к сотовым подключением записи 10,22. См пример напряжения закрытого токов , зарегистрированных от внешнего выход патча на рисунке 5E и 5F.
6. Biocytin Этикетировочное нигральных Нейроны
- Фиксирование ткани
- Если это возможно, использовать отдельные комнаты для записи ломтик / гистохимического обработки 38.
- Закрепить ломтиков путем замены ACSF 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS, рН 7,4) с помощью пипетки Пастера. Всегда используйте свежеприготовленный Фиксирующий раствор (<< 1 неделю назад).
ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующие перчатки руки и химический капюшон помещен в гистологии лабораторию, чтобы манипулировать параформальдегида из-за его токсичности. Прочитайте паспорт безопасности этого опасного продукта перед использованием и сХек правила, касающиеся химической безопасности (Директива об опасных веществах (67/548 / EEC) от Комиссии ЕС), как этот порошок, как полагают, чтобы вызвать рак. Другие детали находятся в работе. 58. - Поместите срезы при 4 ° С в течение ночи. Избегайте загрязнения установки патч-зажима или любого оборудования, используемого для электрофизиологии параформальдегидом.
- После фиксации заменить Фиксирующий раствор с PBS. Используйте различные пипетки Пастера для удаления закрепляющего раствора и применяя PBS. Храните ломтики в PBS при 4 ° С перед дальнейшей обработкой (1 - 2 недели). В этом случае, замените PBS дважды в неделю. Используйте всегда свежеприготовленные PBS (<< 1 неделю назад).
- Окрашивание ткани
- Приготовьте 24 луночный культуральный планшет для этапов окрашивания. Используйте чистое оборудование для передачи ломтиками. Ополосните ломтики 3 х 5 мин с использованием свежей PBS.
- Применить Флюоресцеиновая авидин DCS (авидин D, клеточный сортер класс; 1 мкл fluorescein / мл Тритона Х-100) и 0,3% Тритон Х-100 в PBS при 4 ° С в течение ночи. Защитите ломтики от света в течение окрашивания. В качестве альтернативы флуоресценции, нейроны меток с помощью 3,3'-диаминобензидино для света или электронно - микроскопического анализа 21,58.
ВНИМАНИЕ: Triton Х-100 является опасным. Прочитайте паспорт безопасности и директивы Комиссии ЕС перед использованием этого вещества. - Промыть 3 х 30 мин с PBS, а затем с PB (фосфатным буфером, чтобы избежать образования кристаллов на поверхности среза).
- Установите ломтики на стандартных стеклянных пластинках. тщательно Накройте ломтики с вложением среды. Избегайте пузырьков воздуха в вложению среде. Поместите покровное осторожно, чтобы полностью покрыть срез. Высушите слайды в течение ночи перед визуализируя их с помощью микроскопа.
- Храните меченные срезы при 4 ° С после визуализации. Полезные приемы по гистохимических процедур в работах. 58,59.
- Очистите оборудование, используемое для гистологии и электрофизиологии отдельно. Не следует смешивать гистологию и электрофизиологии оборудование вместе.
7. постфактум Визуализация Biocytin заполненных Нейроны
- С помощью конфокальной микроскопии для визуализации морфологии восстанавливаемых нейронов.
- Грубо найти флуоресцентно меченого нейрон в срезе с эпифлуоресцентной. Изучить дендритов нейронов и определить местонахождение аксонов и аксонов волдырь (2 - мкм O 4) с использованием объектива 10x или 20x. Документ ход аксона.
- Переключиться на конфокальной микроскопии и выбрать лазерный диод 488 нм для возбуждения флуоресцеина, содержащийся в меченого нейроне. Следуйте расширение аксона и дендритов в оси.
- Запись последовательные изображения, для того, чтобы получить Z-стек для всей клетки. Отрегулируйте разрешение оси (расстояние между последовательными изображениями) до 0,5 - 1 мкм. Собирают конфокальной образы клеток USINг низкая (цель 10X) и высокой (цель 60X, масло погружения) увеличение.
- Откройте файл образа нейроне , полученного с помощью конфокальной микроскопии с программным обеспечением для обработки изображений (ImageJ) 60. Сравните Z-проецируемое изображение с ИК-DGC изображением на глаз , чтобы найти точное положение патч - пипеток в течение электрофизиологические записи (фиг.1, 2А, 3А, 4А, 5А и 5д).
- Определение morphometries меченых нейронов: измерение Аксон - сомы расстояния, расстояния между записью пипеток вдоль somatodendritic домена и между дендритной пипеткой и аксона с помощью функции "Измерение" в ImageJ.
- Реконструировать некоторые нейроны с NeuronJ (ImageJ), Imaris 29 или Neuromantic 61.
8. Анализ электрофизиологических данных
- С помощью пакета программного обеспечения , связанного с усилителем грубо анализировать данные (например, Clampfit) или непосредственнодругое программное обеспечение для анализа данных , таких как Stimfit, программное обеспечение с открытым исходным кодом 62,63 , как и в нашей недавней публикации 13 или, например , WinWCP.
Representative Results
Описанный выше протокол намерен облегчить сбор данных с использованием дендритных записи патч-зажим. Этот метод, в сочетании с постфактум гистохимия, помогает получить представление о механизмах многих электрических сигналов , исходящих или распространяющихся в дендритов. Прямой доступ к дендритов с накладными пипеток трудно, но особое внимание нескольким методологическим аспектам повысит уровень успеха записей. Экспериментатор достаточно опытный в стабильной соматической записи можно ожидать, чтобы получить высокое сопротивление (ГОм) уплотнения и полные эксперименты на большинстве попыток. Один из двух высококачественных дендритных записей могут быть собраны за рассечения.
Наличие высококачественных срезах мозга , содержащих здоровый somata и дендриты является необходимым условием для получения доступа к этим тонкие структуры (рисунок 1). criteriа , для выбора этих нейронов являются гладкими и однородными по всей поверхности клетки и сомы и дендритов с низким контрастом при наблюдении с оптимальными регулировать оптикой (фиг.1А и 1В). Выбор нейроны слишком сильно контрастируют как правило , приводит к нестабильным записей (рис 1С и 1С). Поэтому такие нейроны следует избегать.
По сравнению с другими нейронами, нигральных нейроны DA отображать специфические морфологические и электрофизиологические характеристики. Эти особенности , как правило , оцениваются с помощью одного соматического пипеткой может также наблюдаться в двойном соматической (рисунок 2) и somatodendritic записей (рисунок 3). Длинные инъекции гиперполяризационные тока индукции мембранного потенциала ректификации под названием 'провисания' (рис 2B и 5D). Аксон берет свое начало, в большинстве случаев, на дендритных сайте, как это определенос использованием дополнительных критериев 13,25,26, указывая , что дендритные отсек в этих нейронах гетерогенна (Фигура 3А - 3В). Как следствие, отсек , где наблюдается АР первый соответствует той камере, где аксон выходит (фиг.3С - 3D) 13,25,26. Аксон обычно завершается по аксонов пузырьке , вызванного вырезанию аксона во время нарезка 64, но эта структура не систематически обнаруживается.
Выраженный провеса наблюдается в нигральных нейронов DA последовательных к активации I ч предполагает высокую экспрессию HCN субъединиц. Для того, чтобы определить влияние I ч на интеграции синаптических сигналов, синаптические типа тока (EPSC) сигналы были получены и введены с помощью дендритных записи электрода во время somatodendritic двойной записи 55 (<сильный> Рисунок 4). Кинетика этих моделируемых EPSCs были основаны на времени нарастания и затухания постоянных реальных спонтанных EPSCs. Полученный aEPSP был записан с соматической электродом. Ванна применение блокатора I H ZD 7288 увеличена продолжительность aEPSP, что указывает на вклад I ч до временного хода синаптических сигналов (рис 4б). ZD 7288 упразднены также мембранный потенциал ректификации , подтверждающие , что результаты провисает активации I ч (рис 4в). Результаты , полученные с имитацией ВПСП могут быть коррелированы с экспериментами с использованием электрически навеянные ВПСП 65. Для того, чтобы отобразить точное распределение канала в somatodendritic области DA нейронов, клеточные прикреплены записи были реализованы (рисунок 5). Уплотнение с высоким сопротивлением (>> 1 ГОм) является абсолютной необходимостью для сотовых подключаемых записей (рис 5В сильный>). В дендритов DA нейронов, I ч активизирует медленно с длинными гиперполяризационных ступеней напряжения и тока стационарного состояния достигается после того, как сотни мс (рис 5в), так как ранее было показано 66. Это наблюдение указывает на то, что HCN каналы , выраженные в дендритах нейронов да имеют разные субъединиц по сравнению с теми , в пирамидальных нейронов или других типов клеток 10,16,66. По мере того как распределение канала может быть неоднородным в дендритных отсеке и, как дендритные отсек сам по себе неоднородны, личность дендритов (аксонов фертильного или nonaxon несущих дендритов) выявляется путем сравнения изображения ИК-DGC с конфокальной изображения после того, как biocytin окрашивания (рис 3А и В). Восстановление морфологии клеток, поэтому необходимо для обеих двойных somatodendritic записей и для мобильных подключенных записей через последующие соматическими записи целых клеток.
Рисунок 1. Визуальное сомы и проксимальным дендритов нигральных дофаминергических нейронов с использованием инфракрасного видеомикроскопии. (A) IR-DGC изображение нигральных DA нейроне , показывающий сому и проксимальных дендритов и соматических , так и дендритные пипеток. Двойная somatodendritic запись была успешно выполнена на этом здоровом нейроне. Обратите внимание на низкий контраст и гладкую поверхность по всему somatodendritic области клетки. (В) Другой пример здорового DA нейроне. (С) DA нейрон с шероховатой и неровной поверхностью и более сильного контраста. В то время как двойная запись была получена, стабильность была неоптимальным, а продолжительность записи была короткой (~ 15 мин) в связи с постепенным увеличением сопротивления доступа на обоих пипеток. (D) , второй пример Д. нейроне , показывающий сильно контрастировали сомы и дендритов проксимальный, В этом случае наблюдается сильное увеличение сопротивления доступа вскоре после перерыва в режиме целых клеток. Попытка уменьшить сопротивление доступа отрицательным давлением был неудачным. Нейроны в панели С и D , возможно, были повреждены во время процедуры нарезки и его следует избегать для экспериментов. (E) Одновременный двойной соматическая записи в здоровом DA нейрон в начале записи. (F) То же нейрон , как и в панели Е с опухшие тело клетки после ~ 17 мин. Обратите внимание на полное отсутствие контраста, мяч, как внешний вид сомы и наличие большого ядра , которое не проявляется в здоровых нейронов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фигура 2. Одновременная Double Соматические Запись с DA Neuron. (A) IR-DGC изображения во время двойного соматической записи с DA нейроне. (B) гиперполяризационные и деполяризующими 1 S длинные инъекции тока (-160 до 80 мкА, прирост 80 Па) и соответствующие изменения напряжения регистрируются одновременно с обоими коммутационными пипеток. Обратите внимание на наличие провисания в трассировке напряжения с длинной гиперполяризационной ступеньки тока и большой после гиперполяризации после AP во время деполяризующей импульса тока. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Dual S omatodendritic Запись в DA Neuron. (A) IR-DGC изображение нейрона DA. Расстояние между дендритов и сомыкрестики пипетка составляет 29 мкм. (B) конфокальной Z-проекции изображение нейрона в панели меченым авидином , конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Нейрон был заполнен biocytin во время записи. Аксон возникла из проксимального дендрита близко к сомы , как указано стрелкой. (С) Одновременный двойной записи somatodendritic напряжения поклеточного от нейрон в панели А. П. , записанной в сомы (следы черного напряжения) и дендритов (красный напряжение следы) в ответ на 1 с длинной текущей операции впрыска через соматические (левый, черный след тока) , а также в качестве альтернативы дендритных пипеткой (справа; красный след тока) (D) соматические и дендритные А.П. , показанные в расширенном масштабе времени.. При любом соматическим или дендритов тока инжекции, соматическая AP (черный) предшествовало дендритных AP (красный). Задержка между точками доступа в этом нейроне составляет 120 мкс и 210 мкс с соматическими и дендритных инъекции тока, соответственно. Задержкибыли измерены при AP половинной максимальной амплитуды во время восходящей фазы AP. AP наблюдается сначала в отсеке рядом с которым Аксон возникает, подтверждая предыдущие наблюдения 25,26. В этом случае дендритные запись производится из аксон-дендрит отсутствуют. Пример записи с аксона фертильного дендритов находится в работе. 13 (в их рис. 1). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Распространение искусственных ВПСП Вдоль оси Somatodendritic Д.А. нейронами. (A) IR-DGC изображение нейрона DA. Расстояние между дендритов и соматической пипеткой составляет 45 мкм. Оба патч - пипеток в режиме цельноклеточная записи ток-зажим. (В) Токзаписанный с дендритной пипеткой в текущем зажимом и используется для создания искусственного ВПСП (сверху). Ток получается путем инжекции EPSC-подобной формы волны (т нарастания = 0,6 мс; т распада = 3 мс; амплитуду = 100 Pa) с помощью дендритных пипетки записи 55. В нижней части , размножают aEPSPs , записанных сомы в условиях управления (черный) и после применения ванны в I ч блокатора ZD7288 (30 мкМ, красный след). Каждая кривая напряжения представляет собой среднее значение 40 отдельных разверток. Обратите внимание на значительное увеличение продолжительности ВПСП в присутствии ZD7288 с указанием вклада I ч к времени хода ВПСП. (C) Напряжение следы , записанные от сомы в контрольных условиях (черный) и после нанесения 30 мкМ ZD 7288 ( красный) в ответ на длинный (30 мкА; 1 с) гиперпол шаг тока. Обратите внимание на отсутствие мембранного потенциала ректификации (SAG) после закупорки I <к югу> ч. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Наличие I ч в дендриты DA Neuron. (A) IR-DGC изображение нейроне DA и пипеткой на проксимальных дендритов. (B) и емкостные токи утечки при 5 мВ команды напряжения в ячейке-прилагается конфигурации. Сопротивление уплотнение было 5 ГОм в этом примере на стадии (в) гиперполяризационные напряжения. (90 мВ; сверху) от мембранного потенциала от 0 мВ вызывало медленно активирующий I H. Тока след переворачивали и оснащен одной показательной функцией , давая постоянную времени Т = 632 мс. (D) Напряжениеответы цельноклеточной записанной сомы (панель A) до 1 с гипер- и деполяризующие импульсы тока (-160 до 120 мкА, 40 приращения Pa). Соматическая записи цельноклеточная была выполнена после записи клеточного прилагается. Обратите внимание на отсутствие точек доступа за счет внеклеточного применения ТТХ и Cd 2+ для подавления спонтанной стрельбы во время клеточного прилагается записи. Эти потенциалзависимыми Na + , Са 2+ и тока блокаторами были добавлены для подавления биотоки. Панели A - D из того же нейроне (E) IR-DIC изображение другого нейрона DA и дендритных пипеткой (F) зависимые от напряжения тока активируется с помощью тестового импульса до 0 мВ от предымпульса 50 мс при -120 мВ.. во внешнем выход патча, вырезанных из проксимального дендрита нейрона в панели E. Холдинг потенциал -80 мВ. Обратите внимание , зависящий от времени инактивация тока. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличеннуюверсия этой фигуры.
вещество | г / моль | концентрация | за 1 л |
NaCl | 58,443 | 125 мМ | 7,305 г |
NaHCO 3 | 84,007 | 25 мМ | 2,100 г |
KCl | 74,551 | 2,5 мМ | 0,186 г |
NaH 2 PO 4 | 137.99 | 1,25 мМ | 0,172 г |
глюкоза | 198,17 | 25 мМ | 4,95 г |
MgCl 2 | 1 М (раствор) | 1 мМ | 1 мл |
CaCl 2 | 1 М (раствор) | 2 мМ | 2 мл |
Осмолярность: ~ 310 мОсм / л (оптимальный диапазон: 314 - 325 мОсм / л), рН = 7,4 |
Таблица 1: Искусственная спинномозговую жидкость (ACSF).
вещество | г / моль | концентрация | за 1 л |
NaCl | 58,443 | 87 мМ | 5,084 г |
NaHCO 3 | 84,007 | 25 мМ | 2,1001 г |
KCl | 7,551 | 2,5 мМ | 0,18637 г |
NaH 2 PO 4 | 137.99 | 1,25 мМ | 0,17248 г |
MgCl 2 | 1 М (раствор) | 7 мМ | 7 мл |
глюкоза | 198,17 | 10 мМ | 1,9817 г </ TD> |
сахарозы | 342,29 | 75 мМ | 25,672 г |
CaCl 2 | 1 М (раствор) | 0,5 мМ | 0,5 мл |
Осмолярность: ~ 326 мОсм / л, рН = 7,4 |
Таблица 2: Сахароза-ACSF подготовить кусочки.
вещество | г / моль | концентрация | для 100 мл |
KMeSO 4 | 150,2 | 120 мМ | 1,8024 г |
KCl | 74.56 | 20 мМ | 0,14912 г |
MgCl 2 | 1 М (раствор) | 2 мМ | 200 мкл |
Na 2 АТФ | 551,1 | 2 мМ | 0,1102 г |
Na 2 GTP | 523,2 | 0,5 мМ | 0,02661 г |
Na 2 -Phosphocreatine | 255,1 | 5 мМ | 0,1275 г |
EGTA | 380,4 | 0,1 мМ | 3.803 мг |
Hepes | 238,31 | 10 мМ | 0,23831 г |
Biocytin | 1 мг / мл | 0,1 г | |
Осмолярность: ~ 302 мОсм / л, рН = 7,2 доводили с помощью КОН |
Таблица 3: Внутриклеточное решение для двойной записи.
вещество | г / моль | концентрация | для 100мл |
KCl | 74.56 | 120 мМ | 0,8947 г |
CaCl 2 | 1 М (раствор) | 2 мМ | 200 мкл |
MgCl 2 | 1 М (раствор) | 1 мМ | 100 мкл |
Hepes | 238,31 | 10 мМ | 0,23831 |
TEA-Cl | 165,7 | 20 мМ | 0,3314 г |
4-AP | 94.11 | 5 мМ | 0,04705 г |
BaCl 2 | 244.26 | 1 мМ | 0,02443 г |
CdCl 2 | 183,32 | 0,02 мМ | 0.3666 мг |
ТТХ | 1 мМ | 200 нМ | 20 мкл |
Осмолярность: ~ 290 мОсм / л, скорректированный с D-глюкозы (Ref. 16); рН = 7,4 |
Таблица 4: Электродный раствор для клеточных подключаемых записей.
Discussion
Этот отчет описывает протокол шаг за шагом реализовать двойной somatodendritic записи целых клеток и местных дендритных записи. Это полезно для определения влияния ионных каналов (то есть, я з) о времени хода постсинаптических потенциалов и отображение распределения ионного канала (I ч) вдоль somatodendritic области нигральных нейронов DA соответственно. Полученные в результате электрофизиологические измерения объединены , чтобы постфактум гистохимии для восстановления морфологии клеток. Процедура была использована для исследования да нейронов, расположенных в черном веществе, но могут быть обобщены для соседних нигральных нейронов ГАМК, вентральный тегментальной DA нейронов или других нейронов среднего мозга. Все шаги также можно проследить , чтобы исследовать другие ионные каналы , выраженные в дендритах нейронов нигральных без важных изменений. Постфактум визуализация особенно актуально для нейронов с аксона подшипникедендриты, такие как нигральных нейронов гиппокампа, 25,26 Оринс-ALVEUS интернейронов 21 или некоторых СА1 пирамидальных нейронов 67. Интересно отметить , что нейроны , разделяющие эту функцию , как представляется, более распространены , чем обычно считается 67. Морфологический анализ показывает также точное положение электродов и аксона. Обнаружение последнего может быть оптимизировано с помощью мечения белков , экспрессированных в начальном сегменте аксона (напряжения закрытого Na + каналов или анкириновых г) с использованием иммуногистохимии 68,69.
Достоверность данных, собранных с помощью дендритных записей и последующего нейронного маркировки неизменно зависит от качества среза. Максимальное усилие требует поэтому должны применяться для сохранения жизнеспособности клеток в ткани. Это достигается при осторожном обращении здоровых животных, высококачественных инструментов и реагентов, достаточной оксигенации тканей и ледяной температуры на протяжении подготовки срезов, Стабильные условия съемки зависят от выбора здоровых нейронов. В режиме цельноклеточной, последовательное сопротивление должно сначала быть настолько низким, насколько это возможно, и поддерживается постоянной в течение всего эксперимента. Стабильность записи дополнительно зависит от высококачественных манипуляторов, лишенных дрейфа и колебаний. Эти возмущения могут быть уменьшены за счет оптимизации стабильности пипеток: проверка подключения к держателю пипетки и headstage, что контрольный пакет Микроманипулятор кабели слабину, избегая резких изменений температуры или сценического движения и проверки механизма манипулятора. Для двойной записи, метилсульфат 13,15,21 был включен в внутриклеточном растворе, но в качестве альтернативы глюконат 9,14,25 могут быть использованы. Тем не менее, основной анион может привести к изменению мембранного потенциала 70,71 и некоторые зависящие от напряжения тока 72. Внутриклеточных решение может быть дополнена АТФ, ГТФ и фосфокреатина сохранения physioloмиологических функции нейронов. Кроме того, добавление флуоресцентного красителя в растворе пипеткой (например, Alexa 594 или сульфородамин 101 41) для визуализации дендритов во время соматического записи может быть полезно, например , для размещения приложения давления (рисунок 7 в работе. 41) или электрический стимулирующий пипетка. Раствор пипетка для клеточных подключаемых записей содержит высокую концентрацию К + и Na + не запись больших I H. Обращает на себя внимание отношение концентраций Na + / K + влияет на амплитуда тока 10, обратный потенциал тока 11 и стробирование I ч 73. В качестве альтернативы, I ч также могут быть записаны с помощью снаружи аутов 10. В этой конфигурации записи однако, внутриклеточная среда, в непосредственной близости от каналов может быть возмущенных. Следовательно, различия в напряжении-зависимой активации I <к югу> ч наблюдаемый при сравнении токов , полученных с использованием клеточных подключенных заплаты и снаружи аутов 10. Отек нейронов иногда встречается во время записи патч-зажим, и часто возникает из различных причин , таких как низкое качество воды, сильного дисбаланса в осмолярности или рН между внутри- и внеклеточной решения 39 или ошибки в составе решений. Качество Электрофизиологические записи имеет прямое падение на качество морфологии восстановленных нейронов. Высокое сопротивление соматические пипетки используются для двойных записей (6 - 10 МОм, как и в работах 6,11.) , А также для отдельных соматическими записей после клеточных подключаемых записей , чтобы минимизировать разбавление внутриклеточной среды 14. Цельноклеточная соматическая записи следующие записи клеточного прилагается поэтому хранится короткий (<10 мин). Вне-патчи от как соматические и дендритные пипеток имеют важное значение для надлежащего закрытия CELL мембрана и последующее восстановление морфологии клеток. В дополнение к структуре клетки, нейрохимическое содержание может быть определено для зарегистрированных нейронов 59,74. Например, внутриклеточный белок тирозин гидроксилазы может быть immunolabeled для однозначной идентификации DA нейронов 13.
DA нейроны в основном сосредоточены в SN Парс компактов, с гораздо более низкой плотностью , присутствующей в SN Парс геисиЫа, где они перемешаны с большим числом ГАМК нейронов 75. В то время как тело клетки DA нейронов часто больше, чем у ГАМК-нейронов, визуальной идентификации этих клеток с ИК-видеомикроскопии является неопределенным и частично препятствует непрозрачности Парс компактов. Чтобы обойти эти ограничения, предварительный выбор DA нейронов может быть облегчено за счет использования трансгенных мышей , экспрессирующих флуоресцентный маркер в конкретной популяции нейронов (TH 65 или DAT для DA нейронов, ГТРдля ГАМК нейронов) и эпифлуоресцентной освещения. В качестве альтернативы, флуоресцентный краситель, могут быть включены в раствор соматичекой электрода для облегчения визуализации дендритов. Увеличенное разрешение флуоресцентного клетки вносят Nipkow вращающийся диск конфокальной 14,22,30 или двухфотонной микроскопии 7 в сочетании с ИК-6 DGC. Несколько преимуществ связаны с DGC по сравнению с DIC. Во- первых, как ДИК призм не требуется, изображение ИК-DGC могут быть наложены с 49,52,53,76 флуоресцентного изображения. Во- вторых, РСК может быть объединен с фотостимуляцией и оптогенетика 77.
Недостатком препарата ломтика является сохранение целостности нейронов. DA нейроны расширяют свои дендриты в трех пространственных плоскостях 78,79 и поэтому укорочение дендритов отсека не может быть полностью избежать в срезах 80. Выбор ориентации срезов (корональные, горизонтальный или парасагиттальный) является компромиссом. Происхождение иннервации и опытно-конструкторских необходимо учитывать, чтобы выбрать правильную ориентацию срезов.
Прямой дендритных латание это метод, используемый для картирования распределения функциональных ионных каналов в разных отсеках ячеек. Кроме того, этот метод предлагает определить изменчивость функциональных свойств каналов 20. В качестве дополнения расположение и плотность ионных каналов можно определить с помощью иммуногистохимии на уровне 17,23 световой и электронной микроскопии. Этот подход также дает возможность определить плотность каналов в малых калибров структур, которые недоступны для патч-пипеток. Однако эти каналы могут быть в отдельном функциональном состоянии 24 или даже неактивного по сравнению с теми , записанные с использованием методов патч-зажим. Оба метода Поэтому необходимо, чтобы получить полное представление о местоположении и свойствахионных каналов в конкретной сотовой зоне 17. С развитием напряжения чувствительных красителей, визуализация напряжения использовалась для изучения распространения точек доступа и ВПСП в нейронах в нескольких местах 81. В качестве альтернативы двойной записи патч-зажим, этот подход может даже быть реализован для тонких дендритов, которые не доступны для патч-пипеток, но вызывают необходимость точной калибровки сигнала и усреднения.
В то время как DA нейронов в SN и вентральной области покрышки широко исследованы с помощью соматической записей в физиологической и патофизиологической контексте, функциональные свойства их дендритов остается в значительной степени неизвестны в обоих условиях. Заделка от дендритов была реализована для нигральных нейронов допамина несколькими группами с успехом 13,25,26 и остается методом выбора рассекать возбудимых свойств этих тонких субклеточных структур 8. Дендритные записей обеспечивают дальнейшее возщества тщательно исследовать эффективность и пластичность синаптической передачи и пластичности дендритов возбудимости 82,83.
Disclosures
Автор заявляет , что он не имеет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Благодарю д-ра Винсента Seutin за постоянную поддержку, Кристель Gillissen и Лоран Massotte за отличную техническую помощь, д-ра Жан Defourny и Сандра Ormenese для советов с конфокальной микроскопии, д-р Жак Направляемся за дар второго усилителя Axopatch 200В, Giga-изображений платформой для обмена конфокальной микроскопии и программного обеспечения Imaris и д-р Стивен Фриман для критически чтении рукописи. Эта работа была поддержана грантами от бельгийской FRS - FNRS (U.N002.13 и T.N0015.13) и издана при поддержке Фонда университета бельгийского (Publié АВЭК ле Concours де ла Fondation Университетский де Belgique).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Double-distillated water | Millipore | Super Q | Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760 |
Microfilter candles | Robu | Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter | |
Tissue slicer with vibroprobe | Leica | VT1200 | cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40 |
Tissue slicer | Dosaka | DTK-1000 | cutting parameters: speed 4, frequency 7 |
Razor blades | Gilette | Super Silver | |
Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
Reserve chamber | Custom-made | ||
PP beckers | VWR | 213-1725 | 400 ml |
Syringe filter | Merk Millipore | Millex - GV 0.22 µm | |
Cyanoacrylate glue | UHU | "Sekunden Kleber" | liquid glue |
Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
Horizontal pipette puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
Pipettes | Hilgenberg | 1807524 | 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed |
Dental wax | Coltène/Whaledent | orthodontic tray wax strips | |
Platinum grid | to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk | ||
Microforge | Narishige | MF-830 | to fire-polish pipette tips |
Potassium methyl sulfate | MP Biomedicals | 215481 | |
Biocytin | Molecular probes | B1592 | |
Manometer | GREISINGER electronic | GDH 13 AN | |
Microscope | Zeiss | FS | |
Dodt Gradient Contrast | Luigs & Neumann | ||
Manipulators | Luigs & Neumann | LN Mini 25 | |
Frame grabber | The Imaging Source | DFG/USB2pro | |
Camera | DAGE-MTI | NC-70 | |
Condenser | Zeiss | high numerical aperture condenser working with oil | |
Objective | Zeiss | W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR | 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective |
Fourfold-changer | Luigs & Neumann | between the camera and the microscope | |
Black & white video monitor | Sony | SSM-175CE | 16-inch, 850 TV lines, analog |
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap | VWR | 215-2409 | to transfer slices from the setup to histology room |
The Axon Guide | Molecular Devices | Book | |
Stimfit | https://github.com/neurodroid/stimfit | Analysis of electrophysiological data | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
Well cell culture plate | Greiner-Bio-One | 662160 | for the staining of fixed slices |
Triton X-100 | Merk | 108643 | see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use |
mouse anti-TH monoclonal primary | Immunostar | 22941 | working concentration: 1/1,000 |
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | A-11031 | working concentration: 1/500 |
Normal goat serum | Dako | X0907 | |
ProLong Diamond Antifade | Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific | P36961 | |
Fluorescein Avidin DCS | Vector Lab | A-2011 | |
Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
NeuronJ | http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ | plugin for ImageJ | |
Imaris | http://www.bitplane.com | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
Neuromantic | http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ | Reconstruction of biocytin filled neurons | |
WinWCP | http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | Analysis of electrophysiological data |
References
- London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
- Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
- Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
- Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93 (2015).
- Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
- Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
- Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
- Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
- Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
- Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
- Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
- Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
- Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
- Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
- Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
- Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
- Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
- Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
- Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
- Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
- Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
- Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
- Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
- Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
- Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
- Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
- Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
- Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
- Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
- Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
- Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
- Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
- Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
- Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
- Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
- Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
- Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
- Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
- Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
- Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
- van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
- Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
- Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4 (2012).
- Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
- Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
- Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
- Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
- Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
- Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
- Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
- Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
- Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
- Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
- Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
- Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
- Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
- Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
- Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
- Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
- Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
- van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54 (2014).
- Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
- Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
- Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).