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Neuroscience

Nigral डोपामाइन न्यूरॉन्स की Somatodendritic डोमेन से Subcellular पैच दबाना रिकॉर्डिंग

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की dendrites प्राप्त करते हैं और synaptic इनपुट, समर्थन संभावित कार्रवाई के पीछे से प्रचार और न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज व्यक्त करते हैं। इन मौलिक कार्यों को समझने इन न्यूरॉन्स में जानकारी हस्तांतरण पर प्रकाश डाला जाएगा। वृक्ष के समान पैच दबाना रिकॉर्डिंग संभावना सीधे dendrites और अंतर्निहित वोल्टेज gated आयन चैनल के बिजली के गुणों की जांच करने के लिए प्रदान करते हैं। हालांकि, ये ठीक संरचनाओं उनके छोटे व्यास की वजह से पैच pipettes के लिए आसानी से सुलभ नहीं हैं। इस रिपोर्ट में एक कदम दर कदम प्रक्रिया तीव्र स्लाइस में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की dendrites से स्थिर और विश्वसनीय रिकॉर्डिंग को इकट्ठा करने का वर्णन है। Electrophysiological माप सेल आकृति विज्ञान की पोस्ट अस्थायी वसूली के साथ संयुक्त कर रहे हैं। सफल प्रयोगों स्लाइस, समाधान और pipettes, प्रकाशिकी और दर्ज संरचना के साथ संपर्क में पिपेट की स्थिरता की पर्याप्त समायोजन की बेहतर तैयारी पर भरोसा करते हैं। सोम के मानक सिद्धांतोंatic पैच दबाना रिकॉर्डिंग डेन्ड्राइट के लिए, लेकिन पिपेट का एक gentler दृष्टिकोण के साथ लागू कर रहे हैं। इन बहुमुखी तकनीक dendrites के उत्तेजनीय गुण के विषय में विभिन्न सवालों को संबोधित करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

न्यूरॉन्स उनके dendrites पर मुख्य रूप से synaptic जानकारी प्राप्त करते हैं। उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic संकेतों पीढ़ी की अपनी साइट से एकीकरण साइट है जहाँ कार्रवाई की क्षमता (ए पी एस) उत्पादन में संकेत के रूप में पैदा कर रहे हैं में फैल गया। अपने रास्ते पर, synaptic क्षमता दोनों dendrites की संरचना और निष्क्रिय और सक्रिय झिल्ली गुण के बीच बातचीत से प्रभावित हैं। इन अत्यधिक चर मापदंडों के संयोजन न्यूरॉन्स 1,2 के कम्प्यूटेशनल शक्ति चौड़ी। हालांकि, डेन्ड्राइट के छोटे व्यास हालांकि hinders उनके बिजली के गुणों का अध्ययन। (- 3 माइक्रोन Ø 0.7) dendrites 6.7 पैच दबाना तकनीक 3 के सतत विकास, प्रकाशिकी 4 और 5 टुकड़ा तैयारी के लिए तरीकों की शोधन पिछले दशकों के दौरान बहुत पतली से रिकॉर्डिंग के लिए सक्षम है। इन तरीकों में थे, और, अभी भी काफी हद तक एक किस्म ओ में डेन्ड्राइट के excitability जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंएफ न्यूरॉन्स 8। प्रत्यक्ष वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग वितरण 9-19 और कार्यात्मक गुण अलग न्यूरोनल डिब्बों में आयन चैनल का 20-22 में मतभेद निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं। इन आंकड़ों आयन चैनल प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 23,24 करने के लिए संयुक्त immunohistochemistry के साथ पाया वितरण के लिए आवश्यक पूरक हैं। दोहरी somatodendritic रिकॉर्डिंग कार्रवाई क्षमता 9,13-15,21,22,25-27 और synaptic क्षमता 13,16,18 न्यूरॉन्स की somatodendritic डोमेन साथ के प्रसार के प्रचार-प्रसार का पता लगाने में विस्तृत निष्क्रिय केबल मॉडल प्राप्त करने के लिए लागू किया गया है 28- 30 और न्यूरोनल एकीकरण 31 का अस्थायी समाधान की जाँच।

द्रव्य नाइग्रा (एस एन) इस तरह के आंदोलन का नियंत्रण, इनाम और अभ्यस्त व्यवहार की कोडिंग के रूप में कई कार्यों में शामिल मध्यमस्तिष्क में स्थित एक क्षेत्र है। डोपामाइन की कमी के कारण विशिष्टएसएन में डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स की हानि मोटर गड़बड़ी पार्किंसंस रोग 32 से पीड़ित रोगियों में मनाया के साथ जुड़ा हुआ है। डोपामिनर्जिक और GABAergic न्यूरॉन्स: nigral सर्किट के दो मुख्य प्रकार की कोशिकाओं से बना है। दिलचस्प बात ये है कि उन्हें न्यूरॉन्स अन्य न्यूरॉन्स से अलग कई विशिष्ट सुविधाओं है। डीए न्यूरॉन्स और कुछ गाबा न्यूरॉन्स का एक बड़ा हिस्सा के अक्षतंतु यह दर्शाता है कि वृक्ष के समान कुंज विषम (अक्षतंतु असर और अक्षतंतु कमी dendrites) 25,26,33 है एक वृक्ष के समान साइट से निकलती है। सोमा के लिए, डेन्ड्राइट से शुरू और अंत में 34 एक्जॉन: इन न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान न्यूरॉन्स के विशिष्ट संगठन में जो जानकारी हस्तांतरण Cajal द्वारा उत्सर्जित गतिशील ध्रुवीकरण का कानून इस प्रकार के साथ इसलिए विरोधाभासों। डीए न्यूरॉन्स भी उनके dendrites 35 से डोपामाइन को रिहा करने, फोड़ गतिविधि 36 और NMDA रिसेप्टर प्लास्टिसिटी 37 उत्पन्न जाना जाता है। dissecइन घटनाओं के tion साइट है जहाँ वे शुरू कर रहे हैं से प्रत्यक्ष रिकॉर्डिंग के बिना मायावी है। सटीक स्थान और आयन चैनल के कार्यात्मक गुण और nigral न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान excitability और जानकारी के हस्तांतरण में उनकी भूमिका के बीच संबंधों में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, सीधे वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग पसंद का तरीका है।

इस रिपोर्ट में एक विस्तृत प्रक्रिया है कि nigral न्यूरॉन्स की dendrites और इसी पोस्ट अस्थायी biocytin लेबलिंग से एकल और दोहरी पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन है। दैहिक और वृक्ष के समान झिल्ली पट्टी के लिए बुनियादी सिद्धांतों बहुत समान हैं। व्यावहारिक रूप से हालांकि, वृक्ष के समान साइटों से रिकॉर्डिंग दैहिक रिकॉर्डिंग की तुलना में विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता है। सफल वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग स्लाइस, प्रकाशिकी के इष्टतम समायोजन, पैच पिपेट और रिकॉर्डिंग की स्थिरता के कोमल दृष्टिकोण की गुणवत्ता पर भरोसा करते हैं।

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं यहाँ वर्णित है, संस्थागत और राष्ट्रीय दिशा निर्देशों का पालन पशुओं के संरक्षण और यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान एसोसिएशन के महासंघ के दिशा-निर्देश के लिए यूरोपीय संघ के निर्देशों।

1. समाधान की तैयारी

  1. स्टैंडर्ड कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF, 1 टेबल)
    1. उच्च शुद्धता लवण 38 और साफ कांच बीकर पहले डबल आसुत जल के साथ rinsed का प्रयोग एक ताजा समाधान तैयार करने के लिए। सभी अतिरिक्त और intracellular समाधान की तैयारी के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डबल आसुत जल का प्रयोग करें।
    2. 500 मिलीलीटर पानी और दूसरे में 3 NaHCO भंग करने के आदेश 1 टेबल के अनुसार द्विसंयोजक आयनों 39 की वर्षा को रोकने के लिए अन्य लवण भंग करने के लिए एक 2 एल बीकर लो। डबल आसुत जल के साथ व्यवस्थित ढंग से रंग साफ और नमक लेने से पहले इसे सूखा । dissolutio homogenize करने के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक का प्रयोग करेंएन। दोनों बीकर से समाधान के लिए एक उपयुक्त बड़ा फ्लास्क में जोड़ें और उचित मात्रा में लाना।
    3. सुनिश्चित करें कि अंतिम कोशिकी समाधान पूरी तरह से पारदर्शी और वर्षा के बिना किसी भी ट्रेस है।
    4. स्लाइस 38,40 perfusing से पहले 30 मिनट - एक गैस एक गिलास Microfilter मोमबत्ती (Ø 13 मिमी) 20 के साथ 95% 2 हे और 5% सीओ 2 (carbogen गैस) से बना मिश्रण लागू करें। (: 314 - 325 mOsmol / एल इष्टतम रेंज) एक osmometer साथ ACSF की - (3 लगातार माप 2) ध्यान से परासारिता नियंत्रित करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयारी के बाद शेष समाधान स्टोर और 3 दिन के भीतर यह प्रयोग करें।
  2. काटना समाधान (सूक्रोज-ACSF; तालिका 2) 5,13
    1. ताजा समाधान के 3 एल तैयार करें। 1 एल का प्रयोग एक जानवर से मस्तिष्क स्लाइस तैयार करने के लिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष समाधान स्टोर और 3 दिन के भीतर यह प्रयोग करें।
      नोट: उच्च 2 मिलीग्राम + और कम सीए 2 सांद्रता डी करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंecrease synaptic प्रसारण और सुक्रोज के साथ कुछ NaCl के प्रतिस्थापन ऊतक 5,40 संरक्षित करने के लिए।
  3. intracellular समाधान
    1. अग्रिम में दोहरी पूरे सेल रिकॉर्डिंग (3 टेबल) के लिए 100 एमएल समाधान तैयार है।
    2. सेल आकृति विज्ञान की अच्छी वसूली प्राप्त करने के लिए methylsulfate 13,15,21 को शामिल करें। (- 0.4% 0.1) बाद में न्यूरॉन की आकृति विज्ञान की जांच के लिए biocytin जोड़ें। एक फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे, एलेक्सा 594 या 101 Sulforhodamine 41) रिकॉर्डिंग (वैकल्पिक) के दौरान डेन्ड्राइट के विस्तार का पालन करने के लिए शामिल करें।
    3. अग्रिम में सेल संलग्न रिकॉर्डिंग (तालिका 4) के लिए 100 एमएल इलेक्ट्रोड समाधान तैयार है। इस मामले में आंतरिक समाधान के लिए एक उच्च-कश्मीर + स्थूल hyperpolarization सक्रिय केशन वर्तमान (मैं ज) को अलग-थलग करने के लिए डिजाइन समाधान है और अन्य वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल के लिए ब्लॉकर्स शामिल हैं।
    4. स्टोर इंट्रा-20 डिग्री सेल्सियस पर 2 एमएल aliquots में सेलुलर समाधान। हर नई रिकॉर्डिंग सत्र के लिए एक नई विभाज्य का प्रयोग करें। ध्यान से एक osmometer के साथ हर thawed विभाज्य की परासारिता की जाँच करें। यदि परासारिता प्रारंभिक मूल्य के अनुरूप नहीं है एक नया विभाज्य ले लो।
    5. शीर्ष जिनमें से एक 0.22 माइक्रोन बाँझ सिरिंज फिल्टर रखा गया है पर एक 3 मिलीलीटर सिरिंज में विभाज्य से समाधान स्थानांतरण। रिकॉर्डिंग सत्र के दौरान बर्फ पर सिरिंज रखें इसकी यौगिकों (एटीपी, जीटीपी या phosphocreatine) की गिरावट को सीमित करना।

2. निर्माण और पैच पिपेट की भराई

  1. खींचना
    1. एक क्षैतिज इलेक्ट्रोड खींचने और मोटी दीवारों borosilicate ग्लास ट्यूबिंग का प्रयोग करें। पूरे सेल और सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए, एक 2 मिमी बाहरी व्यास / 1 मिमी भीतरी व्यास का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि ग्लास टयूबिंग बिल्कुल साफ 38 है।
    2. यदि यह मामला नहीं है, एक कार्बनिक विलायक में कांच केशिकाओं विसर्जित (जैसे, इथेनॉल) पहली और फिर डबल आसुत जल में। संक्षेप में एक लेम्प बर्नर के साथ केशिका अंत गर्मी। वैकल्पिक रूप से, क्रम में ग्लास टयूबिंग धोया और निर्माता से सीधे गर्म किया (सामग्री की सूची देखें)।
    3. दोहरी somatodendritic रिकॉर्डिंग के लिए, यह सुनिश्चित 6 और 10 MΩ के बीच 6,11 और 8 और 19 जब intracellular समाधान (3 टेबल) के साथ भरा वृक्ष के समान pipettes के लिए MΩ के बीच दैहिक पिपेट प्रतिरोध है। 10 MΩ की एक प्रतिरोध करने के लिए सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए पिपेट प्रतिरोध मानकीकरण न्यूरॉन 16,18,42,43 के somatodendritic डोमेन के साथ तुलनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए।
    4. पट्टी से पहले ताजा pipettes हर रिकॉर्डिंग सत्र से पहले (प्रति दिन) या तुरंत तैयार है और उन्हें 5 का उपयोग करें - उनके निर्माण 39 के बाद 8 घंटे। एक कवर ग्लास कंटेनर में स्टोर pipettes उन्हें धूल और टिप की बाधा से बचाने के लिए।
  2. चमकाने
    1. का निरीक्षण किया और heaटी-पोलिश एक microforge के साथ हर विंदुक टिप झिल्ली के साथ बेहतर जवानों प्राप्त करने के लिए। microforge उपयोग करने से पहले, प्लैटिनम हीटिंग रेशा पर कांच के एक छोटे से टुकड़े पिघला। भक्ति (पीटर जोनास, व्यक्तिगत संचार) के लिए दैनिक प्लैटिनम फिलामेंट पर इस गिलास कोटिंग बदलें।
      नोट: सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया pipettes गर्मी चमकाने कदम से पहले लेपित किया जा सकता पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए। कोटिंग ऐसी पिघला हुआ मोम दंत 22,44 या सिलिकॉन elastomer 39 के रूप में एक इन्सुलेट एजेंट के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

3. मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी

  1. 19 दिन की उम्र - 16 वर्ष की आयु के बीच स्वस्थ Wistar चूहों का प्रयोग करें। अस्वस्थ जानवरों या जानवरों हाइपोथर्मिया या निर्जलीकरण से पीड़ित का प्रयोग न करें। स्लाइस की तैयारी शुरू करने से पहले एक सुरक्षित और मूक जगह में जानवर रहते हैं। जबकि एक जानवर की तैयारी कर कमरे में किसी भी अन्य जानवर होने से बचें। जानवरों धीरे हेरफेर।
  2. दो 400 में सुक्रोज-ACSF डालोएमएल polypropylene (पीपी) बीकर और 45 मिनट के लिए सेल्सियस फ्रीजर में -80 उन्हें जगह है। समाधान मिश्रण एक समरूप बर्फ के ठंडे तरल / जमे हुए समाधान पाने के लिए और बर्फ पर बीकर जगह है। प्रत्येक पीपी बीकर में एक Microfilter मोमबत्ती (Ø 13 मिमी) का उपयोग carbogen गैस के साथ सुक्रोज-ACSF समाधान की आपूर्ति।
  3. स्लाइसर और रिजर्व कक्ष तैयार
    1. जितना संभव हो उतना स्लाइस की ऊपरी परत को नुकसान को कम करने के लिए बेहद कम ऊर्ध्वाधर कंपन 5,38 के साथ एक उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक स्लाइसर का प्रयोग करें। स्लाइसर पर एक ताजा और पूरे धार को ठीक करें।
    2. प्रत्येक काटने सत्र के लिए एक नई धार का प्रयोग करें। धार के झुकने से बचें। धार (जोसेफ Bischofberger, व्यक्तिगत संचार) की सतह पर फैटी फिल्म न निकालें।
    3. यदि उपलब्ध है, निर्माता द्वारा उपलब्ध कराई गई एक vibroprobe के साथ खड़ी कंपन की जाँच करें। वैकल्पिक रूप से, एक कस्टम बनाया vibroprobe 5 का उपयोग करें। ब्लेड रों के ऊर्ध्वाधर कंपन को कमओ के रूप में संभव के रूप में 0 माइक्रोन के करीब होने के लिए।
    4. के रूप में पी पर दर्शाया स्लाइस के लिए एक 150 एमएल रिजर्व चैम्बर 45,46 तैयार करें। रेफरी में 201। 39। रिजर्व कक्ष में मानक ACSF डालो और एक पानी के स्नान में जगह है। carbogen एक Microfilter मोमबत्ती (O 6 मिमी) का उपयोग कर के साथ रिजर्व चैम्बर समाधान की आपूर्ति। सुनिश्चित करें कि carbogen बुलबुले के रूप में संभव के रूप में छोटे हैं।
      नोट: एक नया आरक्षित कक्ष का निर्माण हर 2 - 3 महीने टुकड़ा गुणवत्ता स्थिर रखने के लिए।
  4. कट स्लाइस
    1. एक मूक कमरे में जो प्रयोगकर्ता परेशान या जोर नहीं है, गर्भाशय ग्रीवा मज्जा के स्तर पर सर्जरी कैंची (लंबाई 150 मिमी) के साथ पशु सिर काटना।
    2. एक छुरी के साथ दुम दिशा को नाक में पशु के सिर के शीर्ष पर त्वचा में कटौती और यह पहलू के बल को हटा दें। ठीक कैंची के साथ सिर के नाक भाग को दुम से खोपड़ी के शीर्ष कटौती और पार्श्व खोपड़ी के दोनों भागों को हटा दें। ख हटायेएक पतली रंग के साथ बारिश और इसे ध्यान से ड्रॉप ठंडा युक्त एक पीपी बीकर में (0 - 4 डिग्री सेल्सियस) सुक्रोज-ACSF carbogen 38 के साथ equilibrated।
      नोट: कदम का यह क्रम के रूप में जल्दी संभव के रूप में किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी सावधानी (<< 1 मिनट, मोटे तौर पर 40 S)।
    3. ~ 2 से 5 मिनट के लिए पीपी बीकर के समाधान में मस्तिष्क रखें। मस्तिष्क के आंदोलनों से बचने के लिए carbogen दबाव को समायोजित करें। यदि carbogen बुलबुले एक ताजा एक साथ बहुत बड़ी हैं Microfilter मोमबत्ती बदलें।
    4. एक 9 सेमी पेट्री डिश में जो अंदर नीचे एक ~ 0.5 सेमी मोटी परत Sylgard 38 के साथ कवर किया जाता है पर मस्तिष्क रखें। अग्रिम में इस पेट्री डिश तैयार करें।
    5. ठंडा सुक्रोज-ACSF के साथ मस्तिष्क को चारों ओर। सुनिश्चित करें कि ACSF-सूक्रोज समाधान के कुछ तरल चरण मस्तिष्क submerges। राज्याभिषेक स्लाइस के लिए, एक छुरी या एक धार के साथ राज्याभिषेक विमान में मस्तिष्क के ललाट हिस्सा काट दिया। एक राज्याभिषेक कटौती के साथ सेरिबैलम निकालें।
    6. cyano लागू करेंनमूना ट्रे पर acrylate गोंद (क्षेत्र ~ 1 2 सेमी)। मस्तिष्क ब्लॉक कि इस तरह के ललाट हिस्सा टुकड़ा करने की क्रिया चरण का सामना कर पेस्ट करें। ध्यान से एक गिलास पाश्चर विंदुक के बड़े खोलने का उपयोग कर चिपकाया मस्तिष्क के शीर्ष पर सुक्रोज-ACSF ड्रिप और बाद में धीरे-धीरे स्लाइसर के काटने के चैम्बर डूब। नमूना ट्रे पैंतरेबाजी इतना है कि काटने की सतह (यानी, पहले ऊतक ब्लेड हिट करने के लिए) मस्तिष्क 40 के उदर सतह है।
    7. एक bended कांच Microfilter मोमबत्ती (O 6 मिमी) काटने कक्ष (वैकल्पिक) के साथ carbogen लागू करें।
    8. क्षैतिज विमान 5 के संदर्भ में ~ 15 डिग्री के कोण पर धार को समायोजित करें। द्रव्य नाइग्रा तक पहुँचने से पहले नाक दिशा को दुम में ~ 500 माइक्रोन का राज्याभिषेक मस्तिष्क स्लाइस काटें। 350 माइक्रोन मोटी स्लाइस ब्याज के क्षेत्र से युक्त - मोटाई 300 में कटौती करने के घटाएँ।
    9. एक बहुत पतली छिड़काव करने के लिए संलग्न सुई के साथ ऊतक ब्लॉक से अलग स्लाइसधार के किनारे करने के लिए एक सिरिंज समानांतर। बेंड सुई के रूप में तो सुई और सिरिंज के बीच 90 डिग्री के कोण है। सुनिश्चित करें कि कोई दबाव नहीं है, जबकि ऊतक ब्लॉक से टुकड़ा हटाने धार के लिए आवेदन किया है।
  5. स्टोर स्लाइस
    1. रिजर्व कक्ष में एक गिलास पाश्चर विंदुक का सबसे बड़ा खोलने (एक बल्ब से जुड़ी) का उपयोग कर स्लाइस स्थानांतरण। 1 घंटे - एक बार सभी स्लाइस रिजर्व कक्ष (क्रिस्टोफ श्मिट-Hieber, व्यक्तिगत संचार) में स्थानांतरित कर रहे हैं 0.5 के लिए 34 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी के स्नान के तापमान को लाने के लिए।
    2. इस अवधि के बाद पानी से स्नान बंद कर और कमरे के तापमान पर स्लाइस रख। आदेश रिजर्व कक्ष में स्लाइस के आंदोलनों से बचने के लिए carbogen दबाव को समायोजित करें। रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले एक और 10 से 20 मिनट के लिए स्लाइस रखें।
    3. SLI के अंत में डबल आसुत जल के साथ सावधानी से अभी तक अच्छी तरह से उपकरण और Microfilter मोमबत्ती साफप्रक्रिया cing।

Nigral न्यूरॉन्स और Biocytin फाइलिंग में 4. दोहरी दैहिक और Somatodendric रिकॉर्डिंग

  1. एक्जॉन गाइड में और Refs में दिए गए स्लाइस के लिए एक पैच दबाना सेटअप की विधानसभा के लिए विवरण का पालन करें। 39,40,47। पट्टी की और अधिक बुनियादी पहलुओं के विषय में जानकारी रेफरी में हैं। 48।
  2. रिकॉर्डिंग कक्ष तैयार
    1. रिकॉर्डिंग कक्ष में 2 एमएल डबल आसुत जल - 1 जगह। सत्यापित करें कि यह टपका हुआ नहीं है। स्थानांतरण XY मेज पर रिकॉर्डिंग चैम्बर रखें।
    2. एक ऑक्सीजन अभेद्य छिड़काव ट्यूबिंग प्रणाली (polytetrafluoroethylene) रिकार्डिंग कक्ष के माध्यम से मानक ACSF फ़ीड। 5 एमएल मिनट -1 - 4 की दर से छिड़काव कक्ष में प्रवाह स्थिर। संभव है (1 मीटर) के रूप में के रूप में कम ट्यूबिंग ACSF युक्त बीकर में शामिल होने की लंबाई और रिकॉर्डिंग कक्ष रखें।
    3. रिजर्व कक्ष से एक मस्तिष्क टुकड़ा चयन करें और इसे में स्थानांतरितरिकॉर्डिंग कक्ष एक गिलास पाश्चर विंदुक का सबसे बड़ा खोलने का उपयोग। एक प्लेटिनम की अंगूठी के साथ टुकड़ा कवर रिकार्डिंग कक्ष के तल पर यह लंगर के रूप में पी पर दर्शाया। रेफरी में 201। 39। एक फ्लैट प्लेटिनम की अंगूठी (Ø 1.5 सेमी) का उपयोग करें और उस पर समानांतर नायलॉन के धागे (रिक्ति> 2 मिमी) गोंद।
  3. समायोजित करें और प्रकाशिकी अनुकूलन
    1. अवरक्त (आईआर) वीडियो माइक्रोस्कोपी 4,47,49,50 का उपयोग स्लाइस कल्पना। कोहलर रोशनी 51 को समायोजित करें और अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) 51 प्रकाशिकी या परोक्ष रोशनी (Dodt ढाल विपरीत - क्लब) का अनुकूलन 52,53। इस प्रक्रिया के बारे में अधिक विस्तार से Refs में दिए गए हैं। 40,49।
    2. टुकड़ा की गुणवत्ता की जाँच करें। केवल चिकनी और यहां तक ​​कि सतहों भी जोरदार विषम नहीं हैं और केवल छोटे, छितरी हुई खड्ड के साथ स्लाइस रख।
    3. intracellular समाधान के साथ 2 ताजा और अप्रयुक्त पैच pipettes भरें (
  4. टुकड़ा की सतह से ऊपर pipettes स्थिति
    1. चांदी के तारों पर क्लोराइड कोटिंग की उपस्थिति की जांच (स्नान संदर्भ इलेक्ट्रोड और पैच इलेक्ट्रोड;। जानकारी के लिए, एक्जॉन गाइड और Refs 39,54 देखें)।
    2. पिपेट धारकों में pipettes क्रमिक रूप से डालें और सकारात्मक दबाव (~ 70 मिलीबार) लागू पिपेट धारक, एक तीन तरह के नल और एक दबाव नापने का यंत्र 40 को जोड़ने के लिए एक ट्यूबिंग सर्किट का उपयोग कर। रिकार्डिंग कक्ष के स्नान में पिपेट कम करें।
    3. जाँच करें कि दबाव नापने का यंत्र पर दबाव मूल्य ~ 1 के लिए स्थिर है - 2 मिनट। दबाव कम हो रही है, तो ट्यूबिंग या पिपेट धारक के अंदर सील O- अंगूठी की जाँच करें।
    4. वीडियो मॉनीटर के बीच में पिपेट टिप प्लेस और यह सुनिश्चित करना है कि यह बाधित नहीं है। सुनिश्चित करें कि विंदुक टिप जब आवेदन या पिपेट करने के लिए दबाव जारी कदम नहीं करता है।
    5. वास्तव में विंदुक टिप की स्थिति पर नजर रखने के केंद्र में एक छोटे पार ड्राइंग द्वारा बहाव और विंदुक टिप के कंपन के लिए जाँच करें और टिप के 5 मिनट के लिए संभव के आंदोलनों के लिए निरीक्षण करते हैं।
    6. एक वोल्टेज कदम (5 एम वी) एक आस्टसीलस्कप पर पिपेट प्रतिरोध पर नजर रखने के लिए लागू करें। 0 एम वी पैच दबाना एम्पलीफायर की होल्डिंग क्षमता निर्धारित करें। रद्द पिपेट संभावित ऑफसेट ऐसी है कि डीसी पिपेट वर्तमान एम्पलीफायर मीटर 39,51 पर शून्य पढ़ता है।
    7. टुकड़ा करने के लिए नीचे pipettes ले जाएँ और सतह से ऊपर उन्हें बनाए रखना।
  5. का चयन करें और लंबे डेन्ड्राइट के साथ एक न्यूरॉन पैच
    1. द्रव्य नाइग्रा भीतर लंबी डेन्ड्राइट कि लगभग एक ही पी एल में एक लंबी दूरी पर पीछा किया जा सकता है के साथ एक स्वस्थ न्यूरॉन का चयनane (चित्रा 1 ए और 1 बी) का उपयोग आईआर Dodt ढाल कंट्रास्ट (आईआर क्लब)। एक चिकनी और सजातीय सेल शरीर को चुनें। , टुकड़ा (चित्रा 1 सी और 1 डी) की सतह पर दो जोरदार विषम कोशिकाओं से बचें क्योंकि उस में तोड़ने के लिए और समय के साथ स्थिर रिकॉर्डिंग की स्थिति (स्थिर श्रृंखला प्रतिरोध) को बनाए रखने के लिए मुश्किल है। टुकड़ा सतह के नीचे 30 माइक्रोन - न्यूरॉन्स है कि उनके सोमा 10 का चयन करें।
    2. (- दूर 50 माइक्रोन 40) और एक ही दूरी पर डेन्ड्राइट के लिए वृक्ष के समान इलेक्ट्रोड बंद सोमा के करीब दैहिक इलेक्ट्रोड ले जाएँ। चयन करें और एक डेन्ड्राइट के एक हिस्से को पैच करने के लिए एक 2X बढ़ाई (चौगुना परिवर्तक) का प्रयोग करें। एक 2X बढ़ाई साथ निगरानी के बिना बढ़ाई (1X) 2,100X का एक निरपेक्ष बढ़ाई और 5,500X की पर प्राप्त करते हैं।
    3. थोड़ा 10 मिलीबार से दैहिक पिपेट का दबाव जारी है। यदि आवश्यक हो, ग के विस्थापन से बचने के लिए वृक्ष के समान है और दैहिक पिपेट दबाव को विनियमितपक्ष संरचना (सोमा और डेन्ड्राइट) टुकड़ा के भीतर।
    4. आदेश में एक छोटा सा प्रगर्तन देखने के लिए झिल्ली के करीब वृक्ष के समान पिपेट स्थिति। पिपेट नोक पर दबाव जारी है और डेन्ड्राइट पैच पिपेट प्रतिरोध को नियंत्रित करते हैं। आदर्श परिस्थितियों में, केवल एक बहुत ही मामूली सक्शन एक अच्छा मुहर प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है।
    5. सेल संलग्न मोड में वृक्ष के समान पिपेट रखें। दैहिक झिल्ली को दैहिक पिपेट करीब ले जाएँ और दैहिक झिल्ली पैच। सुनिश्चित करें कि एक उच्च मुहर प्रतिरोध कोशिका झिल्ली (> 1 GΩ) 39 फटने से पहले प्राप्त की है। थोड़ा सेल शरीर और डेन्ड्राइट के विरूपण से बचने के लिए माइक्रोन के एक दंपति द्वारा झिल्ली से दूर दोनों pipettes वापस लेना।
    6. दोनों pipettes के लिए, जितना संभव हो उतना उच्च लाभ और थोड़ा छानने 51 और आस्टसीलस्कप के साथ एक वोल्टेज नाड़ी का उपयोग कर मौजूदा कदम के शीर्ष पर पिपेट समाई यात्रियों के आयाम को कम। पूरे सेल मोड वाई में दर्ज करेंवें वृक्ष के समान पिपेट और बाद में दैहिक विंदुक के साथ।
    7. पूरे सेल समाई यात्रियों को खत्म करने और श्रृंखला प्रतिरोध के लिए क्षतिपूर्ति। मॉनिटर और की शुरुआत में उपयोग प्रतिरोध के दस्तावेज, और नियमित रूप दौरान, प्रयोग। श्रृंखला प्रतिरोध बहुत अधिक है (> 50 MΩ), एक और विंदुक के साथ फिर से प्रयास।
    8. आईआर क्लब उच्च और निम्न आवर्धन पर एक वीडियो ग्राफिक प्रिंटर 25, एक फ्रेम धरनेवाला या एक डिजिटल कैमरा के साथ तस्वीरें (चित्रा 1 ए और 1 बी) ले लीजिए।
      नोट: रिकॉर्डिंग के दौरान न्यूरॉन्स की सूजन (चित्रा 1E और 1F) कई मायनों में मनाया जाता है, लेकिन शायद ही कभी जब परासारिता और समाधान के पीएच सही ढंग से 39 निकाला जाता है।
    9. एक ही प्रक्रिया (2A चित्रा) के साथ - (सोमा सोमा) डबल दैहिक पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्राप्त करते हैं।
  6. लंबे समय (एमएस के कई सैकड़ों) क्रमिक रूप से वर्तमान कदम depolarizing बढ़ती लागू करेंदैहिक और वृक्ष के समान विंदुक के साथ प्राधिकृत व्यक्तियों (आंकड़े 2 बी, 3 सी और 3 डी) पैदा करने के लिए। वृक्ष के समान है और दैहिक पिपेट एक साथ में जिसके परिणामस्वरूप संभावित रिकॉर्ड।
  7. डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में (aEPSPs) कृत्रिम उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षमता के प्रचार-प्रसार का परीक्षण करें
    1. एक उत्तेजक पोस्टअन्तर्ग्रथनी वर्तमान (EPSC) तरंग दोहरी वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग (आंकड़े -4 ए और 4 बी) के दौरान एक वर्तमान आदेश के रूप में इंजेक्षन करने के लिए बनाएँ। ऐसा करने के लिए ब्याज की 55 न्यूरॉन में EPSCs के लिए मापा वास्तविक मूल्यों को इसी आयाम और समय के पाठ्यक्रम के मूल्यों के साथ एक डबल घातीय समारोह का निर्माण। ध्यान से मूल समय पाठ्यक्रम को संरक्षित करने के लिए निर्माण EPSC की और इंजेक्शन EPSC तरंग का नमूना दरों नियंत्रित करते हैं।
      नोट: कोई वास्तविक न्यूरॉन में तरंग आवेदन करने से पहले, एक मॉडल सेल का उपयोग कर यह परीक्षण।
    2. क्रमिक रूप से वृक्ष के समान के माध्यम से तरंग इंजेक्षन औरदैहिक पिपेट और रिकार्ड दोनों दैहिक और वृक्ष के समान pipettes समन्वित के लिए क्षमता है, जिसके परिणामस्वरूप। pipettes के लिए संभव बहाव के लिए नियमित रूप से जाँच करें।
  8. एक न्यूरॉन से रिकॉर्डिंग समाप्त
    1. टुकड़ा और इलेक्ट्रोड के भीतर न्यूरॉन की स्थिति दस्तावेज़ करने के लिए: (5x या 10x उद्देश्य) एक कम बढ़ाई एक आईआर क्लब तस्वीर ले लो।
    2. और धीरे धीरे दोनों pipettes के साथ बाहर-बाहर पैच के लिए फार्म में वृक्ष के समान और neuronal झिल्ली क्रमिक रूप से दैहिक pipettes वापस ले लें। पिपेट पार्श्व-ऊपर की ओर आंदोलनों 38 के एक दृश्य का उपयोग कर निकालें। ये पहली बार में कम किया जाना चाहिए और फिर धीरे-धीरे लंबाई में वृद्धि हुई है। यह रिकॉर्डिंग विन्यास कोशिका झिल्ली के समुचित समापन पक्ष में है।
    3. कैपेसिटिव धाराओं के वोल्टेज दबाना में 5 एम वी वोल्टेज नाड़ी के जवाब में कमी (उपयोग प्रतिरोध में वृद्धि) मॉनिटर जबकि पिपेट वापस लेने।
    4. एक बार झिल्ली समुद्र हैविंदुक टिप के आसपास के नेतृत्व में, यह रिकार्डिंग कक्ष के बाहर पूरी तरह से लेते हैं। स्नान से उद्देश्य निकालें। 15 के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा रखें - मानक ACSF में 20 मिनट (intracellular समाधान से) दर्ज न्यूरॉन में biocytin के संतुलन की अनुमति है।
    5. धीरे से एक 25 एमएल चौड़े मुंह एम्बर (ब्राउन) कांच मानक ACSF युक्त बोतल में एक पाश्चर विंदुक के बड़े खोलने का उपयोग टुकड़ा हस्तांतरण। एक टोपी के साथ बोतल बंद करें। नियतन कदम के लिए पैरा 6 देखें।

5. सेल संलग्न रिकॉर्डिंग

  1. एक डेन्ड्राइट एक ही विमान में एक लंबी दूरी पर विस्तार के साथ एक न्यूरॉन का चयन करें। सुनिश्चित करें कि ब्याज की डेन्ड्राइट एक अच्छी तरह से परिभाषित सोमा के लिए पीछा किया जा सकता है।
  2. इलेक्ट्रोड समाधान (तालिका 4) के साथ पैच पिपेट भरें। अन्य आयन चा ब्लॉक करने के लिए विशिष्ट औषधीय एजेंटों सहित द्वारा सेल संलग्न विन्यास में ब्याज की मौजूदा रिकॉर्ड करने के लिए समाधान डिजाइनnnels।
  3. सेल संलग्न मोड में डेन्ड्राइट पैच
    1. डेन्ड्राइट के एक हिस्से को कल्पना और जोड़तोड़ का उपयोग recoding पिपेट दृष्टिकोण। (- 80 मिलीबार 70) डेन्ड्राइट के विस्थापन से बचने के लिए दबाव नापने का यंत्र की जाँच करके पिपेट नोक पर दबाव को अपनाना। 4.5.4 में वर्णित के रूप डेन्ड्राइट पैच।
    2. कुछ आईआर क्लब चित्र (चित्रा 5 ए) रिकॉर्ड। 10 GΩ सेल संलग्न रिकॉर्डिंग 18 (चित्रा 5 ब) के लिए - संभव (> 1 GΩ 39) के रूप में बड़े रूप में एक सील प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए, सबसे अच्छा में 3 के बीच की कोशिश करें। माइक्रोन के एक दंपति द्वारा झिल्ली से दूर पिपेट वापस लेना डेन्ड्राइट के विरूपण से बचने के लिए।
    3. nigral न्यूरॉन्स की सहज कार्रवाई क्षमता को दर्शाती सेल संलग्न मोड में कार्रवाई धाराओं का निरीक्षण करें। सीए 2 और ना + चैनल ब्लॉकर्स (CdCl 2 और TTX, क्रमशः) के साथ ACSF अनुपूरक कार्रवाई धाराओं को दबाने के लिए।
    4. लागू करें एक 2 svपैच पैदा करने के लिए मैं ज (चित्रा 5C) 0 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता से -90 एम वी के oltage कदम है। ध्यान रखें कि पिपेट क्षमता और आराम झिल्ली संभावित सेल संलग्न विन्यास 56 में श्रृंखला में हैं। अधिक जानकारी के लिए, एक्जॉन गाइड और रेफरी। 39 देखें।
    5. पिपेट के संभावित बहाव के लिए नियमित रूप से जाँच करें।
    6. रिकॉर्डिंग के अंत में, पूरे सेल मोड में जाने के लिए और तुरंत झिल्ली क्षमता की एक readout लेने के लिए पैच टूटना। वर्गों 4.8.2 और 4.8.3 में वर्णित के रूप में एक के बाहर-बाहर पैच प्राप्त करने के लिए पिपेट वापस लेना।
  4. पूरे सेल मोड में इसी सोमा से रिकॉर्ड
    1. डेन्ड्राइट साथ देखो और इसी सोमा का पता लगाने। (- 10 MΩ 5) 6,14,57 एक + K आधारित intracellular समाधान (3 टेबल) के साथ भरा एक उच्च प्रतिरोध पिपेट का प्रयोग करें। के लिए एक संक्षिप्त सक्शन (नकारात्मक दबाव) लागू करेंविंदुक टिप आदेश पूरे सेल मोड में प्रवेश करने के लिए झिल्ली टूटना करने के लिए।
    2. लंबे अति लागू करने और मौजूदा कदम depolarizing (चित्रा 5 डी) द्वारा वर्तमान दबाना में न्यूरॉन की पहचान के लिए जाँच करें और biocytin dendrites साथ फैलाना अनुमति देते हैं। एपी समय पाठ्यक्रम कल्पना करने के लिए कम depolarizing वर्तमान कदम को लागू करें।
    3. 4.8.3 - ≤10 मिनट के बाद, वर्गों 4.8.2 में वर्णित के रूप में एक के बाहर-बाहर पैच प्राप्त करने के लिए पिपेट वापस ले लें। धीरे से एक 25 एमएल एम्बर कांच मानक ACSF युक्त बोतल में एक पाश्चर विंदुक के बड़े खोलने का उपयोग टुकड़ा हस्तांतरण। एक टोपी के साथ बोतल बंद करें।
    4. वैकल्पिक रूप से, पहले भी एक फ्लोरोसेंट डाई युक्त एक पिपेट समाधान के साथ एक दैहिक पूरे सेल प्राप्त करते हैं। डाई के प्रसार की अनुमति दें और एक डेन्ड्राइट 26 के एक हिस्से का चयन करें। एक दूसरे विंदुक के साथ, सेल संलग्न मोड में डेन्ड्राइट पैच। एक confocal खुर्दबीन का प्रयोग करें अगर fluorescently लेबल के दृश्य में सुधार करने के लिए उपलब्धएड 14,22 डेन्ड्राइट।
    5. सेल संलग्न रिकॉर्डिंग 10,22 करने के लिए, बाहर-बाहर विन्यास में वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग प्रदर्शन वैकल्पिक रूप से या इसके अतिरिक्त। एक वोल्टेज-गेटेड धाराओं चित्रा 5E और 5F में एक के बाहर-बाहर पैच से दर्ज का एक उदाहरण देखें।

6. Nigral न्यूरॉन्स की लेबलिंग Biocytin

  1. ऊतक का निर्धारण
    1. यदि संभव हो तो, टुकड़ा रिकॉर्डिंग / histochemical प्रसंस्करण 38 के लिए अलग कमरे का उपयोग करें।
    2. ACSF पाश्चर विंदुक के साथ (पीबीएस, पीएच = 7.4) 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा में 4% paraformaldehyde के साथ जगह से स्लाइस को ठीक करें। हमेशा हौसले लगानेवाला समाधान (<< 1 सप्ताह पुराने) तैयार का उपयोग करें।
      चेतावनी: उचित हाथ के दस्ताने का प्रयोग करें और एक रासायनिक हुड एक ऊतक विज्ञान प्रयोगशाला में रखा गया इसकी विषाक्तता की वजह से paraformaldehyde हेरफेर करने के लिए। उपयोग और सी से पहले इस खतरनाक उत्पाद की सुरक्षा डाटा शीट पढ़ेंबिल्ली इस पाउडर के रूप में नियमों के विषय में रासायनिक सुरक्षा (खतरनाक पदार्थों निर्देशक (67/548 / ईईसी) यूरोपीय संघ आयोग से) कैंसर के लिए प्रेरित करने के लिए सोचा है। अन्य विवरण रेफरी में हैं। 58।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस रात भर स्लाइस रखें। पैच दबाना सेटअप या paraformaldehyde द्वारा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए प्रयोग किया जाता है किसी भी उपकरण के संक्रमण से बचने।
    4. निर्धारण के बाद, पीबीएस के साथ लगानेवाला समाधान की जगह। लगानेवाला समाधान को हटाने और पीबीएस को लागू करने के लिए एक अलग पाश्चर pipettes का प्रयोग करें। (- 2 सप्ताह 1) 4 डिग्री सेल्सियस आगे की प्रक्रिया से पहले कम से पीबीएस में स्टोर स्लाइस। इस मामले में, पीबीएस सप्ताह में दो बार की जगह। हमेशा हौसले से तैयार पीबीएस (<< 1 सप्ताह पुराने) का प्रयोग करें।
  2. ऊतक का धुंधला
    1. धुंधला कदम के लिए एक 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली तैयार करें। स्लाइस हस्तांतरण करने के लिए स्वच्छ उपकरण का प्रयोग करें। ताजा पीबीएस का उपयोग स्लाइस कुल्ला 3 एक्स 5 मिनट।
    2. Fluorescein Avidin DCS (Avidin डी, सेल सॉर्टर ग्रेड लागू करें; 1 μL fluorescein / एमएल ट्राइटन X-100) और 0.3% ट्राइटन पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस रात भर X-100। धुंधला भर में प्रकाश से स्लाइस को सुरक्षित रखें। एक विकल्प के प्रकाश के लिए 3,3'-diaminobenzidine के माध्यम से प्रतिदीप्ति, लेबल न्यूरॉन्स या सूक्ष्म विश्लेषण 21,58 इलेक्ट्रॉन के रूप में।
      चेतावनी: ट्राइटन X-100 खतरनाक है। इस पदार्थ उपयोग करने से पहले सुरक्षा डाटा शीट और यूरोपीय संघ आयोग के निर्देश पढ़ें।
    3. पीबीएस के साथ 3 एक्स 30 मिनट कुल्ला और बाद में पंजाब के साथ (फॉस्फेट बफर, टुकड़ा की सतह पर क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए)।
  3. मानक गिलास स्लाइड पर स्लाइस माउंट। एक embedding माध्यम के साथ सावधानी से स्लाइस को कवर किया। embedding माध्यम में हवा के बुलबुले से बचें। आदेश में पूरी तरह से टुकड़ा को कवर करने में धीरे coverslip रखो। स्लाइड उन्हें एक माइक्रोस्कोप के साथ visualizing से पहले रात भर हवा शुष्क।
  4. दृश्य के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर लेबल स्लाइस स्टोर। Histochemical प्रक्रियाओं पर उपयोगी चाल Refs में हैं। 58,59।
  5. ऊतक विज्ञान और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए अलग से इस्तेमाल उपकरणों को साफ करें। एक साथ ऊतक विज्ञान और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उपकरण मिश्रण नहीं है।

Biocytin से भरे न्यूरॉन्स की 7. पोस्ट अस्थायी दृश्य

  1. बरामद न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए एक confocal खुर्दबीन का प्रयोग करें।
    1. मोटे तौर पर epifluorescence के साथ टुकड़ा में fluorescently लेबल न्यूरॉन का पता लगाने। न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान कुंज की जांच करने और अक्षतंतु और axonal छाला का पता लगाने (2 - 4 माइक्रोन ओ) एक 10x या 20x उद्देश्य का उपयोग। अक्षतंतु के पाठ्यक्रम दस्तावेज़।
    2. confocal खुर्दबीन के लिए स्विच और fluorescein लेबल न्यूरॉन में निहित उत्तेजित करने के लिए 488 एनएम लेजर डायोड का चयन करें। अक्षतंतु और जेड अक्ष में dendrites के विस्तार का पालन करें।
    3. आदेश पूरे सेल के लिए एक z ढेर प्राप्त करने के लिए लगातार छवियों रिकॉर्ड। 1 माइक्रोन - 0.5 से Z अक्ष (लगातार छवियों के बीच दूरी) के संकल्प को समायोजित करें। एक सेल usin के confocal छवियों को ले लीजिएछ कम (10X उद्देश्य) और उच्च (60x उद्देश्य, तेल विसर्जन) बढ़ाई।
    4. न्यूरॉन एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर (ImageJ) 60 के साथ confocal खुर्दबीन के साथ प्राप्त की छवि फ़ाइल खोलें। एक आईआर क्लब छवि के साथ जेड प्रक्षेपण छवि की तुलना आंखों से electrophysiological रिकॉर्डिंग (आंकड़े 1, 2 ए, 3 ए, 4 ए, 5 ए और 5E) के दौरान पैच pipettes की सटीक स्थिति का पता लगाने के लिए।
    5. निर्धारित बनाने के लिए लेबल न्यूरॉन्स की morphometries: अक्षतंतु उपाय - सोमा दूरी, somatodendritic डोमेन के साथ और वृक्ष के समान पिपेट और अक्षतंतु ImageJ में "उपाय" समारोह का उपयोग कर के बीच रिकॉर्डिंग pipettes के बीच दूरी।
    6. NeuronJ (ImageJ), Imaris 29 या 61 Neuromantic के साथ कुछ न्यूरॉन्स पुनर्निर्माण किया।

8. Electrophysiological डेटा का विश्लेषण

  1. एम्पलीफायर के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग निहायत डेटा (जैसे, Clampfit) या सीधे एक विश्लेषण करने के लिएऐसे Stimfit, हमारे हाल ही में प्रकाशन के 13 में या उदाहरण के लिए WinWCP के रूप में एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर 62,63 के रूप में डेटा विश्लेषण के लिए अन्य सॉफ्टवेयर।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल वृक्ष के समान पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग डेटा के संग्रह की सुविधा के लिए करना चाहता है। इस तकनीक, पोस्ट अस्थायी ऊतकरसायनविज्ञान के साथ संयुक्त, मूल या डेन्ड्राइट में फैल कई विद्युत संकेतों के तंत्र में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए मदद करता है। पैच pipettes साथ डेन्ड्राइट के लिए सीधी पहुँच मुश्किल है, लेकिन कई methodological पहलुओं पर विशेष ध्यान रिकॉर्डिंग की सफलता की दर में सुधार होगा। एक प्रयोगकर्ता पर्याप्त रूप से स्थिर दैहिक रिकॉर्डिंग में अनुभव के प्रयास के अधिकांश पर उच्च प्रतिरोध (GΩ) के जवानों और पूरा प्रयोगों प्राप्त करने की उम्मीद कर सकते हैं। दो उच्च गुणवत्ता वाले वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग करने के लिए एक विच्छेदन प्रति एकत्र किया जा सकता है।

उच्च गुणवत्ता वाले मस्तिष्क स्वस्थ somata और dendrites युक्त स्लाइस की उपलब्धता ये ठीक संरचनाओं (चित्रा 1) तक पहुँचने के लिए एक शर्त है। criteriइन न्यूरॉन्स के चयन के लिए एक सभी सेल और एक सोमा और कम विपरीत के साथ डेन्ड्राइट जब इष्टतम समायोजित प्रकाशिकी के साथ मनाया पर एक चिकनी और सजातीय सतह रहे हैं (चित्रा 1 ए और 1 बी)। चयन न्यूरॉन्स भी दृढ़ता से आम तौर पर विषम अस्थिर रिकॉर्डिंग (चित्रा 1 सी और 1 सी) की ओर जाता है। इसलिए इस तरह के न्यूरॉन्स से बचा जाना चाहिए।

अन्य न्यूरॉन्स की तुलना में, nigral दा न्यूरॉन्स विशिष्ट रूपात्मक और electrophysiological विशेषताओं प्रदर्शित करते हैं। इन सुविधाओं को आम तौर पर एक एकल दैहिक पिपेट के साथ मूल्यांकन भी दोहरी दैहिक (चित्रा 2) और somatodendritic रिकॉर्डिंग (चित्रा 3) में मनाया जा सकता है। लांग hyperpolarizing वर्तमान इंजेक्शन एक झिल्ली क्षमता 'शिथिलता' कहा जाता है (आंकड़े 2 बी और 5 डी) परिहार प्रेरित। अक्षतंतु निकलती है, ज्यादातर मामलों में, एक वृक्ष के समान साइट पर के रूप में पहचानपूरक मानदंड 13,25,26 का उपयोग कर, यह दर्शाता है कि इन न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान डिब्बे विषम है (चित्रा 3 ए - 3 बी)। 13,25,26 - एक परिणाम के रूप में, डिब्बे में जहां एपी पहले मनाया जाता है, जिसमें डिब्बे अक्षतंतु उभर (3 डी चित्रा -3 सी) से मेल खाती है। अक्षतंतु आम तौर पर 64 टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान एक axonal अक्षतंतु की एक काटने की वजह से छाला द्वारा समाप्त होता है, लेकिन इस संरचना को व्यवस्थित नहीं पाया गया है।

स्पष्ट मैं ज के सक्रियण के लिए लगातार nigral दा न्यूरॉन्स में मनाया शिथिलता HCN सब यूनिटों के एक उच्च अभिव्यक्ति पता चलता है। Synaptic संकेतों के एकीकरण पर मैं ज के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, synaptic की तरह वर्तमान (EPSC) waveforms उत्पन्न होता है और somatodendritic दोहरी रिकॉर्डिंग (<55 के दौरान वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के माध्यम से इंजेक्ट किया गयाstrong> चित्रा 4)। इन नकली EPSCs के कैनेटीक्स वास्तविक सहज EPSCs के उदय और क्षय समय स्थिरांक पर आधारित थे। जिसके परिणामस्वरूप aEPSP दैहिक इलेक्ट्रोड के साथ दर्ज किया गया था। मैं ज अवरोधक ZD 7288 के स्नान आवेदन aEPSP की अवधि में वृद्धि हुई है, synaptic संकेतों (चित्रा 4 बी) के समय पाठ्यक्रम के लिए मैं ज के योगदान का संकेत है। ZD 7288 की पुष्टि भी झिल्ली क्षमता परिहार को समाप्त कर दिया है कि मैं ज के सक्रियण (चित्रा 4C) से शिथिलता का परिणाम है। नकली EPSPs के साथ प्राप्त परिणामों विद्युत पैदा की EPSPs 65 का उपयोग कर प्रयोगों के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है। डीए न्यूरॉन्स की somatodendritic डोमेन चैनल की सटीक वितरण मैप करने के लिए, सेल संलग्न रिकॉर्डिंग (चित्रा 5) लागू किया गया। एक उच्च प्रतिरोध मुहर (1 >> GΩ) सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए एक परम आवश्यकता (चित्रा 5 ब है मैं ज लंबे hyperpolarizing वोल्टेज कदम के साथ धीरे-धीरे सक्रिय हो जाता है और जैसा कि पहले 66 दिखाए वर्तमान स्थिर राज्य, एमएस (चित्रा 5C) के सैकड़ों के बाद उपलब्ध हो जाता है। इस अवलोकन इंगित करता है कि डीए न्यूरॉन्स की dendrites में व्यक्त HCN चैनलों पिरामिड न्यूरॉन्स या अन्य प्रकार की कोशिकाओं 10,16,66 में उन लोगों की तुलना में अलग-अलग यूनिटों की है। के रूप में चैनल के वितरण के वृक्ष के समान डिब्बे में nonhomogeneous हो सकता है और हो सकता है के रूप में वृक्ष के समान डिब्बे में ही विषम है, डेन्ड्राइट (अक्षतंतु असर या nonaxon असर डेन्ड्राइट) की पहचान confocal छवि के साथ आईआर क्लब की छवि की तुलना से पता चला है biocytin धुंधला (चित्रा 3 ए और बी) के बाद। सेल आकृति विज्ञान की वसूली इसलिए दोनों दोहरी somatodendritic रिकॉर्डिंग के लिए और बाद में दैहिक पूरे सेल रिकॉर्डिंग के माध्यम से सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक है।


चित्रा 1. Nigral डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की सोमा और प्रॉक्सिमल dendrites Visualizing इन्फ्रारेड videomicroscopy का उपयोग करना। (ए) आईआर क्लब सोमा और समीपस्थ डेन्ड्राइट और दोनों दैहिक और वृक्ष के समान pipettes दिखा एक nigral दा न्यूरॉन की छवि। एक दोहरी somatodendritic रिकॉर्डिंग सफलतापूर्वक इस स्वस्थ न्यूरॉन पर प्रदर्शन किया गया था। एक rougher और असमान सतह और एक मजबूत विपरीत के साथ कम विपरीत और सभी सेल की somatodendritic डोमेन पर चिकनी सतह का निरीक्षण करें। (बी) के एक स्वस्थ दा न्यूरॉन का एक और उदाहरण। (सी) दा न्यूरॉन। एक दोहरी रिकॉर्डिंग प्राप्त किया गया है, स्थिरता (डी) दोनों pipettes पर उपयोग प्रतिरोध के एक क्रमिक वृद्धि के कारण सबऑप्टिमल था, और रिकॉर्डिंग की अवधि कम था (~ 15 मिनट)। दिखा एक दा न्यूरॉन का दूसरा उदाहरण एक जोरदार विषम सोमा और समीपस्थ डेन्ड्राइट। इस मामले में, उपयोग प्रतिरोध की एक मजबूत वृद्धि पूरे सेल मोड में तोड़ने के बाद शीघ्र ही मनाया गया। नकारात्मक दबाव द्वारा उपयोग प्रतिरोध को कम करने का प्रयास असफल रहा था। पैनल सी और डी में न्यूरॉन्स टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है किया गया है और प्रयोगों के लिए बचा जाना चाहिए। (ई) रिकॉर्डिंग की शुरुआत में एक स्वस्थ दा न्यूरॉन में एक साथ डबल दैहिक रिकॉर्डिंग। (एफ) के साथ के रूप में पैनल ई में एक ही न्यूरॉन ~ 17 मिनट के बाद एक सूजन सेल शरीर। नोट विपरीत का पूरा अभाव, सोमा की गेंद की तरह दिखने और बड़े नाभिक जो स्वस्थ न्यूरॉन्स में स्पष्ट नहीं है की उपस्थिति। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2। एक दा न्यूरॉन से एक साथ डबल दैहिक रिकॉर्डिंग। (ए) आईआर क्लब एक डीए न्यूरॉन से डबल दैहिक रिकॉर्डिंग के दौरान छवि। (बी) hyperpolarizing और 1 लंबी वर्तमान इंजेक्शन depolarizing (-160 80 पीए करने, वेतन वृद्धि 80 PA) इसी वोल्टेज परिवर्तन दोनों पैच pipettes के साथ एक साथ दर्ज की गई। Depolarizing वर्तमान नाड़ी के दौरान लंबे hyperpolarizing मौजूदा कदम और एपी के बाद के बाद hyperpolarization बड़े के साथ वोल्टेज का पता लगाने में शिथिलता की उपस्थिति पर ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एक दा न्यूरॉन में दोहरी एस omatodendritic रिकॉर्डिंग। (ए) एक डीए न्यूरॉन के आईआर क्लब छवि। वृक्ष के समान है और सोमा के बीच की दूरीटिक पिपेट पैनल एक fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) संयुग्मित avidin के साथ लेबल में न्यूरॉन के 29 माइक्रोन। (बी) confocal जेड-प्रक्षेपण छवि है। न्यूरॉन रिकॉर्डिंग के दौरान biocytin से भर गया। अक्षतंतु सोम के रूप में तीर द्वारा संकेत के करीब एक समीपस्थ डेन्ड्राइट से जन्म लिया है। (सी) एक साथ दोहरी somatodendritic पूरे सेल वोल्टेज रिकॉर्डिंग पैनल ए सोमा (काला वोल्टेज निशान) और dendrite में दर्ज एपी में न्यूरॉन से (लाल वोल्टेज निशान) दैहिक (बाएं के माध्यम से एक 1 लंबी वर्तमान इंजेक्शन कदम के जवाब में, काले वर्तमान ट्रेस) और वैकल्पिक रूप से वृक्ष के समान पिपेट (सही, लाल वर्तमान ट्रेस) (डी) के दैहिक और वृक्ष के समान एपी का विस्तार समय के पैमाने पर दिखाया गया है।। या तो दैहिक या वृक्ष के समान वर्तमान इंजेक्शन के साथ, दैहिक ए.पी. (काला) वृक्ष के समान एपी (लाल) पहले। इस न्यूरॉन में ए पी एस के बीच में देरी 120 μs और दैहिक और वृक्ष के समान वर्तमान इंजेक्शन क्रमश: 210 μs था। देरीएपी के बढ़ते चरण के दौरान एपी आधा अधिक से अधिक आयाम पर मापा गया। एपी डिब्बे बंद अक्षतंतु उभर जो करने के लिए, पिछले टिप्पणियों की पुष्टि 25,26 में पहले मनाया जाता है। इस मामले में, वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग एक अक्षतंतु कमी डेन्ड्राइट से बनाया गया है। एक अक्षतंतु असर डेन्ड्राइट रेफरी में से एक रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण है। 13 (उनकी छवि में। 1)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. दा न्यूरॉन्स की Somatodendritic अक्ष के साथ कृत्रिम EPSPs का प्रचार। (ए) एक डीए न्यूरॉन के आईआर क्लब छवि। वृक्ष के समान है और दैहिक पिपेट के बीच की दूरी 45 माइक्रोन है। दोनों पैच pipettes पूरे सेल वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग मोड में हैं। (बी) के वर्तमानवर्तमान दबाना में वृक्ष के समान विंदुक के साथ दर्ज की गई और कृत्रिम EPSP (ऊपर) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया। वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग पिपेट 55 के माध्यम से वर्तमान एक EPSC की तरह तरंग के इंजेक्शन द्वारा प्राप्त की है (आयाम = 100 पीए; τ क्षय = 3 एमएस τ वृद्धि = 0.6 एमएस)। तल में, प्रचारित नियंत्रण की शर्तों (काला) में सोमा में दर्ज aEPSPs और मैं ज अवरोधक ZD7288 के स्नान आवेदन के बाद (30 माइक्रोन, लाल ट्रेस)। प्रत्येक वोल्टेज का पता लगाने के 40 एकल स्वीप का औसत है। ZD7288 EPSPs के समय पाठ्यक्रम के लिए मैं ज के योगदान को दर्शाता है की उपस्थिति में EPSP अवधि में भारी वृद्धि का निरीक्षण करें। (सी) नियंत्रण की शर्तों (काला) में सोमा से दर्ज निशान वोल्टेज और 30 माइक्रोन के ZD 7288 के आवेदन के बाद ( एक लंबे (30 पीए के जवाब में लाल), 1 ओं) hyperpolarizing वर्तमान कदम है। रुकावट के बाद झिल्ली क्षमता परिहार (एसएजी) की अनुपस्थिति नोट की I <उप> एच। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. दा न्यूरॉन की dendrites में मैं घंटा की उपस्थिति। (ए) आईआर क्लब एक डीए न्यूरॉन और समीपस्थ डेन्ड्राइट पर पिपेट की छवि। (बी) सेल संलग्न विन्यास में एक 5 एम वी वोल्टेज आदेश दौरान capacitive और रिसाव धाराओं। एक झिल्ली क्षमता 0 एम वी एक धीरे-धीरे सक्रिय मैं ज प्रेरित से, (शीर्ष 90 एम वी) मुहर प्रतिरोध इस उदाहरण में 5 GΩ (सी) hyperpolarizing वोल्टेज कदम था।। वर्तमान ट्रेस उल्टे और एक एकल घातीय समारोह τ = 632 एमएस के एक समय लगातार देने के साथ लगाया गया था। (डी) वोल्टेज1 एस अति करने के लिए पूरे सेल दर्ज की सोमा (पैनल) की प्रतिक्रियाओं और depolarizing वर्तमान दालों (120 फिलीस्तीनी अथॉरिटी के -160, 40 पीए वेतन वृद्धि)। दैहिक पूरे सेल रिकॉर्डिंग सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के बाद किया गया था। TTX और सीडी 2+ के बाह्य आवेदन सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के दौरान सहज गोलीबारी को दबाने के लिए की वजह से प्राधिकृत व्यक्ति के अभाव ध्यान दें। ये वोल्टेज gated ना + और सीए 2 वर्तमान ब्लॉकर्स कार्रवाई धाराओं को दबाने के लिए जोड़ा गया था। पैनलों एक - डी (ई) आईआर डीआईसी एक और डीए न्यूरॉन और एक वृक्ष के समान पिपेट की छवि ही न्यूरॉन से कर रहे हैं (एफ) वोल्टेज पर निर्भर -120 एम वी पर एक 50 एमएस prepulse से 0 एम वी के लिए एक परीक्षण नाड़ी से सक्रिय धाराओं।। पैनल ई होल्डिंग में न्यूरॉन के समीपस्थ डेन्ड्राइट संभावित -80 एम वी से excised एक के बाहर-बाहर पैच में। नोट वर्तमान के समय पर निर्भर निष्क्रियता। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का संस्करण।

पदार्थ जी / मोल एकाग्रता 1 एल के लिए
NaCl 58.443 125 मिमी 7.305 जी
3 NaHCO 84.007 25 मिमी 2.100 जी
KCl 74.551 2.5 मिमी 0.186 जी
नः 2 4 पीओ 137.99 1.25 मिमी 0.172 जी
शर्करा 198.17 25 मिमी 4.95 ग्राम
2 MgCl 1 एम (समाधान) 1 मिमी 1 एमएल
2 CaCl 1 एम (समाधान) 2 मिमी 2 एमएल
परासारिता: ~ 310 mOsmol / एल (इष्टतम रेंज: 314 - 325 mOsmol / एल), पीएच = 7.4

तालिका 1: कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF)।

पदार्थ जी / मोल एकाग्रता 1 एल के लिए
NaCl 58.443 87 मिमी 5.084 जी
3 NaHCO 84.007 25 मिमी 2.1001 जी
KCl 7.551 2.5 मिमी 0.18637 जी
नः 2 4 पीओ 137.99 1.25 मिमी 0.17248 जी
2 MgCl 1 एम (समाधान) 7 मिमी 7 एमएल
शर्करा 198.17 10 मिमी 1.9817 जी </ Td>
सुक्रोज 342.29 75 मिमी 25.672 जी
2 CaCl 1 एम (समाधान) 0.5 मिमी 0.5 एमएल
परासारिता: ~ 326 mOsmol / एल, पीएच = 7.4

तालिका 2: सुक्रोज-ACSF स्लाइस तैयार करने के लिए।

पदार्थ जी / मोल एकाग्रता 100 एमएल के लिए
KMeSO 4 150.2 120 मिमी 1.8024 जी
KCl 74.56 20 मिमी 0.14912 जी
2 MgCl 1 एम (समाधान) 2 मिमी 200 μl
ना 2 एटीपी 551.1 2 मिमी 0.1102 जी
ना 2 जीटीपी 523.2 0.5 मिमी 0.02661 जी
ना 2 -Phosphocreatine 255.1 5 मिमी 0.1275 जी
EGTA 380.4 0.1 मिमी 3.803 मिलीग्राम
Hepes 238.31 10 मिमी 0.23831 जी
Biocytin 1 मिलीग्राम / एमएल 0.1 ग्राम
परासारिता: ~ 302 mOsmol / एल, पीएच = 7.2 KOH के साथ समायोजित किया

तालिका 3: दोहरी रिकॉर्डिंग के लिए intracellular समाधान।

पदार्थ जी / मोल एकाग्रता 100 के लिएएमएल
KCl 74.56 120 मिमी 0.8947 जी
2 CaCl 1 एम (समाधान) 2 मिमी 200 μl
2 MgCl 1 एम (समाधान) 1 मिमी 100 μl
Hepes 238.31 10 मिमी 0.23831
चाय-सीएल 165.7 20 मिमी 0.3314 जी
4-एपी 94.11 5 मिमी 0.04705 जी
BaCl 2 244.26 1 मिमी 0.02443 जी
CdCl 2 183.32 0.02 मिमी 0.3666 मिलीग्राम
TTX 1 मिमी 200 एनएम 20 μl
परासारिता: ~ 290 mOsmol / एल, डी ग्लूकोज (Ref 16।) के साथ समायोजित; पीएच = 7.4

सारणी 4: सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड समाधान।

Discussion

इस रिपोर्ट में दोहरी somatodendritic पूरे सेल रिकॉर्डिंग और स्थानीय वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग को लागू करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन है। यह क्रमश: पोस्टअन्तर्ग्रथनी क्षमता के समय पाठ्यक्रम पर आयन चैनल (यानी, मैं ज) के प्रभाव का निर्धारण करने और nigral डीए न्यूरॉन्स की somatodendritic डोमेन साथ आयन चैनल (मैं ज) के वितरण के मानचित्रण, के लिए उपयोगी है। परिणामस्वरूप electrophysiological माप तदर्थ ऊतकरसायनविज्ञान पोस्ट करने के लिए सेल आकृति विज्ञान को ठीक करने के लिए संयुक्त रहे हैं। प्रक्रिया डीए द्रव्य नाइग्रा में स्थित न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए नियुक्त किया गया था, लेकिन पड़ोसी nigral गाबा न्यूरॉन्स, उदर tegmental क्षेत्र दा न्यूरॉन्स या अन्य मध्यमस्तिष्क न्यूरॉन्स के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। सभी कदम भी महत्वपूर्ण संशोधनों के बिना nigral न्यूरॉन्स की dendrites में व्यक्त अन्य आयन चैनल की जांच करने के बाद किया जा सकता। पोस्ट अस्थायी दृश्य अक्षतंतु असर के साथ न्यूरॉन्स के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैऐसे nigral न्यूरॉन्स 25,26, हिप्पोकैम्पस Oriens-alveus इन्तेर्नयूरोंस 21 या कुछ सीए 1 पिरामिड न्यूरॉन्स 67 के रूप में dendrites। दिलचस्प है, इस सुविधा को बांटने न्यूरॉन्स अधिक आम की तुलना में आम तौर पर सोचा 67 होने लगते हैं। रूपात्मक विश्लेषण भी इलेक्ट्रोड और अक्षतंतु की सटीक स्थिति का पता चलता है। उत्तरार्द्ध का पता लगाने के अक्षतंतु प्रारंभिक खंड (वोल्टेज gated ना + चैनल या Ankyrin जी) immunohistochemistry 68,69 का उपयोग करने में व्यक्त प्रोटीन की लेबलिंग से अनुकूलित किया जा सकता है।

वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग और बाद में न्यूरोनल लेबलिंग के साथ एकत्र आंकड़ों की विश्वसनीयता सदा ही टुकड़ा गुणवत्ता पर निर्भर करता है। अधिकतम प्रयास इसलिए जरूरत ऊतक के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता की रक्षा करने के लिए लागू किया जाएगा। यह स्लाइस की तैयारी के दौरान स्वस्थ पशुओं, उच्च गुणवत्ता वाले उपकरणों और अभिकर्मकों, ऊतक और बर्फ के ठंडे तापमान के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन की कोमल से निपटने के साथ हासिल की है। स्थिर रिकॉर्डिंग की स्थिति स्वस्थ न्यूरॉन्स के चयन पर भरोसा करते हैं। पूरे सेल मोड में, श्रृंखला प्रतिरोध शुरू में संभव के रूप में के रूप में कम हो सकता है और प्रयोग के दौरान स्थिर बनाए रखा जाना चाहिए। रिकॉर्डिंग की स्थिरता के बहाव और कंपन से रहित उच्च गुणवत्ता manipulators पर आगे निर्भर है। पिपेट धारक के लिए कनेक्शन की जाँच और headstage करने, नियंत्रित कि micromanipulator केबलों सुस्त हैं, तापमान या चरण के आंदोलन में अचानक परिवर्तन से बचने और जोड़तोड़ की व्यवस्था की जाँच: ये perturbations पिपेट स्थिरता के अनुकूलन के द्वारा कम किया जा सकता है। दोहरी रिकॉर्डिंग के लिए, methylsulfate 13,15,21 intracellular समाधान में शामिल किया गया है, लेकिन gluconate 9,14,25 वैकल्पिक रूप से नियोजित किया जा सकता है। हालांकि, मुख्य आयनों झिल्ली क्षमता 70,71 और कुछ वोल्टेज पर निर्भर धाराओं 72 को बदल सकता है। Intracellular समाधान एटीपी, जीटीपी और physiolo संरक्षित करने के लिए phosphocreatine के साथ पूरक हो सकता हैन्यूरॉन्स की gical कार्य करता है। इसके अतिरिक्त, पिपेट समाधान में एक फ्लोरोसेंट रंजक जोड़ने (जैसे, एलेक्सा 594 या 101 Sulforhodamine 41) dendrites एक दैहिक रिकॉर्डिंग के दौरान कल्पना करने के लिए उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए एक दबाव आवेदन करने के लिए जगह के लिए (Ref में चित्रा 7। 41) या एक बिजली के उत्तेजक पिपेट। सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के लिए पिपेट समाधान बड़े मैं ज रिकॉर्ड करने के लिए एक उच्च + K एकाग्रता और कोई ना + शामिल हैं। उल्लेखनीय ना + / + K एकाग्रता अनुपात वर्तमान आयाम 10, मौजूदा 11 के पलटने की क्षमता है और मैं ज 73 के gating प्रभावित करती है। वैकल्पिक रूप से, मैं ज भी बाहर बहिष्कार 10 का उपयोग कर दर्ज की जा सकती है। इस रिकॉर्डिंग विन्यास में हालांकि, चैनलों की निकटता में intracellular परिवेश परेशान किया जा सकता है। नतीजतन, मैं का वोल्टेज पर निर्भर सक्रियण में मतभेद <उप> ज मनाया जाता है जब तुलना की धाराओं सेल संलग्न पैच और बाहर बहिष्कार 10 का उपयोग कर प्राप्त की। न्यूरॉन्स की सूजन कभी कभी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान सामना करना पड़ा है, और अक्सर इस तरह के कम समाधान की संरचना में परासारिता में पानी की गुणवत्ता, मजबूत असंतुलन या अंतर और बाह्य समाधान 39 या त्रुटियों के बीच पीएच के रूप में अलग कारणों से उत्पन्न होती है। electrophysiological रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता बरामद न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान की गुणवत्ता पर सीधा घटना है। Intracellular परिवेश 14 के कमजोर पड़ने कम करने के लिए सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के बाद - (10 MΩ Refs में 6,11 के रूप में। 6) और एकल दैहिक रिकॉर्डिंग के लिए उच्च प्रतिरोध दैहिक pipettes दोहरी रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है। इसलिए पूरे सेल दैहिक रिकॉर्डिंग सेल संलग्न रिकॉर्डिंग के बाद कम (<10 मिनट) रखा है। दोनों दैहिक और वृक्ष के समान pipettes से बाहर-बाहर पैच ग के समुचित बंद करने के लिए आवश्यक हैंपक्ष झिल्ली और सेल आकृति विज्ञान के बाद वसूली। सेल की संरचना के अलावा, नयूरोचेमिकल सामग्री दर्ज न्यूरॉन्स 59,74 के लिए निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, intracellular प्रोटीन tyrosine hydroxylase दा न्यूरॉन्स 13 की स्पष्ट पहचान के लिए immunolabeled जा सकता है।

डीए न्यूरॉन्स मुख्य रूप से एसएन में केंद्रित कर रहे कॉम्पेक्टा Pars, एक बहुत कम एसएन में मौजूद घनत्व के साथ रेटिकुलाटा, जहां वे गाबा न्यूरॉन्स 75 के एक उच्च संख्या के साथ intermixed pars। जबकि महंगाई भत्ते न्यूरॉन्स की सेल शरीर अक्सर गाबा न्यूरॉन्स की तुलना में बड़ा है, आईआर videomicroscopy के साथ इन कोशिकाओं के दृश्य पहचान अनिश्चित और आंशिक रूप से पार्स कॉम्पेक्टा की अस्पष्टता द्वारा रुकावट है। इन सीमाओं को नाकाम करने के लिए, डीए न्यूरॉन्स की पूर्व चयन न्यूरॉन्स (गु 65 या डैट दा न्यूरॉन्स के लिए, जीएडी की एक विशेष आबादी में एक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों के उपयोग से मदद की जा सकती हैगाबा न्यूरॉन्स) और epifluorescence रोशनी के लिए। वैकल्पिक रूप से, एक फ्लोरोसेंट रंजक डेन्ड्राइट के दृश्य की सुविधा के लिए दैहिक इलेक्ट्रोड के समाधान में शामिल किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट सेल की वृद्धि के प्रस्ताव Nipkow कताई डिस्क confocal 14,22,30 या दो photon माइक्रोस्कोपी 7 आईआर क्लब 6 के लिए संयुक्त द्वारा लाया जाता है। कई फायदे डीआईसी की तुलना में क्लब से संबंधित हैं। सबसे पहले, के रूप में डीआईसी प्रिज्म की आवश्यकता नहीं है, आईआर क्लब छवि एक प्रतिदीप्ति छवि 49,52,53,76 से मढ़ा जा सकता है। दूसरा, क्लब photostimulation के साथ और 77 optogenetics जोड़ा जा सकता है।

टुकड़ा तैयारी का एक नुकसान यह न्यूरॉन्स की अखंडता का संरक्षण है। डीए न्यूरॉन्स तीन स्थानिक विमानों 78,79 में उनकी डेन्ड्राइट का विस्तार है और इसलिए वृक्ष के समान डिब्बे की ट्रंकेशन पूरी तरह से स्लाइस 80 में टाला नहीं जा सकता। स्लाइस के उन्मुखीकरण के चुनाव (राज्याभिषेक, क्षैतिज या पैराबाण) एक व्यापार बंद है। तंत्रिका वितरण और प्रयोगात्मक डिजाइन की उत्पत्ति के स्लाइस की सही उन्मुखीकरण चयन करने के लिए विचार किया जाना चाहिए।

प्रत्यक्ष वृक्ष के समान पट्टी कोशिकाओं के विभिन्न डिब्बों में कार्यात्मक आयन चैनल का वितरण नक्शा करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया है। इसके अलावा, इस तकनीक चैनलों 20 के कार्यात्मक संपत्तियों में परिवर्तनशीलता निर्धारित करने के लिए प्रदान करता है। एक पूरक के रूप स्थान और आयन चैनल का घनत्व प्रकाश और इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी का स्तर 17,23 पर immunohistochemistry का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। यह दृष्टिकोण भी छोटे कैलिबर संरचनाओं जो पैच pipettes के लिए दुर्गम हैं में चैनल घनत्व निर्धारित करने के लिए संभावना प्रदान करता है। हालांकि इन चैनलों पैच दबाना तकनीक का उपयोग कर दर्ज की गई उन लोगों की तुलना में एक विशिष्ट कार्यात्मक राज्य 24 या यहां तक कि निष्क्रिय में हो सकता है। दोनों तकनीकों इसलिए स्थान और के गुणों की एक पूरी तस्वीर प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैंएक विशिष्ट सेलुलर क्षेत्र 17 में आयन चैनल। वोल्टेज के प्रति संवेदनशील रंगों के विकास के साथ, वोल्टेज इमेजिंग कई स्थानों पर 81 ए पी एस और न्यूरॉन्स में EPSPs के प्रचार-प्रसार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। दोहरी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक विकल्प के रूप में, इस दृष्टिकोण भी पतली डेन्ड्राइट कि पैच pipettes के लिए सुलभ नहीं हैं, लेकिन संकेत और औसत की सटीक अंशांकन की जरूरत के लिए लागू किया जा सकता है।

एसएन और उदर tegmental क्षेत्र में डीए न्यूरॉन्स व्यापक रूप से शारीरिक और pathophysiological संदर्भ में दैहिक रिकॉर्डिंग के माध्यम से जांच कर रहे हैं, वहीं उनकी डेन्ड्राइट के कार्यात्मक गुण दोनों की स्थिति में काफी हद तक अनजान बनी हुई है। डेन्ड्राइट से पट्टी सफलता 13,25,26 के साथ कई समूहों द्वारा nigral डोपामाइन न्यूरॉन्स के लिए लागू किया गया है और पसंद की विधि ये ठीक subcellular संरचनाओं 8 की उत्तेजनीय गुण टुकड़े करना रहता है। वृक्ष के समान रिकॉर्डिंग एक और अवसर प्रदान करते हैंसामुदायिक दक्षता और synaptic प्रसारण के plasticity और वृक्ष के समान excitability 82,83 के plasticity की जांच करने के लिए।

Disclosures

लेखक घोषणा की है कि वह कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है।

Acknowledgments

मैं confocal खुर्दबीन, दूसरी Axopatch 200B एम्पलीफायर के उपहार के लिए डॉ जैक्स नियत, GIGA-इमेजिंग के साथ सलाह के लिए अपने निरंतर समर्थन के लिए डॉ विन्सेंट Seutin, Christelle Gillissen और उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए लौरेंत Massotte, डीआरएस जीन Defourny और सैंड्रा Ormenese धन्यवाद गंभीर रूप से पांडुलिपि पढ़ने के लिए confocal खुर्दबीन और Imaris सॉफ्टवेयर और डॉ स्टीफन फ्रीमैन साझा करने के लिए मंच। इस काम बेल्जियम एफआरएस से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था - FNRS (U.N002.13 और T.N0015.13) और बेल्जियम के विश्वविद्यालय फाउंडेशन का समर्थन (Publié avec le Concours डी ला Fondation Universitaire de Belgique) के साथ प्रकाशित किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

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