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Neuroscience

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

ドーパミン作動性ニューロンの樹状突起は、受信およびシナプス入力、支援活動電位逆伝搬し、神経伝達物質の放出を伝えます。これらの基本的な機能を理解することは、これらのニューロン内の情報伝達に光を当てるます。樹状パッチクランプ記録は、直接樹状突起とその下の電位依存性イオンチャネルの電気的特性を検査する可能性を提供します。しかし、これらの微細構造は、その小径のパッチピペットへ簡単にアクセスすることはできません。このレポートでは、急性スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からの安定した信頼性の高い記録を収集するためのステップバイステップの手順を説明します。電気生理学的測定は、細胞形態の事後回復と組み合わされます。成功した実験は、スライス、ソリューションおよびピペットの改善された準備、記録された構造と接触しているピペットの光学系と安定性の十分な調整に依存しています。ソムの標準原則ATICパッチクランプ記録は、樹状突起ではなくピペットの穏やかなアプローチが印加されています。これらの用途の広い技術は、樹状突起の興奮特性に関する様々な問題に対処するために実装することができます。

Introduction

ニューロンは、それらの樹状突起に主にシナプスの情報を受け取ります。興奮性と抑制性シナプスの信号が活動電位（APは）出力信号として誘発された組み込み部位に世代の自分のサイトから広がりました。その途中で、シナプス電位は、樹状突起の構造およびパッシブとアクティブの膜特性の間の相互作用の両方の影響を受けています。これらの高度に可変パラメータの組み合わせは、ニューロン1,2の計算能力を広げます。しかし、樹状突起の小さい直径は、その電気的特性が研究を妨げます。 6,7の樹状突起- （3ミクロンのØ0.7）パッチクランプ法3の継続的な開発は、過去数十年の間に光学系4とスライス標本5のための方法の改良は、非常に薄いからの録音を有効にしています。これらの方法はあった、と、まだ大部分は様々なOで樹状突起の興奮性を調べるために使用されていますFニューロン8。直接の樹状記録は配布9-19と明確な神経区画におけるイオンチャネルの機能特性20-22の相違を決定するために必須です。これらのデータは、光と電子顕微鏡23,24に合わせた免疫組織化学で検出されたイオンチャネルの分布の必要な補数です。デュアル細胞体樹状突起の録音は、詳細な受動的なケーブルモデルを得る、活動電位の伝播9,13-15,21,22,25-27およびシナプス電位のニューロンの細胞体樹状突起ドメインに沿っ13,16,18を拡散を探索するために実装されました28- 30およびニューロンの統合31の時間分解能を調査します。

黒質（SN）は、このような運動の制御など、いくつかの機能に関与する中脳に位置する領域、報酬や習慣的な行動の符号化です。特定によるドーパミンの減少SN中のドーパミン作動性（DA）ニューロンの損失は、パーキンソン病を患っている32人の患者において観察される運動障害と関連しています。ドーパミン作動性及びGABA作動性ニューロン：黒質回路は、2つの主要な細胞型で構成されています。興味深いことに、これらのニューロンは他のニューロンからそれらを区別するいくつかの特定の機能を持っています。 DAニューロンの大部分と、いくつかのGABAニューロンの軸索は樹状突起樹は25,26,33（軸索軸受と軸索欠けている樹状突起）不均一であることを示す樹状サイトに由来します。これらのニューロンの形態は、ニューロンの典型的な組織で、したがって対照的情報伝達はカハールによって放出された動的分極の法則に従うする：樹状突起から、ソーマに、最終的に軸索34に始まります。 DAニューロンは、また、それらの樹状突起35からドーパミンを放出バースト活動36とNMDA受容可塑性37を生成することが知られています。 dissecこれらの現象の化は、それらが開始されているサイトからの直接録音することなく、とらえどころのないです。正確な位置とイオンチャネルの機能特性と黒質ニューロンにおける樹状突起の興奮や情報伝達における役割との関係への洞察を得るために、直接樹状記録が選択される方法です。

このレポートでは、黒質神経細胞の樹状突起と対応する事後ビオサイチンラベリングから、シングルおよびデュアルパッチクランプ記録を得るために使用できる詳細な手順を説明します。体細胞と樹状突起膜にパッチを適用するための基本的な原則は非常に似ています。実際にしかし、樹状の部位からの記録は、体細胞の録音と比較して、特定の最適化を必要とします。成功した樹状記録はスライス、光学系の最適調整、録音のパッチピペットと安定性の穏やかなアプローチの品質に依存しています。

Protocol

ここで説明する全ての実験手順は、動物の保護と欧州実験動物学会連合会のガイドラインのためのEU指令制度や国のガイドラインに従ってください。

ソリューションの調製

  1. 標準人工脳脊髄液（ACSF;表1）
    1. 新鮮な溶液を調製し、以前に二重蒸留水ですすぎ、高純度の塩38と清浄なガラスビーカーを使用します。すべての細胞外および細胞内溶液の調製のための高品質の二重蒸留水を使用してください。
    2. 500 mLの水と表1に記載の二価イオン39の析出を防止するために、他の塩を溶解するために、他の中のNaHCO 3を溶解させるために2リットルのビーカーを取る。二重蒸留水で体系的にへらを清掃し、塩を取る前に、それを乾燥。 dissolutioを均質化するためにマグネチックスターラーを使用して、n個。適切なメスフラスコに、両方のビーカーからのソリューションを追加し、適切な音量にもたらします。
    3. 最終的な細胞外溶液が完全に透明と降水量の痕跡なしであることを確認してください。
    4. スライス38,40を灌流の30分前-ガラスマイクロフィルターキャンドル（O 13 mm）の20と95％O 2および5％CO 2（カルボゲンガス）からなるガス混合物を適用します。 （：314から325ミリオスモル/ Lを最適な範囲）浸透圧計でACSFの - （3回の連続した測定2）慎重に浸透圧を制御します。 4℃で調製後の残りの溶液を保存し、3日以内にそれを使用します。
  2. 切削液（ショ糖ACSF;表2）5,13
    1. 新鮮な溶液の3リットルを準備します。 1動物から脳スライスを準備するために1 Lを使用してください。 4℃で残りの溶液を保存し、3日以内にそれを使用します。
      注：高マグネシウム2+と低いの Ca 2+濃度がdに使用されていますシナプス伝達および組織5,40を維持するために、スクロースといくつかのNaClの置換をecrease。
  3. 細胞内のソリューション
    1. 事前にデュアルホールセル記録（ 表3）のために100 mLの溶液を調製します。
    2. 細胞形態の良好な回収を得るために、メチル13,15,21が含まれます。その後、神経細胞の形態を調べるために - （0.4％0.1）ビオシチンを追加します。記録（オプション）の間、樹状突起の延長をフォローする蛍光色素（ 例えば 、アレクサ594またはスルホローダミン101 41）が挙げられます。
    3. 事前に細胞接着型の記録（ 表4）のために100 mLの電極液を準備します。この場合、内部液は、巨視的な過分極活性化カチオン電流（I h）を単離するために設計された高K +のソリューションであり、他の電位依存性イオンチャネルのためのブロッカーが含まれています。
    4. ストア内-20℃で2 mLのアリコート中の細胞のソリューション。すべての新しい記録セッションのための新しいアリコートを使用してください。浸透圧計で慎重にすべての解凍アリコートの浸透圧を確認してください。浸透圧が初期値に対応しない場合、新しいアリコートを取ります。
    5. 0.22μmの滅菌シリンジフィルターが配置された上に3 mLのシリンジにアリコートからの溶液を移します。その化合物（ATP、GTPやクレアチンリン酸）の分解を制限するために、記録セッション中に氷の上に注射器を保管してください。

2.作製とパッチピペットの充填

  1. 引っ張ります
    1. 水平電極プラーと厚壁ホウケイ酸ガラス管を使用してください。全細胞と細胞接着型の記録のために、2ミリメートル外径/ 1ミリメートルの内径を使用しています。ガラス管は38完全にクリーンであることを確認してください。
    2. そうでない場合は、有機溶媒中にガラスキャピラリーを浸す（ 例えば、エタノール）最初にして二重蒸留水インチ簡単に説明するとブンゼンバーナーとキャピラリー終末を加熱します。また、注文のガラス管を洗浄し、メーカーから直接加熱（材料のリストを参照）。
    3. デュアル細胞体樹記録のために、体細胞ピペット抵抗は6〜10MΩ6,11および細胞内液（ 表3）を充填した樹状ピペットのための8と19MΩの間にあることを確認してください。ニューロン16,18,42,43の細胞体樹状突起ドメインに沿って同等の結果を達成するために、10MΩの抵抗に細胞接着型の記録のためにピペットの抵抗を標準化。
    4. すべてのレコーディング・セッション（毎日）の前または直後にパッチを適用する前に、新鮮なピペットを準備し、それらに5使用-その製造39後の8時間。ほこりや先端の閉塞からそれらを保護するためにカバーされたガラス容器に保管ピペット。
  2. 研磨
    1. 点検しょん膜とのより良いシールを得るために、マイクロフォージのtポリッシュすべてのピペットチップ。マイクロフォージを使用する前に、プラチナ加熱フィラメントにガラスの小片を溶かします。恒常（ピーター・ジョナス、私信）のために毎日、白金フィラメントでこのガラスコーティングを交換してください。
      注：セル接続記録のために使用されるピペットは、バックグラウンドノイズを低減するために、熱研磨工程の前にコーティングすることができます。コーティングは、溶融した歯科用ワックス22,44またはシリコーンエラストマー39のような絶縁物質を用いて達成することができます。

脳スライスの調製

  1. 古い19日 - 16歳の健康なウィスターラットを使用してください。低体温症や脱水症を患っている不健康な動物や動物を使用しないでください。スライスの準備を開始する前に、安全で静かな場所に動物を維持します。動物を準備しながら、部屋の中の任意の他の動物を避けます。優しく動物を操作します。
  2. 2 400にスクロースACSFを注ぎますmLのポリプロピレン（PP）ビーカー、45分間℃のフリーザーで-80に置いてください。均質な氷冷たい液体/凍結溶液を取得し、氷の上にビーカーを配置するためのソリューションを混ぜます。各PPビーカーにマイクロフィルターキャンドル（Ø13ミリメートル）を使用してカーボゲンガスとスクロースACSFのソリューションを提供します。
  3. スライサーと予備室を準備します
    1. できるだけ多くのスライスの表面層へのダメージを最小限に抑えるために、極めて低い上下振動5,38と高品質の組織スライサーを使用してください。スライサー新鮮な全体カミソリの刃を固定してください。
    2. 各切断セッションのための新しいカミソリの刃を使用してください。カミソリの刃を曲げないでください。かみそりの刃（ヨーゼフBischofberger、私信）の表面に脂肪膜を除去しないでください。
    3. 可能な場合は、メーカーが提供するvibroprobeで上下方向の振動をチェックしてください。また、カスタムメイドvibroprobe 5を使用します 。ブレードsの垂直方向の振動を低減0ミクロンにできるだけ近くなるように、O。
    4. Pに示すようにスライスを150 mLの予備室45,46を準備します。文献[201。39。予備室に標準ACSFを注ぎ、水浴に入れてください。マイクロフィルターキャンドル（Ø6ミリメートル）を使用してカーボゲンと予備室の解決策を提供します。カーボゲン気泡ができるだけ小さなであることを確認してください。
      注：すべての2つの新しい予備室を構築する - スライスの品質を一定に保つために3ヶ月。
  4. スライスをカット
    1. 実験者が乱れたり強調されていない無音の部屋では、子宮頸髄質のレベルで手術はさみ（長さ150ミリメートル）で動物を刎ねます。
    2. メスで尾側方向に鼻に動物の頭の上に皮膚をカットし、横方向にそれを削除します。細かいハサミで頭部の鼻の部分に尾側から頭蓋の上部をカットし、横方向に頭蓋骨の両方の部分を削除します。 Bを削除します薄いへらで雨や氷冷含むPPビーカーに慎重にドロップ-カルボゲン38で平衡化した（0〜4℃）スクロースACSFを。
      注：この一連のステップは、可能な限り迅速に行われる必要があるが、また、細心の注意を払って（<< 1分、約40秒）。
    3. 〜2から5分間PPビーカーの溶液中で脳を保管してください。脳の動きを避けるためにカーボゲン圧力を調整します。カーボゲン気泡が新鮮なものと大きすぎるマイクロフィルターキャンドルを交換してください。
    4. 内底が〜0.5センチメートル厚いシルガード層38で覆われた9センチメートルペトリ皿に脳を置きます。事前にこのペトリ皿を準備します。
    5. 氷冷スクロースACSFで脳を囲みます。 ACSF-ショ糖液の一部液相が脳を水没ていることを確認してください。冠状スライスのために、メスまたはカミソリの刃で前頭面で脳の前頭部分をカット。冠状カットで小脳を削除します。
    6. シアノを適用します試料トレイ上アクリレート接着剤（〜1cm 2の面積）。正面部分はスライスステージを向くように脳のブロックを貼り付けます。慎重にガラスパスツールピペットの大きな開口部を使用して貼り付け、脳の上にショ糖ACSFを滴下し、その後ゆっくりとスライサーの切断室を水没。切断面（ すなわち 、第一の組織は、ブレードをヒットする）は、脳40の腹側表面になるように試料トレイを下ろします。
    7. カッティング室（オプション）に曲がったガラスマイクロフィルターキャンドル（Ø6ミリメートル）とカーボゲンを適用します。
    8. 水平面5を参照しながら〜15°の角度でカミソリの刃を調整します。黒質に到達する前に鼻方向に尾側に〜500μmの冠状脳スライスをカット。関心領域を含む350μmの厚さにスライス - 300を切断するために厚さを減少させます。
    9. に接続されている非常に薄い灌流針で組織ブロックとは別のスライスカミソリの刃の端にシリンジ並列。屈曲針と注射器の間で90°の角度を有するように針。組織ブロックからスライスを除去しながら何の圧力がカミソリの刃に適用されていないことを確認してください。
  5. ストアスライス
    1. 予備室に（電球に接続されている）ガラスパスツールピペットの最大の開口部を使用してスライスを転送します。 1時間 - すべてのスライスが予備室（クリストフ・シュミットHieber、私信）に移送されると0.5のために34℃に水浴の温度をもたらします。
    2. この期間の後、水浴のスイッチをオフにし、室温でスライスを維持します。予備室でのスライスの動きを避けるためにカーボゲン圧力を調整します。録音を開始する前に、別の10〜20分間のスライスにしてください。
    3. SLIの終わりに二重蒸留水で慎重にまだ完全に機器やマイクロフィルターキャンドルを清掃してください手順をcing。

黒質ニューロンとビオシチンファイリング4.デュアル体細胞とSomatodendricレコーディング

  1. アクソンガイドと参考文献に与えられたスライスのためのパッチクランプのセットアップの組み立ての説明に従ってください。39,40,47。パッチ適用のより基本的な側面に関する情報は、参考文献である。48。
  2. 記録チャンバーを準備します
    1. 記録チャンバーに2 mLの二重蒸留水 - 1を配置します。それがリーキーではないことを確認します。シフトXYテーブル上の記録室を置きます。
    2. 記録室に酸素不透過性灌流チューブシステム（ポリテトラフルオロエチレン）を介して標準ACSFフィード。 5 mLの分-1 - 4の速度でチャンバ内灌流の流れを安定させます。できるだけ短くACSFを含むビーカーと記録チャンバー（1メートル）を接合するチューブの長さにしてください。
    3. 予備室から脳スライスを選択して、中にそれを転送しますガラスパスツールピペットの最大開度を用いて記録チャンバー。 Pに示されるように記録チャンバーの底にそれを固定するプラチナリングでスライスをカバーしています。文献[201。39。フラットプラチナリング（Ø1.5センチメートル）を使用し、その上に並列ナイロン糸（> 2ミリメートル間隔）を接着。
  3. 光学系を調整し、最適化します
    1. 赤外線（IR）ビデオ顕微鏡4,47,49,50を使用してスライスを視覚化します。ケーラー照明51を調整して、微分干渉コントラスト（DIC）51光学系または斜め照明（Dodtグラデーションコントラスト- DGC）を最適化52,53を 。この手順についてのさらなる詳細は、参考文献に記載されている。40,49。
    2. スライスの品質を確認してください。唯一のあまりに強く対比し、わずかな、分散したクレーターを持っていない滑らかであっても表面を有するスライスを保ちます。
    3. （細胞内液と2新鮮で未使用のパッチピペットを埋めます
  4. スライスの表面上にピペットを置き
    1. （;詳細については、軸索ガイドと参考文献を参照してください39,54。風呂参照電極とパッチ電極）銀線上に塩化コーティングの存在を確認してください。
    2. 順次ピペットホルダーにピペットを挿入し、ピペットホルダーを接続するチューブ回路、三方活栓と圧力計40を用いて、正圧（〜70ミリバール）を適用します。記録チャンバーの浴中にピペットを下げます。
    3. 2分 - 圧力計の圧力値が〜1に対して一定であることを確認してください。圧力が低下している場合は、ピペットホルダ内のチューブやシール、Oリングを確認してください。
    4. ビデオモニターの中央にピペットチップを置き、それが阻害されないことを確認してください。ピペットに圧力をかけたり解除する際ピペットチップが動かないことを確認してください。
    5. 正確にピペットチップの位置にモニターの中央にある小さな十字を描くことによって、ドリフトやピペットチップの振動をチェックし、先端の5分の可能な動きを観察します。
    6. オシロスコープのピペット抵抗を監視するための電圧ステップ（5 mVの）を適用します。 0 mVのにパッチクランプアンプの保持電位を設定します。 DCピペット電流はアンプメートル39,51でゼロを読み取ることの潜在的な、オフセットピペットをキャンセルします。
    7. スライスにピペットを下に移動し、表面の上にそれらを維持します。
  5. 長い樹状突起を持つニューロンを選択し、パッチを適用
    1. 黒質内では、ほぼ同じPLに長い距離にわたって追跡することができ、長い樹状突起との健全なニューロンを選択ANE（ 図1Aおよび1B）を用いてIR-Dodt勾配コントラスト（IR-DGC）。滑らかで均一な細胞体を選択してください。で破壊すると経時安定した記録条件（安定した直列抵抗）を維持することは困難であるので、スライス（ 図1Cおよび1D）の表面にある2つの強く対比細胞を避けてください。スライス面の下に30ミクロン - 彼らのソーマ10を持つニューロンを選択します。
    2. （ - 50ミクロンの距離40）と同じ距離にある樹状突起に近い樹状電極ソーマに近い体細胞電極を移動します。樹状突起の部分を選択し、パッチを適用する2X倍率（四重チェンジャー）を使用します。 2X倍率とモニター倍率（1X）なし2,100Xの絶対倍率と5,500Xの上に取得します。
    3. わずか10ミリバールによって体細胞ピペットの圧力を解放します。必要であれば、Cの変位を避けるために、樹状細胞および体細胞のピペット圧力を調節しますスライス内のエル構造（ソーマと樹状突起）。
    4. 小さなえくぼを参照するために、膜に近い樹状ピペットを置きます。ピペットチップに圧力を解放し、ピペット抵抗を制御しながら、樹状突起にパッチを適用。理想的な条件では、ごくわずかな吸引が良好なシールを得るのに十分です。
    5. セル接続モードで樹状ピペットを保管してください。体細胞膜に近い体細胞ピペットを移動し、体細胞膜にパッチを適用。高いシール抵抗が細胞膜（> 1GΩ）39を破裂する前に得られることを確認してください。わずかに細胞体と樹状突起の変形を避けるために、ミクロンのカップルが離れ膜から両方のピペットを撤回。
    6. 両方のピペットの場合、高利得と少しフィルタリング51とオシロスコープで電圧パルスを用いて、現在のステップの上にピペット容量過渡現象の振幅を可能な限り減らします。全細胞モードのwiに入力してください樹状ピペット番目、その後体細胞ピペットで。
    7. 細胞全体の容量の過渡現象を排除し、直列抵抗を補償します。モニターとの冒頭にアクセス抵抗を文書化し、定期的に中に、実験。直列抵抗が高すぎる場合（> 50MΩ）は、他のピペットで再試行します。
    8. ビデオグラフィックプリンター25、高および低倍率でフレームグラバーやデジタルカメラでIR-DGC写真（ 図1Aおよび1B）を収集します。
      注：記録中に神経細胞の腫れが（ 図1Eおよび1F）が散発的に観察されていますが、まれに解決策の浸透圧、pHを正しく39を調整されていない場合。
    9. 同様の手順（ 図2A）と- （ソーマソーマ）二重の体細胞全体の記録を入手します。
  6. 順次脱分極電流ステップを増やす長い（ミリ秒の数百）を適用します体細胞および樹状ピペットでのAP（ 図2B、3Cおよび3D）を呼び起こすします。同時に、樹状細胞および体ピペットで生じた可能性を記録します。
  7. ドーパミン作動性ニューロンに人工的な興奮性シナプス後電位（aEPSPs）の伝播を調べ
    1. デュアル電流クランプ記録（ 図4Aおよび4B）の間、現在のコマンドとして注入する興奮性シナプス後電流（EPSC）の波形を作成します。これを行うには、関心55のニューロンにおけるEPSCsのために測定された実際の値に対応する振幅と時間経過の値を持つ二重指数関数を構築します。慎重に元の時間経過を維持するために構築さEPSCの注入されたEPSC波形のサンプリング・レートを制御します。
      注：実際のニューロンに波形を適用する前に、モデル細胞を使用してテストします。
    2. 順次樹状経由で波形を注入し、同時に両方の体細胞および樹状ピペットのための電位を生じた体細胞ピペットとレコード。ピペットの可能なドリフトを定期的に確認してください。
  8. ニューロンから記録を終了
    1. スライスと、電極内のニューロンの位置を記録するために：低倍率（5倍または10倍対物レンズ）でIR-DGCの画像を撮影します。
    2. ゆっくりと静かに両方のピペットとアウトサイドアウトパッチを形成するために、樹状細胞およびニューロン膜から順次、体ピペットを撤回。横上向きの動き38のシーケンスを使用してピペットを削除します。これらは、最初は短くても、その後、徐々に長さに増やす必要があります。この記録設定は、細胞膜の適切な閉鎖を促進します。
    3. ピペットを抜き出す電圧クランプで5 mVの電圧パルスに応答して、容量性電流（アクセス抵抗の増加）の減少を監視します。
    4. 膜は海になるとピペットチップの周りに導かれ、記録室の外に完全にそれを取ります。浴から目的を削除します。記録されたニューロン内（細胞内液から）ビオシチンの平衡化を可能にするために、標準のACSFで20分 - 15のための記録チャンバー内のスライスにしてください。
    5. 静か標準ACSFを含む25 mLの広口アンバー（ブラウン）ガラスボトルにパスツールピペットの大きな開口部を使用してスライスを転送します。キャップとボトルを閉じます。固定工程のための第6項を参照してください。

5.細胞に付着したレコーディング

  1. 同一平面上に長い距離にわたって延びる樹状突起を持つニューロンを選択します。興味の樹状突起が明確に定義されたソーマに従うことができることを確認してください。
  2. 電極液（ 表4）でパッチピペットを埋めます。他のイオン茶をブロックするために特定の薬理学的作用物質を含むことにより、セル接続構成への関心の電流を記録するためのソリューションを設計nnels。
  3. セル接続モードでの樹状突起にパッチを適用
    1. 樹状突起の部分を視覚化し、マニピュレータを使用して再符号化ピペットに近づきます。樹状突起の変位を避けるために - （80ミリバール70）圧力計をチェックすることにより、ピペット先端部の圧力を調整します。 4.5.4で説明したようにデンドライトにパッチを適用します。
    2. いくつかのIR-DGC写真（ 図5A）を記録します。細胞接着型の記録18（ 図5B）のために10GΩ -せいぜい3との間に、（> 1GΩ39）できるだけ大きいシール抵抗を得るようにしてください。樹状突起の変形を避けるために、ミクロンのカップルが離れ膜からピペットを撤回。
    3. 黒質ニューロンの自発的な活動電位を反映したセル接続モードでの動作電流を観察します。アクション電流を抑制するために（それぞれのCdCl 2およびTTX）のCa 2+およびNa +チャネルブロッカーでACSFを補います。
    4. 2 SVを適用しますI hを （ 図5C）を呼び起こすためのパッチに0 mVの保持電位から-90 mVでのoltageステップ。ピペット電位と静止膜電位はセル接続構成56に直列であることに留意してください。詳細については、軸索ガイドと参考文献を参照してください。39。
    5. ピペットの可能なドリフトを定期的に確認してください。
    6. 記録の最後に、全細胞モードに入るとすぐに膜電位の読み出しを取るパッチを破裂。アウトサイドアウトパッチを入手するためのセクション4.8.2と4.8.3で説明したように、ピペットを撤回。
  4. 全細胞モードで対応するソーマから録音
    1. 樹状突起に沿って見て、対応するソーマを探します。 K +ベースの細胞内液（ 表3）を充填した- （10MΩ5）6,14,57高抵抗のピペットを使用してください。に簡単な吸引（負圧）を適用しますピペットチップは、全細胞モードに入るために、膜を破壊します。
    2. 長いハイパーを適用すると、現在のステップを脱分極することにより、電流クランプにニューロンの身元を確認する（ 図5D）とビオシチンは、樹状突起に沿って拡散することができます。 APの時間経過を視覚化するための短い脱分極電流ステップを適用します。
    3. 4.8.3 - ≤10分後、セクション4.8.2に記載されているようにアウトサイドアウトパッチを入手するためにピペットを撤回。静か標準ACSFを含む25mLの琥珀色のガラス瓶にパスツールピペットの大きな開口部を使用してスライスを転送します。キャップとボトルを閉じます。
    4. あるいは、第一追加的に蛍光色素を含むピペット溶液を用いて、体全体の細胞を得ます。染料の拡散を可能と樹状突起26の部分を選択します。第二ピペットで、細胞接着型のモードでデンドライトをパッチ。利用可能な場合、蛍光標識の可視化を向上させるために、共焦点顕微鏡を使用して樹状突起14,22エド 。
    5. 細胞接着型の録音10,22に、代替的または追加的に、アウトサイドアウト構成で樹状録音を行います。 図5Eと5Fでアウトサイドアウトパッチから記録された電位依存性電流の例を参照してください。

黒質ニューロンの6ビオサイチンラベリング

  1. 組織の固定
    1. 可能な場合は、スライスの記録/組織化学的処理38のための別々の部屋を使用します。
    2. パスツールピペットで0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH値= 7.4）中の4％パラホルムアルデヒドでACSFを置き換えることによりスライスを修正します。常に新鮮に（<< 1週齢）固定液を調製した使用。
      注意：使用して、適切な手の手袋と、その毒性のパラホルムアルデヒドを操作するために組織学の研究室に配置された化学フード。使用前にこの危険な製品の安全データシートを読むと、c一体この粉末としての規制に関する化学物質の安全性（EU委員会からの危険物質指令（67/548 / EEC））は、がんを誘発すると考えられています。その他の詳細は、文献である。58。
    3. 4°Cで一晩スライスを配置します。パッチクランプのセットアップまたはパラホルムアルデヒドによって電気生理学のために使用される任意の機器の汚染を避けてください。
    4. 固定後、PBSで固定液を交換してください。固定液を除去し、PBSを適用するための別のパスツールピペットを使用してください。 （ - 2週間1）更なる処理の前に4℃でPBSに保管してスライス。この場合は、1週間に2回PBSを交換してください。 （<< 1週齢）常に新たに調製されたPBSを使用してください。
  2. 組織の染色
    1. 染色工程のために24ウェル細胞培養プレートを準備します。スライスを転送するためにクリーンな装置を使用してください。スライス新鮮なPBSを用いて3×5分間洗浄します。
    2. 1μLの蛍光物質;フルオレセインアビジンDCS（アビジンD、セルソーターグレードを適用します一晩4℃でPBS中CEIN / mLのトリトンX-100）および0.3％トリトンX-100。染色を通して光からスライスを保護します。光や電子顕微鏡分析21,58のための3,3'-ジアミノベンジジンを介した蛍光に代わるものとして、ラベルニューロン。
      注意：トリトンX-100は危険です。この物質を使用する前に、安全性データシートとEU委員会指令をお読みください。
    3. PBSで3×30分リンスし、続いてPBで（リン酸緩衝液、スライスの表面における結晶の形成を回避するため）。
  3. 標準ガラススライド上のスライスをマウントします。包埋剤で慎重にスライスをカバーしています。包埋媒体中に気泡を避けてください。完全にスライスをカバーするために穏やかにカバースリップを置きます。顕微鏡でそれらを可視化する前に一晩スライドを空気乾燥します。
  4. 可視化した後、4°Cで標識されたスライスを保管してください。組織化学的手順に有用なトリックは、参考文献である。58,59。
  5. 別々に組織学および電気生理学のために使用される機器を清掃してください。一緒に組織学および電気機器を混在させないでください。

ビオシチンで満たされたニューロンの7. 事後の可視化

  1. 回収されたニューロンの形態を可視化するために、共焦点顕微鏡を使用してください。
    1. ざっくり落射蛍光でスライス内の蛍光標識されたニューロンを見つけます。神経細胞の樹状突起樹を調べ、軸索と軸索ブレブ見つける - 10倍または20倍の対物レンズを用いて（2〜4ミクロンのØを）。軸索のコースを文書化します。
    2. 共焦点顕微鏡に切り替えて、ラベルされたニューロンに含まれる蛍光を励起するための488nmレーザーダイオードを選択します。 z軸での軸索と樹状突起の延長に従ってください。
    3. セル全体のためのzスタックを得るために、連続した画像を記録します。 1ミクロン - 0.5にz軸（連続した画像間の距離）の解像度を調整します。セルusinの共焦点画像を収集（10×対物レンズ）低および高グラム（60X対物レンズ、油浸）の倍率。
    4. イメージングソフトウェア（ImageJの）60と共焦点顕微鏡を用いて得られたニューロンの画像ファイルを開きます。電気生理学的記録（ 図1、図2A、3A、4A、5Aおよび5E）中にパッチピペットの正確な位置を見つけるために目でIR-DGC画像とのz投影画像を比較してください。
    5. ラベルされたニューロンのmorphometriesを決定します軸索を測定 - 相馬距離、ImageJの中の「メジャー」機能を使用して、細胞体樹状突起ドメインに沿って樹状ピペットと軸索との間に記録ピペットとの間の距離。
    6. NeuronJ（ImageJの）、IMARIS 29またはNeuromantic 61といくつかのニューロンを再構築します。

電気生理学的データの8解析

  1. （ 例えば 、Clampfit）肉眼的にデータを分析するために、アンプに関連したソフトウェアパッケージを使用するか、直接このようなStimfit、私たちの最近の刊行物13または例えばWinWCPのように、オープンソースソフトウェア62,63としてデータ分析のために他のソフトウェア。

Representative Results

上記のプロトコルは、樹状パッチクランプ記録を用いて、データの収集を容易にすることを目的とします。 事後組織化学と組み合わせたこの技術は、発信または樹状突起の中に広がり、多くの電気信号のメカニズムへの洞察を得るために役立ちます。パッチピペットと樹状突起への直接アクセスは困難であるが、いくつかの方法論的側面への特別な注意は、レコーディングの成功率が向上します。十分に安定した体細胞記録で経験実験者は試みのほとんどに高抵抗（GΩ）シールおよび完全な実験を得ることを期待することができます。 2高品質の樹状記録するための一つは、解剖ごとに収集することができます。

健康的な細胞体と樹状突起を含む高品質の脳スライスの可用性は、これらの微細構造（ 図1）にアクセスするための前提条件です。 criteriこれらのニューロンを選択するためのすべてのセルと最適な調整された光学系（ 図1Aおよび1B）で観察されたコントラストの低い相馬と樹状突起の上に滑らかで均質な表面です。ニューロンを選択すると、あまりにも強く、一般的に不安定な録音（ 図1Cおよび図1C）につながる対比します。したがって、このようなニューロンは避けるべきです。

他のニューロンと比較して、黒質DAニューロンは、特定の形態学的および電気生理学的特性を示します。通常、単一の体細胞をピペットを用いて評価し、これらの機能は、デュアル体（ 図2）、細胞体樹状突起の記録（ 図3）で観察することができます。ロング過分極電流の注入は、「サグ」（ 図2Bおよび5D）と呼ばれる膜電位整流を誘発します。識別されるような軸索、樹状敷地内に、ほとんどの場合、発信しますこれらのニューロンにおける樹状突起区画は異種の（ - 3B 図3A）であることを示す、相補的な基準を13,25,26を使用。 13,25,26 -結果として、APが最初に観察された区画は軸索は、（3D 図3C）を出現する区画に対応しています。軸索は、一般的に64をスライス中に軸索の切断に起因する軸索胞で終了しますが、この構造を系統的に検出されません。

I hの活性化に連続した黒質のDAニューロンで観察された顕著なたるみは、HCNサブユニットの高発現を示唆しています。シナプス信号の統合のI hの影響を判断するには、シナプスのような電流（EPSC）の波形が生成され、細胞体樹デュアル録音55（<時の樹状記録電極を介して注入しました。強い>図4）。これらのシミュレートされたEPSCsの動態は、実際の自発EPSCsの立ち上がりと立ち下がり時間定数に基づいていました。その結果aEPSPは、体の電極で記録しました。 I hの 遮断 ZD 7288のバス・アプリケーションは、シナプスの信号（ 図4B）の時間経過にI hの寄与を示す、aEPSPの持続時間を増加させました。 ZD 7288は、I H（ 図4C）の起動からサグ結果ことを確認し、膜電位の整流を廃止しました。シミュレートされたEPSPを用いて得られた結果は、電気的に誘発のEPSP 65を用いた実験に相関されることがあります。 DAニューロンの細胞体樹状突起領域のチャネルの正確な分布をマップするには、細胞接着型の記録は、（ 図5）実装されました。高抵抗シール（>> 1GΩ）は（ 図5（b）細胞接着型の記録のための絶対必要です、I hは長い過分極電圧ステップでゆっくりと活性化し、定常電流は、先に示した66のように、ミリ秒（ 図5C）の何百もの後に達成されます。この観察は、DAニューロンの樹状突起で発現HCNチャネルは、錐体ニューロンまたは他の細胞タイプ10,16,66のものと比較して異なるサブユニットを有することを示します。チャネルの分布は樹状突起コンパートメント内および樹状コンパートメントが異機種そのものであるとして不均質であるかもしれないとして、樹状突起（軸索ベアリングまたはnonaxon軸受樹状突起）の同一性は、共焦点画像とIR-DGCの画像を比較することによって明らかにされますビオシチン染色（ 図3AおよびB）の後。細胞形態の回復は二重の細胞体樹状突起の録音の両方のために、その後の体細胞ホールセル記録を介した細胞接着型の記録のために必要があります。


赤外線ビデオ顕微鏡を使用した黒質ドーパミン作動性ニューロンの相馬と近位樹状突起の可視化 図1。 （A）ソーマと近位樹状突起と体細胞および樹状ピペットの両方を示す黒質のDAニューロンのIR-DGCイメージ。デュアル細胞体樹記録が正常にこの健康的なニューロンについて行きました。すべての細胞の細胞体樹状突起ドメインにわたって低コントラストと滑らかな表面を観察します。（B）健康DAニューロンの別の例を。（C）DAニューロンを粗くし、凹凸面と強いコントラストで。デュアル記録が得られたが、安定性が最適以下とし、記録時間が原因両方のピペットにアクセス抵抗が徐々に増加する（〜15分）で短かった。強く対比を示すDAニューロンの（D）第二の例ソーマと近位樹状突起。この場合、アクセス抵抗の強い増加は、全細胞モードで中断直後に観察されました。負圧によってアクセス抵抗を減少させる試みは失敗しました。パネルCおよびDにおけるニューロンは、スライス手順の間に損傷している可能性があり、実験のために避けるべきである。（E）記録の開始時に健康DAニューロンにおける同時二重の体細胞記録。（F）と、パネルEと同じニューロン〜17分後に腫れ細胞体。相馬のボール状の外観と健康ニューロンにおいて明らかではない、大きな核の存在、コントラストの完全な欠如に注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2。 同時ダブル体細胞の録音DAニューロンから。（A）IR-DGCの画像DAニューロンから二重の体細胞記録中。（B）過分極と1秒脱分極長い現在の注射（-160 pAの80、80 pAのをインクリメント）し、両方のパッチピペットと同時に記録された電圧の変化に対応します。脱分極電流パルスの間に長い過分極電流ステップとAP後の後過分極大の電圧トレースでたるみの存在に注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3. DAニューロンにおけるデュアルS omatodendritic録音。（A）DAニューロンのIR-DGCイメージ。樹状突起と細胞体の間の距離チックピペットは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）とコンジュゲートしたアビジンで標識されたパネルAにおけるニューロンの29ミクロン（B）共焦点zの投影像です。ニューロンは、記録時にビオシチンを充填しました。矢印で示すように軸索は細胞体に近い近位樹状突起に由来する。（C）パネルAの細胞体に記録されているAP（黒電圧トレース）と樹状突起（赤電圧のニューロンからの同時デュアル細胞体樹状突起細胞全体の電圧記録黒現在のトレース）と交互に樹状ピペット（右;左の体を介して、1秒長い電流注入ステップ（に応じてトレース）。赤現在のトレース）（D）体細胞および樹状AP拡大タイムスケールで示します。体細胞または樹状電流注入のいずれかで、体細胞AP（黒）は、樹状AP（赤）を先行しました。このニューロンのAP間の遅延はそれぞれ、体細胞と樹状電流注入で120マイクロ秒と210マイクロ秒でした。遅延APの立ち上がり段階の間にAP半最大振幅で測定しました。 APは、軸索は、以前の観察25,26を確認し、出現するに近い区画内に最初に観察されます。この場合には、樹状記録が軸索欠く樹状突起から形成されています。軸索保有樹状突起からの記録の例参考文献である。13（その図1）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
DAニューロンの細胞体樹状突起の軸に沿って人工のEPSPの 図4. 伝播。 （A）DAニューロンのIR-DGCイメージ。樹状細胞および体ピペットとの間の距離は45μmです。両方のパッチピペットは、全細胞電流クランプ記録モードである。（B）現在電流クランプ樹状ピペットを用いて記録し、人工EPSP（上部）を生成するために使用されます。樹状記録ピペット55を介して電流がEPSC状の波形（振幅= 100のpA; = 3ミリ秒τ 減衰 τ 上昇 = 0.6ミリ秒）を注射することにより得られます。底部では、aEPSPsが制御条件（黒）にし、I hの 遮断薬ZD7288（;赤トレース30μM）の浴適用後にソーマで記録伝播。各電圧トレースは、40単一スイープの平均です。 EPSPの時間経過にI hの寄与を示すZD7288の存在下で、EPSP期間の大幅な増加を観察します。制御条件（黒）で、30μMのZD 7288の適用後にソーマから記録（C）電圧トレース（長い（30 PAに応じて赤）; 1秒）過分極電流ステップ。 私の閉塞が<後膜電位整流（サグ）が存在しないことに注意してください。サブ>時間。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
DAニューロンの樹状突起における I h の 図5. 存在 。近位樹状突起上のDAニューロンとピペットの（A）IR-DGCイメージ。（B）細胞接続構成で5 mVの電圧指令時の容量とリーク電流。 。シール抵抗は、この例では5GΩ（C）過分極電圧ステップ（90 mVで、上部）で0 mVでの膜電位から徐々に活性化I Hを誘導しました。現在のトレースが反転し、τ= 632ミリ秒の時定数を与える単一指数関数でフィッティングした。（D）電圧1秒ハイパーへの全細胞記録ソーマ（パネルA）の反応と脱分極電流パルス（120 PAに-160、40 pAの増分）。体全細胞記録は、細胞付着した記録後に行きました。細胞接着型の記録時に自然発火を抑制するためTTXとのCd 2+の細胞外アプリケーションへのAPが存在しないことに注意してください。これらの電位依存性Na +及びCa 2+電流遮断アクション電流を抑制するために添加しました。パネルA - 。。-120 mVの50ミリ秒のプレパルスから0 mVのに試験パルスによって活性化さDと同じニューロンからのものである別のDAニューロンおよび樹状ピペットの（E）IR-DIC画像（F）電位依存性電流アウトサイドアウトパッチでパネルE.保持電位-80 mV単位ニューロンの近位樹状突起から切除。現在の時間依存的不活性化に注意してください。 拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。

物質グラム/モル濃度 1 L用
NaClを 58.443 125 mMの 7.305グラム
NaHCO 3 84.007 25 mMの 2.100グラム
塩化カリウム 74.551 2.5 mMの 0.186グラム
NaH 2 PO 4 137.99 1.25 mMの 0.172グラム
グルコース 198.17 25 mMの 4.95グラム
MgCl 2 1 M（ソリューション） 1 mMの 1 mLの
CaCl 2 1 M（ソリューション） 2 mMの 2 mLの
浸透圧：〜310ミリオスモル/ L（最適範囲- 325ミリオスモル/ L）でpH = 7.4 314

表1： 人工脳脊髄液（ACSF）。

物質グラム/モル濃度 1 L用
NaClを 58.443 87 mMの 5.084グラム
NaHCO 3 84.007 25 mMの 2.1001グラム
塩化カリウム 7.551 2.5 mMの 0.18637グラム
NaH 2 PO 4 137.99 1.25 mMの 0.17248グラム
MgCl 2 1 M（ソリューション） 7 mMの 7ミリリットル
グルコース 198.17 10 mMの 1.9817グラム</ TD>
スクロース 342.29 75 mMの 25.672グラム
CaCl 2 1 M（ソリューション） 0.5 mMの 0.5 mLの
浸透圧：〜326ミリオスモル/ L、pHは= 7.4

表2： スクロースACSFスライスを準備します。

物質グラム/モル濃度 100 mLのための
KMeSO 4 150.2 120 mMの 1.8024グラム
塩化カリウム 74.56 20 mMの 0.14912グラム
MgCl 2 1 M（ソリューション） 2 mMの 200μlの
Na 2 ATP 551.1 2 mMの 0.1102グラム
Na 2 GTP 523.2 0.5 mMの 0.02661グラム
Na 2 -Phosphocreatine 255.1 5 mMの 0.1275グラム
EGTA 380.4 0.1 mMの 3.803ミリグラム
ヘペス 238.31 10 mMの 0.23831グラム
ビオシチン 1mg / mlの 0.1グラム
浸透圧：〜302ミリオスモル/ L、pH値= 7.2 KOHで調整

表3： デュアル録音のための細胞内液。

物質グラム/モル濃度 100用mLの
塩化カリウム 74.56 120 mMの 0.8947グラム
CaCl 2 1 M（ソリューション） 2 mMの 200μlの
MgCl 2 1 M（ソリューション） 1 mMの 100μlの
ヘペス 238.31 10 mMの 0.23831
TEA-Clを 165.7 20 mMの 0.3314グラム
4-AP 94.11 5 mMの 0.04705グラム
BaCl 2 244.26 1 mMの 0.02443グラム
CdCl 2 183.32 0.02 mMの 0.3666ミリグラム
TTX 1 mMの 200 nMの 20μlの
浸透圧：〜290ミリオスモル/ L、D-グルコース（参考文献16）で調整。 pH値= 7.4

表4： 細胞接着型の記録用電極ソリューション。

Discussion

このレポートでは、二重の細胞体樹状突起細胞全体のレコーディングや地元の樹状突起の録音を実現するためのステップバイステップのプロトコルを記述しています。これは、シナプス後電位の時間経過にイオンチャネルの影響（ すなわち、I h）を決定し、それぞれ、黒質DAニューロンの細胞体樹状突起ドメインに沿ってイオンチャネル（I hの ）の分布をマッピングするために有用です。得られた電気生理学的測定は、細胞の形態を回復するためにアドホック組織化学を投稿するために組み合わされます。手順は、腹側被蓋領域DAニューロンまたは他の中脳ニューロンは、黒質に位置するDAニューロンを研究するために使用されたが、隣接する黒質GABAニューロンのために一般化することができます。すべてのステップはまた、重要な変更を加えることなく、黒質ニューロンの樹状突起で発現される他のイオンチャネルを調べるために続くことができる。 事後可視化は、軸索ベアリングとニューロンのために特に適切ですこのような黒質ニューロンのような樹状突起、25,26、海馬oriens-白板の介在ニューロン21またはいくつかのCA1錐体ニューロン67。興味深いことに、この機能を共有するニューロンは、一般的に67考えられていたよりも一般的であるように見えます。形態素解析は、電極と軸索の正確な位置を明らかにする。後者の検出は、免疫組織化学68,69を使用して軸索最初のセグメント（電位依存性Na +チャネルまたはアンキリンG）で発現されたタンパク質を標識によって最適化することができます。

樹状記録とその後の神経細胞のラベリングで収集されたデータの信頼性は、常にスライスの品質に依存します。最大限の努力は、したがって、組織内の細胞の生存率を維持するために適用する必要があります。これは、スライスの準備を通して健康な動物、高品質のツールおよび試薬の穏やかな取り扱い、組織や氷冷温度の十分な酸素を用いて達成されます。安定した記録条件は、健康なニューロンの選択に依存しています。全細胞モードでは、直列抵抗は、最初はできるだけ低くあるべきであり、実験中一定に維持しました。録音の安定性は、ドリフトや振動を欠いている高品質のマニピュレータにさらに依存します。ピペットホルダとの接続を確認し、ヘッドステージには、マイクロマニピュレータケーブルが緩みであることを制御する、温度またはステージ移動の急激な変化を回避し、マニピュレータの機構を確認これらの摂動は、ピペットの安定性を最適化することによって低減することができます。デュアル記録のために、メチル13,15,21は、細胞内液に含まれているが、グルコン酸9,14,25は、代わりに使用することができます。しかし、主な陰イオンは、70,71、膜電位およびいくつかの電圧依存電流72を変更することができます。細胞内液はphysioloを維持するためにATP、GTPおよびクレアチンリン酸を補充することができますニューロンの外科用機能。また、体細胞記録中の樹状突起を可視化するためのピペット溶液（ 例えば 、アレクサ594またはスルホローダミン101 41）内の蛍光色素を添加すると、圧力アプリケーションを配置するには、インスタンスのために有用であることができる（参考文献中の図7。41）または電気刺激ピペット。細胞接着型の記録のためのピペット溶液は、大規模な私の 時間を記録するために、高K +濃度となしのNa +が含まれています 。注目に値するのNa + / K +濃度比は、電流振幅10、現在11の逆転電位とI hの 73のゲーティングに影響を与えます。あるいは、I Hはまた、外部アウト10を用いて記録することができます。しかし、この記録構成では、チャネルの近傍の細胞内環境を摂動することができます。その結果、Iの電圧依存性活性化の違い<比較電流がセル付きパッチと外側アウト10を用いて得られたときに、サブ> Hが観察されます。神経細胞の膨潤が時折パッチクランプ記録中に発生した、と多くの場合、そのような溶液の組成の溶液39またはエラー細胞内および細胞外の間の水の低品質、強力な不均衡浸透圧やpHが明確な原因から生じるされます。電気生理学的記録の品質が回復したニューロンの形態の品質に直接入射しています。細胞内環境14の希釈を最小限にするために細胞接着型の録音後- （参考文献で6,11として、10MΩ。6）と、単一の体細胞の録音のために高抵抗体細胞ピペットは、二重の録画に使用されています。細胞接着型の記録以下の全細胞体細胞記録は、したがって、短い（<10分）に維持されます。体細胞および樹状ピペットの両方からアウトサイドアウトのパッチは、cの適切な閉鎖のために不可欠ですエル膜および細胞形態のその後の回復。セルの構成に加えて、神経化学的コンテンツが記録されたニューロン59,74のために決定されてもよいです。例えば、細胞内タンパク質のチロシンヒドロキシラーゼは、DAニューロン13の明確な識別のために免疫標識することができます。

DAニューロンは、SNに主に集中しているSNに存在するはるかに低い密度で、緻密部は、それらがGABAニューロン75のより多くの数と混合された網様を、扁平部。 DAニューロンの細胞体は、GABAニューロンよりもしばしば大きいが、IR-ビデオ顕微鏡でこれらの細胞の視覚的同定が不明と部分的に緻密部の不透明性により妨げられます。これらの制限を回避するために、DAニューロンの事前選択は、DAニューロンのための神経細胞（TH 65 DATの特定の集団における蛍光マーカーを発現するトランスジェニックマウスを使用することによって促進することができる、GADGABAニューロン）と落射蛍光照明用。あるいは、蛍光色素は、樹状突起の可視化を容易にするために、体の電極の液に含まれてもよいです。蛍光細胞の増加解像度はニポースピニングディスク共焦点14,22,30またはIR-DGC 6に合わせた2光子顕微鏡7によってもたらされます。いくつかの利点がDICと比較してDGCに関連しています。 DICプリズムが必要とされないように、まず、IR-DGC画像は蛍光画像49,52,53,76と重ね合わせることができます。第二に、DGCは、光刺激とし、77光遺伝学組み合わせることができます。

スライス標本の欠点は、ニューロンの完全性の維持です。 DAニューロンは、3つの空間の平面78,79に彼らの樹状突起を伸ばすため、樹枝状の区画の切り捨ては完全にスライス80で回避することはできません。スライスの向きの選択（冠状、水平またはパラ）サジタルトレードオフがあります。神経支配と実験デザインの起源は、スライスの右方向を選択するために考慮しなければなりません。

直接樹状パッチは、細胞の異なるコンパートメントにおける機能的イオンチャネルの分布をマッピングするために使用される技術です。また、この技術は、チャネル20の機能的特性の変動を決定するために提供しています。補体のイオンチャネルの位置および密度は、光及び電子顕微鏡レベル17,23で免疫組織化学を使用して確認することができます。このアプローチは、パッチピペットにアクセスできない小口径構造におけるチャネル密度を決定する可能性を提供しています。しかし、これらのチャネルは、パッチクランプ技術を使用して記録したものと比較して異なる機能状態24、あるいは非アクティブになることがあります。両方の技術は、場所との特性の全体像を取得することが必要です特定の細胞領域17におけるイオンチャネル。電位感受性色素の開発と、電圧画像化は、複数の位置81でのニューロンのAPとEPSPSが増殖を調べるために使用されています。デュアルパッチクランプ記録の代わりに、このアプローチはあってもパッチピペットにアクセスすることはできませんが、信号と平均の正確なキャリブレーションを必要と薄いデンドライトのために実施することができます。

SNと腹側被蓋領域におけるDAニューロンが広く生理学的および病態生理学的文脈における体細胞の録音を経由して調査しているが、それらの樹状突起の機能特性は、両方の条件で大部分が未知のままです。樹状突起からパッチ適用は成功13,25,26といくつかのグループによって黒質ドーパミンニューロンのために実装されており、これらの微細な細胞内構造8の興奮性の特性を分析するための最適な方法のままされています。樹状録音はさらにopportuを提供します無限大は、効率性とシナプス伝達の可塑性と樹状突起の興奮82,83の可塑性を精査します。

Disclosures

著者は彼が競合する金融利害関係がないことを宣言します。

Acknowledgments

私は2番目のAxopatch 200B増幅器の贈り物、GIGA-イメージングのための共焦点顕微鏡とのアドバイスのための優れた技術支援、博士ジャンDefournyとサンドラOrmenese、博士ジャック命運を決めるための彼の一定の支援、のChristelle GillissenとローランMassotteのために博士ヴィンセントSeutinに感謝します批判的に原稿を読み取るための共焦点顕微鏡とIMARISソフトウェアおよび博士スティーブン・フリーマンを共有するためのプラットフォーム。この作品は、ベルギーのFRSからの助成金によってサポートされていました - FNRS（U.N002.13とT.N0015.13）とベルギーの大学財団（PubliéAVECル・コンクール・デ・ラ・財団Universitaire・デ・ベルギー）の支援を発表しました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

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