Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subcellulære Patch-clamp Optagelser fra Somatodendritisk Domain of nigrale dopamin neuroner

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

Dendritter af dopaminerge neuroner modtage og formidle synaptisk input, støtte handling potentiale back-propagation og neurotransmitter frigørelse. Forståelsen af ​​disse grundlæggende funktioner vil belyse overførsel oplysningerne i disse neuroner. Dendritiske patch-clamp optagelser giver mulighed for direkte at undersøge de elektriske egenskaber af dendritter og underliggende spænding ionkanaler. Men disse fine strukturer er ikke let tilgængelige for patch pipetter, på grund af deres lille diameter. Denne rapport beskriver en trin-for-trin procedure til at indsamle stabile og pålidelige optagelser fra dendritter af dopaminerge neuroner i akutte skiver. Elektrofysiologiske målinger kombineres med post hoc genvinding af cellemorfologi. Vellykket eksperimenter afhængige forbedret forberedelse af skiver, løsninger og pipetter, passende justering af optik og stabilitet af pipetten i kontakt med den indspillede struktur. Standard principper for whichatic patch-clamp optagelse påføres dendritter men med en blidere tilgang af pipetten. Disse alsidige teknikker kan gennemføres til at løse forskellige spørgsmål vedrørende overgearet egenskaber dendritter.

Introduction

Neuroner modtager synaptisk information overvejende om deres dendritter. Stimulerende og hæmmende synaptiske signaler spredes fra deres hjemmeside af generation til integrationen site, hvor aktionspotentialer (APS) er fremkaldt som udgangssignalet. På deres vej, er synaptiske potentialer påvirkes både af strukturen af ​​dendritter og samspillet mellem passive og aktive membranegenskaber. Kombinationen af disse meget variable parametre udvider beregningskraft af neuroner 1,2. Men den lille diameter af dendritter hindrer imidlertid studiet af deres elektriske egenskaber. Den fortsatte udvikling af plasteret-clamp teknik 3, har optikken 4 og videreudvikling af metoder til skive forberedelse 5 i løbet af de sidste årtier aktiverede optagelser fra meget tynde (0,7-3 um Ø) dendritter 6,7. Disse metoder var, og er stadig i vid udstrækning anvendes til at undersøge ophidselse af dendritter i forskellige of neuroner 8. Direkte dendritiske optagelser er afgørende for at bestemme fordelingen 9-19 og forskelle i de funktionelle egenskaber 20-22 af ionkanaler i forskellige neuronale rum. Disse data er et nødvendigt supplement af ion-kanal distributioner detekteret med immunhistokemi kombineres til lys og elektronmikroskopi 23,24. Dual somatodendritiske optagelser er blevet gennemført for at undersøge udbredelsen af aktionspotentialer 9,13-15,21,22,25-27 og spredning af synaptiske potentialer 13,16,18 langs somatodendritiske domæne af neuroner, få detaljerede passive kabel modeller 28- 30 og undersøge den tidsmæssige opløsning af neuronal integration 31.

Den sorte substans (SN) er en region beliggende i den involveret i flere funktioner, såsom kontrol af bevægelser, kodningen af ​​belønning og vanemæssige adfærd midthjernen. Faldet af dopamin skyldes den specifikketab af dopaminerge (DA) neuroner i SN er forbundet med de motoriske forstyrrelser hos patienter, der lider af Parkinsons sygdom 32. Den nigrale kredsløb er sammensat af to vigtigste celletyper: dopaminerge og GABAerge neuroner. Interessant, disse neuroner har flere specifikke funktioner, der adskiller dem fra andre neuroner. Den Axon af en stor del af DA neuroner og nogle GABA neuroner stammer fra en dendritisk websted angiver, at dendritiske Lysthuset er heterogen (Axon-bærende og Axon-mangler dendritter) 25,26,33. Morfologi disse neuroner kontrast derfor med den typiske organisation af neuroner, hvor overførslen information følger loven af dynamiske polarisering udsendes af Cajal: startende fra dendritter, til soma og endelig til axon 34. DA neuroner er også kendt for at frigive dopamin fra deres dendritter 35, generere sprængning aktivitet 36 og NMDA-receptor plasticitet 37. Den dissecaf disse fænomener er undvigende uden direkte optagelser fra det sted, hvor de er iværksat. For at få indblik i forholdet mellem den præcise placering og funktionelle egenskaber ionkanaler og deres rolle i den dendritiske ophidselse og informationsoverførsel i nigrale neuroner, direkte dendritiske optagelser er den foretrukne metode.

Denne rapport beskriver en detaljeret procedure, der kan bruges til at opnå enkelt og dobbelt patch-clamp optagelser fra dendritter af nigrale neuroner og den tilsvarende post hoc biocytin mærkning. De grundlæggende principper for lappe det somatiske og dendritiske membran er meget ens. Praktisk dog optagelser fra dendritiske steder kræver særlig optimering i forhold til somatiske optagelser. Vellykket dendritiske optagelser stole på kvaliteten af ​​de skiver, optimal justering af optikken, blid tilgang af plasteret pipette og stabilitet af optagelserne.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer beskrevet her følger institutionelle og nationale retningslinjer, EU-direktiver for beskyttelse af dyr og retningslinjerne for sammenslutningen af ​​europæiske laboratorium Animal Science Association.

1. Forberedelse af løsninger

  1. Standard kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, tabel 1)
    1. Brug høj renhed salte 38 og rene glas bægre forvejen er skyllet med dobbelt-destilleret vand for at forberede en frisk opløsning. Brug af høj kvalitet dobbelt-destilleret vand til udarbejdelsen af ​​alle ekstra- og intracellulære løsninger.
    2. Tage en 2 liters bægerglas opløses NaHCO3 i 500 ml vand og en anden til at opløse de andre salte for at forhindre udfældning af divalente ioner 39 ifølge tabel 1. Rens spatel systematisk med dobbelt-destilleret vand og tør den før tager en salt . Brug en magnetisk omrører for at homogenisere dissolution. Tilsæt løsninger fra begge bægre til en passende målekolbe og bringe til passende størrelse.
    3. Sørg for, at den endelige ekstracellulære løsning er fuldstændig gennemsigtig og uden nogen spor af nedbør.
    4. Påfør en gasblanding sammensat af 95% O2 og 5% CO2 (carbogen gas) med et glas mikrofilter stearinlys (Ø 13 mm) 20 - 30 min før perfusion skiverne 38,40. kontrollere forsigtigt osmolaritet (2 - 3 på hinanden følgende målinger) i ACSF med en osmometer (optimal rækkevidde: 314-325 mOsmol / l). den resterende opløsning efter fremstilling Opbevar ved 4 ° C og bruge det inden for 3 dage.
  2. Skæring opløsning (saccharose-ACSF; tabel 2) 5,13
    1. Forbered 3 liter frisk opløsning. Brug 1 L til at forberede hjernen skiver fra et dyr. den resterende opløsning opbevares ved 4 ° C og bruge det inden for 3 dage.
      BEMÆRK: Høj Mg2 + og lave Ca2 + koncentrationer anvendes til decrease synaptisk transmission og substitution af nogle NaCl med saccharose at bevare vævet 5,40.
  3. intracellulære løsninger
    1. Forbered på forhånd 100 ml dobbelt hel-celle optagelser (tabel 3).
    2. Medtag methylsulfat 13,15,21 at opnå god inddrivelse af cellemorfologi. Tilføj biocytin (0,1 - 0,4%) efterfølgende at undersøge morfologi neuron. Medtag et fluorescerende farvestof (f.eks Alexa 594 eller Sulforhodamin 101 41) for at følge udvidelsen af dendritter under optagelsen (valgfrit).
    3. Forbered på forhånd 100 ml elektrode løsning til celle-vedhæftede optagelser (tabel 4). I dette tilfælde den interne opløsning er en høj-K + løsning designet til at isolere den makroskopiske hyperpolarisationsaktiveret kation (I h) og indeholder blokkere for de øvrige spændingsstyrede ionkanaler.
    4. Store intracellulære løsninger i 2 ml alikvoter ved -20 ° C. Brug en ny portion til hver ny optagelse session. Kontroller osmolaritet hver optøet portion forsigtigt med en osmometer. Tag en ny alikvot hvis osmolariteten ikke svarer til den oprindelige værdi.
    5. Opløsningen overføres fra portionen i en 3 ml sprøjte på toppen af ​​hvilke et 0,22 um steril sprøjte filter anbringes. Hold sprøjten på is under indspilningen for at begrænse nedbrydning af dets forbindelser (ATP, GTP eller phosphocreatine).

2. Fabrikation og Fyldning af Patch Pipette

  1. trække
    1. Brug en horisontal elektrode aftrækker og tykvægget borosilikatglas slange. For hel-celle og celle-vedhæftede optagelser, skal du bruge en 2 mm udvendig diameter / 1 mm indvendig diameter. Sørg for, at glasrøret er absolut ren 38.
    2. Hvis dette ikke er tilfældet, fordybe glaskapillarer i et organisk opløsningsmiddel (f.eks ethanol) Først og derefter i dobbelt-destilleret vand. Kort varme kapillære slutninger med en bunsenbrænder. Alternativt ordre glasrør vasket og opvarmes direkte fra producenten (se listen Materials).
    3. For to somatodendritiske optagelser, sikre, at den somatiske pipette modstand er mellem 6 og 10 MOhm 6,11 og mellem 8 og 19 MOhm for dendritiske pipetter når fyldt med intracellulær løsning (tabel 3). Standardisering pipette modstand for celle-attached optagelser til en modstand på 10 MOhm at opnå sammenlignelige resultater langs somatodendritiske domæne af neuron 16,18,42,43.
    4. Forbered friske pipetter før hver indspilning session (hver dag) eller umiddelbart før lappe og bruge dem 5-8 timer efter deres fremstilling 39. Opbevar pipetter i en overdækket glasbeholder at beskytte dem mod støv og obstruktion af spidsen.
  2. Polering
    1. Undersøg og heat-polish hver pipette spids med en microforge at opnå bedre sæler med membranen. Før du bruger microforge, smelte et lille stykke af glas på glødetråden platin opvarmning. Erstat dette glas belægning på glødetråd platin dagligt for konstans (Peter Jonas, personlig kommunikation).
      BEMÆRK: Pipetter anvendes til celle-vedhæftede optagelser kan belægges før varmen-polering skridt til at reducere baggrundsstøj. Coating kan opnås med et isolerende middel såsom smeltet dental voks 22,44 eller en siliconeelastomer 39.

3. Udarbejdelse af Brain Skiver

  1. Brug sunde Wistar rotter mellem 16 - 19 dag gammel. Brug ikke usunde dyr eller dyr, der lider af hypotermi eller dehydrering. Før start fremstillingen af ​​skiver holde dyret i en sikker og tavse sted. Undgå at have noget andet dyr i rummet, mens forbereder et dyr. Manipulere dyr forsigtigt.
  2. Hæld saccharose-ACSF i to 400ml polypropylen (PP) bægerglas og placere dem i -80 ° C fryser i 45 minutter. Bland opløsningen for at få en homogen iskold væske / frosne opløsning og placere bægerglas på is. Levere den sucrose-ACSF løsning med carbogen gas ved hjælp af et mikrofilter lys (Ø 13 mm) i hver PP bæger.
  3. Forbered pålægsmaskine og reserven kammer
    1. Brug en høj kvalitet væv pålægsmaskine med ekstremt lave lodrette svingninger 5,38 for at minimere skader på de overfladiske lag af skiver så meget som muligt. Løs et frisk og hel barberblad på pålægsmaskine.
    2. Brug en ny barberblad for hver klipning. Undgå at bøje af barberblad. Fjern ikke den fede film på overfladen af ​​barberblad (Josef Bischofberger, personlig kommunikation).
    3. Hvis det er muligt, kontrollere den vertikale vibrationer med en vibroprobe fra producenten. Alternativt kan du bruge en skræddersyet vibroprobe 5. Reducer de lodrette svingninger i bladet so at være så tæt som muligt på 0 um.
    4. Forbered en 150 ml reserve kammer 45,46 for skiver som vist på s. 201 i Ref. 39. Hæld standard ACSF i reserven kammeret og placere den i et vandbad. Levere reserven kammer løsning med carbogen ved hjælp af et mikrofilter lys (Ø 6 mm). Sørg for, at carbogen boblerne er så lille som muligt.
      BEMÆRK: Byg en ny reserve kammer hver 2 - 3 måneder for at holde skive kvalitet konstant.
  4. cut skiver
    1. I en stille rum, hvor forsøgslederen ikke forstyrres eller stresset, halshugge dyret med kirurgi saks (længde 150 mm) på niveau med den cervikale medulla.
    2. Skære huden på toppen af ​​dyrets hoved i den nasale til kaudal retning med en skalpel og fjern den sideværts. Skær toppen af ​​kraniet fra kaudalt for den nasale del af hovedet med fine sakse og fjerne begge dele af kraniet sideværts. Fjern Bregn med en tynd spatel og slip den forsigtigt ind i en PP bægerglas indeholdende iskold (0 - 4 ° C) saccharose-ACSF ligevægt med carbogen 38.
      BEMÆRK: Denne sekvens af trin, der skal gøres så hurtigt som muligt, men også stor nøjagtighed (<< 1 min, ca. 40 s).
    3. Holde hjernen i opløsning af PP bægeret for ~ 2 til 5 min. Juster carbogen tryk for at undgå bevægelser af hjernen. Erstat mikrofilteret candle hvis carbogen bobler er for store med en frisk.
    4. Placer hjernen på en 9 cm petriskål, hvor den indvendige bund er dækket med en ~ 0,5 cm tykt Sylgard lag 38. Forbered denne petriskål på forhånd.
    5. Surround hjernen med iskold saccharose-ACSF. Sørg for, at nogle flydende fase af ACSF-saccharoseopløsning dykker hjernen. For koronale skiver, afbrød den frontale del af hjernen i koronale plan med en skalpel eller et barberblad. Fjern lillehjernen med en coronal snit.
    6. Anvend cyanoacrylat lim på prøven bakken (område ~ 1 cm2). Indsæt hjernen blok, således at den forreste del vender mod udskæring scenen. drypper omhyggeligt saccharose-ACSF på toppen af ​​den indsatte hjernen ved hjælp af den store åbning af en glas Pasteur-pipette og efterfølgende langsomt nedsænkes skærekammeret af snitteren. Manøvrere modellen bakke, så at den skærende overflade (dvs. det første væv ramt bladet) er den ventrale overflade af hjernen 40.
    7. Påfør carbogen med en bøjet glas mikrofilter stearinlys (Ø 6 mm) til skærekammeret (valgfrit).
    8. Juster barberbladet i en vinkel på ~ 15 ° med reference til det vandrette plan 5. Skær koronale hjernen skiver af ~ 500 um i kaudalt for nasal retning, før de når substantia nigra. Reducer tykkelse til at skære 300 - 350 um tykke skiver, der indeholder området af interesse.
    9. Separate skiver fra vævet blok med en meget tynd perfusion nål fastgjort tilen sprøjte parallel med kanten af ​​barberbladet. Bøj nålen så den har en vinkel på 90 ° mellem kanylen og sprøjten. Sikre, at ingen tryk påføres barberbladet under fjernelse af udsnit fra vævet blok.
  5. Store skiver
    1. Overfør udsnit med den største åbning af et glas Pasteur-pipette (fastgjort til en kugle) i reserven kammeret. Når alle skiverne overføres til reserven kammer (Christoph Schmidt-HIEBER, personlig kommunikation) bringe temperaturen af ​​vandbadet til 34 ° C i 0,5 - 1 time.
    2. Efter denne periode slukke vandbadet og holde skiverne ved stuetemperatur. Juster carbogen tryk for at undgå bevægelser af skiver i reserven kammer. Hold skiverne i yderligere 10 til 20 minutter, før du starter optagelser.
    3. Rengør udstyr og mikrofilteret stearinlys forsigtigt endnu grundigt med dobbelt-destilleret vand i slutningen af ​​SLIcing procedure.

4. Dual Somatiske og Somatodendric optagelser i nigrale neuroner og biocytin Filing

  1. Følg beskrivelser til samling af en patch-clamp setup for skiver givet i Axon Guide og i Refs. 39,40,47. Oplysninger om mere grundlæggende aspekter af patching er i Ref. 48.
  2. Forbered optagelsen kammer
    1. Placer 1 - 2 ml dobbelt-destilleret vand i optagelsen kammer. Kontroller, at det ikke er utæt. Placer optagelsen kammer på skiftende xy bord.
    2. Feed standard ACSF gennem et oxygen-impermeabelt perfusionsslange systemet (polytetrafluorethylen) til optagelsen kammeret. Stabiliser perfusionen flow i kammeret ved en hastighed af 4 - 5 ml min-1. Holde længden af ​​slangen sammenføjning bægerglasset indeholdende ACSF og registreringen kammer så kort som muligt (1 m).
    3. Vælg en hjerne skive fra reserven kammeret og overføre det tiloptagelsen kammer ved hjælp af den største åbning af et glas Pasteur-pipette. Dæk skive med en platin ring for at forankre den i bunden af ​​optagelsen kammeret som vist på s. 201 i Ref. 39. Brug en flad platin ring (Ø 1,5 cm) og lim parallelle nylontråde (afstand> 2 mm) på den.
  3. Justere og optimere optikken
    1. Visualiser skiver ved hjælp af infrarød (IR) video mikroskopi 4,47,49,50. Juster Köhler belysning 51 og optimere differential interferens kontrast (DIC) 51 optik eller skrå belysning (Dodt Gradient kontrast - DGC) 52,53. Mere detaljer om denne procedure er givet i ref. 40,49.
    2. Kontroller kvaliteten af ​​den pågældende del. Behold kun skiver med glatte og jævne overflader, der ikke er alt for stærkt kontrast og har kun små, spredte kratere.
    3. Fyld 2 friske og ubrugte patch pipetter med intracellulær løsning (
  4. Placer pipetterne over overfladen af udsnittet
    1. Kontroller tilstedeværelsen af chlorid belægning på sølvtråde (badekar referenceelektrode og patch-elektrode, for detaljer, se The Axon Guide og Refs 39,54.).
    2. Sæt sekventielt pipetter ind i pipetteholdere og anvende positivt tryk (~ 70 mbar) ved hjælp af en slange ledning, der forbinder pipette indehaveren, en tre-vejs hane og et manometer 40. Sænk pipette ind i badet af optagelsen kammeret.
    3. Kontroller, at værdien pres på manometeret er konstant for ~ 1 - 2 ud min. Hvis trykket er faldende, kontrollere slanger eller de forseglende O-ringe inde holder pipetten.
    4. Anbring pipettespidsen i midten af ​​videomonitoren og sikre, at den ikke spærres. Sørg for, at pipettespidsen ikke flytter sig, når de anvender eller frigive pres på pipetten.
    5. Check for afdrift og vibrationer af pipettespidsen ved at trække et lille kors i midten af ​​skærmen nøjagtigt ved positionen af ​​pipettespidsen og observere i 5 min mulige bevægelser af spidsen.
    6. Påfør en spænding trin (5 mV) for at overvåge pipette modstand på et oscilloskop. Indstil bedrift potentiale patch-clamp-forstærker til 0 mV. Annuller pipette offset potentiale, således at DC pipette strøm læser nul ved forstærkeren meter 39,51.
    7. Flyt pipetterne ned til skive og opretholde dem over overfladen.
  5. Vælg og lappe en neuron med lange dendritter
    1. Inden substantia nigra vælge en sund neuron med lange dendritter, der kan følges over en lang distance i omtrent samme plAne (figur 1A og 1B) under anvendelse af IR-Dodt Gradient Contrast (IR-DGC). Vælg en glat og ensartet celle krop. Undgå de to kontrastrige celler ved overfladen af den skive (figur 1C og 1D), fordi det er vanskeligt at bryde ind og at bevare stabile optageforhold over tid (stabil seriemodstand). Vælg neuroner, der har deres soma 10 - 30 um under skive overflade.
    2. Flyt somatiske elektrode tæt på soma (40 - 50 pm væk) og den dendritiske elektrode tæt på dendritceller i samme afstand. Brug en 2X forstørrelse (firedobbelte skifter) for at vælge og lappe en del af en dendritceller. Opnå på skærmen en absolut forstørrelse på 2,100X uden forstørrelse (1X) og 5,500X med en 2X forstørrelse.
    3. Lidt frigiver trykket af somatiske pipette med 10 mbar. Hvis det er nødvendigt, regulere dendritisk og somatisk pipette tryk for at undgå forskydning af cell struktur (soma og dendritceller) inden for skive.
    4. Placer dendritiske pipette tæt til membranen for at se en lille dimpling. Slip trykket på pipettespidsen og lappe den dendritceller samtidig med at kontrollere pipettens modstand. Under ideelle betingelser, kun en meget svag sugning er tilstrækkelig til at opnå en god tætning.
    5. Opbevar dendritiske pipette i cellen for grupperne tilstand. Flyt somatiske pipette tæt på somatiske membran og lappe den somatiske membran. Sørg for, at der opnås en høj tætning modstand før brud cellemembranen (> 1 GQ) 39. En hård trække begge pipetter væk fra membranen ved et par um for at undgå deformation af cellelegemet og dendritceller.
    6. For begge pipetter, mindskes mest muligt amplituden af pipetten kapacitans transienter oven på det aktuelle trin under anvendelse af en spændingsimpuls med høj forstærkning og lidt filtrering 51 og oscilloskopet. Træde ind i hel-celle-tilstand with den dendritiske pipette og efterfølgende med den somatiske pipette.
    7. Eliminer de hel-celle kapacitans transienter og kompensere for seriemodstand. Overvåger og dokumenterer adgangen modstand ved begyndelsen af, og regelmæssigt under eksperimentet. Hvis seriemodstand er for høj (> 50 MOhm), gentag med en anden pipette.
    8. Saml IR-DGC billeder (figur 1A og 1B) med en video grafisk printer 25, en frame grabber eller et digitalkamera ved høje og lave forstørrelser.
      BEMÆRK: Hævelse af neuroner under optagelse (Figur 1E og 1F) er sporadisk observeres, men sjældent når osmolaritet og pH af løsninger er justeret 39 korrekt.
    9. Opnå dobbelt somatiske hel-celle optagelser (soma - Soma) med den samme fremgangsmåde (figur 2A).
  6. Påfør lang (flere hundrede ms) stigende depolariserende nuværende trin sekventieltmed somatiske og dendritiske pipette at fremkalde APs (figur 2B, 3C og 3D). Optag den resulterende potentiale på dendritiske og somatiske pipette samtidigt.
  7. Undersøg udbredelsen af kunstige excitatoriske postsynaptiske potentialer (aEPSPs) i dopaminerge neuroner
    1. Opret en excitatorisk postsynaptisk strøm (EPSC) bølgeform at injicere som aktuelle kommando under dobbelt strøm-clamp optagelser (figur 4A og 4B). For at gøre dette, bygge en dobbelt eksponentialfunktion med amplitude og tidsforløb værdier svarende til reelle værdier målt for EPSCs i neuron af interesse 55. styrer forsigtigt samplingfrekvens på den beregnede EPSC og det injicerede EPSC bølgeform at bevare den oprindelige tidsforløb.
      Bemærk: Før påføring af bølgeform i en rigtig neuron, teste det ved hjælp af en model celle.
    2. Sekventielt injicere bølgeform via dendritiske ogsomatisk pipette og optage resulterende potentialer for både somatiske og dendritiske pipetter samtidigt. Tjek regelmæssigt for eventuel afdrift af pipetter.
  8. Afslutning af optagelse fra en neuron
    1. Tag en IR-DGC billedet ved en lav forstørrelse (mål: 5X eller 10X) at dokumentere positionen af ​​neuron i udsnit og elektroderne.
    2. Langsomt og forsigtigt trække dendritiske og somatiske pipetter fra sekventielt den neuronale membran for at danne uden-out patches med begge pipetter. Fjern pipetten under anvendelse af en sekvens af lateral-opadgående bevægelser 38. Disse bør være kort på først og derefter gradvist øge i længden. Denne registrering konfiguration favoriserer korrekt lukning af cellemembranen.
    3. Overvåg faldet i kapacitive strømme (stigning i adgangen resistens) som reaktion på en 5 mV spændingsimpuls i spænding-clamp mens tilbagetrækning af pipetten.
    4. Når membranen er havetførte omkring pipettespidsen, tage det helt ud af optagelsen kammeret. Fjern målet fra badet. Hold skive i optagelsen kammer i 15 - 20 min i standard ACSF at der opnås ligevægt af biocytin (fra den intracellulære opløsning) i det optagede neuron.
    5. overføre forsigtigt skive ved hjælp af den store åbning af en Pasteur-pipette til et 25 ml bred mund rav (brun) glasflaske indeholdende standard ACSF. Luk flasken med en hætte. Se afsnit 6 til fiksering trin.

5. Cell-vedhæftede optagelser

  1. Vælg en neuron med en dendritceller strækker sig over en lang afstand i det samme plan. Sørg for, at dendritceller af interesse kan følges til en veldefineret soma.
  2. Fyld patch-pipetten med elektroden opløsning (tabel 4). Design løsningen til at registrere den aktuelle interesse i cellen-attached konfiguration ved at inkludere specifikke farmakologiske midler til at blokere andre ion channels.
  3. Patch dendritceller i cellen-attached tilstand
    1. Visualiser en del af dendritceller og nærmer omkodning pipette hjælp af manipulator. Tilpasse trykket ved pipettespidsen ved at kontrollere manometeret (70 - 80 mbar) for at undgå forskydning af dendritceller. Patch dendritceller som beskrevet i 4.5.4.
    2. Optag nogle IR-DGC billeder (figur 5A). Forsøge at opnå en tætning modstand så stor som muligt (> 1 GQ 39), i bedste periode mellem 3 - 10 GQ for celle-attached optagelser 18 (figur 5B). Trække pipetten væk fra membranen ved et par um for at undgå deformation af dendritceller.
    3. Overhold action strømninger i cellen-attached tilstand afspejler spontane aktionspotentialer af nigrale neuroner. Supplere ACSF med Ca2 + og Na + kanal blokkere (CdCI2 og TTX, henholdsvis) for at undertrykke action strømninger.
    4. Påfør en 2 svoltage trin med -90 mV fra et holdepotentiale på 0 mV til plasteret at fremkalde I h (figur 5C). Husk, at pipetten potentiale og potentialet hvile membran er i serie i cellen-attached konfiguration 56. For flere detaljer, se The Axon vejledning og Ref. 39.
    5. Tjek regelmæssigt for eventuel afdrift af pipetten.
    6. Ved slutningen af ​​optagelsen, brister plasteret til at gå i hel-celle-funktion og straks en udlæsning af membranpotentialet. Træk pipetten, som beskrevet i afsnit 4.8.2 og 4.8.3 for at få en-out patch.
  4. Optag fra den tilsvarende soma i hel-celle-tilstand
    1. Kig langs dendritceller og find den tilsvarende soma. Brug en høj resistens pipette (5 - 10 MOhm) 6,14,57 fyldt med en K + -baseret intracellulær opløsning (Tabel 3). Påfør en kort sugning (negativt tryk) tilpipettespidsen til at sprænge membranen for at komme ind i hel-celle-tilstand.
    2. Check for identiteten af den neuron i strøm-clamp ved at anvende lange hyper- og depolariserende nuværende trin (figur 5D), og lad biocytin at diffundere langs dendritter. Anvend korte depolariserende nuværende skridt til at visualisere AP tidsforløbet.
    3. Efter ≤10 min trække pipetten for at få en-out patch som beskrevet i afsnit 4.8.2 - 4.8.3. overføre forsigtigt skive ved hjælp af den store åbning af en Pasteur-pipette til et 25 ml ravfarvet glasflaske indeholdende standard ACSF. Luk flasken med en hætte.
    4. Alternativt først indhente en somatisk helcelle med en pipette indeholdende yderligere et fluorescerende farvestof. Tillad diffusionen af farvestoffet og vælge en del af en dendritceller 26. Med en anden pipette lappe dendrit i cellen for grupperne tilstand. Brug et konfokalt mikroskop hvis tilgængelig til at forbedre visualiseringen af ​​fluorescens etiketed dendritceller 14,22.
    5. Udfør dendritiske optagelser i udenfor-out konfiguration, alternativt eller yderligere til celle-attached optagelser 10,22. Se et eksempel på en spændings-styrede strømme er optaget fra en ekstern-out patch i figur 5E og 5F.

6. biocytin mærkning af nigrale neuroner

  1. Fiksering af væv
    1. Brug om muligt separate værelser til skive optagelse / histokemisk behandling 38.
    2. Fix skiverne ved at erstatte ACSF med 4% paraformaldehyd i 0,1 M phosphatbuffer saltvand (PBS, pH = 7,4) med en Pasteur-pipette. Brug altid frisklavet fikseringsopløsning (<< 1 uge gammel).
      ADVARSEL: Anvend passende hånd handsker og et kemisk hætte anbragt i en histologi laboratorium at manipulere paraformaldehyd grund af dets toksicitet. Læs sikkerhedsdatabladet for denne farlige produkt før brug og cdælen den regler om kemiske sikkerhed (direktivet om farlige stoffer (67/548 / EØF) fra EU-Kommissionen), da dette pulver menes at fremkalde kræft. Andre detaljer er i Ref. 58.
    3. Læg skiverne ved 4 ° C natten over. Undgå forurening af patch-clamp setup eller noget udstyr, der anvendes til elektrofysiologi af paraformaldehyd.
    4. Efter fiksering udskifte fiksativ opløsning med PBS. Brug en anden Pasteur-pipetter til fjernelse af fiksativ opløsning og anvendelse af PBS. Opbevar skiver i PBS ved 4 ° C før yderligere behandling (1 - 2 uger). I dette tilfælde, erstatte PBS to gange om ugen. Brug altid frisklavet PBS (<< 1 uge gammel).
  2. Farvning af vævet
    1. Forbered en 24 cellekulturplade plade til farvning trin. Brug rent udstyr til at overføre skiver. Skyl skiverne 3 x 5 min med friske PBS.
    2. Påfør Fluorescein Avidin DCS (Avidin D, celle sorteringsanlæg lønklasse 1 pi Lysstofrørcein / mL Triton X-100) og 0,3% Triton X-100 i PBS ved 4 ° C natten over. Beskytte skiverne fra lys i hele farvning. Som et alternativ til fluorescens, label neuroner via 3,3'-diaminobenzidin for lys eller elektronmikroskopisk analyse 21,58.
      ADVARSEL: Triton X-100 er farligt. Læs sikkerhedsdatablad og EU Kommissionens direktiver, før du bruger dette stof.
    3. Skyl 3 x 30 min med PBS og efterfølgende med PB (phosphatbuffer, for at undgå dannelsen af ​​krystaller ved overfladen af ​​udsnittet).
  3. Monter skiverne på standard objektglas. Dæk skiverne omhyggeligt med et omsluttende medium. Undgå luftbobler i indlejring medium. Sæt dækglasset forsigtigt for at dække fuldstændigt udsnittet. Air-tørre dias natten før visualisere dem med et mikroskop.
  4. Opbevar de mærkede skiver ved 4 ° C efter visualisering. Nyttige tricks på histokemiske procedurer er i Refs. 58,59.
  5. Rengør udstyr til histologi og elektrofysiologi separat. Bland ikke histologi og elektrofysiologi udstyr sammen.

7. Indlæg Hoc Visualisering af biocytin-fyldte neuroner

  1. Brug et konfokalt mikroskop for at visualisere morfologien af ​​genvundne neuroner.
    1. Groft finde fluorescensmærkede neuron i skive med epifluorescens. Undersøg dendritiske Lysthuset af neuroner og find Axon og axonal bleb (2 - 4 um Ø) med en 10x eller 20x objektiv. Dokumentere løbet af axon.
    2. Skift til konfokal mikroskop og vælg 488 nm laserdiode til at ophidse fluorescein indeholdt i den mærkede neuron. Følg forlængelsen af ​​axon og dendritter i z-aksen.
    3. Optage på hinanden følgende billeder for at opnå en z-stak for hele cellen. Juster opløsningen af ​​z-aksen (afstanden mellem på hinanden følgende billeder) til 0,5-1 um. Saml konfokale billeder af en celle using lav (10X objektiv) og høj (60X objektiv, olie-nedsænkning) forstørrelse.
    4. Åbn billedfilen af neuron opnået med den konfokal mikroskop med en imaging software (ImageJ) 60. Sammenlign z-projektion billede med en IR-DGC billede ved øjet til at finde den nøjagtige position af patch pipetter i løbet af de elektrofysiologiske optagelse (figur 1, 2A, 3A, 4A, 5A og 5E).
    5. Bestem morphometries af mærkede neuroner: måle Axon - soma afstand, afstande mellem optagelse pipetter langs somatodendritiske domæne og mellem dendritiske pipette og Axon ved hjælp af "Measure" -funktionen i ImageJ.
    6. Rekonstruere nogle neuroner med NeuronJ (ImageJ), Imaris 29 eller Neuromantic 61.

8. Analyse af Elektrofysioloqisk data

  1. Brug softwarepakken forbundet med forstærkeren til groft analysere data (f.eks Clampfit) eller direkte enanden software til dataanalyse såsom Stimfit, et open source-software 62,63 som i vores seneste publikation 13 eller for eksempel WinWCP.

Representative Results

Den ovenfor beskrevne protokol har til hensigt at lette indsamlingen af ​​data ved hjælp af dendritiske patch-clamp optagelser. Denne teknik, kombineret med post hoc histokemi, er med til at få indblik i mekanismerne i mange elektriske signaler oprindelse eller spredning i dendritter. Direkte adgang til dendritter med patch pipetter er svært, men særlig opmærksom på flere metodologiske aspekter vil forbedre succesraten af ​​optagelserne. En forsøgslederen tilstrækkelig erfaring i stabil somatiske optagelse kan forvente at opnå høj modstand (GQ) tætninger og komplette eksperimenter på de fleste forsøg. kan indsamles En til to af høj kvalitet dendritiske optagelser pr dissektion.

Tilgængeligheden af høj kvalitet hjerneskiver indeholdende sunde somata og dendritter er en forudsætning for at få adgang til disse fine strukturer (figur 1). Den criterien til udvælgelsen af disse neuroner er en glat og homogen overflade over hele cellen og en soma og dendritter med lav kontrast når de observeres med optimale justeret optik (figur 1A og 1B). Valg neuroner for stærkt kontrast generelt fører til ustabile optagelser (figur 1C og 1C). Derfor bør undgås sådanne neuroner.

I sammenligning med andre neuroner, nigrale DA neuroner have særlig morfologiske og elektrofysiologiske egenskaber. Disse funktioner normalt vurderes med en enkelt somatisk pipette kan også ses i dobbelt somatiske (figur 2) og somatodendritiske optagelser (figur 3). Lange hyperpolarisering nuværende injektioner inducerer et membranpotentiale berigtigelse kaldet "synke" (figurerne 2B og 5D). Axon stammer, i de fleste tilfælde på en dendritisk sted som identificeretanvende supplerende kriterier 13,25,26, hvilket indikerer, at den dendritiske rum i disse neuroner er heterogent (figur 3A - 3B). Som følge heraf rummet, hvor AP observeres først svarer til rummet, hvori Axon fremgår (figur 3C - 3D) 13,25,26. Axon er generelt afsluttet ved en axonal bleb forårsaget af en skæring af axon under udskæring 64, men denne struktur er ikke systematisk registreret.

Den markante nedhængning observeret i nigrale DA neuroner i træk til aktiveringen af I h antyder en høj ekspression af HCN-underenheder. For at bestemme indflydelsen af jeg h på integrationen af synaptiske signaler, blev synaptiske-lignende aktuelle (EPSC) kurveformer genereret og injiceres via den dendritiske optagelse elektrode under somatodendritiske dual optagelser 55 (<strong> Figur 4). Kinetik disse simulerede EPSCs var baseret på de stige og forfald tidskonstanter af rigtige spontane EPSCs. Den resulterende aEPSP blev optaget med den somatiske elektrode. Bad anvendelse af I h blocker ZD 7288 steg varigheden af aEPSP med angivelse bidrag I h til tidsforløbet af synaptiske signaler (figur 4B). ZD 7288 afskaffede også membranpotentialet berigtigelse bekræfter, at synke skyldes aktiveringen af I h (figur 4C). De opnåede med simulerede EPSP'er resultater kan korreleres til forsøg med elektrisk fremkaldt EPSP'er 65. At kortlægge den præcise fordeling af kanalen i somatodendritiske domæne af DA-neuroner, blev celle-attached optagelser gennemført (figur 5). En høj-modstand forsegling (>> 1 GQ) er en absolut nødvendighed for celle-attached optagelser (figur 5B jeg h aktiverer langsomt med lange hyperpolarisering spænding trin og den nuværende steady-state opnås efter hundredvis af ms (figur 5C), som tidligere vist 66. Denne observation indikerer, at HCN-kanaler udtrykt i dendritter af DA neuroner har forskellige underenheder i forhold til dem i pyramidale neuroner eller andre celletyper 10,16,66. Da fordelingen af ​​kanalen kan være ikke-homogen i den dendritiske rum og som den dendritiske rum er selv heterogen, er identiteten af ​​dendrit (axon-bærende eller nonaxon-bærende dendritceller) afslørede ved at sammenligne IR-DGC billede med det konfokale billede efter biocytin farvning (figur 3A og B). Inddrivelse af cellemorfologi er derfor nødvendigt for både dobbelte somatodendritiske optagelser og for celle-vedhæftede optagelser via efterfølgende somatiske hel-celle optagelser.


Figur 1. visualisere Soma og proksimale dendritter af nigrale dopaminerge neuroner Brug Infrarød Videomicroscopy. (A) IR-DGC billede af en nigrale DA neuron viser soma og proximale dendritceller og begge somatiske og dendritiske pipetter. En dobbelt somatodendritisk optagelse med succes udført på denne sunde neuron. Observere lav kontrast og den glatte overflade over hele somatodendritiske domæne af cellen. (B) Et andet eksempel på en sund DA neuron. (C) DA neuron med en grovere og ujævn overflade og en stærkere kontrast. Mens en dobbelt optagelse er opnået, stabiliteten var suboptimal, og varigheden optagelsen var kort (~ 15 min) som følge af en gradvis forøgelse af adgangen modstand i begge pipetter. (D) Anden eksempel på en DA neuron viser en stærkt kontrast soma og proximale dendritceller. I dette tilfælde blev en kraftig stigning i adgangen modstand observeret kort efter pausen i hel-celle-tilstand. Et forsøg på at formindske adgang resistens ved negativt tryk mislykkedes. Neuroner i panel C og D kan være blevet beskadiget under udskæring procedure og bør undgås for eksperimenter. (E) Samtidig dobbelt somatisk optagelse i en sund DA neuron ved begyndelsen af optagelsen. (F) Samme neuron som i panel E med en opsvulmet celle kroppen efter ~ 17 min. Bemærk den fulde fravær af kontrast, bolden-lignende udseende af soma og tilstedeværelsen af den store kerne, som ikke er synlige i sunde neuroner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Samtidig Dobbelt Somatisk Optagelse fra en DA Neuron. (A) IR-DGC billede under dobbelt somatisk optagelse fra en DA-neuron. (B) hyperpolarisering og depolariserende 1 s lange aktuelle injektioner (-160 til 80 pA, tilvækst 80 pA) og tilsvarende spændingsændringer optages samtidigt med begge patch pipetter. Bemærk tilstedeværelsen af synke sammen i spænding spor med den lange hyperpolarisering aktuelle trin og den store efter-hyperpolarisering efter AP under depolariserende aktuelle puls. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Dual S omatodendritic Optagelse i en DA Neuron. (A) IR-DGC billede af en DA-neuron. Afstanden mellem dendritiske og somatic pipette er 29 um. (B) Konfokal z-projektion billede af neuron i panel A mærket med avidin konjugeret til fluoresceinisothiocyanat (FITC). Den neuron var fyldt med biocytin under optagelse. Axon stammede fra en proximal dendritceller tæt på soma som angivet med pilen. (C) samtidig Dual somatodendritisk helcelle-spænding optagelse fra neuron i panel A. AP registreret i soma (sort spænding spor) og dendritceller (rød spænding spor) som svar på en 1 s lang strøm injektion trin via somatiske (venstre, sort aktuelle spor) og alternativt dendritiske pipette (højre, rød nuværende spor) (D) somatisk og dendritiske AP vist på udvidet tidshorisont.. Med enten somatisk eller dendritiske aktuelle injektion, den somatiske AP (sort) forud for dendritiske AP (rød). Forsinkelsen mellem APs i denne neuron var 120 mikrosekunder og 210 mikrosekunder med somatiske og dendritiske nuværende injektion hhv. Forsinkelserblev målt ved AP halvmaksimal amplitude under stigende fase af AP. AP observeres først i rummet tæt på som Axon opstår, hvilket bekræfter tidligere bemærkninger 25,26. I dette tilfælde er den dendritiske optagelse foretaget fra en axon-mangler dendritceller. Et eksempel på en optagelse fra en Axon bærende dendritceller er i Ref. 13 (i deres figur. 1). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Formering af kunstige EPSP Langs Somatodendritisk Axis af DA neuroner. (A) IR-DGC billede af et DA neuron. Afstanden mellem dendritiske og somatiske pipette er 45 um. Begge patch pipetter er i hel-celle strøm-clamp optagefunktion. (B) Currentoptaget med den dendritiske pipette i strøm-clamp og anvendes til at generere den kunstige EPSP (øverst). Den aktuelle opnås ved injektion af en EPSC-lignende bølgeform (T rise = 0,6 ms; τ henfald = 3 ms amplitude = 100 Pa) via den dendritiske optagelse pipette 55. Nederst, formeret aEPSPs indspillet i soma i kontrol betingelser (sort) og efter badet anvendelse af I h blocker ZD7288 (30 uM, rød spor). Hver spænding spor er gennemsnittet af 40 enkelte sweeps. Overhold den store stigning i EPSP varighed i tilstedeværelse af ZD7288 angiver bidrag jeg h til tidsforløbet for EPSP'er. (C) Spænding spor optaget fra soma i kontrol betingelser (sort), og efter anvendelse af 30 uM ZD 7288 ( rød) som respons på en lang (30 pA; 1 s) hyperpolarisering aktuelle trin. Bemærk fraværet af membranpotentialet berigtigelse (SAG) efter blokering af I <sub> h. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Tilstedeværelse af I h i dendritter af DA Neuron. (A) IR-DGC billede af en DA-neuron og pipette på proksimale dendritceller. (B) Kapacitive og læk strømme under en 5 mV spænding kommando i celle-attached konfiguration. Forseglingen var resistens 5 GQ i dette eksempel (C) hyperpolariserende spændingstrin. (90 mV; top) fra et membranpotentiale af 0 mV inducerede en langsomt aktiverende I h. Den aktuelle spor blev vendt og monteret med en enkelt eksponentialfunktion giver en tidskonstant afT = 632 ms. (D) Spændingsvarene fra hel-celle optaget soma (panel A) til en s hyper- og depolariserende strømpulser (-160 til 120 pA, 40 pA tilvækst). Den somatiske helcelle-optagelse blev udført efter den celle-attached optagelse. Bemærk fraværet af AP'er grund af den ekstracellulære anvendelse af TTX og Cd 2+ at undertrykke spontan fyring under celle-bundet optagelse. Disse spændingsstyrede Na + og Ca2 + aktuelle blokkere blev tilsat for at undertrykke action strømninger. Paneler A - D er fra samme neuron (E) IR-DIC billede af en anden DA-neuron og en dendritiske pipette (F) Voltage-afhængige strømme aktiveres af en test puls til 0 mV fra en 50 ms prepulse på -120 mV.. i en uden-out patch udskåret fra den proximale dendrit af neuronet i panel E. Holding potentiale -80 mV. Bemærk den tidsafhængige inaktivering af den nuværende. Klik her for at se et størreversion af denne figur.

Stof g / mol Koncentration i 1 L
NaCl 58,443 125 mM 7,305 g
NaHCO3 84,007 25 mM 2,100 g
KCI 74,551 2,5 mM 0,186 g
NaH 2 PO4 137,99 1,25 mM 0,172 g
glukose 198,17 25 mM 4,95 g
MgCl2 1 M (opløsning) 1 mM 1 ml
CaCl2 1 M (opløsning) 2 mM 2 ml
Osmolaritet: ~ 310 mOsmol / L (optimale område: 314 - 325 mOsmol / l), pH = 7,4

Tabel 1: Kunstig cerebrospinalvæske (ACSF).

Stof g / mol Koncentration i 1 L
NaCl 58,443 87 mM 5,084 g
NaHCO3 84,007 25 mM 2,1001 g
KCI 7,551 2,5 mM 0,18637 g
NaH 2 PO4 137,99 1,25 mM 0,17248 g
MgCl2 1 M (opløsning) 7 mM 7 ml
glukose 198,17 10 mM 1,9817 g </ Td>
saccharose 342,29 75 mM 25,672 g
CaCl2 1 M (opløsning) 0,5 mM 0,5 ml
Osmolaritet: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4

Tabel 2: Sucrose-ACSF at forberede skiver.

Stof g / mol Koncentration for 100 ml
KMeSO 4 150,2 120 mM 1,8024 g
KCI 74,56 20 mM 0,14912 g
MgCl2 1 M (opløsning) 2 mM 200 pi
Na 2 ATP 551,1 2 mM 0,1102 g
Na 2 GTP 523,2 0,5 mM 0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine 255,1 5 mM 0,1275 g
EGTA 380,4 0,1 mM 3.803 mg
Hepes 238,31 10 mM 0,23831 g
biocytin 1 mg / ml 0,1 g
Osmolaritet: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 indstillet med KOH

Tabel 3: Intracellulær løsning til to optagelser.

Stof g / mol Koncentration for 100ml
KCI 74,56 120 mM 0,8947 g
CaCl2 1 M (opløsning) 2 mM 200 pi
MgCl2 1 M (opløsning) 1 mM 100 pi
Hepes 238,31 10 mM 0,23831
TEA-Cl 165,7 20 mM 0,3314 g
4-AP 94,11 5 mM 0,04705 g
BaCI2 244,26 1 mM 0,02443 g
CdCI2 183,32 0,02 mM 0.3666 mg
TTX 1 mM 200 nM 20 pi
Osmolaritet: ~ 290 mOsmol / l, justeret med D-glucose (ref. 16); pH = 7,4

Tabel 4: Elektrode løsning for celle-vedhæftede optagelser.

Discussion

Denne rapport beskriver en trin-for-trin-protokollen til at gennemføre dobbelt somatodendritiske hel-celle optagelser og lokale dendritiske optagelser. Det er nyttigt til bestemmelse af indflydelsen af ionkanaler (dvs. jeg h) på tidsforløbet af postsynaptiske potentialer og kortlægning af fordelingen af ionkanalen (I h) langs somatodendritiske domæne af nigrale DA-neuroner, hhv. Resulterende elektrofysiologiske målinger kombineres for at skrive hoc histokemi at inddrive cellemorfologi. Proceduren blev anvendt til at undersøge DA neuroner beliggende i substantia nigra, men kan generaliseres til tilstødende nigrale GABA-neuroner, ventral tegmentalområde DA neuroner eller andre midthjernen neuroner. Alle trin kan også følges for at undersøge andre ionkanaler udtrykt i dendritter af nigrale neuroner uden vigtige ændringer. En post-hoc visualisering er særlig relevant for neuroner med axon-bærendedendritter, såsom nigrale neuroner 25,26, hippocampale Oriens-Alveus interneuroner 21 eller nogle CA1 pyramidale neuroner 67. Interessant, neuroner, der deler denne funktion synes at være mere udbredt end generelt menes 67. Morfologisk analyse afslører også den nøjagtige position af elektroderne og Axon. Påvisning af sidstnævnte kan optimeres ved mærkning af proteiner udtrykt i Axon indledende segment (spændingsafhængige Na + kanaler eller ankyrin G) ved hjælp af immunhistokemi 68,69.

Pålideligheden af ​​data indsamlet med dendritiske optagelser og efterfølgende neuronal mærkning uvægerligt afhænger af skive kvalitet. Maksimal indsats skal derfor anvendes til at bevare levedygtigheden af ​​celler i vævet. Dette opnås med skånsom håndtering af sunde dyr, høj kvalitet værktøjer og reagenser, tilstrækkelig iltning af væv og iskolde temperaturer i hele forberedelsen af ​​skiver. Stabile optageforholdene stole på udvalg af sunde neuroner. I helcelle-tilstand, bør seriemodstand i starten være så lav som muligt og holdes konstant gennem hele forsøget. Stabiliteten af ​​optagelserne er yderligere afhængig af høj kvalitet manipulatorer blottet for afdrift og vibrationer. Disse forstyrrelser kan reduceres ved at optimere pipette stabilitet: kontrollere forbindelsen til pipette indehaveren og hovedtrin, kontrollere, at mikromanipulator kabler er slap, undgå pludselige ændringer i temperatur eller scene bevægelse og kontrol af mekanismen af ​​manipulator. For to optagelser, er methylsulfat 13,15,21 medtaget i den intracellulære løsning, men gluconat 9,14,25 kan alternativt anvendes. Imidlertid kan den vigtigste anion ændrer membranpotentialet 70,71 og nogle spændingsafhængige strømme 72. Intracellulær opløsning kan suppleres med ATP, GTP og phosphocreatin at bevare physiologiske funktioner af neuroner. Derudover, tilsætning af et fluorescerende farvestof i pipetten opløsning (f.eks Alexa 594 eller Sulforhodamin 101 41) for at visualisere dendritter under en somatisk optagelse kan være nyttigt for eksempel at placere en trykpåføring (figur 7 i Ref. 41) eller en elektrisk stimulerende pipette. Pipetten løsning til celle-bundet optagelser indeholder en høj K + koncentration og ingen Na + optages store Ih. Bemærkelsesværdige Na + / K + koncentrationsforhold påvirker strømamplitude 10, omvendt potentiale af de nuværende 11 og gating af I h 73. Alternativt kan I h også registreres ved hjælp uden-outs 10. I denne optagelse konfiguration kan dog den intracellulære miljø i nærheden af ​​kanalerne blive foruroliget. Følgelig forskelle i spænding-afhængig aktivering af I <sub> h observeres, når man sammenligner strømme opnået ved hjælp af celle-vedhæftede patches og uden-outs 10. Hævelse af neuroner er lejlighedsvis stødt under patch-clamp optagelse, og ofte skyldes forskellige årsager, såsom den lave kvalitet af vandet, stærk ubalance i osmolaritet eller pH mellem intra- og ekstracellulære løsninger 39 eller fejl i sammensætningen af løsninger. Kvaliteten af ​​elektrofysiologiske optagelser har en direkte indvirkning på kvaliteten af ​​morfologi af genvundne neuroner. Høj modstandsdygtighed somatiske pipetter anvendes til dobbelt optagelser (6 - 10 MQ, som i Refs 6,11.) Og for enkelte somatiske optagelser efter celle-bundet optagelser for at minimere fortynding af det intracellulære miljø 14. Helcelle-somatisk optagelse efter celle-attached optagelse derfor holdes kort (<10 min). Udenfor-out patches fra både somatiske og dendritiske pipetter er afgørende for korrekt lukning af cell membran og efterfølgende genopretning af cellen morfologi. Ud over cellens struktur, kan bestemmes den neurokemiske indhold til de registrerede neuroner 59,74. For eksempel kan det intracellulære protein tyrosin hydroxylase blive immunolabeled til utvetydig identifikation af DA neuroner 13.

DA neuroner er primært koncentreret i SN pars compacta, med en meget lavere densitet stede i SN pars reticulata, hvor de blandes med et højere antal GABA-neuroner 75. Mens cellelegemet af DA-neuroner er ofte større end den for GABA-neuroner, den visuelle identifikation af disse celler med IR-videomicroscopy er usikker og delvist hæmmet af opaciteten af ​​pars compacta. For at omgå disse begrænsninger, kan den første udvælgelse af DA neuroner lettes ved brug af transgene mus, der udtrykker et fluorescerende markør i en bestemt population af neuroner (TH 65 eller DAT for DA neuroner, GADfor GABA-neuroner) og epifluorescensbelysning. Alternativt kan et fluorescerende farvestof indgå i opløsning af den somatiske elektrode for at lette visualiseringen af ​​dendritter. Øget opløsning af det fluorescerende celle er anlagt af Nipkow spinning disk konfokal 14,22,30 eller to-foton mikroskopi 7 kombineres til IR-DGC 6. Adskillige fordele er relateret til DGC i sammenligning med DIC. Først, som DIC prismer ikke er påkrævet, IR-DGC billede kan overlejres med et fluorescens-billede 49,52,53,76. For det andet kan DGC kombineres med photostimulation og optogenetics 77.

En ulempe ved skive præparat er bevarelsen af ​​integriteten af ​​neuroner. DA neuroner udvide deres dendritter i de tre rumlige planer 78,79 og dermed trunkering af den dendritiske rum ikke helt kan undgås i skiver 80. Valget af orienteringen af ​​skiverne (koronale, vandret eller parasagittal) er et trade-off. Oprindelsen af ​​innervation og det eksperimentelle design skal anses for at vælge den rigtige retning skiver.

Direkte dendritiske patching er den anvendte teknik til at kortlægge fordelingen af ​​funktionelle ionkanaler i de forskellige rum af celler. Desuden denne teknik tilbyder at bestemme variabiliteten i funktionelle egenskaber af kanaler 20. Som et supplement placering og tæthed af ionkanaler kan konstateres ved hjælp af immunhistokemi på de lette og elektronisk mikroskopi niveauer 17,23. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for at bestemme den kanal tæthed i små kaliber strukturer, som er utilgængelige for patch pipetter. Men disse kanaler kan være i en særskilt funktionel tilstand 24 eller endda inaktive i forhold til dem, optaget med patch-clamp-teknikker. Begge teknikker er derfor nødvendigt at få et fuldstændigt billede af placering og egenskaberionkanaler i en specifik cellulær område 17. Med udviklingen af spændingsfølsomme farvestoffer, er spænding billeddannelse blevet anvendt til at undersøge udbredelsen af AP'er og EPSP'er i neuroner på flere steder 81. Som et alternativ til dobbelt patch-clamp optagelser, kan denne tilgang også gennemføres for tynde dendritter, der ikke er tilgængelige for patch pipetter men nødvendiggør nøjagtig kalibrering af signalet og gennemsnit.

Mens DA neuroner i SN og ventrale tegmentalområde er almindeligt undersøgt via somatiske optagelser i den fysiologiske og patofysiologiske kontekst, de funktionelle egenskaber af deres dendritter forbliver stort set ukendt i begge betingelser. Patching fra dendritter er blevet implementeret for nigrale dopamin neuroner af adskillige grupper med succes 13,25,26 og er fortsat den foretrukne fremgangsmåde til at dissekere exciterbare egenskaber af disse fine subcellulære strukturer 8. Dendritiske optagelser giver en yderligere MULIGHEDERskabet at kontrollere effektiviteten og plasticitet synaptisk transmission og plasticitet dendritiske uro 82,83.

Disclosures

Forfatteren erklærer, at han ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Jeg takker Dr. Vincent Seutin for hans konstante støtte, Christelle Gillissen og Laurent Massotte for fremragende teknisk bistand, Drs Jean Defourny og Sandra Ormenese for råd med konfokale mikroskop, Dr. Jacques markedsavance for gaven af ​​den anden Axopatch 200B forstærker, GIGA-Imaging platform for deling af konfokal mikroskop og Imaris software og Dr. Stephen Freeman for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra de belgiske FRS - FNRS (U.N002.13 og T.N0015.13) og offentliggjort med støtte fra det belgiske University Foundation (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93 (2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50 (2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4 (2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54 (2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Tags

Neuroscience dendritceller patch-clamp dual optagelser celle-tilknyttet biocytin mærkning neuronal morfologi substantia nigra dopaminerge neuron ionkanal
Subcellulære Patch-clamp Optagelser fra Somatodendritisk Domain of nigrale dopamin neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engel, D. Subcellular Patch-clamp… More

Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter