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Neuroscience

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

도파민 뉴런의 수상 돌기 수신 및 시냅스 입력, 지원 활동 전위 역 전파 및 신경 전달 물질 방출을 전달. 이러한 기본적인 기능을 이해하는 것은 이러한 신경 세포의 정보 전달을 밝혀됩니다. 수지상 패치 클램프 기록을 직접 돌기 및 기저 전압 관문 이온 채널의 전기적 특성을 검사 할 수있는 가능성을 제공한다. 그러나 이러한 미세 구조 때문에 작은 직경의 패치 피펫에 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 이 보고서는 급성 조각에서 도파민 뉴런의 수상 돌기에서 안정적인 기록을 수집하는 단계별 절차를 설명합니다. 전기 생리 측정은 세포 형태의 사후 복구와 결합된다. 성공적인 실험은 조각, 솔루션과 피펫, 기록 된 구조와 접촉하는 광학 및 피펫의 안정성의 적절한 조정의 개선 준비에 의존하고 있습니다. 솜의 기본 원칙ATIC 패치 클램프 녹음 수상 돌기에 있지만 피펫의 완만 한 접근 방식으로 적용됩니다. 이러한 다양한 기술은 수상 돌기의 흥분 특성에 관한 다양한 질문을 해결하기 위해 구현 될 수있다.

Introduction

신경 세포는 수상 돌기에 주로 시냅스 정보를받을 수 있습니다. 흥분성 및 활동 전위 (APS)를 출력 신호로 유발되는 통합 사이트로 세대의 사이트에서 확산 억제 시냅스 신호. 길에서 시냅스 전위는 수상 돌기의 구조와 수동 및 능동 막 특성 사이의 상호 작용 모두에 의해 영향을 받는다. 이러한 고도의 가변 파라미터의 조합은 1,2- 뉴런의 계산 능력을 넓힌다. 그러나, 수상 돌기의 직경이 작은 그러나 자신의 전기적 특성의 연구를 방해한다. 6, 7을 수상 돌기 - (3 μm의의 Ø 0.7) 패치 클램프 기술 (3)의 지속적인 개발은 지난 수십 년 동안 광학 4 조각 준비 5 방법의 정제는 매우 얇은에서 녹음을 사용할 수있다. 이러한 방법은 있었고, 여전히 대부분 다양한 O를 수상 돌기의 흥분을 검사하는 데 사용됩니다F 뉴런 (8). 직접 수상 기록은 기능적 특성 별개의 신경 세포 구획에서 이온 채널의 20 ~ 22의 분포 9-19과 차이점을 확인하는 것이 필수적이다. 이러한 데이터는 광학 및 전자 현미경 (23, 24)에 결합하여 면역 조직 화학 검출 이온 채널 분포의 필요한 보완. 듀얼 somatodendritic 녹음 상세한 패시브 케이블 모델, 활동 전위 9,13-15,21,22,25-27 뉴런의 somatodendritic 도메인 따라 시냅스 전위 13,16,18 확산의 전파를 탐색 수득 구현 된 28- (30)는 신경 세포 통합 (31)의 시간 분해능을 조사.

흑색질 (SN)는 이러한 이동의 제어, 보상 및 습관성 행동 부호화 여러 기능에 관여 중뇌에있는 영역이다. 특정에 의한 도파민의 감소SN에서 도파민 (DA) 신경 세포의 손실은 파킨슨 병 (32)을 앓고있는 환자에서 관찰 된 운동 장애와 관련된다. 도파민과 GABA 성 신경 세포 다음 흑색질 회로는 두 가지 종류의 세포로 구성되어있다. 흥미롭게도,이 신경 세포는 다른 신경 세포와 구별 몇 가지 특정 기능을 가지고 있습니다. DA 뉴런 및 일부 GABA 신경 세포의 큰 비율의 축삭은 돌기의 아버는 이종 (축삭 베어링 및 축삭-부족 수상 돌기) 25,26,33가 있음을 나타내는 수지상 사이트에서 유래. 소마로, 수상 돌기에서 시작하여 최종적으로 34 축삭하는 이러한 신경 세포의 형태는 정보 전달 동적 Cajal에 의해 방출 편광의 법을 따라하는 신경 세포의 전형적인 조직에 따라서 대조. DA 뉴런은 그 돌기 (35)로부터 도파민을 방출 붕괴 활성 36 NMDA 수용체 가소성 (37)를 생성하는 것으로 알려져있다. dissec이러한 현상의 기 그들이 시작하는 사이트에서 직접 녹음하지 않고 애매하다. 정확한 위치 및 이온 채널의 기능적 특성과 흑색질 신경 세포의 수지상 흥분과 정보 전달의 역할 사이의 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해, 직접 수상 기록은 선택의 방법입니다.

이 보고서는 흑색질 신경 세포의 수상 돌기 및 대응하는 사후 biocytin 레이블에서 싱글 및 듀얼 패치 클램프 녹음을 얻을 수 있습니다 상세한 절차를 설명합니다. 체세포와 수지상 막 패치에 대한 기본 원칙은 매우 유사하다. 실질적으로하지만, 수지상 사이트에서 녹음 체세포 녹음에 비해 특정 최적화가 필요합니다. 성공적인 수상 기록은 슬라이스, 광학의 최적의 조절, 녹음의 패치 피펫과 안정성의 부드러운 접근 방식의 품질에 의존한다.

Protocol

여기에 설명 된 모든 실험 절차는 동물의 보호 및 유럽 실험 동물 학회 연합회의 가이드 라인에 대한 EU 지침 기관 및 국가 지침을 따르십시오.

솔루션 1. 준비

  1. 표준 인공 뇌척수액 (ACSF 표 1)
    1. 신선한 용액을 제조 이전에 두 번 증류수로 세척 고순도 염 (38) 깨끗한 유리 비커를 사용합니다. 모든 역외 세포 내 용액의 제조를 위해 고품질의 이중 증류수를 사용한다.
    2. . 표 1에있어서 가의 이온 (39)의 침전을 방지하기 위해 다른 염을 용해시키기 위해 500 ㎖의 물 및 다른에서의 NaHCO3를 용해 2 L 비이커을 이중 증류수 체계적 주걱 청소 및 염 복용 전에 건조 . dissolutio 균질화 자석 교반기를 사용하여엔. 적절한 부피 플라스크에 모두 비커에서 솔루션을 추가하고 해당 볼륨에 가져다.
    3. 최종 세포 외 용액이 완전히 투명하고 강수의 어떤 흔적도없이 있는지 확인하십시오.
    4. 조각 (38, 40)을 관류하기 전에 30 분 - 유리 마이크로 캔 (Ø 13mm) 20 95 % O 2, 5 % CO 2 (carbogen 가스)로 이루어지는 혼합 가스를 적용한다. (: 314-325 mOsmol / L를 최적의 범위)는 삼투압으로 ACSF의 - (3 연속 측정 2) 조심스럽게 삼투압을 제어 할 수 있습니다. 4 ° C에서 준비 후 남아있는 솔루션을 저장하고 3 일 이내에 그것을 사용할 수 있습니다.
  2. 절단 솔루션 (자당 ACSF 표 2) 5,13
    1. 신선한 용액을 3 L를 준비합니다. 하나의 동물에서 뇌 조각을 준비하는 1 L를 사용합니다. 4 ° C에서 남아있는 솔루션을 저장하고 3 일 이내에 그것을 사용할 수 있습니다.
      참고 : 높은 마그네슘 2+, 저 칼슘 농도는 D에 사용된다ecrease 시냅스 전달 및 자당 일부 염화나트륨의 대체 조직 5,40을 유지한다.
  3. 세포 내 솔루션
    1. 사전에 듀얼 전체 셀 녹음 (표 3) 100 mL의 솔루션을 준비합니다.
    2. 세포 형태의 좋은 복구를 얻을 메틸 설페이트 13,15,21를 포함합니다. 이후 신경 세포의 형태를 검사 - (0.4 % 0.1) biocytin를 추가합니다. 형광 염료를 (예를 들어, 알렉사 594 또는 Sulforhodamine (101) 41) 기록 (선택 사항) 동안 수상 돌기의 확장을 따라 포함합니다.
    3. 사전에 세포 부착 녹음 (표 4) 100 mL의 전극 솔루션을 준비합니다. 이 경우, 내부 용액 거시적 과분극 활성화 양이온 전류 (I의 H)를 분리하도록 설계된 하이 K + 용액이고, 다른 전압 관문 이온 채널 차단제를 포함한다.
    4. 매장 내-20 ℃에서이 용액의 분취 량의 세포 용액. 모든 새 레코딩 세션에 대한 새 나누어지는을 사용합니다. 조심스럽게 삼투압으로 모든 해동 나누어지는의 삼투압을 확인합니다. 삼투압이 초기 값에 대응하지 않는 경우 새로운 분취보십시오.
    5. 0.22 ㎛의 멸균 주사기 필터가 배치되는 상단에 3 ㎖ 주사기로 분취 량의 용액을 옮긴다. 그 화합물 (ATP, GTP 또는 포스 포)의 열화를 제한하는, 기록 세션 동안 얼음에 주사기를 유지한다.

2. 제조 및 패치 피펫의 충전

  1. 이겠지
    1. 수평 전극 풀러와 두꺼운 벽 붕규산 유리 튜브를 사용합니다. 전체 세포와 세포 부착 녹음 들어, 2mm 외경 / 1mm 내경를 사용합니다. 유리 튜브 (38) 절대적으로 깨끗한 지 확인합니다.
    2. 그렇지 않을 경우, 유기 용매에 유리 모세관을 담가 (예, 에탄올) 제 두 번 증류수있다. 간단히 분젠 버너 모세관 엔딩을 가열한다. (재료 목록 참조) 또한, 주문 유리 튜브 세척 및 제조 업체에서 직접 가열.
    3. 이중 somatodendritic 녹음의 경우, 보장 체세포 피펫 저항이 있음을 6 내지 10 MΩ 6,11 및 세포 내 용액 (표 3) 가득 수지상 피펫에 대한 MΩ 8 ~ 19. 신경 세포 16,18,42,43의 somatodendritic 도메인에 따라 유사한 결과를 달성하기 위해 10 MΩ의 저항에 세포 부착 된 레코딩을위한 피펫 저항을 표준화.
    4. 패치 전에 신선한 피펫 모든 기록 세션 전에 (매일) 즉시 준비하고 그들에게 5 사용 - 자신의 제조 39 후 8 시간을. 덮여 유리 용기에 보관 피펫은 먼지와 팁의 방해로부터 보호합니다.
  2. 세련
    1. 검사 및 난방t-폴란드어 microforge와 모든 피펫 팁은 막 더 나은 바다 표범을 얻었다. microforge을 사용하기 전에, 백금 가열 필라멘트에 유리의 작은 조각을 녹여. 불변성 (피터 조나스, 개인 통신) 매일 백금 필라멘트에이 유리 코팅을 교체합니다.
      주 : 세포 부착 녹음에 사용되는 피펫은 배경 잡음을 줄이기 위해 열 연마 공정 전에 도포 될 수있다. 코팅은 용융 치과 22,44 왁스 또는 실리콘 엘라스토머 (39) 등의 절연 제에 의해 달성 될 수있다.

뇌 조각 3. 준비

  1. 십구일 세 - 16 세 사이의 건강한 위 스타 쥐를 사용합니다. 저체온증 또는 탈수 앓고 건강에 해로운 동물이나 동물을 사용하지 마십시오. 조각의 준비를 시작하기 전에 안전하고 조용한 장소에서 동물을 유지합니다. 동물을 준비하는 동안 방에있는 다른 동물을 갖는 피하십시오. 부드럽게 동물을 조작 할 수 있습니다.
  2. 이 400으로 크로스 - ACSF을 붓고ML의 폴리 프로필렌 (PP) 커와 45 분 동안 C 냉동고 °에서 -80을 배치합니다. 균일 한 얼음 차가운 액체 / 냉동 솔루션을 얻을 얼음에 비커를 배치 솔루션을 섞는다. 각 PP 비이커에서 마이크로 캔 (Ø 13mm)를 사용 carbogen 가스로 자당 ACSF 용액 공급.
  3. 슬라이서 및 예비 실을 준비
    1. 가능한 슬라이스 표면층의 손상을 최소화하기 위해 매우 낮은 수직 진동 5,38 가진 고품질 조직 슬라이서를 사용한다. 슬라이서에 신선하고 전체 면도날을 수정합니다.
    2. 각 절단 세션에 대한 새로운 면도날을 사용한다. 면도날의 굽힘 마십시오. 면도날 (요셉 Bischofberger, 개인 통신)의 표면에서 지방 필름을 제거하지 마십시오.
    3. 가능한 경우, 제조사에서 제공하는 vibroprobe과 수직 진동을 확인합니다. 또는, 주문 제작 vibroprobe 5를 사용합니다. 블레이드의의 수직 진동을 감소같은 O를 가능한 한 0 μm의에 가깝게 될 수 있습니다.
    4. 페이지의 묘사로 조각에 대한 150 mL의 예비 실 45, 46를 준비합니다. 참조 201. 39. 예비 챔버로 표준 ACSF을 붓고 수조에 넣습니다. carbogen는 마이크로 촛불 (Ø 6mm)를 사용하여와 예비 챔버 솔루션을 제공합니다. carbogen 거품은 가능한 한 작은 있는지 확인합니다.
      주 : 매 2 새로운 예비 실 빌드 - 슬라이스 품질을 일정하게 유지하기 3개월.
  4. 잘라 조각
    1. 실험자가 방해 또는 강조되지 않은 조용한 실내에서 경추 수질 레벨에서 수술 가위 (길이 150mm)을 가진 동물을 참살.
    2. 메스와 꼬리 방향으로 코에 동물의 머리 상단에있는 피부를 잘라 옆으로 제거합니다. 미세 가위로 머리의 코 부분에 꼬리에서 두개골의 상단을 잘라 옆으로 두개골의 두 부분을 제거합니다. ㄴ를 제거얇은 주걱 비와 얼음처럼 차가운 포함하는 PP 비이커에 조심스럽게 놓습니다은 (0-4 °에 C) 자당 ACSF는 carbogen 38 평형.
      주 :이 단계들의 순서는 가능한 빨리 수행되어야 할뿐만 아니라 꼼꼼하게 (<< 1 분, 약 40 (S)).
    3. ~ 2-5 분 동안 PP 비커의 용액에 머리를 유지합니다. 뇌의 움직임을 피하기 위해 carbogen 압력을 조정한다. carbogen 거품 신선한 하나에 너무 큰 경우 마이크로 촛불을 교체합니다.
    4. 내부 바닥은 ~ 0.5 cm 두께의 실 가드 층 (38)으로 덮여있는 9 cm 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다. 사전에이 배양 접시를 준비합니다.
    5. 얼음처럼 차가운 자당 ACSF와 뇌를 둘러싸고 있습니다. ACSF - 자당 용액의 일부 액상 뇌 잠기 있는지 확인합니다. 관상 슬라이스, 메스 나 면도날 관상면에서 뇌의 전두엽 부분을 잘라. 코로나 컷 소뇌를 제거합니다.
    6. 시아 적용시편 트레이 아크릴 레이트 접착제 (지역 ~ 1cm 2). 정면 부분은 슬라이싱 단계를 향하도록 뇌 블록을 붙여 넣습니다. 조심스럽게 유리 파스퇴르 피펫의 큰 개구부를 사용하여 붙여 뇌 위에 자당 ACSF 물방울이어서 서서히 슬라이서의 절단 실 잠수함. 절단면 (즉, 제 조직 블레이드를 타격하기 위해) 뇌 (40)의 복부 표면이되도록 시료 트레이를 기동.
    7. 절단 실 (옵션)에 굽 유리 마이크로 촛불 (Ø 6mm)와 carbogen을 적용합니다.
    8. 수평면 5를 참조하여 15 ° ~ 각도 면도날을 조정한다. 흑질에 도달하기 전에 코 방향으로 꼬리에 ~ 500 ㎛, 관상 뇌 조각을 잘라. 관심 영역을 포함하는 350 μm의 두께 슬라이스 - 300 인하 두께를 줄입니다.
    9. 부착 극박 관류 바늘로 조직 블록으로부터 분리 된 조각면도날의 에지에 평행하게 주사기. 벤드는 바늘, 바늘 및 주사기 사이에 90 °의 각도가되도록. 조직 블록에서 조각을 제거하는 동안 어떤 압력이 면도날에 적용되지 않음을 확인합니다.
  5. 스토어 조각
    1. 예비 실에 (전구에 부착) 유리 파스퇴르 피펫의 가장 큰 구멍을 사용하여 조각을 전송합니다. 1 시간 - 모든 슬라이스 예비 실 (크리스토프 슈미트 Hieber 개인 통신)으로 전송되면 0.5 34 ° C로 수조의 온도를 가져온다.
    2. 이 기간 후 물 목욕을 끄고 실온에서 슬라이스를 유지합니다. 예비 실 내의 슬라이스의 움직임을 피하기 위해 carbogen 압력을 조정한다. 녹음을 시작하기 전에 다른 10 ~ 20 분 동안 조각을 유지합니다.
    3. SLI는 말에 두 번 증류수로 조심스럽게 아직 완전히 장비 및 마이크로 초를 청소절차를 향하도록.

흑색질 신경 세포와 Biocytin의 신고 4. 이중 신체적 및 Somatodendric 녹음

  1. 축삭 설명서 및 참고 문헌에 주어진 조각에 대한 패치 클램프 설정의 조립에 대한 설명을 따르십시오. 39,40,47합니다. 패치의 기본적인 측면에 대한 정보는 참고 문헌에 있습니다. 48.
  2. 기록 챔버를 준비
    1. 녹화 실에서 2 mL를 두 번 증류수 1 - 놓습니다. 이 누설되어 있지 않은지 확인합니다. 변속 XY 테이블에 기록 챔버를 놓습니다.
    2. 상기 기록 챔버로의 산소 투과성 관류 튜브 시스템 (폴리 테트라 플루오로 에틸렌)를 통해 표준 ACSF 피드. 5 ㎖의 분 -1 - (4)의 유량으로 챔버 내의 관류 안정화. 수 (1 남) 짧게 ACSF을 함유하는 비이커를 연결하는 배관의 길이와 기록 챔버를 유지한다.
    3. 예비 실에서 뇌 슬라이스를 선택하고로 전송유리 파스퇴르 피펫의 큰 개구부를 사용하여 기록 챔버. P에 도시 된 바와 같이 상기 기록 챔버의 바닥에이를 고정하기 위해 백금 링 슬라이스 커버. 참조 201. 39. 평면 백금 링 (Ø 1.5 cm)를 사용하고 병렬 나일론 스레드 (간격> 2mm)를 붙입니다.
  3. 조정 및 광학을 최적화
    1. 적외선 (IR) 비디오 4,47,49,50 현미경을 사용하여 슬라이스를 가시화. 쾰러 조명 (51)을 조정하고 미분 간섭 대비 (DIC) 51 광학 또는 경사 조명 (Dodt 그라데이션 대비 - DGC) 최적화 52, 53입니다. 이 절차에 대한 자세한 세부 사항은 참고 문헌에 나와있다. 40,49.
    2. 슬라이스의 품질을 확인합니다. 만 너무 강하게 대조 단지 작은, 분산 분화구가되지 않는 부드러운, 심지어 표면 조각을 유지합니다.
    3. (세포 내 용액이 신선하고 사용되지 않는 패치 피펫 채우기
  4. 슬라이스의 표면 위의 피펫의 위치를
    1. 실버 클로라이드 와이어에 코팅의 존재 확인 (목욕 기준 전극 및 패치 전극;. 자세한 내용 축삭 가이드 및 참고 문헌 39,54 참조).
    2. 피펫 홀더에 피펫 순차적으로 삽입하고 피펫 홀더, 세 방향 탭과 압력계 (40)를 연결하는 튜브 회로를 사용하여 정압 (~ 70 밀리바)를 적용합니다. 녹화 실의 화장실에 피펫을 낮 춥니 다.
    3. 2 분 - 압력계의 압력 값이 1 ~ 상수 있는지 확인합니다. 압력이 감소되는 경우, 튜브 또는 피펫 홀더 안에 밀봉 O 링을 확인한다.
    4. 비디오 모니터의 중앙에 피펫 팁을 놓고이 방해되지 않도록. 적용하거나 피펫에 압력을 해제 할 때 피펫 팁이 이동하지 않도록하십시오.
    5. 정확히 피펫 팁의 위치에서 모니터 중앙에 작은 십자가를 그려 드리프트 및 피펫 팁의 진동을 확인하고 팁의 5 분 가능한 움직임에 대한 관찰합니다.
    6. 오실로스코프에 피펫 저항을 모니터링하기위한 승압 (5 MV)를 적용한다. 0 MV에 패치 클램프 증폭기의 유지 가능성을 설정합니다. 피펫을 취소하면 DC 피펫 전류 증폭기 m 39,51에서 0을 판독하도록 오프셋 전위.
    7. 슬라이스 아래로 피펫을 이동하고 표면 위를 유지한다.
  5. 선택과 긴 수상 돌기를 가진 신경 세포 패치
    1. 흑질 내에서 거의 동일한 PL에 긴 거리에 걸쳐 올 수 있습니다 긴 돌기를 가진 건강한 신경 세포를 선택메탄 (그림 1A 및 1B)를 사용하여 IR-Dodt 그라데이션 대비 (IR-DGC). 부드럽고 균일 한 셀 바디를 선택합니다. 이 침입 할 시간이 안정적인 촬영 조건 (안정 직렬 저항)을 유지하기 어렵 기 때문에, 슬라이스 (그림 1C 및 1D)의 표면에있는 두 개의 강하게 대조 세포를 피하십시오. 슬라이스의 표면 아래에 30 μm의 - 자신의 소마 (10)이 뉴런을 선택합니다.
    2. (- 거리에 50 μm의 40)과 같은 거리에서의 수상 돌기에 돌기 전극 가까이 소마에 가까운 체세포 전극을 이동합니다. 선택과 수상 돌기의 일부를 패치 2 배 확대 (네 배 체인저)를 사용합니다. 2 배 확대와 모니터 배율 (1X)없이 2,100X의 절대 배율 5,500X의에 가져옵니다.
    3. 약간 10 밀리바에 의해 체세포 피펫의 압력을 놓습니다. 필요한 경우 (C)의 어긋남을 방지 돌기 체세포 피펫 압력을 조절슬라이스 내에서 엘 구조 (소마와 수상 돌기).
    4. 작은 딤플을 참조하기 위해 막에 가까운 수지상 피펫을 배치합니다. 피펫 팁에 압력을 해제하고 피펫 저항을 제어하면서 수상 돌기 패치. 이상적인 조건에서, 단지 아주 약간 흡입 좋은 밀봉을 얻기에 충분하다.
    5. 세포 연결된 모드에서 수지상 피펫을 유지합니다. 체세포 막에 체세포 피펫 가까이 이동하고 체세포 막 패치. 높은 씰 저항이 세포막 (> 1 GΩ) (39)를 파열 전에 얻을 수 있는지 확인합니다. 약간 세포체와 수상 돌기의 변형을 방지하기 위해 ㎛의 부부 떨어져 막에서 모두 피펫을 철회.
    6. 두 피펫은 고 이득 작은 필터 (51) 및 오실로스코프 전압 펄스를 이용하여 현재 단계의 상부에 최대한 께 피펫 용량 과도의 진폭을 감소시킨다. 전체 셀 모드 위스콘신로 입력수지상 피펫 번째 및 이후 체세포 피펫.
    7. 전체 셀 용량 과도를 제거하고 직렬 저항을 보상. 모니터링의 시작시 액세스 저항 문서화 정기적 동안 실험. 직렬 저항이 너무 높으면 (> 50 MΩ)은, 다른 피펫 시도.
    8. 높고 낮은 배율에서 비디오 그래픽 프린터 (25), 프레임 그래버 (frame grabber) 또는 디지털 카메라 IR-DGC 사진 (도 1A 및 1B) 모은다.
      참고 : 녹화 중에 신경의 부종 (그림 1E 및 1F)가 산발적으로 관찰되지만, 거의 용액의 삼투압과 pH를 제대로 (39)를 조절되지 않을 때.
    9. 동일한 절차 (그림 2A)와 - (소마 소마)를 두 번 체세포 전체 셀 녹음을 얻습니다.
  6. 순차적으로 현재의 단계를 탈분극 증가 길이 (밀리 수백) 적용체세포와 수지상 피펫의 AP (그림 2B, 3C 및 3D)를 보여주고있다. 수지상 동시에 체세포 피펫에서의 결과 잠재력을 기록합니다.
  7. 도파민 신경 세포 인공 흥분성 시냅스 후 전위의 전파 (aEPSPs를) 검토
    1. 듀얼 전류 클램프 녹음 (도 4a 및도 4b) 동안 현재의 명령으로 주입하는 흥분성 시냅스 후 전류 (EPSC) 파형을 생성합니다. 이렇게하려면, 관심 (55)의 신경 세포에 EPSCs 측정 실제 값에 해당하는 진폭 및 시간 경과 값을 갖는 두 지수 함수를 구축 할 수 있습니다. 조심 원래 시간 코스를 유지하도록 구성 EPSC 및 주입 EPSC 파형의 샘플링 레이트를 제어한다.
      주 : 실제 뉴런에서 파형을인가하기 전에 모델을 사용하여 셀을 테스트한다.
    2. 순차적 수지상 통해 파형을 주입 한부수적으로 모두 체세포와 수지상 피펫을위한 잠재력을 결과 체세포 피펫 기록. 피펫의 가능한 드리프트 정기적으로 확인합니다.
  8. 신경 세포로부터 기록 종료
    1. 슬라이스와 전극 내의 신경 세포의 위치를 ​​문서화 : 낮은 배율 (5 배 또는 10 배 목표)는 IR-DGC의 사진을 촬영합니다.
    2. 천천히 부드럽게 모두 피펫과 외부 아웃 패치를 형성하기 위해 수지상과 신경 막 순차적에서 체세포 피펫을 철회. 측면-상승 움직임 (38)의 시퀀스를 사용하여 피펫을 제거합니다. 이들은 처음에는 짧게하고 점차 길이가 증가한다. 기록이 구성은 세포막의 적절한 폐쇄 호의.
    3. 피펫을 철회하면서 전압 클램프에서 5 MV 전압 펄스에 응답하여 용량 성 전류의 감소 (액세스 저항의 증가)를 모니터링합니다.
    4. 멤브레인은 바다되면피펫 팁 주변지도, 녹화 실에서 완전히 가져 가라. 욕실에서 목표를 제거합니다. 기록 된 신경 세포의 (세포 내 용액으로부터) biocytin의 평형을 허용하는 표준 ACSF에서 20 분 - 15의 기록 챔버에서 슬라이스를 유지합니다.
    5. 부드럽게 표준 ACSF를 포함하는 25 mL의 넓은 입 황색 (갈색) 유리 병에 파스퇴르 피펫의 큰 구멍을 사용하여 슬라이스를 전송합니다. 마개로 병을 닫습니다. 정착 단계에 대한 제 6 항을 참조하십시오.

5. 세포 부착 녹음

  1. 수지상은 동일 평면 상에 긴 거리에 걸쳐 연장 뉴런을 선택한다. 관심의 수상 돌기가 잘 정의 된 소마에 따라 할 수 있는지 확인합니다.
  2. 전극 용액 (표 4)와 패치 피펫을 입력합니다. 다른 이온을 차단하는 차 특정 약리학 적 제제를 포함하여 세포 부착 구성에 대한 관심의 전류를 기록하는 솔루션을 설계nnels.
  3. 세포 부착 모드 수지상 패치
    1. 덴 드라이트의 부분을 시각화하고 조작부를 사용하여 레코딩 피펫 접근. 덴 드라이트의 변위를 방지하기 위해 - (80 밀리바 70) 압력계를 확인하여 피펫 팁의 압력을 적용. 4.5.4에 기술 된 바와 같이 수지상 패치.
    2. 일부 IR-DGC 사진 (그림 5A)를 기록한다. 세포 부착 녹음 (18) (그림 5B) 10 GΩ - 기껏해야 3 사이 (> 1 GΩ 39) 가능한 한 큰 씰 저항을 얻기 위해 시도합니다. 덴 드라이트의 변형을 방지하기 위해 ㎛의 부부 떨어져 막에서 피펫을 철회.
    3. 흑색질 신경 세포의 자발적인 활동 전위를 반영하는 세포 부착 된 모드에서 동작 전류를 관찰한다. 동작 전류를 억제하는 칼슘과 나 + 채널 차단제 (을 CDCl3 2 TTX, 각각)와 ACSF을 보충합니다.
    4. 2 SV 적용I h를 (그림 5C)를 연상 할 수있는 패치 0 MV의 유지 가능성에서 -90 mV로 oltage 단계. 피펫 잠재력과 휴식 막 전위가 세포 부착 구성 56 시리즈에 있음을 알아 두셔야합니다. 자세한 내용은 축삭 가이드 및 참조. (39)을 참조하십시오.
    5. 피펫의 가능한 드리프트 정기적으로 확인합니다.
    6. 기록이 끝나면 막전위의 판독을 즉시 전체 셀 모드로 이동하는 패치 파열. 외부 아웃 패치를 얻기 위해 섹션 4.8.2과 4.8.3에 설명 된대로 피펫을 철회.
  4. 전체 세포 모드에서 대응하는 레코드로부터 소마
    1. 수지상 함께보고 해당 소마를 찾습니다. K + 기반의 세포 내 용액 (표 3) 가득 - (10 MΩ 5) 6,14,57 고 저항 피펫을 사용합니다. 받는 간단한 흡입 (음압)을 적용피펫 팁은 전체 세포 모드를 입력하기 위해 막을 파열.
    2. 긴 하이퍼을 적용하고 현재 단계 (그림 5D)를 탈분극에 의해 전류 클램프의 신경 세포의 신원을 확인하고 biocytin이 수상 돌기를 따라 확산 할 수 있습니다. AP에 시간 과정을 시각화하는 짧은 탈분극 현재의 단계를 적용합니다.
    3. 4.8.3 - ≤10 분 후, 섹션 4.8.2에 기술 된 바와 같이 외부 아웃 패치를 획득하기 위해 피펫을 철회. 부드럽게 ACSF 표준을 함유하는 25 ㎖ 호박색 유리 병에 파스퇴르 피펫의 큰 개구부를 사용하여 슬라이스를 옮긴다. 마개로 병을 닫습니다.
    4. 선택적으로, 첫번째 추가 형광 염료를 함유하는 피펫 용액 체세포 전체 셀을 얻었다. 염료의 확산을 허용하고, 덴 드라이트 (26)의 일부를 선택한다. 제 피펫 셀 접속 모드에서 수지상 패치. 사용 가능한 형광 라벨의 가시화를 향상시키는 경우, 공 초점 현미경을 사용하여에드는 14, 22 덴 드라이트.
    5. 세포 - 부착 기록 10,22에 대안 적으로 또는 부가 적으로, 외부 아웃 구성 수지상 기록을 수행한다. 그림 5E 및 5 층에서 외부 아웃 패치에서 기록 된 전압 게이트 전류의 예를 참조하십시오.

흑색질 신경 세포의 6 Biocytin 라벨링

  1. 조직의 고정
    1. 가능하면 슬라이스 기록 / 조직 화학적 처리 (38)에 대해 별도의 객실을 사용합니다.
    2. 파스퇴르 피펫 (PBS, pH는 7.4), 0.1 M 인산 완충 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드로 대체하여 ACSF 슬라이스 수정. 항상 갓 (<< 1 주 이전) 정착액 솔루션을 준비 사용합니다.
      주의 : 적절한 손 장갑과 조직학 실험실에 배치 화학 후드 때문에 독성 파라 포름 알데히드를 조작합니다. 사용 및 C 전에이 위험한 제품의 물질 안전 보건 자료 읽기도대체이 분말의 규제에 관한 화학 물질 안전성 (유럽 연합 (EU) 집행위원회에서 위험 물질 지침 (67 / 548 / EEC)가) 암을 유발하는 것으로 생각된다. 기타 세부 사항은 참고 문헌에 있습니다. 58.
    3. 4 ℃로 하룻밤의 조각을 놓습니다. 패치 클램프 설치 또는 파라 포름 알데히드에 의해 전기 생리학에 사용되는 모든 장비의 오염을 피하십시오.
    4. 고정 후, PBS로 정착 솔루션을 교체합니다. 정착액 용액을 제거하고 PBS를인가하는 다른 파스퇴르 피펫을 사용한다. (- 2 주 1) 4 ° C 추가 처리 이전에 PBS에 보관 조각. 이 경우, 주 배 PBS를 교체한다. (<< 1 주 이전) 항상 신선하게 준비된 PBS를 사용합니다.
  2. 조직의 염색
    1. 염색 단계는 24 잘 세포 배양 접시를 준비합니다. 슬라이스를 전송하는 청소 장비를 사용합니다. 신선한 PBS를 사용하여 조각 3 × 5 분을 씻어.
    2. 형광 아비딘 DCS (아비딘 D, 셀 소터 등급을 적용, 1 μL의 fluores을밤새 4 ° C에서 PBS에 cein / mL의 트리톤 X-100) 0.3 % 트리톤 X-100. 염색을 통해 빛의 조각을 보호합니다. 빛 3,3'- 디아 미노 벤지딘을 통해, 라벨 신경 세포를 형광 또는 현미경 분석 21,58를 전자에 대한 대안으로.
      주의 : 트리톤 X-100은 위험하다. 이 물질을 사용하기 전에 안전 보건 자료 및 EU 집행위원회 지침을 읽어보십시오.
    3. PBS로 3 회 30 분 세척하여 연속적으로 PB (인산 완충액, 슬라이스의 표면에서 결정의 형성을 피하기 위해).
  3. 표준 유리 슬라이드에 슬라이스를 탑재합니다. 매립 매체를주의 깊게 조각을 커버. 매립 매체에 공기 방울을 피하십시오. 완전히 조각을 커버하기 위해 부드럽게 coverslip에 넣습니다. 현미경을 시각화하기 전에 밤새 슬라이드를 공기 - 건조.
  4. 시각화 후 4 ° C에 표시된 슬라이스를 저장합니다. 조직 화학적 절차에 대한 유용한 트릭은 참고 문헌에 있습니다. 58, 59.
  5. 별도로 조직 학적 및 전기 생리학에 사용되는 장비를 청소합니다. 함께 조직학 및 전기 생리학 장비를 함께 사용하지 마십시오.

Biocytin 가득 뉴런 7. 사후 시각화

  1. 복구 된 신경 세포의 형태를 시각화하기 위해 공 초점 현미경을 사용합니다.
    1. 대략 표면 형광과 슬라이스의 형광 표지 된 신경 세포를 찾습니다. 뉴런의 수상 돌기의 아버를 검사하고 축삭과 축삭 여과포의 위치 - 10 배 또는 20 배 목표를 사용하여 (2 ~ 4 μm의 O를). 축삭의 과정을 문서화.
    2. 공 초점 현미경으로 전환 표지 신경 세포에 포함 된 형광을 자극하는 488 nm의 레이저 다이오드를 선택합니다. z 축에서 축삭과 수상 돌기의 연장을 따르십시오.
    3. 전체 셀에 대한 Z 스택을 얻기 위해서는 연속적인 영상을 기록한다. 1 μm의 - 0.5 z 축 (연속적인 이미지 사이의 거리)의 해상도를 조정합니다. 셀 날기의 공 촛점 이미지를 수집g 낮은 (10X 목적)과 고 (60X 목표, 오일 침지) 확대.
    4. 이미징 소프트웨어 (ImageJ에) (60)와 공 초점 현미경으로 얻은 신경 세포의 이미지 파일을 연다. 전기 생리 학적 기록 (도 1, 2A, 3A, 4A, 5A 및 5E) 중에 패치 피펫의 정확한 위치를 찾기 위해 눈에 의해 IR-DGC 화상과 Z 축 투영 화상을 비교한다.
    5. 레이블 뉴런의 morphometries를 결정 축삭을 측정 - 소마 거리가 somatodendritic 도메인을 따라 수지상 피펫과 ImageJ에있는 "측정"기능을 사용하여 축삭 사이에 기록 피펫 사이의 거리.
    6. NeuronJ (ImageJ에), Imaris 29 또는 Neuromantic 61 일부 신경 세포를 재구성.

전기 생리 데이터의 8 분석

  1. 조잡한 직접 데이터 (예 Clampfit) 또는 분석하는 증폭기와 관련된 소프트웨어 패키지를 사용하여이러한 Stimfit, WinWCP 우리의 최근 출판물 (13) 또는 예를 들어 같은 오픈 소스 소프트웨어 62, 63 등의 데이터 분석을위한 다른 소프트웨어.

Representative Results

상술 프로토콜 수지상 패치 클램프 기록을 이용하여 데이터의 수집을 용이하게하고자한다. 사후 조직 화학 결합이 기술은, 원산지 또는 수상 돌기로 확산 많은 전기 신호의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 패치 피펫과 수상 돌기에 직접 액세스는 어렵지만 몇 가지 방법 론적 측면에 특별한주의는 녹음의 성공률을 향상시킬 수 있습니다. 충분히 안정 체세포 기록에 경험 실험자는 시도의 대부분에 높은 저항 (GΩ) 물개와 완벽한 실험을 얻을 것으로 예상 할 수있다. 두 고품질 수상 녹화 한 해부에 따라 회수 할 수있다.

건강 인 somata과 수상 돌기를 포함하는 높은 품질의 뇌 조각의 가용성은 이러한 미세 구조 (그림 1)에 액세스하기위한 전제 조건입니다. criteri이러한 신경 세포를 선택하기위한 모든 셀 최적 조정 광학 관찰 낮은 콘트라스트 및 소마 돌기 위에 매끄럽고 균일 한 표면이다 (도 1a 및도 1b). 선택 뉴런이 너무 강하게 일반적으로 대조 불안정 기록 (그림 1C 및 1C)에 연결됩니다. 따라서 이러한 뉴런 피해야한다.

다른 신경 세포에 비해, 흑색질 DA 뉴런 특정 형태 및 전기 생리 특성을 표시합니다. 일반적으로 하나의 체세포 피펫으로 평가 이러한 기능은 듀얼 체세포 (그림 2)와 somatodendritic 녹음 (그림 3)에서 관찰 할 수있다. 긴 hyperpolarizing 현재 주사 (도 2B와 5D) '처지'라는 막 잠재적 인 정류를 유도한다. 식별 된 엑손은 수지상 사이트에서 대부분의 경우, 발신이러한 신경 세포의 수지상 구획 이기종 것을 나타내는, 보완 기준 13,25,26를 사용하여 (그림 3A - 3B). 13,25,26 - 그 결과, AP는 처음 관찰되는 구획 축삭은 (3D도 3c)를 나온다 된 구획에 대응한다. 축삭은 일반적으로 64 슬라이스 동안 축삭의 절단에 의한 축삭 여과포로 종료되지만,이 구조를 체계적으로 감지되지 않습니다.

연속 I (H)의 활성화에 흑색질 DA 뉴런에서 관찰되는 뚜렷한 저하는 HCN 서브 유닛의 높은 발현을 의미한다. 시냅스 신호의 적분에 I (H)의 영향을 결정하기 위해 연접 형 전류 (EPSC) 파형 생성 somatodendritic 듀얼 레코딩 55 (<동안 수지상 기록 전극을 통해 주입 하였다강한> 그림 4). 이러한 시뮬레이션 EPSCs의 반응 속도는 실제 자발적 EPSCs의 상승 및 감쇠 시간 상수에 근거했다. 그 결과 aEPSP는 체세포 전극으로 기록되었다. 는 I의 시간 차단제 ZD 7288의 목욕 응용 프로그램은 시냅스 신호 (그림 4B)의 시간 코스 I (H)의 기여도를 나타내는 aEPSP의 지속 시간을 증가했다. ZD 7288은 확인도 막 잠재적 인 정류를 폐지하는 I (H)의 활성화 (그림 4C)에서 처짐 결과. EPSPS 시뮬레이션으로 얻은 결과는 전기적 유발 EPSPS 65을 이용하여 실험에 상관 될 수도있다. DA 신경 세포의 somatodendritic 영역에서 채널의 정확한 분포를 매핑하려면, 세포 부착 녹음 (그림 5)를 구현 하였다. 높은 저항 씰 (>> 1 GΩ)는 (그림 5B 세포 부착 녹음을 위해 절대적으로 필요하다 나는 시간이 긴 hyperpolarizing 전압 단계를 서서히 활성화되고 이전에 (66)와 같이 현재의 정상 상태는, MS (그림 5C)의 수백 후에 달성된다. 이 관찰은 DA 뉴런의 수상 돌기로 표현 HCN 채널 피라미드 뉴런 또는 다른 세포 유형 10,16,66에서와 비교하여 다른 서브 유닛을 가지고 있음을 나타냅니다. 채널의 분배가 수지상 구획 비균질하고 하듯 수지상 실 자체 이질적이기 때문에, 덴 드라이트 (엑손 베어링 또는 nonaxon 함유 수지 상정)의 신원은 공 촛점 이미지로 IR-DGC 화상을 비교함으로써 밝혀 biocytin 염색법 (도 3A와 B) 후. 세포 형태의 복구는 모두 듀얼 somatodendritic 녹음 및 이후의 체세포 전체 셀 녹음을 통해 세포 부착 된 레코딩을위한 필요가있다.


적외선 Videomicroscopy를 사용하여 흑색질 도파민 뉴런의 소마와 근위 Dendrites에서 시각화 그림 1. 소마와 인접 수상 돌기 모두 체세포와 수지상 피펫을 보여주는 흑색질 DA 신경 세포의 (A) IR-DGC 이미지입니다. 이중 somatodendritic 기록이 성공적이 건강한 신경 세포에서 수행 하였다. 모든 세포의 somatodendritic 도메인에 대한 낮은 콘트라스트와 매끄러운 표면을 관찰한다. (B) 건강한 DA 신경 세포의 또 다른 예입니다. (C) DA 신경 세포를 거친 고르지 않은 표면과 강한 대조. 이중 기록이 수득되었지만, 인해 두 피펫의 접속 저항의 점진적인 증가 (~ 15 분) 안정성이 최적이며, 기록 시간은 짧았다. (D) 도시하는 DA 신경 세포의 두 번째 예 강한 대조 소마와 인접 수상 돌기. 이 경우, 상기 접속 저항의 강한 증가는 전체 셀 모드에서 브레이크 직후 관찰되었다. 음의 압력에 의해 액세스 저항을 감소하려는 시도가 실패했습니다. 패널 C와 D의 뉴런은 슬라이스 과정에서 손상되었을 수 및 실험 피해야한다. (E) 기록의 시작 부분에 건강한 DA 신경 세포에서 동시 이중 체세포 기록. (F)와 패널 E에서와 같은 신경 세포 ~ 17 분 후 부어 세포체. 대비의 전체 부재를 참고 소마의 공 같은 모양과 건강한 신경 세포에서 명확하지 않은 큰 핵의 존재는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 동시 두 번 체세포 DA 신경 세포에서 녹음. DA 신경 세포에서 두 번 체세포 녹화 중 (A) IR-DGC 이미지입니다. (B) Hyperpolarizing 1의 긴 현재 주사 탈분극 (-160 pA에 80을, 아빠 (80)를 증가) 및 해당 전압 변화는 두 패치 피펫과 동시에 기록했다. 탈분극 전류 펄스 동안의 긴 hyperpolarizing 현재 단계와 AP 후 후 과분극 대형와 전압 추적의 처짐의 존재를합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. DA 신경 세포에서 이중 S omatodendritic 기록. (A)는 DA 신경 세포의 IR-DGC 이미지입니다. 수지상 및 소마 간의 거리는틱 피펫은 플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)에 결합 아비딘으로 표시 패널 (A)에서 신경 세포의 29 μm의. (B) 공 촛점 z를 프로젝션 이미지입니다. 신경 세포는 녹화 중에 biocytin으로 가득 차 있었다. 축삭은 화살표로 표시된 바와 같이 소마 가까운 기단 수지상 유래. 소마 (블랙 전압 트레이스) 및 수지상 기록 패널 A.의 AP에서 신경 세포로부터 (C)의 동시 듀얼 somatodendritic 전체 셀 전압 녹화 (적색 전압 블랙 현재 추적)과 오른쪽 선택적으로 수지상 피펫 (; 체세포 (왼쪽 통해 하나의 긴 전류 주입 단계에 응답 흔적) 빨간색 현재 추적) (D) 체세포와 수지상 AP 확장 된 시간 스케일에 표시.. 체세포 또는 수지상 전류 주입 중 하나로, 체세포 AP (블랙) 수지상 AP (적색) 앞에. 이 신경 세포에서의 AP 사이의 지연은 120 μs의 각각 체세포와 수지상 전류 주입, 210 μS했다. 지연액세스 포인트의 상승 단계에서 AP 반 최대 진폭을 측정 하였다. AP는 축삭 이전의 관찰 25, 26을 확인, 나온다되는 가까운 구획에 처음 관찰된다. 이 경우, 돌기의 기록은 엑손 - 결핍 수지상 만들어진다. 축삭 베어링 수지상 참조에에서 기록의 예. 13 (자신도. 1). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
DA 뉴런의 Somatodendritic 축을 따라 인공 EPSPS 그림 4. 전파. (A)는 DA 신경 세포의 IR-DGC 이미지입니다. 수지상 체세포 피펫 사이의 거리는 45 μm의 것이다. 두 패치 피펫 전체 셀 전류 클램프 기록 모드에있다. (B) 현전류 클램프 수지상 피펫 기록 인공 EPSP (상부). 현재는 EPSC 같은 파형의 주입에 의해 얻어진다 (; τ 붕괴 = 3 MS] τ 상승 = 0.6 밀리 진폭 = 100 씩) 수지상 기록 피펫 (55)를 통해. (적색 추적 30 μM) 하단에 제어 조건 (검은 색)의 소마 기록 aEPSPs을 전파하고 I의 시간 차단제 ZD7288의 목욕 신청 후. 각 전압 추적 40 단일 스윕의 평균입니다. 30 μM의 ZD 7288의 도포 후 (제어 상태 (흑)의 소마에서 녹화 흔적은 전압. (C)를 EPSPS 시간 경과에 I (H)의 기여를 나타내는 ZD7288의 존재 EPSP 기간에서 큰 증가를 관찰 긴 (30 pA에 대한 응답에서 빨간색) 1 초) hyperpolarizing 현재 단계. 나는 <의 막힘 후 막 잠재적 인 정류 (처짐)의 부재를 참고서브> 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
DA 신경 세포의 Dendrites에서의 I h를 그림 5. 존재. 근위 수상 돌기에 DA 신경 세포와 피펫의 (A) IR-DGC 이미지입니다. (B) 세포 부착 구성에서 5 MV 전압 명령 중 정전 용량과 누설 전류. 밀봉 저항이 예에서는 5 GΩ이었다 (C) Hyperpolarizing 전압 단계.; MV는 천천히 활성화 I h를 유도 0의 막 전위 (90 MV 위). 현재 트레이스 반전 τ = 632 ms의 시간 상수를 제공 한 지수 함수를 장착 하였다. (D) 전압하나의 하이퍼로 전체 셀 기록 소마 (패널 A)의 반응과 탈분극 전류 펄스 (120 pA에에 -160, 40 아빠 증가). 체세포 전체 셀 기록이 세포 부착 후에 기록 하였다. 때문에 세포 부착 녹음 중에 자연 발화를 억제하는 TTX 및 카드뮴 2+의 세포 외 응용 프로그램에 액세스 포인트의 부재를합니다. 이 전압 - 게이트 나 + 및 CA 2+ 전류 차단기 동작 전류를 억제하도록 하였다. 패널 A - D는 같은 신경 세포에서있는 다른 DA 신경 세포와 수지상 피펫 (E) IR-DIC 이미지 -120 MV에서 50 밀리의 프리 펄스에서 0 MV에 테스트 펄스에 의해 활성화 (F) 전압에 의존하는 전류.. 패널 E. 지주의 신경 세포의 근위 수상 돌기 잠재적 -80 MV에서 절제 외부 아웃 패치입니다. 현재의 시간에 따른 불 활성화를합니다. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.

물질 g / 몰 집중 1 L에 대한
염화나트륨 58.443 125 밀리미터 7.305 g
의 NaHCO3 84.007 25 mM의 2.100 g
KCl을 74.551 2.5 밀리미터 0.186 g
의 NaH 2 PO 4 137.99 1.25 밀리미터 0.172 g
포도당 198.17 25 mM의 4.95 g
의 MgCl 2 1 M (솔루션) 1 ㎜ 1 mL의
염화칼슘 (2) 1 M (솔루션) 2 밀리미터 2 mL의
삼투압 ~ 310 mOsmol / L (최적의 범위: 314-325 mOsmol / L), pH는 7.4

표 1 : 인공 뇌척수액 (ACSF).

물질 g / 몰 집중 1 L에 대한
염화나트륨 58.443 87 mM의 5.084 g
의 NaHCO3 84.007 25 mM의 2.1001 g
KCl을 7.551 2.5 밀리미터 0.18637 g
의 NaH 2 PO 4 137.99 1.25 밀리미터 0.17248 g
의 MgCl 2 1 M (솔루션) 7 밀리미터 7 mL의
포도당 198.17 10 mM의 1.9817 g </ TD>
자당 342.29 75 mM의 25.672 g
염화칼슘 (2) 1 M (솔루션) 0.5 밀리미터 0.5 mL의
삼투압 ~ 326 mOsmol / L, pH는 7.4

표 2 : 자당 - ACSF는 조각을 준비한다.

물질 g / 몰 집중 100 ㎖에 대한
KMeSO 4 150.2 120 밀리미터 1.8024 g
KCl을 74.56 20 mM의 0.14912 g
의 MgCl 2 1 M (솔루션) 2 밀리미터 200 μL
나 2 ATP (5)51.1 2 밀리미터 0.1102 g
나 2 GTP 523.2 0.5 밀리미터 0.02661 g
나 2 -Phosphocreatine 255.1 5 밀리미터 0.1275 g
EGTA 380.4 0.1 mM의 3.803 mg의
헤 페스 238.31 10 mM의 0.23831 g
Biocytin 1 ㎎ / ㎖ 0.1 g
삼투압 ~ 302 mOsmol / L, pH는 7.2로 조정 KOH

표 3 : 듀얼 레코딩을위한 세포 내 솔루션입니다.

물질 g / 몰 집중 (100)mL의
KCl을 74.56 120 밀리미터 0.8947 g
염화칼슘 (2) 1 M (솔루션) 2 밀리미터 200 μL
의 MgCl 2 1 M (솔루션) 1 ㎜ 100 μL
헤 페스 238.31 10 mM의 0.23831
TEA-CL 165.7 20 mM의 0.3314 g
4-AP 94.11 5 밀리미터 0.04705 g
BaCl 2 244.26 1 ㎜ 0.02443 g
을 CDCl3 2 183.32 0.02 밀리미터 0.3666 mg의
TTX 1 ㎜ 200 nm의 20 μL
삼투압 ~ 290 mOsmol / L, D-포도당 (참고 16.)로 조정; pH가 7.4

표 4 : 세포 부착 된 레코딩을위한 전극 솔루션입니다.

Discussion

이 보고서는 듀얼 somatodendritic 전체 셀 녹음 및 지방 수상 기록을 구현하기위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 그것은 각각 시냅스 후 전위의 시간 경과에 이온 채널 (즉, I 높이)의 영향을 결정하고 흑색질 DA 뉴런의 somatodendritic 도메인 따라 이온 채널 (I 높이)의 분포를 매핑하는데 유용하다. 그 결과 전기 생리 측정은 세포 형태를 복구하기 위해 특별 조직 화학을 게시 결합된다. 절차는 흑색질에있는 DA 신경을 조사하기 위해 사용되었지만, 인접 흑색질 GABA 뉴런, 복측 피개 영역 DA 신경이나 중뇌 신경 대해 일반화 될 수있다. 모든 단계가 중요 수정없이 흑색질 신경 세포의 수상 돌기에 표현 된 다른 이온 채널을 검사 따라 할 수있다. 사후 시각화 축삭 베어링과 신경 세포에 특히 관련입니다이러한 흑색질 신경 세포 25, 26, 해마 oriens-alveus의의 interneurons 21 일부 CA1 피라미드 뉴런 (67) 등의 수상 돌기. 흥미롭게도,이 기능을 공유하는 신경 세포는 일반적으로 67 생각했던 것보다 더 일반적인 것 같다. 형태 학적 분석은 또한 전극과 축삭의 정확한 위치를 알 수있다. 후자의 면역 검출 68,69을 이용 축삭 초기 세그먼트 (전압 - 게이트 나 + 채널 또는 Ankyrin G)에서 발현 된 단백질의 라벨에 의해 최적화 될 수있다.

수지상 녹음 이후의 연결 라벨과 수집 된 데이터의 신뢰성은 변함없이 조각의 품질에 따라 달라집니다. 최대 노력이 필요하므로 조직 내 세포의 생존을 유지하기 위해 적용된다. 이는 슬라이스의 제조 건강한 동물 걸쳐 고품질 도구 및 시약 조직 빙냉 온도 충분한 산소 부드러운 핸들링 달성. 안정된 기록 조건 건강한 신경 세포의 선택에 의존한다. 전체 세포 모드에서, 직렬 저항은 처음에는 가능한 한 낮게하고, 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지한다. 녹음의 안정성은 드리프트과 진동없는 높은 품질의 조종에 더 의존한다. 피펫 홀더와의 연결을 확인하고 headstage하는 미세 조작기 케이블 슬랙 것을 제어하는 ​​온도 스테이지 이동의 급격한 변화를 방지하여 머니퓰레이터의기구에 의하면 이러한 교란은 피펫 안정성을 최적화함으로써 감소 될 수있다. 이중 기록 들어 메틸 설페이트 13,15,21는 세포 내 용액에 포함되었지만, 글루코 9,14,25 대안으로 사용될 수있다. 그러나, 주요 음이온 (70, 71) 전위 막의 일부 전압 의존 전류 (72)를 변경할 수있다. 세포 내 용액은 ATP, GTP와 physiolo을 유지하기 크레아틴 인산 보충 할 수있다신경 학적 기능을합니다. 인스턴스가 압력 응용 프로그램을 배치 할뿐만 아니라, 피펫 용액에 형광 염료를 추가 (예를 들어, 알렉사 594 또는 Sulforhodamine 101 41)가 도움이 될 수있는 체세포 기록하는 동안 수상 돌기를 시각화 (참조 그림 7. 41) 또는 전기 자극을 피펫. 세포 부착 녹음 용 피펫 솔루션은 대형 I의 시간을 기록하는 높은 K + 농도와 더 나 +가 포함되어 있습니다. 주목할 나 + / K + 농도 비는 전류 진폭 (10), 전류 (11)의 반전 전위 I의 H (73)의 게이트에 영향을 미친다. 또한, 나는 시간은 외부 아웃 (10)를 사용하여 기록 할 수 있습니다. 그러나이 기록 구성에서, 채널에 근접하여 세포 내 환경을 교란 할 수있다. 따라서, I의 전압 - 의존적 활성화의 차이 <비교 전류가 세포 부착 된 패치 및 외부 아웃 (10)를 사용하여 얻은 경우 서브> 시간이 관찰된다. 뉴런의 붓기는 때때로 패치 클램프 녹음 중에 발생하고, 종종 솔루션의 구성에 솔루션을 39 또는 오류 인트라와 세포 사이의 물 품질이 낮은 강한 불균형 삼투압이나 pH를 같이 별개의 원인으로 발생한다. 전기 생리 레코딩의 품질 회수 뉴런의 형태의 품질에 대한 직접 입사있다. 세포 내 환경 (14)의 희석을 최소화하기 위해 세포 부착 녹음 후 - (참고 문헌에서 6,11로, 10 MΩ. 6) 및 하나의 체세포 녹음에 대한 높은 저항 체세포 피펫 듀얼 레코딩에 사용됩니다. 셀에 연결된 기록 다음 전체 세포 체세포 기록 따라서 짧은 (<10 분)로 유지된다. 체세포와 수지상 모두 피펫에서 외부 아웃 패치는 C의 적절한 폐쇄에 필수적이다엘 멤브레인 및 세포 형태의 이후의 복구. 세포의 구조뿐만 아니라, 신경 화학적 콘텐츠 기록 뉴런 59,74 대해 결정될 수있다. 예를 들어, 세포 내 단백질 티로신 수산화 효소는 DA 신경 (13)의 명확한 식별 immunolabeled 수있다.

DA 신경 주로 SN에 집중되어 것은 SN 존재 훨씬 낮은 밀도, compacta을 갈 거예요 그들이 GABA 뉴런 (75)의 높은 수와 혼합되어 reticulata을 갈 거예요. DA 신경 세포의 세포체는 GABA 뉴런보다 종종 더 큰 반면, IR-videomicroscopy 이러한 세포의 시각적 식별 불확실 부분적 유리체의 compacta의 불투명도에 의해 방해된다. 이러한 제한을 피하기 위해, DA 신경의 예비 선택은 뉴런 (DA 신경 대한 TH 65 DAT, GAD 특정 인구 형광 마커를 발현하는 형질 전환 마우스를 이용하여 용이하게 할 수있다GABA 신경 세포) 및 표면 형광 조명. 대안 적으로, 형광 염료가 덴 드라이트의 시각화를 용이하게하기 위해 체세포 전극 용액에 포함될 수있다. 형광 세포의 증가 된 해상도는 Nipkow 회전 디스크 공 촛점 14,22,30 또는 IR-DGC (6)에 결합 된 두 광자 현미경 (7)에 의해하게된다. 여러 장점 DIC 비교 DGC 관련이있다. DIC 프리즘이 필요하지 첫째, 상기 IR-DGC 화상은 형광 이미지 49,52,53,76와 중첩 될 수있다. 둘째, DGC는 photostimulation와 77 optogenetics 결합 할 수 있습니다.

슬라이스 제제의 단점은 신경 세포의 무결성을 보존한다. DA 신경 세 평면 공간 78,79 그들의 수지상 연장 따라서 수지상 실의 절단이 완전히 조각 (80)을 회피 할 수 없다. 슬라이스 방향의 선택 (관상 수평 파라) 시상 트레이드 오프입니다. 신경 분포 및 실험 설계의 기원은 슬라이스의 오른쪽 방향을 선택하기 위해 고려되어야한다.

직접 수지상 세포의 패치는 다른 구획 기능성 이온 채널의 분포를 매핑하는 데 사용되는 기술이다. 또한,이 기술은 채널 (20)의 기능성의 변화를 결정하도록 제공한다. 보완 이온 채널의 위치와 밀도는 광 및 전자 현미경 수준에서 면역 17,23을 이용하여 확인 될 수있다. 이 접근법은 또한 패치 피펫에 액세스 할 수없는 작은 구경 구조에서 채널 밀도를 결정할 수있는 가능성을 제공한다. 그러나 이들 채널은 패치 클램프 기술을 이용하여 기록 된 것과 비교하여 고유 한 기능 상태 (24) 또는 비활성화 될 수있다. 두 기술은 위치 및 속성의 전체 사진을 얻을하는 것이 필요하다특정 세포 영역 (17)의 이온 채널. 전압 감응 염료의 발전 전압 촬상 여러 위치 81에서 AP와 뉴런 EPSPS의 전파를 조사하는 데 사용되어왔다. 듀얼 패치 클램프 기록에 대한 대안으로서,이 방법은 심지어 패치 피펫에 액세스하지 않지만, 신호 평균화의 정확한 보정을 필요 얇은 돌기에 구현 될 수있다.

SN 및 복부 피개 영역에서 DA 뉴런 널리 생리 및 병리 생리 학적 맥락에서 체세포 녹음을 통해 조사하는 동안, 자신의 수상 돌기의 기능적 특성은 두 조건에 크게 알려지지 않은 남아있다. 수상 돌기에서 패치 성공 13,25,26으로 여러 그룹에 의해 흑색질 도파민 신경 세포에 대한 구현이 미세 세포 내 구조 8 고르기 속성을 해부하는 선택의 방법을 유지하고있다. 수지상 기록은 더 opportu을 제공NITY는 효율성과 시냅스 전달의 소성 및 수지상 흥분 82,83의 가소성을 자세히 조사합니다.

Disclosures

저자는 그가 더 경쟁 재정적 이익을 가지고 있지 함을 선언합니다.

Acknowledgments

나는 공 초점 현미경, 두 번째 Axopatch 200B 앰프의 선물 박사 자크 정해지다은 GIGA-영상과 조언에 대한 그의 지속적인 지원을위한 박사 빈센트 Seutin, 크리스 Gillissen과 우수한 기술 지원 로랑 Massotte, 박사 진 Defourny와 산드라 Ormenese 감사합니다 비판적 원고를 읽기 위해 공 초점 현미경 및 Imaris 소프트웨어 및 박사 스티븐 프리먼 공유를위한 플랫폼입니다. 이 작품은 벨기에 FRS에서 보조금에 의해 지원되었다 - FNRS (U.N002.13 및 T.N0015.13)와 벨기에 대학 재단의 지원 (Publié AVEC 르 콩쿠르 드 라 파운데이션 부문 Universitaire 드 벨기에 (프랑스어))를 발표했다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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신경 과학 문제 (117) 수상 돌기 패치 클램프 듀얼 레코딩 세포 부착 biocytin 라벨 신경 세포의 형태 흑질 도파민 신경 세포 이온 채널
흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음
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Engel, D. Subcellular Patch-clamp… More

Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

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