Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54601
Automatic Translation
1
1GIGA-Neurosciences, Quartier Hôpital, University of Liege

Abstract

dopaminerjik nöronların Dendritler almak ve sinaptik girdi, destek aksiyon potansiyeli geri yayılma ve nörotransmitter salınımını iletmek. Bu temel işlevleri anlaşılması bu nöronların bilgi aktarımı ışık tutacaktır. Dendritik patch-kelepçe kayıtları doğrudan dendritler ve altta yatan voltaj kapılı iyon kanallarının elektriksel özelliklerini incelemek imkanı sağlamaktadır. Ancak, bu ince yapılar nedeniyle küçük çaplı yama pipetler kolayca erişilebilir değildir. Bu rapor, akut dilim dopaminerjik nöronların dendrit gelen istikrarlı ve güvenilir kayıtları toplamak için bir adım-adım prosedürü anlatılmaktadır. Elektrofizyolojik ölçümler hücre morfolojisi post hoc geri kazanımı ile bir araya getirilmektedir. Başarılı deneyler dilimleri, çözümleri ve pipetler, kaydedilen yapısı ile temas halinde optik ve pipet istikrar yeterli uyum gelişmiş hazırlık güveniyor. som standart ilkeleriatic yama-kelepçe kayıt dendritler ama pipetle bir yumuşak bir yaklaşım ile uygulanır. Bu çok yönlü teknikler dendritler telaşlı özellikleri hakkında çeşitli soruları için uygulanabilir.

Introduction

Nöronlar kendi dendritler ağırlıklı sinaptik bilgi almak. Uyarıcı ve aksiyon potansiyelleri (AP) çıkış sinyali olarak uyarılmış bütünleşme sitesine nesil kendi sitesinden yayılan inhibitör sinaptik sinyalleri. Yolda, sinaptik potansiyeller dendrit yapısı ve pasif ve aktif membran özellikleri arasındaki etkileşim hem etkilenir. Bu son derece değişken parametrelerin kombinasyonu nöronlar 1,2 hesaplama gücünü genişletmektedir. Ancak, dendritler küçük çaplı ancak kendi elektriksel özelliklerinin incelenmesini engellemektedir. 6,7 dendritlerindeki - (3 mikron Ø 0.7) patch-kelepçe tekniği 3 sürekli gelişim, son yıllarda optik 4 ve dilim hazırlama 5 için yöntemler arıtma çok ince kayıtları sağlamıştır. Bu yöntemler vardı ve hala büyük ölçüde çeşitli o içinde dendritler heyecanlanma incelemek için kullanılırf nöronlar 8. Doğrudan dendritik kayıtları fonksiyonel özellikleri farklı nöronal bölümlerinde iyon kanallarının 20-22 dağılım 9-19 ve farklılıkları belirlemek için gereklidir. Bu veriler, ışık ve elektron mikroskobu 23,24 kombine immünhistokimya ile tespit edilen iyon kanal dağılımlarının gerekli bir tamamlayıcıdır. Çift somatodendritik kayıtları detaylı pasif kablo modelleri, aksiyon potansiyeli 9,13-15,21,22,25-27 ve nöronların somatodendritik etki boyunca sinaptik potansiyellerin 13,16,18 yayılması yayılmasını keşfetmek elde etmek için uygulanmaktadır 28- 30 ve nöronal entegrasyon 31 zamansal çözünürlüğe araştırmak.

substantia nigra (SN) gibi hareketin kontrolü, ödül ve alışılmış davranışları kodlama gibi çeşitli fonksiyonlar yer alan orta beyinde yer alan bir bölgedir. Belirli nedeniyle dopamin azalmaSN dopaminerjik (DA) nöron kaybı, Parkinson hastalığı 32 mustarip hastalarda gözlenen motor bozuklukları ile bağlantılıdır. dopaminerjik ve GABAerjik nöronlar: nigral devresi iki hücre tipinde oluşmaktadır. İlginçtir, bu nöronlar diğer nöronlardan ayırt birçok özgü özellikleri vardır. DA nöronlar ve bazı GABA nöronların büyük bir bölümünün akson dendritik çardak heterojen (akson taşıyan ve akson-eksik dendritler) 25,26,33 olduğunu belirten bir dendritik sitesinden kaynaklanır. Soma kadar, dendritler başlayarak ve son olarak 34 akson için: bu nöronların morfolojisi bilgi aktarımı dinamik Cajal yaydığı kutuplaşma yasasını takip ettiği nöronların tipik organizasyonu ile bu nedenle tezat. DA nöronlar, aynı zamanda, kendi dendritler 35 dopamin serbest patlama aktivitesi 36 ve NMDA reseptörü plastisite 37 neden olduğu bilinmektedir. dissecBu olayların tion onlar başlatılan sitesinden doğrudan kayıtları olmadan zor olduğunu. hassas konum ve iyon kanallarının fonksiyonel özellikleri ve nigral nöronlar dendritik heyecanlanma ve bilgi transferi rollerine arasındaki ilişki içine anlayışlar kazanmak için, doğrudan dendritik kayıtlar tercih edilen yöntem vardır.

Bu rapor nigral nöronların dendrit ve ilgili post hoc biocytin etiketleme tek ve çift yama-kelepçe kayıtları elde etmek için kullanılabilir detaylı yordam açıklanır. somatik ve dendritik membran yama için temel ilkeler çok benzer. Pratikte, ancak dendritik sitelerden kayıtları somatik kayıtları karşılaştırıldığında özel optimizasyon gerektirir. Başarılı dendritik kayıtları dilimleri, optik optimal ayarı, kayıtların yama pipet ve istikrar nazik yaklaşımı kalitesine güveniyor.

Protocol

Burada anlatılan tüm deneysel prosedürleri, Hayvanları Koruma ve Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Derneği Federasyonu Kuralları AB Direktifleri kurumsal ve ulusal kurallara uyun.

Çözümler 1. hazırlanması

  1. Standart yapay serebrospinal akışkan (ACSF Tablo 1)
    1. Taze çözelti hazırlamak için, daha önce, iki kez damıtılmış su ile yıkandı, yüksek saflıkta tuzlan 38 ve temiz bir cam beher kullanın. Tüm ekstra ve hücre içi çözeltilerin hazırlanması için, yüksek kaliteli iki kez damıtılmış su kullanın.
    2. . Tablo 1 'e göre iki değerlikli iyonların 39 çökelmesini önlemek için diğer Tuzları çözmek için 500 ml su ve başka NaHCO 3 çözmek üzere, 2 L'lik bir beher al iki kez damıtılmış su ile sistematik spatula temizleyin ve bir tuz almadan önce kuru . dissolutio homojenize etmek için manyetik bir karıştırıcı kullanarakn. Uygun bir ölçülü balona her iki bardak çözümler ekleyin ve uygun miktarda getirmek.
    3. Nihai hücre dışı çözüm tamamen şeffaf ve yağış herhangi iz bırakmadan olduğundan emin olun.
    4. Dilimleri 38,40 perfüze önce 30 dakika - bir cam mikrofiltre mum (Ø 13 mm) 20 ile% 95 O 2 ve% 5 CO 2 (carbogen gaz) oluşan bir gaz karışımı uygulayın. (: 314 - 325 mOsmol / L optimum aralık) bir ozmometre ile ACSF - (3 ardışık ölçümler 2) dikkatlice osmolarite kontrol eder. 4 ° C 'de hazırlandıktan sonra, kalan solüsyon saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
  2. Kesme çözeltisi (sakaroz-ACSF; Tablo 2) 5,13
    1. taze çözelti 3 L hazırlayın. bir hayvandan beyin dilimleri hazırlamak için 1 L kullanın. 4 ° C'de kalan çözelti saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
      NOT: Yüksek Mg +2 ve düşük Ca 2 + konsantrasyonları d kullanılırecrease sinaptik iletim ve sakaroz ile bazı NaCl ikame dokusunu 5,40 korumak için.
  3. Hücre içi çözümler
    1. Önceden çift bütün hücre kayıtları (Tablo 3), 100 ml çözelti hazırlayın.
    2. Hücre morfolojisi iyi kurtarma elde etmek için metilsülfat 13,15,21 ekleyin. sonradan nöronun morfolojisini incelemek için - (% 0.4 0.1) biocytin ekleyin. Bir floresan boya (örneğin, Alexa 594 veya sülforhodamin 101 41) Kayıt (opsiyonel) sırasında dendritler uzantısı takip ekleyin.
    3. Önceden hücre bağlı kayıtları (Tablo 4) için 100 ml elektrot çözeltisi hazırlayın. Bu durumda iç çözüm makroskopik hiperpolarizasyon aktive katyon akımı (I h) izole etmek için tasarlanmış yüksek K + çözümdür ve diğer voltaj kapılı iyon kanalları için bloker içerir.
    4. Mağaza içi-20 ° C'de 2 mL alikotlar hücresel çözümler. Her yeni kayıt oturumu için yeni bir kısım kullanın. dikkatli bir osmometre her buzları çözülmüş bir alikotu ozmolaritesini edin. ozmolarite başlangıç ​​değerine karşılık gelmiyor, yeni bir kısım alın.
    5. 0.22 um'lik steril bir şırınga filtresi yerleştirildiği üstüne bir 3 ml şırınga içine kısım solüsyonun aktarın. bileşikleri (ATP, GTP veya phosphocreatine) bozulmasını sınırlamak için kayıt oturumu sırasında buz üzerinde şırınga tutun.

2. Üretim ve Yama Pipet doldurma

  1. çeken
    1. yatay elektrot çektirmenin ve kalın duvarlı borosilikat cam tüp kullanın. Bütün hücre ve hücre-bağlı kayıtlar için, 2 mm dış çap / 1 mm iç çap kullanın. Cam tüp 38 kesinlikle temiz olduğundan emin olun.
    2. Bu durum söz konusu değilse, bir organik çözücü içinde bir cam kılcal bırakın (örneğin, etanol) Birinci ve daha sonra iki kez damıtılmış su içinde. Kısaca Bunsen beki ile kılcal sonlar ısıtırlar. (Malzeme listeye bakın) Alternatif olarak, sipariş cam tüp yıkanmış ve doğrudan üreticiden ısıtılır.
    3. Çift somatodendritik kayıtlar için, temin somatik pipet direnci olduğu 6 ila 10 M? 6,11 ve hücre içi çözelti (Tablo 3) ile doldurulmuş dendritik pipetler için MQ 8 ila 19. Nöron 16,18,42,43 ve somatodendritik etki boyunca karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için 10 M? Bir direnç hücre bağlı kayıtları için pipet direnci standart hale getirilmiştir.
    4. Yama önce taze pipetler her kayıt oturumundan önce (her gün) ya da hemen hazırlayın ve onlara 5 kullanın - kendi imalat 39 8 saat sonra. kapalı cam kapta saklayın pipetler toz ve ucunun tıkanması onları korumak için.
  2. Polisaj
    1. Kontrol edin ve heat-lehçe bir microforge her pipet membran ile daha iyi mühürler elde etmek. microforge kullanmadan önce, platin ısıtma lifte cam küçük bir parça eritin. constancy (Peter Jonas, kişisel iletişim) günlük platin filaman bu cam kaplama değiştirin.
      NOT: Hücre bağlı kayıtları için kullanılan pipetler arka plan gürültüsünü azaltmak için ısı parlatma aşamasından önce kaplanabilir. Kaplama, erimiş diş mumu 22,44 veya bir silikon elastomer 39 gibi bir yalıtıcı madde ile elde edilebilir.

Beyin Dilimleri 3. hazırlanması

  1. 19 gün eski - 16 yaş arası sağlıklı Wistar sıçan kullanın. Hipotermi veya dehidratasyon muzdarip sağlıksız hayvan veya hayvan kullanmayın. dilim hazırlanmasını başlamadan önce güvenli ve sessiz bir yerde hayvan tutun. bir hayvanı hazırlarken odasında başka bir hayvan kaçının. nazikçe hayvanları işleyin.
  2. iki 400, sakaroz-ACSF dökünml polipropilen (PP) beher ve 45 dakika ° C derin dondurucuda -80 yerleştirin. homojen bir buz soğuk sıvı / dondurulmuş çözüm olsun ve buz üzerinde beher yerleştirmek için çözüm karıştırın. Her PP beher bir mikrofiltre mum (Ø 13 mm) kullanılarak carbogen gazı ile sakaroz-ACSF çözümü sağlayın.
  3. Dilimleme makinesi ve rezerv odasını hazırlayın
    1. Mümkün olduğunca dilim yüzeysel tabakalarına hasarı en aza indirmek için çok düşük bir dikey titreşim 5,38 olan yüksek kaliteli bir doku dilimleme makinesi kullanın. dilimleyici üzerinde taze ve tüm jilet sabitleyin.
    2. Her bir kesme oturum için yeni bir jilet kullanın. jilet eğilmesini önlemek. jilet (Josef Bischofberger, kişisel iletişim) yüzeyindeki yağ filmi çıkarmayın.
    3. Varsa, üretici tarafından sağlanan bir vibroprobe dikey titreşim kontrol edin. Alternatif olarak, bir ısmarlama vibroprobe 5 kullanın. Bıçak s dikey titreşimleri azaltmakolarak o mümkün olduğunca 0 um kadar yakın olmak.
    4. P gösterildiği gibi dilimler için bir 150 mL rezerv odasını 45,46 hazırlayın. Ref 201. 39. Rezerv odasına standart ACSF dökün ve bir su banyosunda yerleştirin. carbogen bir mikrofiltre mum (Ø 6 mm) kullanılarak rezerv odası çözümü sağlayın. carbogen kabarcıklar mümkün olduğunca küçük olduğundan emin olun.
      NOT: Her 2 yeni rezerv odasını kurmak - dilim kalite sabit tutmak için 3 ay.
  4. Kes dilim
    1. deneyci rahatsız veya stresli edilmediği sessiz bir odada, servikal medulla düzeyinde cerrahi makas (uzunluk 150 mm) ile hayvan başını kesmek.
    2. Bir neşter ile kaudal yöne nazal hayvanın başının üstündeki deriyi kesin ve yanal çıkarın. ince makas ile başın burun kısmına kaudal gelen kafatası üst kesin ve yanal kafatasının iki parçayı çıkarın. b kaldırince bir spatula ile yağmur ve buz gibi soğuk içeren bir PP behere dikkatlice bırakın (0-4 ° C) sakaroz-ACSF karbojen 38 ile dengelenmiş.
      NOT: adımların Bu dizi kısa sürede yapılması gerektiğini, ama aynı zamanda titizlikle (<< 1 dk, yaklaşık 40 s).
    3. ~ 2-5 dakika için, PP beher çözeltisi beyin tutun. Beynin hareketlerini önlemek için carbogen basıncını ayarlayın. carbogen kabarcıklar yeni bir tanesiyle çok büyükse mikrofiltre mum değiştirin.
    4. Iç taban, bir ~ 0.5 cm kalınlığında Sylgard tabakası 38 ile kaplanmış olan bir 9 cm Petri tabağına beyin yerleştirin. Bu önceden petri hazırlayın.
    5. buz gibi soğuk sükroz-ACSF beyin Surround. ACSF sakaroz çözeltisinin bir kısmının sıvı faz beyin submerges emin olun. koronal dilimleri için, bir neşter veya jiletle koronal düzlemde beynin frontal kısmı kesilmiş. koronal kesim ile beyincik çıkarın.
    6. siyano uygulanumune tepsisi üzerine akrilat yapıştırıcı (alan ~ 1 cm2). ön kısmı dilimleme sahne karşı karşıya şekilde beyin blok yapıştırın. Dikkatle cam Pasteur pipeti büyük açılış kullanılarak yapıştırılan beynin üstündeki sakaroz-ACSF damla ve sonradan yavaş yavaş dilimleme makinesi kesme odasına daldırın. Kesme yüzeyi (yani, ilk doku bıçağı vurmak) beynin 40 ventral yüzeyi böylece numune tepsisini Manevra.
    7. Kesme odasının (isteğe bağlı) bir bükülmüş cam mikrofiltre mum (Ø 6 mm) ile carbogen uygulayın.
    8. Yatay düzleme 5'e atıfta bulunmak sureti ile 15 ° ~ lik bir açı ile bir jilet ayarlayın. substantia nigra ulaşmadan önce burun yönüne kuyruktaki ~ 500 mikron koronal beyin dilimleri kesin. ilgi bölgesini içeren 350 mikron kalınlığında dilimler - 300 kesmek için kalınlığı azaltın.
    9. bağlı bir çok ince perfüzyon iğne ile doku bloğundan ayrı dilimjilet kenarına bir şırınga paraleldir. Viraj iğne iğne ve şırınga arasında 90 ° 'lik bir açı sahip olacak şekilde. Doku bloğundan dilim çıkarırken herhangi bir baskı jilet uygulanır emin olun.
  5. Mağaza dilimleri
    1. Rezerv odasına (bir ampul takılı) bir cam Pasteur pipeti büyük açılış kullanarak dilim aktarın. 1 saat - bütün dilimleri saklama odası (Christoph Schmidt-Hieber, kişisel iletişim) transfer edildikten sonra 0.5 34 ° C su banyosu sıcaklığına getirmek.
    2. Bu dönemden sonra su banyosu kapatın ve oda sıcaklığında dilim tutun. rezerv odasında dilim hareketlerini önlemek amacıyla carbogen basıncını ayarlayın. kayıtları başlamadan önce bir 10 ila 20 dakika boyunca dilimleri tutun.
    3. SLI sonunda iki kez damıtılmış su ile dikkatli bir şekilde yine iyice cihaz ve mikrofiltre mumlar temizlemeprosedürü dans ediyorum.

Nigral Nöronlar ve Biocytin Dosyalama 4. Çift somatik ve Somatodendric Kayıtlar

  1. Akson Kılavuzu ve Refs verilen dilimler için bir yama-kelepçe kurulum montajı için açıklamaları takip edin. 39,40,47. Yama daha temel yönlerine ilişkin bilgiler Ref vardır. 48.
  2. Kayıt odasını hazırlayın
    1. kayıt odasına 2 ml iki kez damıtılmış su - 1 yerleştirin. o sızdıran olmadığından emin olun. değişen xy masaya kayıt odasına yerleştirin.
    2. kayıt odasına bir oksijen geçirmeyen perfüzyon boru sistemi (politetrafloroetilen) üzerinden standart ACSF besleyin. 5 ml dak-1 - 4 arasında bir oranda bölme perfüzyon akışı stabilize. Mümkün (1 m) gibi kısa ACSF içeren beher katılmadan boru uzunluğu ve kayıt odasını tutun.
    3. Rezerv odasından bir beyin dilim seçin ve içine aktarınBir cam Pasteur pipeti büyük açılış kullanarak kayıt odası. p gösterildiği gibi kayıt odasının alt kısmına demirlemek için bir platin halkası ile dilim örtün. Ref 201. 39. Düz platin halkası (Ø 1,5 cm) kullanın ve ona paralel naylon konuları (aralık> 2 mm) tutkal.
  3. Ayarlayın ve optik optimize
    1. Kızılötesi (IR) Video mikroskopi 4,47,49,50 kullanarak dilim gözünüzde canlandırın. Köhler aydınlatma 51 ayarlayın ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) 51 optik ya da eğik aydınlatma (Dodt Gradient kontrast - DGC) optimize 52,53. Bu yordam hakkında daha fazla detay Refs verilmiştir. 40,49.
    2. Dilimin kalitesini kontrol edin. Sadece çok güçlü bir tezat ve sadece küçük, dağınık kraterler var olmayan pürüzsüz ve hatta yüzeyleri ile dilimleri tutmak.
    3. (Hücre içi çözelti ile 2 taze ve kullanılmayan yama pipet doldurun
  4. Dilim yüzeyi üzerinde pipetler yerleştirin
    1. Gümüş telleri üzerinde klorür kaplama varlığını kontrol ediniz (banyo referans elektrot ve yama elektrot;. Ayrıntılar için, Akson Kılavuzu ve refs 39,54 bakınız).
    2. Pipet sahipleri içine pipetler sırayla yerleştirin ve pipet tutucu, üç yönlü bir musluk ve bir manometre 40 bağlayan bir boru devresi kullanarak pozitif basınç (~ 70 mbar) uygulanır. kayıt odasının banyosuna pipet indirin.
    3. 2 dakika - manometre basınç değeri ~ 1 sabit olup olmadığını kontrol edin. Basınç düşürme durumunda, tüp ya da pipet tutucu içine sızdırmazlık O-ringleri kontrol edin.
    4. video monitörünün ortasında pipet yerleştirin ve tıkalı olmadığından emin olun. uygulayarak veya pipet basınç serbest zaman pipet hareket etmez emin olun.
    5. tam pipet pozisyonunda ekranın ortasındaki küçük bir haç çizerek sürüklenme ve pipet titreşimleri kontrol edin ve bahşiş 5 dk olası hareketleri gözlemlemek.
    6. bir osiloskop üzerinde pipet direnci izlemek için bir gerilim adım (5 mV) uygulayın. 0 mV yama-kelepçe amplifikatör tutma potansiyeli ayarlayın. Pipet İptal DC pipet akımı amplifikatör ölçer 39,51 de sıfır okur gibi potansiyel ofset.
    7. dilime aşağı pipetler taşı ve yüzey üzerinde onları korumak.
  5. Seçin ve uzun dendritler ile bir nöron yama
    1. substantia nigra içinde yaklaşık aynı pl uzun bir mesafe takip edilebilir uzun dendritler ile sağlıklı bir nöron seçinane (Şekil 1A ve 1B) kullanarak IR-Dodt Gradient Kontrast (IR-DGC). pürüzsüz ve homojen bir hücre gövdesi seçin. O kırmak için ve zamanla stabil kayıt koşulları (kararlı seri direnç) korumak zor olduğundan, dilim (Şekil 1C ve 1D) yüzeyinde iki yüksek kontrastlı hücreleri kaçının. dilim yüzeyin altında 30 mikron - kendi soma 10 olan nöronlar seçin.
    2. (- Uzakta 50 mikron 40) ve aynı mesafede dendrit dendritik elektrot yakın soma yakın somatik elektrot taşıyın. seçin ve bir dendrit bir kısmını yama 2X büyütme (dörtlü değiştirici) kullanın. 2X büyütme ile monitör büyütme (1X) olmadan 2,100X mutlak büyütme ve 5,500X on edinin.
    3. Hafif 10 mbar tarafından somatik pipet basıncı boşaltın. Gerekirse, c yer değiştirmesini önlemek için, dendritik ve somatik pipet basıncını düzenleyendilim içinde ell yapısı (soma ve dendrit).
    4. Küçük bir dimpling görmek için zara yakın dendritik pipet yerleştirin. pipet üzerindeki baskıyı ve pipet direnci kontrol altında tutarken dendrit yama. İdeal koşullarda, sadece çok hafif bir emme iyi bir sızdırmazlık elde etmek için yeterlidir.
    5. Hücre bağlı modunda dendritik pipet tutun. somatik zara somatik pipet yakın hareket ettirin ve somatik membran yama. Yüksek mühür direnç hücre zarı (> 1 GΩ) 39 yırtılma önce elde emin olun. Biraz hücre gövdesi ve dendrit deformasyonunu önlemek için um bir çift tarafından zardan hem pipetler çekin.
    6. Her iki pipetler için, yüksek kazanç ve küçük filtreleme 51 ve oscilloscop bir gerilim darbesi kullanarak geçerli adımın üstünde mümkün olduğunca pipet kapasitans geçici genlik azaltır. tam hücreli modu wi içine girmekdendritik pipet inci ve sonradan somatik pipet ile.
    7. tam hücreli kapasitans geçişlerini ortadan kaldırmak ve seri direnç telafi. Monitör ve başında erişim direnci belge ve düzenli esnasında, deney. seri direnç çok yüksek ise (> 50 M?), başka bir pipet yardımıyla yeniden deneyin.
    8. Yüksek ve düşük büyütme oranlarında video grafik yazıcıda 25, bir çerçeve kapmak ya da dijital kamera ile IR-DGC resimleri (Şekil 1A ve 1B) toplayın.
      NOT: Kayıt sırasında nöronların şişmesi (Şekil 1E ve 1F) sporadik görülmektedir, ancak nadiren çözümleri ozmolaritesi ve pH doğru 39 ayarlandığı zaman.
    9. Aynı prosedür (Şekil 2A) ile - (soma soma) çift somatik tam hücreli kayıtları edinin.
  6. sırayla geçerli adımları depolarizan artan uzun (ms birkaç yüz) uygulayınsomatik ve dendritik pipet ile AP (Şekil 2B, 3C ve 3D) uyandırmak için. dendritik ve aynı zamanda somatik pipet sonuçtaki potansiyelini kaydedin.
  7. Dopaminerjik nöronlarda yapay uyarıcı postsinaptik potansiyellerin yayılmasını (aEPSPs) inceleyin
    1. Çift akım kelepçe kayıtları (Şekil 4A ve 4B) sırasında geçerli bir komut olarak enjekte eksitatör postsinaptik akımı (EPSC) dalga formu oluşturun. Bunu yapmak için, faiz 55 nöron EPSCs için ölçülen gerçek değerlere karşılık gelen genlik ve zaman ders değerleri ile bir çift üstel fonksiyonu oluşturmak. Dikkatle orijinal zaman kursu korumak için inşa EPSC ve enjekte EPSC dalga örnekleme oranları kontrol eder.
      Not: Gerçek bir nöron dalga biçimini uygulamadan önce bir model hücre kullanarak test.
    2. Sıralı dendritik yoluyla dalga formunu enjekte veeş zamanlı hem somatik ve dendritik pipetler için potansiyelleri ortaya çıkan somatik pipet ve kayıt. pipetler olası sürüklenme için düzenli olarak kontrol edin.
  8. Bir nörondan kayıt Sonlandırma
    1. dilim ve elektrotların içinde nöron konumunu belgelemek için: Düşük büyütme (5X veya 10X objektif) bir IR-DGC resim çekin.
    2. Yavaş ve nazikçe hem pipetler dışında çıkış yamalar oluşturmak için dendritik ve nöronal membran sırayla somatik pipetler çekin. Yanal yukarı doğru hareketleri 38 bir sırasını kullanarak bir pipet çıkarın. Bunlar ilk başta kısa ve daha sonra yavaş yavaş uzunluğu artmalıdır. Bu kayıt yapılandırma hücre zarının doğru kapanmasını yanadır.
    3. pipet geri çekilirken voltaj kelepçe bir 5 mV voltaj darbesine cevaben kapasitif akımların azalma (erişim direncinde artış) izleyin.
    4. Membran deniz kezPipet ucu etrafında led, kayıt odasının tamamen götürün. banyosundan hedefi çıkarın. Kaydedilen nöron (hücre içi çözeltiden) biocytin bir dengede izin standart ACSF 20 dakika - 15 kayıt odasına dilim tutun.
    5. Yavaşça standart ACSF içeren 25 mL'lik geniş ağızlı amber (kahverengi) cam şişeye, bir Pasteur pipeti büyük açıklık ile dilim aktarın. Bir kapakla şişeyi kapatın. tespit aşaması için paragraf 6'ya bakınız.

5. Hücre bağlı Kayıtlar

  1. Bir dendrit aynı düzlemde uzun bir mesafe boyunca uzanan bir nöron seçin. ilgi dendrit iyi tanımlanmış soma için takip edilebilir emin olun.
  2. Elektrot solüsyonu (Tablo 4) ile yama pipet doldurun. diğer iyon cha engellemek için özel farmakolojik ajanlar da dahil olmak üzere hücre bağlı konfigürasyonda ilgi akımını kaydetmek için çözümü tasarlamannels.
  3. Hücre bağlı modunda dendrit yama
    1. dendrit bir kısmını görselleştirmek ve manipülatör kullanarak recoding pipet yaklaşım. dendrit değiştirmesini önlemek için - (80 mbar 70) manometre kontrol ederek pipet basıncı uyarlayın. 4.5.4 tarif edildiği gibi dendrit yama.
    2. Bazı IR-DGC resimleri (Şekil 5A) kaydedin. Hücre bağlı kayıtları 18 (Şekil 5B) 10 GΩ - en iyi 3 arasında, (> 1 GΩ 39) mümkün olduğunca büyük bir mühür direnci elde etmeye çalışın. dendrit deformasyonunu önlemek için um bir çift tarafından zardan pipet geri çekin.
    3. nigral nöronların spontan aksiyon potansiyelleri yansıtan hücre bağlı modda eylem akımları dikkate alınmalıdır. Eylem akımları bastırmak için Ca 2 + ve Na + kanal blokerleri (CDC 2 ve TTX, sırasıyla) ile ACSF tamamlar.
    4. 2 sv uygulaBen h (Şekil 5C) uyandırmak için yama 0 mV tutma potansiyelinden -90 mV voltajlı bir adım. Pipet potansiyeli ve istirahat membran potansiyeli hücre bağlı konfigürasyonda 56 seri olduklarını unutmayın. Daha fazla bilgi için, Akson kılavuzu ve Ref. 39 bkz.
    5. pipet olası sürüklenme için düzenli olarak kontrol edin.
    6. Kaydın sonunda, membran potansiyelinin bir okuma almak hemen tüm hücre modunda gitmek için yama rüptürü. bir dış-out yama elde etmek bölümleri 4.8.2 ve 4.8.3 de açıklandığı gibi pipet geri çekin.
  4. Tam hücreli modunda gelen soma rekor
    1. dendritin boyunca bakmak ve ilgili soma bulun. Bir K + tabanlı hücre içi çözeltisi (Tablo 3) ile doldurulmuş - (10 M? 5) 6,14,57 yüksek dirençli pipet kullanın. kısa bir emme (negatif basınç) uygulayınPipet tüm hücre modunda girmek için membran rüptür için.
    2. Uzun hiper uygulayarak ve güncel adımları (Şekil 5D) depolarize geçerli-kelepçe içinde nöron kimliğini kontrol edin ve biocytin dendritler boyunca diffüz izin verin. AP zaman kursu görselleştirmek için kısa depolarizasyon akımı adımları uygulayın.
    3. 4.8.3 - ≤10 dakika sonra, kesitler 4.8.2 anlatıldığı gibi bir dış-out yama elde etmek için pipet çekebilirsiniz. Yavaşça standart ACSF ihtiva eden bir 25 ml cam kehribar rengi şişeye Pasteur pipet büyük açıklık ile dilim aktarın. Bir kapakla şişeyi kapatın.
    4. Alternatif olarak, birinci ek olarak bir flüoresan boya ihtiva eden bir pipet çözeltisi ile somatik bir bütün-hücre elde. Boya yayılmasına imkan ve dendrit 26 bir bölümünü seçin. İkinci bir pipet yardımıyla hücre bağlı modda dendrit yama. Mevcut floresan etiket görselleştirme geliştirmek için eğer bir konfokal mikroskop kullanmaked 14,22 dendritine.
    5. Hücre bağlı kayıtları 10,22 alternatif ya da ilave olarak, dış çıkış yapılandırmada dendritik kayıtları gerçekleştirin. Şekil 5E ve 5F bir dış-out yama kaydedilen bir voltaj kapılı akımların bir örneğe bakın.

Nigral Nöronlar 6. Biocytin Etiketleme

  1. Doku Fixation
    1. Mümkünse, dilim kayıt / histokimyasal işleme 38 için ayrı odalar kullanın.
    2. Pasteur pipeti ile (PBS, pH = 7.4), 0.1 M fosfat tampon tuzlu su içinde% 4 paraformaldehit ile ACSF değiştirerek dilimleri sabitleyin. Her zaman taze (<< 1 haftalık) fiksatif çözüm hazırlanmış kullanın.
      DİKKAT: Uygun eldivenler ve histoloji laboratuarında yerleştirilen bir kimyasal kaput nedeniyle toksisite paraformaldehid işlemek için. Kullanım ve c önce bu tehlikeli ürünün güvenlik bilgi formunu okuyunhalt bu toz olarak yönetmelikler ile ilgili kimyasal güvenlik (AB Komisyonu'ndan Tehlikeli Maddeler Direktifi (67/548 / EEC)) kanserini tetiklediği düşünülmektedir. Diğer ayrıntılar Referans vardır. 58.
    3. 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca dilim yerleştirin. patch-kelepçe kurulum veya paraformaldehid tarafından elektrofizyoloji için kullanılan herhangi bir ekipman kirlenmesini önlemek.
    4. Tespit edildikten sonra, PBS ile fiksatif çözüm değiştirin. sabitleyici çözelti çıkarılması ve PBS uygulamak için başka bir Pasteur pipet kullanın. (- 2 hafta 1) 4 ° C daha fazla işlem öncesi PBS içinde saklayın dilimleri. Bu durumda, haftada iki kez PBS değiştirin. (<< 1 haftalık) her zaman taze hazırlanmış PBS kullanın.
  2. Dokusunun
    1. boyama aşamaları için 24 gözlü hücre kültür plakası hazırlayın. dilim aktarmak için temiz ekipman kullanınız. Taze PBS kullanarak dilimleri 3 x 5 dakika durulayın.
    2. Floresein Avidin DCS (Avidin D, hücre sıralayıcı notu uygular; 1 uL Fluoresgece boyunca 4 ° C'de PBS içinde cein / ml Triton X-100) ve% 0.3 Triton X-100. boyamadan boyunca ışıktan dilimleri koruyun. Işık 3,3'-diaminobenzidin ile, etiket nöronların fluoresans ya da mikroskopik analiz 21,58 elektron alternatif olarak.
      DİKKAT: Triton X-100, tehlikelidir. Bu maddeyi kullanmadan önce güvenlik bilgi formu ve AB Komisyonu Direktifleri okuyun.
    3. PBS ile 3 x 30 dakika durulayın ve daha sonra, PB ile (fosfat tamponu, dilim yüzeyinde kristallerin oluşumunu önlemek için).
  3. Standart cam slaytlar dilimleri monte edin. Bir gömme ortamı ile dikkatlice dilimleri örtün. gömme ortamındaki hava kabarcıkları kaçının. tamamen dilim karşılamak için yavaşça lamel koyun. Bir mikroskop ile görselleştirme önce bir gecede slayt Hava kurutun.
  4. görselleştirme sonra 4 ° C'de etiketli dilimleri saklayın. Histokimyasal prosedürler Faydalı hileler Refs bulunmaktadır. 58,59.
  5. ayrı ayrı histoloji ve elektrofizyoloji için kullanılan ekipman temizleyin. Birlikte histoloji ve elektrofizyoloji ekipmanı karışmaz.

Biocytin dolu nöronlar 7. Post Hoc Görselleştirme

  1. kurtarılan nöronların morfolojisi görselleştirmek için bir konfokal mikroskop kullanın.
    1. Kabaca Epifloresans ile dilim floresan etiketli nöron bulun. nöronların dendritik çardak incelemek ve akson ve akson bleb bulun - 10x veya 20x objektif kullanılarak (2 4 mikron Ø). akson seyrini belge.
    2. konfokal mikroskop geçin ve etiketli nöron içerdiği floresein heyecanlandırmak için 488 nm lazer diyot seçin. z-ekseninde akson ve dendritler uzantısı izleyin.
    3. tüm hücre için z-yığını elde etmek için art arda görüntüleri kaydedebilirsiniz. 1 mikron - 0,5 z ekseni (ardışık görüntüler arasındaki mesafe) çözünürlüğünü ayarlayın. Bir hücre usin konfokal görüntüleri toplayıng düşük (10X objektif) ve yüksek (60X objektif, yağ daldırma) büyütme.
    4. Bir görüntüleme yazılımı (ImageJ) 60 ile konfokal mikroskop ile elde edilen nöron görüntü dosyasını açın. Elektrofizyolojik kayıt (Şekil 1, 2A, 3A, 4A, 5A ve 5E) sırasında yama pipetler kesin konumunu bulmak için göz tarafından bir IR-DGC görüntü z-projeksiyon görüntüsünü karşılaştırın.
    5. etiketli nöronların morphometries belirleyin: akson ölçmek - soma mesafe, somatodendritik etki boyunca ve dendritik pipet ve ImageJ "Tedbir" fonksiyonunu kullanarak akson arasındaki kayıt pipetler arasındaki mesafeler.
    6. NeuronJ (ImageJ), Imaris 29 veya Neuromantic 61 ile bazı nöronların yeniden yapılandırma.

Elektrofizyolojik Verilerin 8. Analiz

  1. Fena halde doğrudan veri (örneğin, Clampfit) ya da analiz etmek için amplifikatör ile ilgili yazılım paketi kullanınBöyle Stimfit, WinWCP bizim son yayında 13 veya örnek olarak bir açık kaynak yazılım 62,63 olarak veri analizi için diğer yazılım.

Representative Results

Yukarıda açıklanan protokol dendritik yama-kelepçe kayıtları kullanılarak verilerin toplanmasını kolaylaştırmak niyetinde. Post hoc Histokimyanın ile birlikte bu teknik, köken ya da dendrit içine yayılan birçok elektrik sinyallerine mekanizmaları içgörü kazanmak için yardımcı olur. yama pipetler ile dendritler doğrudan erişim zordur, ama birkaç metodolojik açıdan özel önem kayıtları başarı oranını artıracaktır. yeterince stabil somatik kayıt konusunda deneyimli bir deneyci girişimleri en yüksek direnç (GΩ) mühürler ve tam deneyler elde bekleyebilirsiniz. İki yüksek kaliteli dendritik kayıtlar için bir diseksiyon başına toplanabilir.

Sağlıklı somata ve dendritler içeren yüksek kaliteli beyin dilimleri durumu bu ince yapılar (Şekil 1) erişmek için bir ön koşuldur. ölçülereBu nöronlar seçmek için bir bütün hücre ve optimum ayarlanmış optik ile gözlenen düşük kontrastlı bir soma ve dendritler üzerinde pürüzsüz ve homojen bir yüzey vardır (Şekil 1A ve 1B). Seçme nöronlar çok güçlü genel tezat stabil olmayan kayıtlar (Şekil 1C ve 1C) yol açar. Bu nedenle bu tür nöronlar kaçınılmalıdır.

diğer nöronlara karşılaştırıldığında, nigral DA nöronlar belirli morfolojik ve elektrofizyolojik özellikler göstermektedir. Genellikle tek bir somatik pipet ile değerlendirilen bu özellikler aynı zamanda çift somatik (Şekil 2) ve somatodendritik kayıtları (Şekil 3) görülebilir. Uzun hiperpolarizan akım enjeksiyonları (Şekil 2B ve 5D) 'sarkma' olarak adlandırılan bir membran potansiyeli düzeltme neden olur. tanımlandığı şekilde akson bir dendritik sitede, çoğu durumda, kaynaklanırBu nöronların dendritik bölmesi heterojen olduğunu gösteren, tamamlayıcı kriterleri 13,25,26 ile (Şekil 3A - 3B). 13,25,26 - bir sonucu olarak, AP ilk görülmektedir bölmesi akson (3D Şekil 3C) çıktığı kompartıman karşılık gelir. Akson genellikle 64 dilimleme sırasında akson bir kesme neden bir akson bleb ile sona erer, ancak bu yapı sistemli algılanmaz.

Arka arkaya Ih aktivasyonuna nigral DA nöronlarının gözlenen belirgin sarkma HCN alt biriminden oluşan bir yüksek ifade etmektedir. Sinaptik sinyallerin entegrasyonu ben h etkisini belirlemek için, sinaptik benzeri akım (EPSC) dalga şekilleri oluşturulur ve somatodendritik çift kayıtları 55 (<esnasında dendritik kayıt elektrot aracılığıyla enjekte edildistrong> Şekil 4). Bu simüle EPSCs kinetiği gerçek spontan EPSCs yükselişi ve çürüme zaman sabitleri dayanmaktadır. Elde edilen aEPSP somatik elektrot ile kaydedildi. Ih bloke edici ZD 7288 Banyo uygulaması sinaptik sinyallerin (Şekil 4B) zaman seyrine Ih katkısını göstermektedir aEPSP süresini uzatmıştır. ZD 7288 teyit membran potansiyeli düzeltme kaldırması da Ih aktivasyonu (Şekil 4C) için sarkma oluşur. Simüle EPSPS ile elde edilen sonuçlar elektrik uyarılmış EPSPS 65 kullanıldığı deneylerde korele edilebilir. DA nöronların somatodendritik etki kanalın hassas dağılımı eşlemek için, hücreye bağlı kayıtları (Şekil 5) uygulanmıştır. Bir yüksek dirençli mühür (>> 1 GΩ) (Şekil 5B hücre bağlı kayıtlar için mutlak bir zorunluluktur ben h uzun hiperpolarizan gerilim adımlarla yavaş yavaş harekete geçirir ve daha önce 66 gösterildiği gibi mevcut kararlı durum, ms (Şekil 5C) yüzlerce sonra elde edilir. Bu gözlem, DA nöronlarının dendritleri ifade HCN kanalları, piramidal nöronlar ya da diğer hücre tipleri 10,16,66 olanlara kıyasla, farklı alt birimlerine sahip olduğunu gösterir. Kanalın dağılımı dendritik bölmesinde homojen olmayan olabilir ve As dendritik bölmesi kendisi heterojen olduğu gibi, dendrit (akson taşıyan veya nonaxon taşıyan dendrit) kimlik konfokal görüntü ile IR-DGC görüntü karşılaştırarak ortaya biocytin boyama (Şekil 3A ve B) uygulanmasından sonra. hücre morfolojisi geri kazanılması da, çift somatodendritik kayıtlar için ve takip eden somatik bütün hücre kayıtları yoluyla hücre-bağlı kayıtlar için gereklidir.


Kızılötesi videomikroskopi kullanarak nigral dopaminerjik nöronlar Soma ve Proksimal dendritler görselleştirme Şekil 1.. Soma ve proksimal dendrit hem somatik ve dendritik pipetler gösteren bir nigral DA nöronun (A) IR-DGC görüntü. Bir çift somatodendritik kayıt başarıyla bu sağlıklı nöron üzerinde gerçekleştirildi. Tüm hücrenin somatodendritik etki üzerinde düşük kontrast ve düzgün bir yüzey gözlemleyin. (B) sağlıklı DA nöron bir başka örneği. (C) DA nöron bir kaba ve pürüzlü yüzey ve daha güçlü bir kontrasta sahip. Çift bir kayıt elde edilmiş olsa da, her iki yüzünden pipetler de erişim direnci, tedrici artışına yol (~ 15 dakika) stabilite suboptimal ve kayıt süresi kısa olmuştur. (D) gösteren bir DA nöron İkinci örnek, yüksek kontrastlı soma ve proksimal dendrit. Bu durumda, erişim direnci güçlü bir artış bütün hücre modunda arası kısa bir süre sonra gözlenmiştir. negatif basınç erişim direncini azaltmak için bir girişimi başarısız oldu. Panel C ve D nöronlar dilimleme işlemi sırasında zarar görmüş olabilir ve deneyler için kaçınılmalıdır. (E) kaydın başında sağlıklı DA nöron Eşzamanlı çift somatik kayıt. (F) panel E aynı nöron ~ 17 dakika sonra bir şişmiş hücre gövdesi. Aksine tam olmadığına dikkat edin, soma top benzeri bir görünüm ve sağlıklı nöronlar açık değildir büyük çekirdeğinin varlığı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Eşzamanlı Çift somatik bir DA Neuron kayıt yapılması. DA nöron çift somatik kayıt sırasında (A) IR-DGC görüntü. (B) hiperpolarizan ve 1 s uzun akım enjeksiyonları depolarizan (-160 pA 80, pA 80 artırmak) ve ilgili gerilim değişimleri hem yama pipetler ile eş zamanlı olarak kaydedilir. Depolarize akım darbesi sırasında uzun hiperpolarizan akım adım ve AP sonra sonrası hiperpolarizasyon büyük gerilim izleme sarkma varlığını unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. DA Neuron Çift S omatodendritic Kaydı. (A) DA nöron IR-DGC görüntü. dendritik ve soma arasındaki mesafetlc pipet flöresin izotiyosiyanat (FITC) ile konjuge avidin ile işaretlenmiş Panel A'daki nöron 29 um. (B) Konfokal z projeksiyon görüntüsü. nöron kayıt sırasında biocytin ile doluydu. Akson okla gösterildiği gibi soma yakın bir yakın dendrit kaynaklandı. Soma (siyah gerilim izleri) ve dendrit kaydedilen paneli A. AP nöron (C) Eşzamanlı çift somatodendritik tüm hücre voltaj kayıt (kırmızı gerilimi siyah akım iz) ve sağ alternatif olarak dendritik pipet (;, somatik (sol üzerinden 1 s uzun akım enjeksiyon aşamasında yanıt izleri) kırmızı akım iz) (D) Somatik ve dendritik AP genişletilmiş zaman ölçeğinde gösterilen.. somatik veya dendritik akım enjeksiyon ile ya somatik AP (siyah) dendritik AP (kırmızı) öncesinde. Bu nöron AP arasındaki gecikme 120 us ve sırasıyla somatik ve dendritik akım enjeksiyonu, 210 us oldu. gecikmelerAP yükselen aşamasında AP yarı-maksimum genlik ölçüldü. AP akson önceki gözlemleri 25,26 teyit ortaya çıktığı yakın bölmeye ilk gözlenmektedir. Bu durumda, dendritik kaydı bir akson-eksik dendrit yapılır. Bir akson taşıyan dendrit Ref olduğu bir kaydın bir örneği. 13 (onların Şekil. 1). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
DA Nöronlar somatodendritik Eksen boyunca Yapay EPSPS Şekil 4. Yayılım. (A) da nöron IR DGC görüntüsü. dendritik ve somatik pipet arasındaki mesafe 45 mm. Her iki yama pipetler tüm hücre akım kelepçe kayıt modunda bulunmaktadır. (B) Cariakım kelepçe dendritik pipet ile kaydedilir ve yapay EPSP (üst) oluşturmak için kullanılır. Geçerli bir EPSC gibi dalga enjeksiyonu ile elde edilir (; τ çürüme = 3 ms; τ yükselişi = 0.6 ms genlik = 100 Pa) dendritik kayıt pipet 55 üzerinden. (; Kırmızı iz 30 iM) alt kısmında, kontrol koşulları (siyah) olarak soma kaydedildi aEPSPs propagandası ve h bloker ZD7288 ve banyo uygulamasından sonra. Her gerilim iz 40 tek süpürür ortalamasıdır. 30 mcM ZD 7288 uygulanmasından sonra (kontrol koşullarında (siyah) soma kaydedilen izleri Gerilim. (C) EPSPS zaman tabii ben h katkısını gösteren ZD7288 varlığında EPSP süresi büyük bir artış gözlemlemek ve uzun (30 pA yanıt kırmızı); 1 ler) hiperpolarizan mevcut adım. I <tıkanması sonra membran potansiyeli düzeltme (sarkma) olmadığına dikkatsub> h. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
DA Neuron ve Dendritler ben h Şekil 5. varlığı. Proksimal dendrit bir DA nöron ve pipet (A) IR-DGC görüntü. (B) hücre bağlı konfigürasyonda bir 5 mV gerilim komutu esnasında Kapasitif ve kaçak akımları. Conta direnci bu örnekte 5 GΩ olarak (C), hiperpolarize bir gerilim., MV yavaş aktive Ih neden 0 membran potansiyelinden (90 mV üst). Geçerli iz ters ve τ = 632 ms'lik bir zaman sabitini veren tek üstel fonksiyonu ile donatılmış. (D) Gerilim1 s hiper bütün hücre kaydedilen soma (panel A) yanıtları ve depolarize akım darbeleri (120 pA için -160, 40 pA artış). somatik tam hücreli kayıt hücre bağlı kayıttan sonra yapıldı. Nedeniyle hücre bağlı kayıt sırasında kendiliğinden ateş bastırmak için TTX ve Cd 2+ dışı uygulama AP olmadığına dikkat edin. Bu voltaj kapılı Na + ve Ca2 + mevcut blokerlerinin akımlarını bastırmak ilave edildi. Paneller A - D aynı nöron vardır başka DA nöron ve dendritik pipet (E) IR-DIC görüntü -120 mV bir 50 ms prepulse 0 mV bir test darbesi ile aktive (F) Gerilim-bağımlı akımlar.. Panel E. Holding nöron proksimal dendrit potansiyeli -80 mV eksize bir dış çıkış yama. Akımın zamana bağlı inaktivasyonunu unutmayın. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.

Madde g / mol konsantrasyon 1 L
NaCI 58,443 125 mM 7,305 g
NaHCO 3 84,007 25 mM 2.100 gr
KCI 74,551 2.5 mM 0.186 g
NaH 2 PO 4 137,99 1.25 mM 0.172 g
glikoz 198,17 25 mM 4.95 g
MgCI2 (1 M çözelti) 1 mM 1 mL
CaCl2 (1 M çözelti) 2 mM 2 mL
Osmolarite: ~ 310 mOsmol / L (optimum aralık: 314-325 mOsmol / L) pH = 7.4

Tablo 1: yapay serebrospinal akışkan (ACSF).

Madde g / mol konsantrasyon 1 L
NaCI 58,443 87 mM 5,084 g
NaHCO 3 84,007 25 mM 2,1001 g
KCI 7,551 2.5 mM 0,18637 g
NaH 2 PO 4 137,99 1.25 mM 0,17248 g
MgCI2 (1 M çözelti) 7 mM 7 ml
glikoz 198,17 10 mM 1,9817 g </ Td>
sakaroz 342,29 75 mM 25,672 g
CaCl2 (1 M çözelti) 0.5 mM 0.5 mL
Ozmolarite: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7.4

Tablo 2: Sakaroz-ACSF dilimleri hazırlamak.

Madde g / mol konsantrasyon 100 mL'lik
KMeSO 4 150.2 120 mM 1,8024 g
KCI 74,56 20 mM 0,14912 g
MgCI2 (1 M çözelti) 2 mM 200 ul
Na 2 ATP 551.1 2 mM 0,1102 g
Na 2 GTP 523,2 0.5 mM 0,02661 g
Na 2 -Phosphocreatine 255,1 5 mM 0,1275 g
EGTA 380,4 0.1 mM 3,803 mg
Hepes 238,31 10 mM 0,23831 g
Biocytin 1 mg / ml 0.1 gr
Ozmolarite: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7.2, KOH ile ayarlanmış

Tablo 3: Çift kayıtlar için hücre içi bir çözüm.

Madde g / mol konsantrasyon 100 içinmL
KCI 74,56 120 mM 0,8947 g
CaCl2 (1 M çözelti) 2 mM 200 ul
MgCI2 (1 M çözelti) 1 mM 100 ul
Hepes 238,31 10 mM 0,23831
TEA-CI 165.7 20 mM 0,3314 g
4-AP 94,11 5 mM 0,04705 g
BaCl 2 244,26 1 mM 0,02443 g
CDC 2 183,32 0.02 mM 0,3666 mg
TTX 1 mM 200 nM 20 ul
Osmolarite: ~ 290 mOsmol / L, D-glikoz (Ref 16). Ile ayarlanabilir; pH = 7.4

Tablo 4: Hücre bağlı kayıtları için elektrot çözüm.

Discussion

Bu rapor ikili somatodendritik tam hücreli kayıtları ve yerel dendritik kayıtları uygulamak için bir adım-adım protokolü açıklanır. Sırasıyla, postsinaptik potansiyeller zamanla iyon kanalları (yani, İH) etkisini belirlemek ve nigral DA nöronların somatodendritik bölgeleri boyunca iyon kanalı (lH) dağılımını haritalama için kullanışlıdır. Elde edilen elektrofizyolojik ölçümler hücre morfolojisi kurtarmak için hoc histokimya göndermek için birleştirilir. Prosedür substantia nigra bulunan DA nöronları araştırmak için kullanıldı, ancak komşu nigral GABA nöronlar, ventral tegmental alan DA nöronları ya da diğer orta beyin nöronları için genelleştirilebilir. Tüm adımlar da önemli değişiklikler olmadan nigral nöronların dendrit ifade diğer iyon kanallarını incelemek için takip edilebilir. Post hoc görselleştirme akson-rulman ile nöronlar için özellikle uygun olduğunuBöyle nigral nöronlar 25,26, hipokampal oriens-alveus internöronlar 21 ya da bazı CA1 piramidal nöronlar 67 olarak dendritler. İlginçtir, bu özelliği paylaşan nöronlar genellikle 67 düşündüğümden daha yaygın olduğu görülüyor. Morfolojik analizi de elektrotlar ve akson kesin konumunu ortaya koymaktadır. Ikinci tespit immünohistokimya 68,69 kullanılarak akson başlangıç çizgi parçasının (voltaj kontrollü, Na + kanal veya Ankirin G) 'de ifade edilen proteinlerin etiketlenmesine ile optimize edilebilir.

dendritik kayıtları ve sonraki nöronal etiketleme ile toplanan verilerin güvenilirliği her zaman dilim kalitesine bağlıdır. En kusursuz nedenle ihtiyaç doku içindeki hücrelerin canlılığını korumak için uygulanır. Bu dilim hazırlıkları süresince sağlıklı hayvanlardan, yüksek kaliteli araçları ve reaktifler, doku ve buz gibi soğuk sıcaklıklar yeterli oksijenizasyonun nazik işleme ile elde edilir. Kararlı kayıt koşulları sağlıklı nöronların seçimi güveniyor. Bütün hücre modunda, seri direnci, başlangıçta mümkün olduğu kadar düşük olması ve deney boyunca sabit tutulur gerekir. Kayıtların istikrar sürüklenme ve titreşim yoksun yüksek kaliteli manipülatörler hakkında daha fazla bağlıdır. pipet tutucu bağlantısını kontrol ve headstage, mikromanipülatör kabloları gevşek olduğunu kontrol, sıcaklık ya da sahne hareketi ani değişiklikler kaçınarak ve manipülatör mekanizması kontrol: Bu tedirginlikler pipet istikrar optimize ederek azaltılabilir. Çift kayıtlar için, metilsülfat 13,15,21 hücre içi çözelti içinde dahil edilmiştir, ancak glukonat 9,14,25 alternatif olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, temel anyon 70,71 potansiyel membran ve bir voltaja bağımlı akımlar 72 değiştirebilir. Hücre içi çözüm ATP, GTP ve physiolo korumak için phosphocreatine ile takviye edilebilirnöronların jik fonksiyonları. Örneğin, bir basınç uygulama yer için ek olarak, pipet çözeltisi bir floresan boya eklenmesi (örneğin, Alexa 594 veya sülforodamin 101 41) yararlı olabilir somatik kayıt sırasında dendritler görselleştirmek için (Ref Şekil 7. 41) ya da elektrikli bir uyarıcı pipet. Hücre bağlı kayıtları için pipet çözümü büyük bir h kaydetmek için yüksek K + konsantrasyonu ve hiçbir Na + içerir. Kayda Değer Na + / K + konsantrasyon oranı geçerli genliği 10, mevcut 11 ters potansiyeli ve h 73 yolluk etkiler. Alternatif olarak, ben h de dışında-çıkışları 10 kullanılarak kaydedilebilir. Bununla birlikte, bu kayıt yapılandırmada, kanalların yakınında hücre içi ortamı tedirgin olabilir. Sonuç olarak, bir voltaja bağımlı aktivasyonuna farklılıklar <karşılaştıran akımları hücre bağlı yamaları ve dış-çıkışları 10 kullanılarak elde zaman sub> h görülmektedir. Nöronların Şişme bazen yama-kelepçe kayıt sırasında karşılaşılan ve sık sık bu tür çözümlerin bileşiminde çözümler 39 veya hatalar hücre içi ve dışı arasında su kalitesinin düşük, güçlü dengesizlik ozmolarite veya pH gibi farklı nedenlerden kaynaklanan bir. elektrofizyolojik kayıtlar kalitesi iyileşti nöronların morfolojisi kalitesi üzerinde doğrudan bir oranına sahiptir. Hücre içi ortamın 14 seyreltme en aza indirmek için, hücre bağlı kaydından sonra - (sayılı referanslarda 6,11 olarak 10 M?. 6) ve tek bir somatik kayıtlar için yüksek direnç somatik pipetler çift kayıtlar için kullanılır. Hücre bağlı kayıt aşağıdaki bütün hücre somatik kayıt nedenle kısa (<10 dk) tutulur. Somatik ve dendritik iki pipetler-dış plasterlerini c uygun kapama için gerekli olanell membran ve hücre morfolojisi sonraki iyileşme. Hücrenin yapısına ek olarak, nörokimyasal içerik kaydedilir nöronlar 59,74 için tespit edilebilir. Örneğin, hücre içi protein tirosin hidroksilaz DA nöronlarının 13 kesin tanımlanması için immunolabeled edilebilir.

DA nöronlar ağırlıklı SN yoğunlaşmıştır SN mevcut çok daha düşük yoğunluğa sahip, pars compactadaki onlar GABA nöronlar 75 daha yüksek bir sayı ile karışmış olan reticulata, pars. DA nöronların hücre gövdesi GABA nöronların genellikle daha büyük olmakla birlikte, kızılötesi-videomikroskopi bu hücrelerin görsel tanımlama belirsiz ve kısmen pars compacta'da opaklık tarafından engellenmektedir. Bu sınırlamaları aşmak için, DA nöronların ön seçim nöronlar (DA nöronlar için TH 65 veya DAT GAD belirli bir popülasyonda bir flüoresan işaretleyici ifade eden transgenik farelerin kullanılması ile kolaylaştırılabilirGABA nöronlar) ve epifloresans aydınlatma. Seçenek olarak ise, bir floresan boya dendritler görselleştirme kolaylaştırmak için somatik elektrot çözelti içinde ilave edilebilir. Floresan hücrenin artan çözünürlük Nipkow dönen disk konfokal 14,22,30 veya IR-DGC 6 kombine iki foton mikroskopi 7 tarafından getirilir. Çeşitli avantajlar DIC göre DGC ile ilgilidir. DIC prizma gerekli değildir Birincisi, IR-DGC görüntü floresan görüntü 49,52,53,76 ile kaplanmış olabilir. İkinci olarak, DGC photostimulation ve 77 optogenetics birleştirilebilir.

dilim hazırlık bir dezavantajı, nöronların bütünlüğünü korumaktır. DA nöronlar üç uzamsal düzlemde 78,79 kendi dendrit uzanır ve bu nedenle, dendritik bölmenin kesme tam dilimleri 80 önlenemez. dilim yönelim seçimi (koronal, yatay ya da para) Sagital bir trade-off. innervasyon ve deneysel tasarım kökeni dilimleri doğru yönünü seçmek için dikkate alınmalıdır.

Doğrudan dendritik yama hücrelerin farklı bölümlerinde fonksiyonel iyon kanallarının dağılımının haritasının çıkartılması kullanılan bir tekniktir. Buna ek olarak, bu teknik, kanallar 20 işlevsel özelliklerinde değişkenliği belirlemek sunar. Bir tamamlayıcısı olarak iyon kanallarının konumu ve yoğunluğu ışık ve elektronik mikroskopi düzeylerinde 17,23 de immünhistokimya kullanılarak tespit edilebilir. Bu yaklaşım aynı zamanda yama pipetler için erişilemez küçük kalibreli yapılarda kanal yoğunluğunu belirlemek için imkanı sunuyor. Bununla birlikte, bu kanallar patch-clamp tekniği kullanılarak kaydedilen kişilerce kıyasla belirgin bir fonksiyonel durum 24 ya da inaktif olabilir. Her iki teknik konumu ve özellikleri tam bir resmini elde etmek için bu nedenle gereklispesifik hücresel bölgesinin 17 iyon kanalları. Voltaj duyarlı boyaların gelişmesiyle birlikte, gerilim görüntüleme birden çok yerde 81 de AP ve nöronlarda EPSPS yayılmasını incelemek için kullanılır olmuştur. Çift patch-kelepçe kayıtları bir alternatif olarak, bu yaklaşım bile yama pipetler için erişilebilir değildir ama sinyal ve ortalamanın doğru kalibrasyon gerektiren ince dendritler için uygulanabilir.

SN ve ventral tegmental alandaki DA nöronlar yaygın fizyolojik ve patofizyolojik bağlamda somatik kayıtları aracılığıyla incelenmiş olmakla birlikte, bunların dendritler fonksiyonel özellikleri her iki durumda da büyük ölçüde bilinmemektedir. Dendritler gelen Yama başarı 13,25,26 ile çeşitli gruplar tarafından nigral dopamin nöronları için uygulanan ve bu güzel hücre içi yapıların 8 heyecanlı özelliklerini incelemek için tercih edilen bir yöntem olmaya devam edilmiştir. Dendritik kayıtları başka bir firsattir sağlamakdilmekte verimliliği ve sinaptik iletim plastisite ve dendritik eksitabiliteye 82,83 plastisite irdelemek.

Disclosures

Yazar o hiçbir rakip mali çıkarlarını sahip olduğunu beyan eder.

Acknowledgments

Ben konfokal mikroskop, ikinci Axopatch 200B amplifikatör hediye Dr Jacques DESTINE, GIGA-Görüntüleme ile önerileri için yaptığı sürekli destek için Dr. Vincent Seutin, Christelle GILLISSEN ve mükemmel teknik yardım için Laurent Massotte, Dr Jean Defourny ve Sandra Ormenese teşekkür eleştirel yazının okunması için konfokal mikroskop ve Imaris yazılım ve Dr Stephen Freeman paylaşımı için bir platform. Bu çalışma Belçikalı FRS hibe ile desteklenmiştir - FNRS (U.N002.13 ve T.N0015.13) ve Belçikalı Üniversitesi Vakfı'nın desteğiyle (halkla avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique) ile yayınladı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Double-distillated water Millipore Super Q Resistivity >14 MΩ cm, ideal 18.2 MΩ cm at 25 °C, filtered (0.22 µm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Microfilter candles Robu Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter
Tissue slicer with vibroprobe Leica VT1200 cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40
Tissue slicer Dosaka DTK-1000 cutting parameters: speed 4, frequency 7
Razor blades Gilette Super Silver
Dissection tools Braun, Aesculap
Reserve chamber Custom-made
PP beckers VWR 213-1725 400 ml
Syringe filter Merk Millipore Millex - GV 0.22 µm
Cyanoacrylate glue  UHU "Sekunden Kleber" liquid glue
Recording chamber  Luigs & Neumann Slice mini chamber
Horizontal pipette puller Sutter Instruments Brown-Flaming P-97
Pipettes Hilgenberg 1807524 2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed
Dental wax Coltène/Whaledent orthodontic tray wax strips
Platinum grid to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk
Microforge Narishige MF-830 to fire-polish pipette tips
Potassium methyl sulfate MP Biomedicals 215481
Biocytin Molecular probes B1592
Manometer GREISINGER electronic GDH 13 AN
Microscope Zeiss FS
Dodt Gradient Contrast Luigs & Neumann
Manipulators Luigs & Neumann LN Mini 25
Frame grabber The Imaging Source DFG/USB2pro
Camera DAGE-MTI NC-70
Condenser Zeiss high numerical aperture condenser working with oil
Objective Zeiss W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR 63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective
Fourfold-changer Luigs & Neumann between the camera and the microscope
Black & white video monitor Sony SSM-175CE 16-inch, 850 TV lines, analog
Sample Bottles, Amber Glass, with Cap VWR 215-2409 to transfer slices from the setup to histology room
The Axon Guide Molecular Devices Book
Stimfit https://github.com/neurodroid/stimfit Analysis of electrophysiological data
Paraformaldehyde Sigma 441244 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
Well cell culture plate Greiner-Bio-One 662160 for the staining of fixed slices
Triton X-100 Merk 108643 see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use
mouse anti-TH monoclonal primary Immunostar 22941 working concentration: 1/1,000
goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568 Invitrogen - Thermo Fisher Scientific A-11031 working concentration: 1/500
Normal goat serum Dako X0907
ProLong Diamond Antifade Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific P36961
Fluorescein Avidin DCS Vector Lab A-2011
Confocal microscope Olympus FV1000
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/
NeuronJ http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ plugin for ImageJ
Imaris http://www.bitplane.com Reconstruction of biocytin filled neurons
Neuromantic http://www.reading.ac.uk/neuromantic/ Reconstruction of biocytin filled neurons
WinWCP http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm Analysis of electrophysiological data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. London, M., Häusser, M. Dendritic computation. Annu Rev Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  2. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  3. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev of Physiol. 46, 455-472 (1984).
  4. Dodt, H. U., Zieglgänsberger, W. Infrared videomicroscopy: a new look at neuronal structure and function. Trends Neurosci. 17 (11), 453-458 (1994).
  5. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflug Arch. 443 (3), 491-501 (2002).
  6. Nevian, T., Larkum, M. E., Polsky, A., Schiller, J. Properties of basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons: a direct patch-clamp recording study. Nat Neurosci. 10 (2), 206-214 (2007).
  7. Delvendahl, I., Straub, I., Hallermann, S. Dendritic patch-clamp recordings from cerebellar granule cells demonstrate electrotonic compactness. Front Cell Neurosci. 9, 93 (2015).
  8. Stuart, G., Spruston, N. Probing dendritic function with patch pipettes. Curr Opin Neurobiol. 5 (3), 389-394 (1995).
  9. Stuart, G. J., Sakmann, B. Active propagation of somatic action potentials into neocortical pyramidal cell dendrites. Nature. 367 (6458), 69-72 (1994).
  10. Magee, J. C. Dendritic hyperpolarization-activated currents modify the integrative properties of hippocampal CA1 pyramidal neurons. J Neurosci. 18 (19), 7613-7624 (1998).
  11. Berger, T., Larkum, M. E., Lüscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  12. Hoffman, D. a, Magee, J. C., Colbert, C. M., Johnston, D. K+ channel regulation of signal propagation in dendrites of hippocampal pyramidal neurons. Nature. 387 (6636), 869-875 (1997).
  13. Engel, D., Seutin, V. High dendritic expression of Ih in the proximity of the axon origin controls the integrative properties of nigral dopamine neurons. J Physiol. 593 (22), 4905-4922 (2015).
  14. Hu, H., Martina, M., Jonas, P. Dendritic mechanisms underlying rapid synaptic activation of fast-spiking hippocampal interneurons. Science. 327 (5961), 52-58 (2010).
  15. Bischofberger, J., Jonas, P. Action potential propagation into the presynaptic dendrites of rat mitral cells. J Physiol. 504 (2), 359-365 (1997).
  16. Angelo, K., London, M., Christensen, S. R., Hausser, M. Local and global effects of I(h) distribution in dendrites of mammalian neurons. J Neurosci. 27 (32), 8643-8653 (2007).
  17. Stuart, G., Spruston, N., Häusser, M. Dendrites. , Oxford University Press. Oxford New York. (2008).
  18. Williams, S. R., Stuart, G. J. Site independence of EPSP time course is mediated by dendritic I(h) in neocortical pyramidal neurons. J Neurophysiol. 83 (5), 3177-3182 (2000).
  19. Williams, S. R., Stuart, G. J. Action potential backpropagation and somato-dendritic distribution of ion channels in thalamocortical neurons. J Neurosci. 20 (4), 1307-1317 (2000).
  20. Gasparini, S., Magee, J. C. Phosphorylation-dependent differences in the activation properties of distal and proximal dendritic Na+ channels in rat CA1 hippocampal neurons. J Physiol. 541, Pt 3 665-672 (2002).
  21. Martina, M., Vida, I., Jonas, P. Distal initiation and active propagation of action potentials in interneuron dendrites. Science. 287 (5451), 295-300 (2000).
  22. Kim, S., Guzman, S. J., Hu, H., Jonas, P. Active dendrites support efficient initiation of dendritic spikes in hippocampal CA3 pyramidal neurons. Nature Neurosci. 15 (4), 600-606 (2012).
  23. Lorincz, A., Notomi, T., Tamas, G., Shigemoto, R., Nusser, Z. Polarized and compartment-dependent distribution of HCN1 in pyramidal cell dendrites. Nat Neurosci. 5 (11), 1185-1193 (2002).
  24. Nusser, Z. Differential subcellular distribution of ion channels and the diversity of neuronal function. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 366-371 (2012).
  25. Häusser, M., Stuart, G., Racca, C., Sakmann, B. Axonal initiation and active dendritic propagation of action potentials in substantia nigra neurons. Neuron. 15 (3), 637-647 (1995).
  26. Gentet, L. J., Williams, S. R. Dopamine gates action potential backpropagation in midbrain dopaminergic neurons. J Neurosci. 27 (8), 1892-1901 (2007).
  27. Stuart, G., Spruston, N., Sakmann, B., Häusser, M. Action potential initiation and backpropagation in neurons of the mammalian CNS. Trends Neurosci. 20 (3), 125-131 (1997).
  28. Roth, A., Häusser, M. Compartmental models of rat cerebellar Purkinje cells based on simultaneous somatic and dendritic patch-clamp recordings. J Physiol. 535, Pt 2 445-472 (2001).
  29. Schmidt-Hieber, C., Jonas, P., Bischofberger, J. Subthreshold dendritic signal processing and coincidence detection in dentate gyrus granule cells. J Neurosci. 27 (31), 8430-8441 (2007).
  30. Nörenberg, A., Hu, H., Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Distinct nonuniform cable properties optimize rapid and efficient activation of fast-spiking GABAergic interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (2), 894-899 (2010).
  31. Pouille, F., Scanziani, M. Enforcement of temporal fidelity in pyramidal cells by somatic feed-forward inhibition. Science. 293 (5532), 1159-1163 (2001).
  32. Hornykiewicz, O. The discovery of dopamine deficiency in the parkinsonian brain. J Neural Transm. (70), 9-15 (2006).
  33. Tepper, J. M., Sawyer, S. F., Groves, P. M. Electrophysiologically identified nigral dopaminergic neurons intracellularly labeled with HRP: light-microscopic analysis. J Neurosci. 7 (9), 2794-2806 (1987).
  34. Cajal, S. R. Histologie du Système Nerveux de l'Homme et des Vertébrés. Tome premier. Maloine, , Azoulay. Paris. (1909).
  35. Cheramy, A., Leviel, V., Glowinski, J. Dendritic release of dopamine in the substantia nigra. Nature. 289, 537-542 (1981).
  36. Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. J Neurosci. 4 (11), 2877-2890 (1984).
  37. Harnett, M. T., Bernier, B. E., Ahn, K. -C., Morikawa, H. Burst-timing-dependent plasticity of NMDA receptor-mediated transmission in midbrain dopamine neurons. Neuron. 62 (6), 826-838 (2009).
  38. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  39. Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , Springer. US: New York. (1995).
  40. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat Protoc. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  41. Weng, J. -Y., Lin, Y. -C., Lien, C. -C. Cell type-specific expression of acid-sensing ion channels in hippocampal interneurons. J Neurosci. 30 (19), 6548-6558 (2010).
  42. Kole, M. H., Hallermann, S., Stuart, G. J. Single Ih channels in pyramidal neuron dendrites: properties, distribution, and impact on action potential output. J Neurosci. 26 (6), 1677-1687 (2006).
  43. Angelo, K., Margrie, T. W. Population diversity and function of hyperpolarization-activated current in olfactory bulb mitral cells. Sci Rep. 1, 50 (2011).
  44. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e1-e2 (2008).
  45. Gibb, A. J., Edwards, F. a Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelectrode techniques, The Plymouth workshop handbook. , 255-274 (1994).
  46. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Method Enzymol. 207 (1980), 208-222 (1992).
  47. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflug Arch Eur J Phy. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  48. Castañeda-Castellanos, D. R., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Blind patch clamp recordings in embryonic and adult mammalian brain slices. Nat Protoc. 1 (2), 532-542 (2006).
  49. Dodt, H. -U., Becker, K., Zieglgänsberger, W. Infrared video microscopy for visualizing neurons and neuronal excitation in brain slices. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (12), 1149-1152 (2013).
  50. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  51. Stuart, G. Patch-pipet recording in brain slices. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 6, Unit 6.7 (2001).
  52. Dodt, H. U., Frick, A., Kampe, K., Zieglgänsberger, W. NMDA and AMPA receptors on neocortical neurons are differentially distributed. Eur J Neurosci. 10 (11), 3351-3357 (1998).
  53. Dodt, H. -U., Eder, M., Schierloh, A., Zieglgänsberger, W. Infrared-guided laser stimulation of neurons in brain slices. Sci STKE. 2002 (120), (2002).
  54. Techniques for Chloriding Silver Wires. , Warner Instruments. (1999).
  55. Stuart, G., Sakmann, B. Amplification of EPSPs by axosomatic sodium channels in neocortical pyramidal neurons. Neuron. 15 (5), 1065-1076 (1995).
  56. van Welie, I., van Hooft, J. a, Wadman, W. J. Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated Ih channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (14), 5123-5128 (2004).
  57. Berger, T., Larkum, M. E., Luscher, H. R. High I(h) channel density in the distal apical dendrite of layer V pyramidal cells increases bidirectional attenuation of EPSPs. J Neurophysiol. 85 (2), 855-868 (2001).
  58. Marx, M., Günter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  59. Booker, S. a, Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J Vis Exp. (91), e1-e11 (2014).
  60. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  61. Myatt, D. R., Hadlington, T., Ascoli, G., Nasuto, S. Neuromantic - from semi manual to semi automatic reconstruction of neuron morphology. Front Neuroinform. 6, 4 (2012).
  62. Guzman, S. J., Schlögl, A., Schmidt-Hieber, C. Stimfit: quantifying electrophysiological data with Python. Front Neuroinform. 8, 1-10 (2014).
  63. Schlögl, A., Jonas, P., Schmidt-Hieber, C., Guzman, S. J. Stimfit: A Fast Visualization and Analysis Environment for Cellular Neurophysiology. BME / Biomed Tech (Berl). 58, 24-25 (2013).
  64. Shu, Y., Hasenstaub, A., Duque, A., Yu, Y., McCormick, D. A. Modulation of intracortical synaptic potentials by presynaptic somatic membrane potential. Nature. 441 (7094), 761-765 (2006).
  65. Masi, A., et al. Differential contribution of Ih to the integration of excitatory synaptic inputs in substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 42 (9), 2699-2706 (2015).
  66. Franz, O., Liss, B., Neu, A., Roeper, J. Single-cell mRNA expression of HCN1 correlates with a fast gating phenotype of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated ion channels (Ih) in central neurons. Eur J Neurosci. 12 (8), 2685-2693 (2000).
  67. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83 (6), 1418-1430 (2014).
  68. Kuba, H., Ishii, T. M., Ohmori, H. Axonal site of spike initiation enhances auditory coincidence detection. Nature. 444 (7122), 1069-1072 (2006).
  69. Dugladze, T., Schmitz, D., Whittington, M. a, Vida, I., Gloveli, T. Segregation of Axonal and Somatic Activity During Fast Network Oscillations. Science. 336 (6087), 1458-1461 (2012).
  70. Zhang, L., et al. Whole-cell recording of the Ca(2+)-dependent slow afterhyperpolarization in hippocampal neurones: effects of internally applied anions. Pflug Arch Eur J Phy. 426 (3-4), 247-253 (1994).
  71. Kaczorowski, C. C., Disterhoft, J., Spruston, N. Stability and plasticity of intrinsic membrane properties in hippocampal CA1 pyramidal neurons: effects of internal anions. J Physiol. 578, Pt 3 799-818 (2007).
  72. Velumian, aa, Zhang, L., Pennefather, P., Carlen, P. L. Reversible inhibition of IK, IAHP, Ih and ICa currents by internally applied gluconate in rat hippocampal pyramidal neurones. Pflug Arch Eur J Phy. 433 (3), 343-350 (1997).
  73. Azene, E. M., Xue, T., Li, R. a Molecular basis of the effect of potassium on heterologously expressed pacemaker (HCN) channels. J Physiol. 547, Pt 2 349-356 (2003).
  74. Káradóttir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
  75. Nair-Roberts, R. G., Chatelain-Badie, S. D., Benson, E., White-Cooper, H., Bolam, J. P., Ungless, M. A. Stereological estimates of dopaminergic, GABAergic and glutamatergic neurons in the ventral tegmental area, substantia nigra and retrorubral field in the rat. Neuroscience. 152 (4), 1024-1031 (2008).
  76. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Sci STKE. 2004 (219), (2004).
  77. Hsu, T. -T., Lee, C. -T., Tai, M. -H., Lien, C. -C. Differential Recruitment of Dentate Gyrus Interneuron Types by Commissural Versus Perforant Pathways. Cereb cortex. , 1-13 (2015).
  78. Lin, J. Y., van Wyk, M., Bowala, T. K., Teo, M. -Y., Lipski, J. Dendritic projections and dye-coupling in dopaminergic neurons of the substantia nigra examined in horizontal brain slices from young rats. J Neurophysiol. 90 (4), 2531-2535 (2003).
  79. Henny, P., et al. Structural correlates of heterogeneous in vivo activity of midbrain dopaminergic neurons. Nat Neurosci. 15 (4), 613-619 (2012).
  80. van Pelt, J., van Ooyen, A., Uylings, H. B. M. Axonal and dendritic density field estimation from incomplete single-slice neuronal reconstructions. Front Neuroanat. 8, 54 (2014).
  81. Popovic, M., et al. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Adv Exp Med Biol. 859, 57-101 (2015).
  82. Sjostrom, P. J., Rancz, E. a, Roth, A., Häusser, M. Dendritic Excitability and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 88 (2), 769-840 (2008).
  83. Magee, J. C., Johnston, D. Plasticity of dendritic function. Curr Opin Neurobiol. 15 (3), 334-342 (2005).

Tags

Nörobilim Sayı 117 dendrit patch-kelepçe çift kayıtları hücre-bağlı biocytin etiketleme nöronal morfoloji substantia nigra dopaminerjik nöron iyon kanalı
Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Engel, D. Subcellular Patch-clamp… More

Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (117), e54601, doi:10.3791/54601 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter