Summary
Этот протокол показывает, как выполнить цельноклеточной записи патч зажим на нейроны сетчатки из плоского монтажа подготовки.
Abstract
Сетчатка млекопитающее представляет собой слоистую ткань состоит из нескольких типов нейронов. Чтобы понять, как визуальный сигналы обрабатываются в пределах своей сложной синаптической сети, электрофизиологические записи часто используются для изучения связи между отдельными нейронами. Мы оптимизировали препарат плоским крепление для патч зажим записи генетически маркированных нейронов в обоих GCL (слой ганглиозных клеток) и INL (внутренний ядерный слой) сетчаток мыши. Запись INL нейронов в плоских монтирует отдается предпочтение по сравнению ломтиками, потому как вертикальные, так и боковые соединения сохраняются в предыдущей конфигурации, позволяя схемы сетчатки глаза с большими боковыми компонентами, которые будут изучены. Мы использовали эту процедуру, чтобы сравнить ответы зеркально-Partnered нейронов в сетчатке, таких как холинергических звездообразования амакринных клеток (мешочков).
Protocol
Этическое одобрение - процедуры, связанные с субъектов животных были проведены в соответствии с нормами и правилами Национальных институтов здравоохранения руководящих принципов для исследований животных, утвержденные институциональном ухода за животными и использовать комитет из Медицинского колледжа Бэйлора.
1. Внешние и внутренние решения
- Используйте раствор Рингера млекопитающих во время рассечения сетчатки глаза и в качестве внешнего решения в последующем электрофизиологические записи. Приготовьте раствор Рингера млекопитающих от 10x маточного раствора (без кальция) в день записи, а также добавлять CaCl 2 по каплям через 15 мин carbogenation (95% O 2 и 5% CO 2). Окончательный 1x раствор содержит (в мМ): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 и MgSO 4 10 D-глюкоза.
- Используйте два внутренних решений для характеристики SAC колебаний. Контрольная работаполезность приготовленных растворов в длительных цельноклеточная записей патч зажим на ГКС мыши взрослых и хранить верифицированные порции в 500 мкл аликвотах при -20 ° С до использования.
- Для записи мембранного потенциала колебаний, используют внутренний калий раствор на основе, содержащий (в мМ): 125 К-глюконат, 8 NaCl, 4 АТФ-Mg, 0,5 Li-ГТФ, 5 EGTA, 10 HEPES и 0,2% biocytin (вес / V). Доведения рН до 7,3 с помощью КОН.
- Для записи возбуждающих и тормозных постсинаптических токов, используют цезий на основе внутреннего раствора, содержащего (в мМ): 100 Cs-метансульфонат, 8 NaCl, 4 АТФ-Mg, 0,5 Li-ГТФ, 5 EGTA, 10 HEPES и 0,2% biocytin ( вес / объем). Отрегулируйте рН до 7,3 с CsOH.
2. Подготовка к Дню записи
- Для того, чтобы подготовить нитроцеллюлозную мембрану с открытыми отверстиями, вручную пробивать мембраны с индивидуальным перфоратор, выполненной из затупленного 16 G иглой шприца и придавить мембрану между двумя чистыми стеклянными пластинами. Для общеправительственногокрепление сетчатку, чтобы центральное отверстие диаметром 0,2 мм и окружают его на 4 больших отверстий, которые 1-1,2 мм в диаметре.
- Для того, чтобы индивидуальные засыпки нить для загрузки внутреннего раствора в электродах, растопить 10 мкл кончиком пипетки в середине и слегка удлинить растопленное часть, пока она не остывает и затвердевает. Непосредственно перед использованием, используйте чистую лезвие для обрезки нити, пока не будет немного длиннее, чем патч-пипеток.
- Извлечь патч пипетки в программируемом съемника из боросиликатного стекла трубки с внутренней нитью. Производство в микропипетки на день эксперимента и использовать их немедленно.
Примечание: Для записи УКД, мы используем следующие настройки: Съемник тепла: 484; тянуть: 0; скорость: 25; время задержки: 1; давление: 400 и значение рампа 462. OD и идентификатор боросиликатных трубок 1,65 мм и 1,0 мм соответственно. Сопротивление пипеток составляет 10-14 МОм. - Один час до сбора урожая ткани, разморозить трубу внутреннего раствора Шекинг его на вихрь в течение> 30 мин.
3. Retina Вскрытие
- Обезболить животное на 4% изофлуран в кислороде, пока животное не теряет способность реагировать на носок щепотку. Жертвоприношение животного путем смещения шейных позвонков.
- Отрезать обе глазные яблоки прочь зрительных нервов на уровне 1-2 мм от зрительного нерва головок с прямыми однонаправленным ириса ножницами.
- Кидайте глазные яблоки на бумажное полотенце, чтобы удалить чистую кровь, а затем погрузить их в раствор carbogenated млекопитающих Рингера. Удар отверстие на лимба с 23 G иглой и рассекают глазные яблоки разрезанием вдоль лимба с микро-ножниц. Удалите роговица и хрусталик с использованием тонких щипцов.
- Для сетчатки глаза целом монтажа, аккуратно очистить всю сетчатку выключить пигментного эпителия с тонким пинцетом и сделать четыре 1.5-2 мм ортогональные разрезы от края к головке зрительного нерва.
- Погрузите пробитое нитроцеллюлозную мембрану в блюдо и аккуратно перетащить на сетчатку над ней сGCL стороной вверх. Установите головку зрительного нерва в центральное отверстие при подготовке целого монтажа сетчатки глаза. Перенесите мембрану с сетчаткой в другую чистую чашку. Аккуратно придавить сетчатку с тонкой кистью, чтобы выглядеть как мальтийский крест и положи все четыре ребра над отверстиями.
- Если часть сетчатки подлежит рассмотрению в то время, разрезать каждую окуляр, полученный из шага 3.3 в 3-4 штуки с бритвенным лезвием с пигментный эпителий остается прикрепленной. Защитите неиспользованные части от света в carbogenated внешнем растворе и использовать их в течение 12 часов.
- Пятно нитроцеллюлозную мембрану с куском сухой фильтровальной бумаги и удалить стекловидное и внутреннюю ограничивающую мембрану с пинцетом и кисточка.
- Убедитесь, что все ребра сетчатки полностью прикреплены к мембране перед передачей в сборе в записи камеры с запаянной стеклянной крышкой скольжения в нижней части. Закрепите мембрану с вакуумной смазкой к покровным и rehydratе сетчатку с внешним раствором. Будьте осторожны, чтобы не поймать пузырьки воздуха находящиеся под узлом.
- Установите камеру на сцену вертикального микроскопа. Заливать камеру с теплым (34-35 ° C) carbogenated внешнего раствора со скоростью ~ 3 мл в мин.
- Осмотрите сетчатку под 10-кратным объективом, а затем использовать 60x водно-иммерсионной линзу, чтобы увидеть GCL и INL нейроны под дифференциального интерференционного контраста (DIC) и / или эпифлуоресцентной. Для визуализации tdTomato-экспрессирующих мешочков использовать белый светодиодный источник света в сочетании с фильтром возбуждения 554 нм и фильтр эмиссии 581 нм.
4. цельноклеточной патч зажим Запись от плоскопанельных горы Retina
- Фильтр внутреннего раствора через шприц-фильтр в пользовательских засыпки нити.
- Вставьте нить в свежего разливного микропипетки и дозировать внутреннего раствора вблизи наконечника до тех пор, пока раствор не покрывает провода электрода серебро для>5 мм. Закрепить микропипетки на электрододержатель с всасывающим полюсом, через который под давлением внутри электрода можно регулировать с помощью толкания или вытягивания поршня из трубки соединенных 10 мл пластмассовый шприц.
- Найти пипетку под цели и довести его до ~ 100 мкм над сетчаткой. В режиме тока повторителя (I = 0), используйте смещение по постоянному току к нулю, стоящий сигнал постоянного напряжения. Измерьте сопротивление пипеток под токовыми клещами режиме (I зажим) путем введения фиксированной амплитуды волны квадратных токов через пипетку в то время как он находится в ванне и нейтрализовать разницу поворотом ручки rРаботайте с . Используйте чтение на ручке rРаботайте с, чтобы вычислить сопротивление пипеток по закону Ома.
- Медленно довести электрод до ~ 10 мкм выше сетчатки. Применение положительного давления на электрод. Смотрите изменения отражения вблизи кончика пипетки по мере приближения к сетчатке. Быстро, но осторожно заставить пипетку в GCL и уменьшить положительный pressuповторно немедленно.
- Переместите пипетку к меченым нейроне. Избегайте контакта с другими нейронами, кровеносные сосуды и endfeet клеток Мюллера. Применить более положительное давление, если это необходимо для предотвращения электрода засорения.
- Поместите наконечник вблизи средней линии меченым нейроне, пока ямочка не видно. Освободить положительное давление и позволить плазматическую мембрану отскакивать обратно на кончик пипетки.
- Применить от 20 до 120 Pa отрицательные токи пипетку, чтобы помочь формированию гига-ом печатью. Применить нежный всасывания, при необходимости, чтобы вытащить плазматическую мембрану в пипетку. Подождите, через 5 мин после формирования уплотнения к разрыву клеточной мембраны. Это позволяет пролил внутреннее решение быть очищены от суперфузии. Разрывают мембрану нежным всасыванием.
- После разрыва мембраны и в то время как в текущем режиме зажим, переключатель на мосту баланса и настроить его с помощью ручки rРаботайте с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для маленькой камере, как САК, требуется только незначительная корректировка, если таковые имеются. Alternнительно, запись возбуждающие и подавляющие постсинаптические токи в режиме зажима напряжения (V Clamp), удерживая ячейку при обращении потенциалов хлорида (около -75 мВ) и глутамат (около 0 мВ), соответственно. Проверить и отрегулировать положение пипеткой в случае необходимости, чтобы приспособить случайные сетчатку и / или дрейф Микроманипулятор. - Для записи мембранного потенциала или изменение тока до, во время и после медикаментозного лечения, подготовки синаптические блокаторы (например, CNQX, АП5, пикротоксином, тубокурарин и т.д.) и модуляторы каналов (например, флупиртин, допамин, меклофенамовая кислота и т.д.) свежие на день эксперимента из замороженных запасов. Развести препараты с раствором carbogenated Рингера. Применяют их в периодическом режиме через перфузией.
- После записи, осторожно удалите пипеткой из сомы. Перенести сборку из камеры в чистую посуду. Отделить и повторно прикрепить сетчатку на другую уплощенной нитроцеллюлозную мембрану без пробивки холэс обеспечить плоскостность сетчатки глаза во время фиксации.
- Закрепить сетчатку, погрузив его в 4% параформальдегид в течение 30 мин при комнатной температуре. Удалить сетчатку от нитроцеллюлозной мембраны и промойте его экстенсивно с 1x PBS. Показывают морфологии записанных клеток O / N окрашивания стрептавидином красителя конъюгированных с разведенной в 1x PBS с 0,4% тритона Х-100 при температуре 4 ° C 14. Установите сетчатку в antifade среде и наблюдать записанные клеток с использованием сканирующей конфокальной микроскопии.
Примечание: Процедуры, связанные с параформальдегида, который является летучими и токсичными, следует проводить в проекте камеры для безопасности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные записи балансовые и УКД OFF-типа от деафферентированной сетчатки мыши показаны на рисунке 1. Холинергических клеток в обоих GCL и INL может быть надежно идентифицированные tdTomato флуоресценции и , предназначенные для целых клеток записи патч зажим под DIC (Рисунок 1А) выявить колебания их мембранных потенциалов (верхние следы) и синаптических токов , которые управляют его (нижние следы, рис 1б). Ингибирующие и возбуждающие синаптические токи выявлены путем проведения клеток при 0 мВ и -75 мВ, соответственно, в условиях зажима напряжения (рис 1B, нижние следы). Типичные дендритные уровни разветвление и стратификации SAC в IPL (рис 1C) могут быть визуализированы с помощью постфактум стрептавидин- окрашивания для внутренне диализу biocytin. Ритмичность и частота колебаний мембранного потенциала и постсинаптические изменения тока можетбыть количественно определена путем расчета спектральной плотности мощности. Фармакологическая блокада, или их отсутствие, могут быть использованы , чтобы различать различные синаптические механизмы , лежащие в основе мембранного потенциала колебаний 7.
Рисунок 1. Морфология и мембранные потенциалы внебалансовой и звездообразования амакринных клетки в сетчатке мышей Ноб. (A) Оба ON-УКД на GCL и OFF-УКД на INL были легко идентифицированы с помощью Cre-ведомой экспрессии tdTomato и целевой для записи при ДВС-синдрома. Шкала баров равна 20 мкм, как указано. (B) Верхние следы мембранного потенциала изменения , записанные с внебалансовой и УКД , как указано. Нижние следы являются репрезентативными ритмичное возбуждающих постсинаптических ток (EPSC), которые управляют колебание мембранного потенциала и аритмический тормозных постсинаптических ток (IPSC). (C) Постфактум гистологическое характеристика зарегистрированных клеток указывает на типичные дендритные уровни морфологии и стратификации SAC в IPL. Шкала баров равна 50 мкм , как указано. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многие лаборатории зафиксировали от GCL нейронов в квартире монтажа подготовки 15-18, но наши процедуры позволяют записи из INL нейронов. Настоящим выделить несколько шагов, которые имеют решающее значение для успешного проведения рутинных записей.
Свежесть и плоскостность сетчатки имеют большое значение для проникновения в его пипеткой записи. В связи с этим, фирма прикрепление сетчатки к пробитой нитроцеллюлозные мембраны имеет первостепенное значение и достигается за счет переходных процессов абсорбции раствора с последующим своевременным регидратации (этап 3,4-3,6). За этот короткий период, как правило, менее 30 сек, стекловидное тело ведет себя как рыхлой желе и может быть снята. Наша методика является более эффективным по сравнению с несколькими опубликованными методиками, в которых стекловидное тело удаляется вручную в растворе 17,19 или ферментативными действиями 18,20. Другой часто используемый метод разорвать внутреннюю ограничивающую мембрану от использования пустой патч пипетки для каждой ячейкидля записи 21,22. Мы не преследовали метод разрывания, опасаясь демонтажа сетчатку. Тем не менее, пилинг несколько прозрачной и желеобразной стекловидного прочь иногда может сместить сетчатку от мембраны. Это, следовательно, шаг, который требует практики, как сохранение сетчатки на нитроцеллюлозной мембране имеет важное значение для записи INL нейронов. Хорошей практикой является использование хорошо сплющенный и полностью гидратированного мембраны нитроцеллюлозы. Точка стоит отметить здесь , является очевидным компромисс между записываемой области (т.е. размер пробивки), плоскостность сетчатки, а также твердость прикрепления к мембране. Большее окно записи является предпочтительным, но большая пробивка означает, что там меньше площадь мембраны для сетчатки глаза, чтобы прикрепить к. Точно так же, монтаж сетчатку через меньшее отверстие обеспечивает прочное крепление, но плоскостности может быть уменьшена, и поэтому снимаемой области.
Для того, чтобы вставить электрод через стекловидное тело вGCL и INL (шаг 4.4), мы применяем положительное давление, чтобы предотвратить заклинивание электрода. Немедленное снижение этого давления на проникновение в сетчатке также имеет важное значение для уменьшения окрашивания фона и сохранения колебаний. Важным моментом является проверка, чтобы сократить время между проникновением и получение уплотнение, предпочтительно менее чем 30 сек для GCL нейронов и в течение 60 секунд для БМНП нейронов. Другим важным моментом является 5 мин период ожидания после формирования Giga-ом уплотнение и перед мембранными разрывам. Этот период ожидания обеспечивает очистку пролитой внутреннего раствора в пути электрода и особенно актуально, когда внутреннее решение на основе калия используется потому, что высокое содержание калия может временно деполяризовать соседние нейроны и нарушают колебание. И, наконец, несколько нетрадиционный особенностью нашего подхода (шаг 4.7) является то, что мы подходим к клетке, образуют уплотнение гига-ом, а затем получить доступ целой клетки под токовые клещи моде, как советует доктор Рори Маккуистон из Университета Вирджинии, который помог нам с нашими исходными электрофизиологических записей. Этот метод позволяет быстро изменить сопротивление при обкатке быть захваченными изменения напряжения (видимый через осциллограф) и защищает записанную клетку от внезапного качания мембранного потенциала на уровне целых клеток. Еще одной полезной особенностью нашего метода является отрицательный ток, приложенный к кончику электрода, который помогает привлечь положительно заряженные фосфолипиды мембраны и облегчает формирование уплотнения.
Что касается сохранения боковых цепей в сетчатке, горизонтально нарезанных препарат сетчатки глаза 20 было предложено. В то время как этот метод эффективно обнажает горизонтально расширяющиеся дендритов и синаптических связей в IPL для записи и обработки изображений, вертикальный путь, к сожалению, нарушается, и, следовательно, этот метод может быть использован только для ограниченного круга целей. И, наконец, уточнений мы реализуем впроцедуры подготовки ткани и записи позволяют рутинные целевой записи INL нейронов , таких как OFF-УКД 7. Объединив изображений двухфотонную и с целью улучшения контраста микроскопии, ориентированных на биполярные клетки и горизонтальные клетки вблизи внешней плексиформной слоя для патч-зажим записи в различных условиях освещения в настоящее время считается возможным в плоской монтажа подготовки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al. Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness. J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).
- Hellmer, C. B., Ichinose, T. Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques. J Vis Exp. (96), (2015).
- Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- Demas, J., et al. Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity. Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).
- Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model. Front Cell Neurosci. 9, 513 (2015).
- Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina. J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).
- Margolis, D. J., Detwiler, P. B. Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa. J Ophthalmol. , (2011).
- Stasheff, S. F. Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse. J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, 277 (2015).
- Trenholm, S., et al. Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels. J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).
- Chen, C. K. J., et al. Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).
- O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells. J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).
- Lee, S., et al. An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells. Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).
- Hoggarth, A., et al. Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size. Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).
- Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration. PLoS One. 9 (1), e86253 (2014).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J Vis Exp. (47), (2011).
- Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina. Front Cell Neurosci. 9, 390 (2015).
- Enoki, R., Koizumi, A. A method of horizontally sliced preparation of the retina. Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).
- Akrouh, A., Kerschensteiner, D. Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina. J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
