Questo protocollo dimostra come eseguire cellula intera registrazione patch clamp su neuroni della retina da una preparazione TV a montare.
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Articolo metodologico
Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina
In questo articolo
Sommario
Abstract
La retina dei mammiferi è un tessuto stratificato composto da più tipi di neuroni. Per capire come i segnali visivi vengono elaborati all'interno della propria rete sinaptica intricata, registrazioni elettrofisiologiche sono spesso utilizzati per studiare le connessioni tra i singoli neuroni. Abbiamo ottimizzato una preparazione TV a monte per la registrazione patch clamp di neuroni geneticamente marcate sia in GCL (strato di cellule gangliari) e INL (strato nucleare interno) di retine di topo. Registrazione neuroni INL a Flat-monti è favorita rispetto fette perché le connessioni sia verticali e laterali sono conservati nella ex di configurazione, consentendo circuiti della retina con componenti di grandi dimensioni laterali da studiare. Abbiamo usato questa procedura per confrontare le risposte dei neuroni specchio-partnered in retine come i colinergici cellule amacrine starburst (ZSC).
Introduzione
Come parte facilmente accessibile del sistema nervoso centrale, la retina è stata per decenni un modello utile negli studi di neuroscienze. La marcatura genetica dei neuroni ha permesso una caratterizzazione dettagliata delle connessioni sinaptiche nella retina. Con molte metodologie disponibili per esaminare la funzione e la morfologia dei neuroni retinici, la tecnica di registrazione patch clamp è stata determinante per la nostra attuale comprensione dei segnali trasmessi verticalmente nella retina. Questi segnali sono originati dall'assorbimento di fotoni nei fotorecettori e inviati ai centri visivi del cervello attraverso lo spiking delle cellule gangliari retinic....
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Protocollo
l'approvazione etica - procedure che coinvolgono soggetti animali sono state condotte in conformità con le norme ei regolamenti del National Institutes of linee guida sanitarie per gli animali di ricerca, come approvato dalla cura degli animali istituzionale e usare comitato di Baylor College of Medicine.
1. esterno e delle soluzioni interne
- Utilizzare la soluzione di Ringer mammiferi durante la dissezione retina e la soluzione esterna nella successiva registrazione elettrofisiologica. Preparare la soluzione di Ringer mammiferi da 10x soluzione madre (senza calcio) il giorno della registrazione, e aggiungere CaCl 2 goccia a goccia do....
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Risultati
Registrazioni rappresentativi di on e off-tipo ZSC da una retina deafferentated del mouse sono mostrati in figura 1. Le cellule colinergici sia in GCL e INL può essere attendibilmente identificate da tdTomato fluorescenza e mirati per la cellula intera registrazione patch clamp sotto DIC (Figura 1A) a rivelare l'oscillazione dei loro potenziali di membrana (in alto tracce) e le correnti sinaptiche che la determinano (tracce di fondo, figura 1.......
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Discussione
Molti laboratori hanno registrato dai neuroni GCL nella preparazione 15-18 TV a monte, ma le nostre procedure consentono la registrazione da neuroni INL. Con la presente sottolineare diversi passaggi che sono fondamentali per le registrazioni di routine di successo.
La freschezza e planarità della retina sono importanti per penetrare con una pipetta di registrazione. A questo proposito, il fermo attaccamento della retina alla membrana di nitrocellulosa perforato è fondamentale e s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Joung Jang e Xin Guan per l'assistenza tecnica. Ringraziamo il Dr. Rory McQuiston della Virginia Commonwealth University per aver installato il nostro primo patch clamp rig e per i consigli sulle procedure sperimentali. Ringraziamo il Dr. Samuel Wu per i suggerimenti sulla registrazione del morsetto di tensione. Il lavoro è supportato da sovvenzioni NIH EY013811, EY022228 e da una sovvenzione Vision Core EY002520. C-KC è la cattedra Alice R. McPherson Retina Research Foundation presso il Baylor College of Medicine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio fluorescente a stadio fisso con | Olympus | BX51-WI | |
| Sutter | MP-225 | ||
| A-M System | AM2400 | ||
| AD convertitore | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Controller riscaldatore | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline riscaldatore | Warner Instrument | SC-20 | |
| Pompa peristaltica | Estrattore | Rainin Dynamax | |
| Sutter Instrument | P-1000 | ||
| Tubo di vetro con filamento | King Precision Glass | Stimolatore personalizzato | |
| A.M.P.I. | Master-8 | ||
| Biocitina | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucosio | Sigma | G6152 | |
| K-gluconato | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-metansolfonato | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Filtro siringa | Nalgene | 171 | |
| 1 ml siringa | Rainin | ||
| 10 μ l puntale per pipetta | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidina-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
Riferimenti
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al.
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Ristampe e permessi
