Summary
Dieses Protokoll zeigt, wie Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf die retinale Neuronen aus einem flachen-Mount-Vorbereitung durchzuführen.
Abstract
Die Netzhaut von Säugetieren ist ein geschichtetes Gewebe aus mehreren neuronalen Typen zusammen. Um zu verstehen, wie visuelle Signale in seinem komplizierten synaptische Netzwerk verarbeitet werden, werden häufig elektrophysiologischen Ableitungen zu studieren Verbindungen zwischen den einzelnen Neuronen verwendet. Wir haben optimiert, um eine Flachmontage Vorbereitung für die Patch-Clamp-Aufzeichnung von genetisch markierten Neuronen in sowohl GCL (Ganglion Zellschicht) und INL (innere Kernschicht) von Maus-Netzhäuten. Aufnahme INL Neuronen in Flat-Halterungen über Scheiben bevorzugt, weil sowohl vertikale als auch seitliche Anschlüsse in der früheren Konfiguration beibehalten werden, so dass der Netzhaut-Schaltungen mit großen seitlichen Komponenten untersucht werden. Wir haben dieses Verfahren verwendet Reaktionen von Spiegelneuronen partnered in Retinae wie die cholinerge Starburst-Amakrinzellen (SAC) zu vergleichen.
Protocol
Ethische Zustimmung - Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der National Institutes of Health Leitlinien für die Forschung Tieren durchgeführt, wie sie in der institutionellen Tierpflege und verwenden Ausschuss von Baylor College of Medicine zugelassen.
1. Externe und interne Lösungen
- Verwenden Sie Säugetier Ringer-Lösung während der Retina Dissektion und als externe Lösung in den nachfolgenden elektro Aufnahme. Bereiten Sie das Säugetier-Ringer-Lösung von 10x Stammlösung (ohne Calcium) am Tag der Aufnahme, und fügen Sie CaCl 2 tropfenweise nach 15 min von carbogenation (95% O 2 und 5% CO 2). Die endgültige 1x Lösung enthält (in mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 und 10 D-glucose.
- Verwenden Sie zwei interne Lösungen zu SAC Schwingungen charakterisieren. TestDie Nützlichkeit hergestellten Lösungen in längeren whole-cell patch clamp-Aufnahmen auf erwachsenen Maus RGCs und speichert die verifizierten Chargen in 500 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C bis zur Verwendung.
- Für Membranpotential Schwingungs Aufzeichnung, mit einem kaliumhaltigen interne Lösung, die (in mM) enthält: 125 K-Gluconat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES und 0,2% Biocytin (w / v). Der pH-Wert auf 7,3 mit KOH.
- Für die Aufnahme von erregenden und hemmenden postsynaptischen Ströme, verwenden Sie eine Cäsium-basierte interne Lösung, die (in mM) enthält: 100 Cs-Methansulfonat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES und 0,2% biocytin ( w / v). Der pH-Wert auf 7,3 mit CsOH.
2. Vorbereitung für den Tag der Aufnahme
- Um eine Nitrocellulosemembran mit offenen Löchern herzustellen, Punsch manuell die Membran mit einer angepassten Puncher aus einem abgestumpften 16 G Spritzennadel und glätten die Membran zwischen zwei saubere Glasplatten. Für eine Groß-Mount Retina, ein zentrales Loch von 0,2 mm Durchmesser machen und umgeben es um 4 größere Löcher, die von 1 bis 1,2 mm im Durchmesser sind.
- Um eine angepasste Verfüllung Glühfaden zum Laden interne Lösung in Elektroden machen, schmelzen, um eine 10 & mgr; l-Pipettenspitze in der Mitte und sanft den geschmolzenen Abschnitt zu verlängern, bis sie abkühlt und erstarrt. Gerade vor dem Gebrauch mit einem sauberen Rasierklinge den Faden zu schneiden, bis er etwas länger als die Patch-Pipetten ist.
- Pull-Patch-Pipetten in einem programmierbaren puller aus Borsilikat Glasrohr mit einem inneren Filaments. Herstellung der Mikro am Tag des Experiments und nutzen sie sofort.
HINWEIS: Für die Aufnahme FFH, verwenden wir die folgende Abzieher Einstellung: Wärme: 484; ziehen: 0; Geschwindigkeit: 25; Verzögerungszeit: 1; Druck: 400 und eine Rampenwert von 462. Die OD und ID der Borosilikat-Rohre sind 1,65 mm und 1,0 mm, respectively. Widerstand der Pipetten ist 10-14 MOhm. - Eine Stunde vor Gewebe Ernte, tauen ein Rohr der internen Lösung von shaking es auf einem Vortex für> 30 min.
3. Retina Dissection
- Anesthetize das Tier um 4% Isofluran in Sauerstoff, bis das Tier Reaktion auf eine Prise Zehe verliert. Sacrifice das Tier durch Genickbruch.
- Schneiden Sie beide Augäpfel aus den Sehnerven bei 1-2 mm von den Papillen mit geradem zackigen Iris Schere.
- Rollen Sie die Augäpfel auf einem sauberen Papiertuch Blut zu entfernen, und dann tauchen sie in carbogenated Säugetier-Ringer-Lösung. Lochen Sie ein Loch auf dem Limbus mit einer 23 G-Nadel und halbieren die Augäpfel durch entlang des Limbus mit Mikro-Schere schneiden. Entfernen Sie die Hornhaut und Linse mit einer feinen Pinzette.
- Für retinalen ganze Montage, sanft die gesamte Netzhaut aus dem Pigmentepithel mit einer feinen Pinzette schälen und vier 1,5-2 mm orthogonale Schnitte vom Rand in Richtung des Sehnervenkopfes zu machen.
- Tauchen Sie ein gestanztes Nitrocellulosemembran in die Schüssel, und ziehen Sie vorsichtig auf die Netzhaut über sie mitdie GCL Seite nach oben. Platzieren Sie den Sehnervenkopf in das Mittelloch, wenn eine ganze-mount Netzhaut vor. Übertragen Sie die Membran mit der Netzhaut in eine andere saubere Teller. glätten Sie vorsichtig die Netzhaut mit einem feinen Pinsel wie ein Malteserkreuz zu sehen und alle vier Kanten über die Löcher legen.
- Wenn ein Bruchteil der Netzhaut zu einem Zeitpunkt untersucht werden soll, schneiden sich eyecup aus Schritt hergestellten 3,3 in 3-4 Stücke mit einer Rasierklinge mit der pigmentierten Epithel befestigt bleibt. Schützen Sie die nicht verwendeten Stücke von Licht in carbogenated externe Lösung und innerhalb von 12 Stunden.
- Blot die Nitrocellulosemembran mit einem Stück trockenen Filterpapier und entfernen Sie den Glaskörper und innere Grenzmembran mit einer Zange und einem Pinsel.
- Stellen Sie sicher, dass alle retinalen Kanten vollständig an die Membran gebunden sind, bevor die Anordnung in die Aufnahmekammer mit einem verschlossenen Glasdeckglas auf dem Boden zu übertragen. Sichern Sie die Membran mit Vakuumfett auf das Deckglas und rehydrate die Netzhaut mit der externen Lösung. Achten Sie darauf, keine Luftblasen unter der Montage zu stoppen.
- Stellen Sie die Kammer auf die Bühne eines aufrechten Mikroskop. Perfundieren die Kammer mit warm (34-35 ° C) carbogenated externe Lösung mit einer Rate von ~ 3 ml pro min.
- Überprüfen Sie die Netzhaut unter einem 10-fach Objektivlinse zuerst, und dann mit einem 60x Wasser-Immersionslinse GCL und INL Neuronen unter differentiellen Interferenzkontrast (DIC) und / oder Epifluoreszenz zu sehen. Zur Visualisierung FFH tdTomato-exprimierenden, verwenden Sie eine weiße LED-Lichtquelle in Kombination mit einem Anregungsfilter von 554 nm und einem Emissionsfilter von 581 nm.
4. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von Flat-Mount Retina
- Filtern Sie die interne Lösung durch einen Spritzenfilter in den benutzerdefinierten Verfüllung Filaments.
- Setzen Sie den Faden in einem frisch gezapften Mikropipette und verzichten die interne Lösung in der Nähe der Spitze, bis die Lösung die Silberelektrodendraht für> bedeckt5 mm. Befestigen der Mikropipette auf einen Elektrodenhalter mit einem Saug- Pol, durch den Druck im Inneren der Elektrode kann durch Drücken oder Ziehen des Kolbens aus einem rohr verbunden 10 ml Kunststoffspritze einstellbar.
- Finden Sie die Pipette unter dem Objektiv und bringen es auf ~ 100 & mgr; m über der Netzhaut nach unten. Unter dem Stromfolgemodus (I = 0), verwenden Gleichstrom-Offset des stehenden Gleichspannungssignal auf Null. Messen Sie die Pipette Widerstand unter der Stromklemme (I Klammer) Modus durch feste Amplitude Rechteckströme durch die Pipette eingespritzt , während sie im Bad ist und den Unterschied zu neutralisieren , indem Sie den raccess Knopf drehen. Verwenden Sie den Messwert auf der raccess Knopf Pipette Widerstand der Ohmschen Gesetz zu berechnen.
- Langsam bringen die Elektrode zu ~ 10 & mgr; m über der Netzhaut. Gelten positive Druck auf die Elektrode. Sehen Sie sich das Reflexionsänderung in der Nähe der Pipettenspitze, wie sie die Netzhaut erreicht. Schnell aber sanft die Pipette in die GCL zwingen und die positive pressu reduzierensofort wieder.
- Bewegen Sie die Pipette zu einem markierten Neuron. Vermeiden Sie anderen Neuronen in Kontakt, Blutgefäße und Endfüßen von Müllerzellen. Nehmen positiver Druck, wenn nötig Elektrode ein Verstopfen zu verhindern.
- Positionieren Sie die Pipettenspitze in der Nähe der Mittellinie eines markierten Neuron, bis ein Grübchen sichtbar ist. Lassen Sie den Überdruck und damit die Plasmamembran wieder auf die Pipettenspitze auf die Beine.
- Gelten 20-120 pA negative Ströme an der Pipette die Bildung eines Giga-Ohm-Dichtung zu helfen. Tragen Sie eine sanfte Saugwirkung, wenn notwendig, die Plasmamembran in die Pipette zu ziehen. Warten Sie 5 Minuten nach der Dichtung Bildung, die Zellmembran zu Bruch. Dies ermöglicht die verschüttete interne Lösung von Superfusions gelöscht. Rupture die Membran durch eine sanfte Saugwirkung.
- Nach der Membranbruch und während in der Stromklemme Modus einschalten Brückenabgleich und stellen Sie den raccess Knopf.
HINWEIS: Für eine kleine Zelle wie der SAC, nur eine geringe Anpassung notwendig ist, falls vorhanden. Alterntiv, Rekord erregenden und hemmenden postsynaptischen Ströme im voltage clamp Modus (V Clamp) durch die Zelle an Umkehrpotentiale von Chlorid halten (um -75 mV) und Glutamat (um 0 mV) sind. Überprüfen und Pipettenposition anpassen, wenn nötig gelegentliche Netzhaut und / oder Mikromanipulator Drift aufzunehmen. - Zur Aufzeichnung vor Membranpotential oder Stromänderung, während und nach der pharmakologischen Behandlung, bereiten synaptischen Blocker (zB CNQX, AP5, Picrotoxin, Tubocurarin, etc.) und Kanalmodulatoren (zB Flupirtin, Dopamin, Meclofenaminsäure, etc.) frisch auf der Tag des Experiments aus gefrorenen Beständen. Verdünnen Sie die Medikamente mit carbogenated Ringer-Lösung. Wenden Sie sie in einer Batch-Weise durch Perfusion.
- Nach der Aufnahme entfernen sanft die Pipette aus der soma. Übertragen Sie die Anordnung aus der Kammer zu einer sauberen Schüssel. Lösen Sie erneut an die Netzhaut auf eine andere abgeflachte Nitrocellulosemembran ohne gestanzte holes Retina Flachheit während der Fixierung zu gewährleisten.
- Befestigen Sie die Netzhaut, indem sie es in 4% Paraformaldehyd für 30 min bei RT eingetaucht wird. Entfernen Sie die Netzhaut von der Nitrocellulosemembran und spülen Sie ihn ausgiebig mit 1x PBS. Zeigen die Morphologie der aufgezeichneten Zellen durch O / N Anfärbung mit Farbstoff-konjugiertem Streptavidin , verdünnt in 1x PBS mit 0,4% Triton X-100 bei 4 ° C 14. Montieren Sie die Netzhaut in verblassungshemmenden Medium und beobachten aufgezeichnet Zellen unter Verwendung eines konfokalen Mikroskop.
HINWEIS: Verfahren beteiligt Paraformaldehyd, die flüchtig und giftig ist, sollte für die Sicherheit in einem Entwurf Kammer durchgeführt werden.
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Representative Results
Repräsentative Aufnahmen von On- und OFF-Typ FFH aus einer deafferentated Maus Netzhaut sind in Abbildung 1 dargestellt. Cholinergen Zellen sowohl in der GCL und INL zuverlässig durch tdTomato Fluoreszenz und gezielt für Ganzzell - Patch - Clamp - Aufzeichnung unter DIC (1A) identifiziert werden , offenbaren Schwingung ihrer Membranpotentialen (oben Spuren) und den synaptischen Ströme, die es (unten Spuren, 1B) fahren. Die inhibitorische und exzitatorische synaptische Ströme ergeben , indem die Zellen bei 0 mV halten und -75 mV bzw. unter voltage clamp Bedingungen (1B, untere Spuren). Typische SAC dendritischen arborization und Schichtung Ebenen in der IPL (1C) durch Post - hoc - Streptavidin - Färbung für die intern dialysiert biocytin visualisiert werden. Die Rhythmik und Frequenz des Membranpotentials Fluktuation und postsynaptischen Stromänderungen könnenquantifiziert werden, indem die spektrale Leistungsdichte zu berechnen. Pharmakologische Blockade oder das Fehlen davon , können verwendet werden , um verschiedene synaptischen Mechanismen Potentialschwankung 7 zugrundeliegenden Membran zu erkennen.
Abbildung 1. Morphologie und Membranpotentialen von On- und OFF-Starburst Amakrinzell in der Nob Maus Netzhaut. (A) Beide ON-FFH bei GCL und OFF-FFH bei INL wurden leicht durch Cre-driven tdTomato Ausdruck identifiziert und gezielt für die Aufzeichnung unter DIC. Maßstabsbalken gleich 20 & mgr; m, wie angegeben. (B) Die Top - Spuren sind Membranpotentialänderungen aufgezeichnet von On- und OFF-FFH , wie angegeben. Die unteren Spuren sind repräsentativ rhythmische exzitatorischen postsynaptischen Strom (EPSC), der die Schwingung des Membranpotentials und der Arrhythmie-hemmenden postsynaptischen Strom (IPSC) fahren. (CPost) hoc histologische Charakterisierung der aufgezeichneten Zellen zeigt die typischen SAC dendritische Morphologie und Schichtung Ebenen in der IPL. Maßstabsbalken gleich 50 & mgr; m , wie angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Viele Labors haben von GCL - Neuronen in der aufgezeichneten Flachmontage Vorbereitung 15-18, aber unsere Verfahren von INL Neuronen ermöglichen die Aufnahme. Wir betonen hiermit mehrere Schritte, die für eine erfolgreiche Routine-Aufnahmen von entscheidender Bedeutung sind.
Die Frische und die Flachheit der Netzhaut sind wichtig für sie mit einer Aufnahme Pipette eindringen. In dieser Hinsicht ist die feste Anbringung der Netzhaut auf die gestanzten Nitrocellulosemembran ragende und durch transiente Absorption der Lösung durch rechtzeitige Rehydratation (Schritt 3,4-3,6), gefolgt erreicht. Während dieser kurzen Zeit, üblicherweise weniger als 30 sec, verhält sich der Glaskörper wie ein loser Gelee und kann abgezogen werden. Unser Verfahren ist effizienter , wenn zu mehreren veröffentlichten Verfahren verglichen, in dem der Glaskörper manuell 18,20 in Lösung 17,19 oder durch enzymatische Maßnahmen entfernt wird. Ein anderes häufig verwendetes Verfahren ist die innere Grenzmembran aus mit einem leeren Patch-Pipette für jede Zelle zu reißenzu 21,22 aufgezeichnet. Wir haben verfolgen nicht das Zerreißen Methode für Angst, die Netzhaut abzusteigen. Jedoch kann die Netzhaut von der Membran manchmal die etwas transparent und geleeartige Glaskörper Abziehens entfernen. Dies ist daher ein Schritt, der auf der Nitrocellulosemembran Praxis als die Beibehaltung der Netzhaut erfordert für die Aufzeichnung von INL Neuronen essentiell ist. Eine gute Praxis ist die Verwendung gut abgeflachte und vollhydratisierte Nitrocellulosemembran. Ein beachtenswerter Punkt hier ist die scheinbare Kompromiß zwischen dem beschreibbaren Bereich (dh die Größe eines gestanzten Lochs), die Flachheit der Netzhaut, und die Festigkeit der Bindung an die Membran. Eine größere Aufzeichnungsfenster wird bevorzugt, aber eine größere Stanzloch bedeutet, dass es weniger Membranfläche für die Netzhaut befestigen zu. Ebenso gewährleistet die Netzhaut über eine kleinere Loch Montage stabile Befestigung aber Ebenheit reduziert werden kann, und so ist beschreibbaren Bereich.
eine Elektrode durch den Glas Zum Einfügen indie GCL und INL (4.4 Schritt), wenden wir einen positiven Druck Elektrode Verklemmen zu verhindern. Die sofortige Reduzierung dieses Drucks beim Eindringen in die Netzhaut ist auch entscheidend für die Färbung Hintergrund zu reduzieren und für die Erhaltung der Schwingung. Ein wichtiger Kontrollpunkt ist die Zeit zwischen dem Eindringen und den Erhalt der Dichtung, vorzugsweise weniger als 30 Sekunden für GCL Neuronen und innerhalb von 60 Sekunden für INL Neuronen zu verkürzen. Ein weiterer wichtiger Punkt ist die 5 min Wartezeit nach der Bildung des Giga-Ohm-Dichtung und vor die Membran reißt. Diese Wartezeit sorgt für die Reinigung des verschütteten interne Lösung auf dem Weg der Elektrode und ist besonders relevant, wenn eine Kalium-basierte interne Lösung verwendet, da der hohe Gehalt an Kalium, vorübergehend benachbarten Neuronen depolarisieren kann und Schwingung stören. Schließlich ist eine etwas unkonventionelle Merkmal unseres Ansatzes (Schritt 4.7) besteht darin, dass wir eine Zelle nähern, eine GigaOhm Dichtung zu bilden, und dann mit ganzen Zellen Zugang unter der aktuellen Klemme mo gewinnende, wie von Dr. Rory McQuiston der Virginia Commonwealth University beraten, die uns mit unseren ersten Aufnahmen geholfen elektro. Diese Methode ermöglicht die schnelle Widerstandsänderung auf einen Durchbruch der Spannungsänderungen erfasst werden (sichtbar durch ein Oszilloskop) und schützt die Zelle aufgenommen von dem plötzlichen Schwung des Membranpotentials an der gesamten Zellebene. Ein weiteres nützliches Merkmal unseres Verfahrens ist der negative Strom an die Elektrodenspitze angelegt, die positiv geladene Membran Phospholipide hilft gewinnen und erleichtert Dichtungsbildung.
Hinsichtlich seitlichen retinalen Schaltungen zu erhalten, zu einer horizontal geschnittenen Vorbereitung der Netzhaut 20 vorgeschlagen. Während dieses Verfahren wirksam die horizontal erweitert Dendriten und synaptischen Verbindungen in der IPL für die Aufzeichnung und Abbildungs aussetzt, wird der vertikale Weg leider gestört und daher kann dieses Verfahren nur für begrenzte Zwecke verwendet werden. Schließlich setzen die Verfeinerungen wir inGewebepräparation und Aufnahmeverfahren ermöglichen Routine gezielte Aufnahmen von INL Neuronen wie OFF-FFH 7. Durch die Integration von Zwei-Photonen-Bildgebung und Kontrastmikroskopie Verbesserung der bipolaren Zellen und horizontalen Zellen in der Nähe der äußeren plexiformen Schicht für Patch-Clamp-Targeting-Bedingungen der Aufnahme unter verschiedenen Licht wird nun als möglich in einer flachen Montage Vorbereitung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
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