Summary
Este protocolo demonstra como executar de células inteiras de gravação patch-clamp em neurônios da retina a partir de uma preparação flat-mount.
Abstract
A retina dos mamíferos é um tecido em camadas compostas de vários tipos neuronais. Para entender como os sinais visuais são processados dentro de sua rede sináptica intrincado, registros eletrofisiológicos são frequentemente usados para estudar as conexões entre os neurônios individuais. Nós otimizamos uma preparação plana de montagem para a gravação de patch-clamp de neurônios geneticamente marcados em ambos GCL (camada de células ganglionares) e INL (camada nuclear interna) de retinas de ratos. Gravação de neurônios do INL em planos montagens é favorecido sobre fatias porque as conexões verticais e laterais são preservados na configuração anterior, permitindo que os circuitos da retina com grandes componentes laterais a ser estudado. Temos utilizado este procedimento para comparar as respostas dos neurônios-espelho-partnered em retinas tais como as células amácrinas starburst colinérgicos (ZEC).
Protocol
A aprovação ética - procedimentos que envolvem indivíduos animais foram conduzidos de acordo com as regras e regulamentos dos Institutos Nacionais de diretrizes de saúde para animais de pesquisa, conforme aprovado pelo Institutional Animal Care e usar comitê de Baylor College of Medicine.
1. externa e Soluções Internas
- Usar a solução de Ringer de mamífero durante a dissecção retina e como a solução externa na gravação eletrofisiológico subsequente. Preparar a solução de Ringer de mamífero a partir de solução-mãe 10x (sem cálcio) no dia da gravação, e adicionar CaCl2 gota a gota, após 15 minutos de carbogenation (95% O 2 e 5% CO 2). A solução final 1x contém (em mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 e 10 de D-glucose.
- Use duas soluções internas para caracterizar oscilações SAC. Testea utilidade das soluções preparadas em de célula inteira gravações patch clamp prolongados em RGCs rato adulto e armazenar os lotes verificados em alíquotas de 500 uL a -20 ° C até à sua utilização.
- Para a gravação de membrana oscilação potencial, usar uma solução interna à base de potássio que contém (em mM): 125 de K-gluconato, 8 de NaCl, 4 de ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina (w / v). Ajustar o pH para 7,3 com KOH.
- Para gravação excitatórios e correntes pós-sinápticos de inibição, usar uma solução interna à base de césio que contém (em mM): 100 Cs-metanossulfonato, 8 de NaCl, 4 de ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina ( w / v). Ajustar o pH para 7,3 com CsOH.
2. Preparação para o Dia da Gravação
- Para preparar uma membrana de nitrocelulose com buracos abertos, perfurar manualmente a membrana com um perfurador personalizado feito de uma agulha de seringa embotada 16 G e achatar a membrana entre duas placas de vidro limpo. Para uma whole-montar retina, faça um furo central de 0,2 mm de diâmetro e cercá-lo por 4 furos maiores que são 1-1,2 mm de diâmetro.
- Para fazer um filamento aterro personalizado para carregar solução interna para eletrodos, derreta uma ponta de pipeta 10 ul no meio e gentilmente alongar a parte derretida até que esfria e endurece. Imediatamente antes da utilização, usar uma lâmina de barbear para cortar limpo do filamento até que é ligeiramente mais longo do que as pipetas de patch.
- Puxe pipetas de patch em um extrator programável de tubo de vidro de borosilicato com um filamento interno. Fabricar as micropipetas no dia da experiência e usá-los imediatamente.
NOTA: Para ZEC gravação, usamos a seguinte configuração extrator: calor: 484; puxe: 0; velocidade: 25; tempo de atraso: 1; pressão: 400 e um valor de rampa de 462. O OD e ID dos tubos de borosilicato são de 1,65 mm e 1,0 mm, respectivamente. Resistência das pipetas é 10-14 mohms. - Uma hora antes da colheita de tecidos, descongelar um tubo de solução interna por shaking-lo em um vórtice de> 30 min.
3. Retina Dissection
- Anestesiar o animal por 4% de isoflurano em oxigênio até que o animal perde a capacidade de resposta a uma pitada dedo do pé. Sacrificar o animal por deslocamento cervical.
- Corte ambos os globos oculares fora os nervos ópticos a 1-2 mm de distância das cabeças do nervo óptico com íris retas-apontou tesoura.
- Rolar os olhos em uma toalha de papel limpa para remover sangue e, em seguida, mergulhe-os em solução de Ringer de mamífero carbogenated. Faça um furo no limbo com uma agulha G 23 e bissetriz os globos oculares cortando ao longo do limbo com micro-tesoura. Retirar a córnea ea lente usando uma pinça fina.
- Para retinal todo-mount, descascar delicadamente a retina inteira fora do epitélio pigmentado com uma pinça fina e fazer cortes quatro 1,5-2 mm ortogonais a partir da borda em direção à cabeça do nervo óptico.
- Mergulhe uma membrana de nitrocelulose soco no prato e gentilmente arraste a retina sobre ele como lado GCL-se. Coloque a cabeça do nervo óptico no orifício central na preparação de uma retina de toda a montagem. Transferir a membrana com a retina no outro prato limpo. Gentilmente achatar a retina com um pincel fino para olhar como uma cruz de Malta e colocar todas as quatro bordas ao longo dos buracos.
- Se uma fracção da retina é para ser examinado de cada vez, cortar cada ocular preparado a partir do Passo 3.3 em 3-4 pedaços com uma lâmina de barbear com o epitélio pigmentado permanece ligado. Proteger as peças não utilizadas de luz na solução externa carbogenated e usá-los dentro de 12 horas.
- Seque a membrana de nitrocelulose com um pedaço de papel de filtro seco e remover a membrana limitadora interna e vítreo com uma pinça e um pincel.
- Certifique-se de que todas as bordas da retina são totalmente ligado à membrana antes de transferir a montagem para a câmara de gravação com uma lamela de vidro selado na parte inferior. Fixe a membrana com graxa de vácuo para a lamínula e rehydratE é a retina com a solução externa. Seja não tomar cuidado para prender as bolhas de ar debaixo da montagem.
- Definir a câmara para o palco de um microscópio vertical. Perfundir a câmara com (34-35 ° C) solução externa carbogenated quente, a uma taxa de ~ 3 mL por min.
- Examinar a retina sob uma lente objetiva de 10x em primeiro lugar e, em seguida, usar uma lente de 60x de imersão em água para ver neurônios GCL e INL sob contraste de interferência diferencial (DIC) e / ou de epifluorescência. Para visualizar ZEC-expressando tdTomato, utilizar uma fonte de luz LED branco em combinação com um filtro de excitação de 554 nm e um filtro de emissão de 581 nm.
4. Whole-cell patch de gravação braçadeira de Flat-mount Retina
- Filtrar a solução através de um filtro interno da seringa no filamento aterro costume.
- Insira o filamento em uma micropipeta acabada de tirar e dispensar a solução interna perto da ponta até que a solução cobre o fio do eletrodo de prata para>5 mm. Fixar a micropipeta para um suporte de eléctrodo com uma vara de aspiração, através da qual a pressão no interior do eléctrodo pode ser ajustada, empurrando ou puxando o êmbolo de uma seringa de plástico de 10 ml ligado de tubo.
- Encontre a pipeta no âmbito do objectivo e trazê-lo para baixo para ~ 100 mm acima da retina. Sob o modo atual seguidor (I = 0), use DC offset para zero o sinal de tensão DC em pé. Meça a resistência da pipeta sob a pinça de corrente de modo (I Grampo) através da injeção de amplitude fixa correntes onda quadrada através da pipeta enquanto ele está no banho e neutralizar a diferença girando o botão rAcesse. Use a leitura na maçaneta rAcesse para calcular a resistência da pipeta pela lei de Ohm.
- levar lentamente o eletrodo para ~ 10 mm acima da retina. Aplicar a pressão positiva para o eléctrodo. Assista a mudança reflexão perto da ponta da pipeta quando se aproxima da retina. Rapidamente, mas com cuidado forçar a pipeta no GCL e reduzir o pressu positivare imediatamente.
- Mover a pipeta para um neurônio rotulados. Evite entrar em contato com outros neurónios, vasos sanguíneos e endfeet de células Muller. Aplique uma pressão mais positiva se for necessário para evitar o entupimento do eletrodo.
- Posicione a ponta da pipeta perto da linha média de um neurônio rotulados até uma covinha é visível. Solte a pressão positiva e permitir que a membrana plasmática para saltar de volta para a ponta da pipeta.
- Aplicar 20 a 120 pA correntes negativos para a pipeta para ajudar a formação de um selo giga-ohm. Aplicar uma sucção suave, se necessário, para puxar a membrana plasmática para a pipeta. Esperar 5 minutos após a formação de selo para romper a membrana celular. Isso permite que a solução interna derramado foi afastada pelo superfusão. Ruptura da membrana por uma sucção suave.
- Após a ruptura da membrana e ao mesmo tempo no modo de pinça de corrente, ligue o equilíbrio ponte e ajustá-lo usando o botão rAcesse.
NOTA: Por uma pequena célula como o SAC, só é necessário ligeiro ajuste, se houver. Alterntivamente, ficha excitatórios e inibitórios correntes pós-sinápticos no modo braçadeira de tensão (V Grampo) por segurando o celular no potencial de reversão de cloreto de (cerca de -75 mV) e glutamato (em torno de 0 mV), respectivamente. Verifique e ajuste a posição da pipeta se necessário para acomodar retina ocasional e / ou deriva micromanipulador. - Para registar o potencial de membrana ou alteração da corrente antes, durante e após o tratamento farmacológico, preparam sinápticas bloqueadores (por exemplo, CNQX, AP5, picrotoxina, tubocurarina, etc.) e moduladores do canal (por exemplo, flupirtina, dopamina, ácido meclofenâmico, etc.) em fresco o dia do experimento de stocks congelados. Diluir as drogas com solução carbogenated de Ringer. Aplicá-las de uma forma de lote por meio de perfusão.
- Após a gravação, remover suavemente a pipeta da soma. Transferir a montagem da câmara para um prato limpo. Desligar e voltar a ligar a retina para outra membrana de nitrocelulose achatados sem hol perfuradoES para assegurar o nivelamento da retina durante a fixação.
- Fixar a retina por imersão em 4% de paraformaldeído durante 30 min à TA. Remova a retina a partir da membrana de nitrocelulose e lave-o extensivamente com 1x PBS. Revelam a morfologia das células gravadas por O / N coloração com estreptavidina conjugado com corante diluídos em 1x PBS com 0,4% de Triton X-100 a 4 ° C 14. Monte a retina em meio Antifade e observar células gravado utilizando um microscópio de varredura confocal.
NOTA: os procedimentos de paraformaldeído, que é volátil e tóxico, deve ser realizado em um projeto de câmara de segurança.
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Representative Results
Registos representativos de dentro e fora do tipo SACs de uma retina deafferentated rato são mostrados na Figura 1. As células colinérgicas em ambos GCL e INL podem ser identificados de forma confiável por tdTomato fluorescência e direcionados para de células inteiras de gravação patch-clamp sob DIC (Figura 1A) para revelar oscilação de seus potenciais de membrana (top traços) e as correntes sinápticas que dirigi-lo (traços inferiores, Figura 1B). Correntes sinápticas inibitórias e excitatórias são revelados, mantendo as células a 0 mV e -75 mV, respectivamente, em condições de fixação de tensão (Figura 1B, traços inferiores). Dendríticas níveis de arborização e de estratificação típicos SAC no IPL (Figura 1C) pode ser visualizado por post hoc estreptavidina coloração para a biocitina dialisados internamente. A ritmicidade e frequência de potencial de membrana de flutuação e as mudanças atuais pós-sinápticos podeser quantificada calculando a densidade espectral de potência. O bloqueio farmacológico, ou a falta dela, podem ser usados para distinguir diferentes mecanismos sinápticos subjacentes membrana potencial oscilação 7.
Figura 1. Morfologia e de membrana potenciais de células amacrine dentro e fora do starburst na retina do rato Nob. (A) tanto on-ZEC na GCL e OFF-ZEC no INL foram prontamente identificados pela expressão tdTomato Cre-dirigido e direcionado para a gravação sob DIC. As barras de escala igual a 20 uM, tal como indicado. (B) Os traços principais são mudanças potenciais de membrana gravados a partir de dentro e fora da ZEC, como indicado. Os traços de fundo são corrente pós-sináptica excitatória rítmica representativa (EPSC) que dirigem a oscilação do potencial de membrana e a corrente pós-sináptica inibitória arrítmico (IPSC). (C) Post hoc caracterização histológica de células gravadas indica os níveis típicos SAC dendríticas morfologia e estratificação do IPL. Barras de escala igual a 50 mm, conforme indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Muitos laboratórios têm gravado a partir de neurônios GCL na preparação 15-18 plana de montagem, mas os nossos procedimentos de permitir a gravação de neurônios do INL. Vimos por este meio enfatizar várias etapas que são críticas para as gravações de rotina bem sucedidas.
A frescura e achatamento da retina são importantes para penetrar com uma pipeta de gravação. A este respeito, a ligação firme da retina para a membrana de nitrocelulose perfurado é primordial e é conseguida pela absorção transitória da solução seguido por re-hidratação oportuna (Passo 3,4-3,6). Durante este curto período, normalmente inferior a 30 segundos, o vítreo se comporta como uma geleia solta e pode ser retirada. A nossa técnica é mais eficaz quando comparado com vários processos publicados, em que o vítreo é removido manualmente em solução de 17,19 ou por acções enzimáticas 18,20. Outro método frequentemente utilizado é o de rasgar a membrana limitante interna fora de usar uma pipeta de patch vazio para cada célulaa ser gravado 21,22. Nós não perseguir o método de arrancamento por medo de desmontar a retina. No entanto, peeling off vítreo pouco transparente e gelatinosa pode às vezes desalojar a retina a partir da membrana. Esta é, portanto, um passo que requer a prática quanto a retenção de retina na membrana de nitrocelulose é essencial para a gravação de neurónios INL. Uma boa prática é usar membrana de nitrocelulose bem achatada e totalmente hidratado. Um ponto importante notar aqui é a aparente trade-off entre a zona de gravação (isto é, o tamanho de um orifício perfurado), o achatamento da retina, e a firmeza da fixação à membrana. Uma janela de gravação maior é preferido, mas um buraco perfurado maior significa que há menos área de membrana para a retina para anexar. Do mesmo modo, a montagem da retina ao longo de um orifício mais pequeno assegura fixação firme mas planeza pode ser reduzida, e assim é a área gravável.
Para inserir um eletrodo através do vítreo emo GCL e INL (Passo 4.4), aplica-se uma pressão positiva para evitar a interferência do eletrodo. A redução imediata desta pressão sobre a penetração na retina também é crítico para a redução da coloração de fundo e para a preservação da oscilação. Um ponto de verificação é importante para reduzir o tempo entre a penetração e a obtenção do selo, de preferência menos do que 30 segundos para os neurónios GCL e dentro de 60 segundos para os neurónios INL. Outro ponto importante é o período de espera de cinco minutos após a formação do vedante giga-ohm e antes das rupturas da membrana. Este período de espera garante a compensação da solução interna derramado no caminho do eletrodo e é especialmente relevante quando uma solução interna de potássio com base é usada porque o alto teor de potássio pode despolarizar temporariamente neurônios vizinhos e perturbar oscilação. Finalmente, uma característica pouco convencional da nossa abordagem (Passo 4.7) é que nos aproximamos de uma célula, formam um selo giga-ohm, e depois obter acesso de célula inteira no âmbito do actual mo braçadeirade, tal como recomendado pelo Dr. Rory McQuiston da Virginia Commonwealth University, que ajudou-nos com os nossos registros eletrofisiológicos iniciais. Este método permite a mudança de resistência rápida mediante arrombamento de ser capturado por variações de tensão (visíveis através de um osciloscópio) e protege a célula gravado a partir da súbita oscilação do potencial de membrana no nível de célula inteira. Outra característica útil do nosso método é a corrente negativa aplicada à ponta do eléctrodo, o que ajuda a atrair fosfolípidos membrana carregada positivamente e facilita a formação de selo.
No que diz respeito à preservação da retina circuitos laterais, uma preparação horizontalmente cortada da retina 20 tem sido sugerida. Enquanto este método expõe eficientemente os dendritos horizontalmente em expansão e conexões sinápticas no IPL para gravação e de imagem, a via vertical é interrompida e, consequentemente, infelizmente, este método só pode ser utilizado para fins específicos. Finalmente, os refinamentos vamos implementar emprocedimentos de preparação de tecidos e de gravação permitem gravações de rotina alvo de neurônios do INL, como OFF-ZEC 7. Ao incorporar imagens de dois fótons e contraste reforço microscopia, tendo como alvo as células bipolares e células horizontais perto da camada plexiforme externa de patch-clamp gravação sob diversas condições de iluminação é agora considerado viável numa preparação flat-mount.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
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