Summary
이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
포유류의 망막 신경 세포는 여러 종류로 이루어지는 층상 티슈이다. 그 복잡한 시냅스 네트워크 내에서 처리하는 방법을 시각적 신호를 이해하기 위해, 전기 생리 녹음 자주 개별 뉴런 사이의 연결을 연구하는 데 사용됩니다. 우리는 마우스 망막의 GCL (신경절 세포 층) 및 INL 모두 유 전적으로 표시 뉴런의 패치 클램프 기록 (내부 핵 층)에 대한 평면 장착 준비를 최적화했다. 수직 및 횡 방향 모두 연결이 전 구성에 보존되어 있기 때문에 평면 마운트에 기록 INL 신경 세포를 연구하는 많은 측면 구성 요소와 망막 회로를 허용 조각을 통해 선호한다. 우리는 콜린성 스타 버스트 무 축삭 세포 (보안 인증)으로 망막의 거울 트너가 신경 세포의 반응을 비교하기 위해이 절차를 사용하고 있습니다.
Protocol
윤리 승인 - 기관 동물 관리의 승인과 의학의 베일러 대학의위원회를 사용할 때 동물 주제와 관련된 절차, 규칙 및 연구 동물을위한 건강 지침의 국립 연구소의 규정에 따라 실시 하였다.
1. 외부 및 내부 솔루션
- 망막 박리시 이후 전기 생리 녹음에 외부 솔루션으로 포유 동물의 링거액을 사용합니다. 기록의 날 (칼슘)없이 10 배 원액에서 포유 동물의 링거액을 준비하고 carbogenation 15 분 (95 % O 2, 5 % CO 2) 후 염화칼슘 2 드롭 현명한을 추가합니다. 최종 1X 용액은 (mM 단위로)의 NaHCO3 0.8 나 2 HPO 4 0.1의 NaH 2 PO 4,이 CaCl2를 1 황산 10 D 글루코오스 (120)의 NaCl, 5 KCl을 25.
- SAC 진동을 특성화하기 위해 두 개의 내부 솔루션을 사용합니다. 테스트성인 마우스 망막 신경절 세포에 장기간 전체 셀 패치 클램프 녹음에 준비된 솔루션의 유용성과는 사용할 때까지 -20 ° C에서 500 μL 씩의 확인 배치를 저장합니다.
- 막 잠재적 인 진동을 기록, (mm 단위)가 포함 된 칼륨 기반 내부 솔루션을 사용 : 125 K-글루코 네이트, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 및 0.2 % biocytin (/ w V). KOH와 7.3의 pH를 조정합니다.
- (100 CS-메탄, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 0.2 % biocytin : 흥분성과 억제 성 시냅스 후 전류를 기록, (mm 단위)가 포함 된 세슘 기반 내부 솔루션을 사용 w / V). CsOH와 7.3의 pH를 조정합니다.
기록의 날 2. 준비
- 개방 구멍 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 제조하기 위해, 수동으로 무딘 16 G 주사기 바늘로 이루어진 사용자 정의 펀칭기로 막을 펀치 개의 깨끗한 유리 플레이트 사이의 평탄 막. 도매상에 대한, 망막 마운트 직경 중앙 구멍을 0.2 mm을 직경 1-1.2 mm이다 4 큰 구멍으로 그것을 둘러싸고 있습니다.
- 전극에 내부 솔루션을로드하기위한 사용자 정의 백필 필라멘트하려면 중간에 10 μL 피펫 팁을 용해하고 냉각 및 경화 될 때까지 부드럽게 녹아 부분을 길게. 직전, 사용이 약간 긴 패치 피펫보다 때까지 필라멘트를 잘라 깨끗한 면도날을 사용합니다.
- 내부 필라멘트와 붕규산 유리 관에서 프로그램 풀러에 패치 피펫을 당깁니다. 실험 당일 가능한 Micropipette 제조 및 즉시 사용합니다.
참고 : 열 : 기록 주머니를 들어, 우리는 다음과 같은 풀러 설정 사용 484; 당기 : 0; 속도 : 25; 시간 지연 : 1; 압력 : 400, 462 붕규산 튜브의 OD 및 ID의 램프 값은 각각 1.65 mm, 1.0 mm이다. 피펫의 저항은 10-14 MΩ이다. - 한 시간 조직 수확하기 전에, 샤키하여 내부 용액의 튜브를 해동> 30 분 동안 소용돌이에 겨.
3. 망막 해부
- 동물이 발가락 핀치에 응답을 잃을 때까지 산소에 4 % 이소 플루 란으로 동물을 마취. 자궁 전위에 의해 동물을 희생.
- 멀리 직선 지적 홍채 가위로 시신경 헤드 1-2mm의 시신경 오프 모두의 시선을 잘라.
- 혈액을 제거하고 carbogenated 포유 동물 링거액에서 그들을 젖어 깨끗한 종이 타월에 눈알을 굴립니다. 23 G 바늘로 윤부에 구멍을 펀치와 마이크로 가위로 윤부를 따라 절단하여 시선을 이등분. 미세 집게를 사용하여 각막과 렌즈를 제거합니다.
- 망막 전체 마운트를 들어, 부드럽게 미세 집게와 색소 상피 오프 전체 망막 박리 및 시신경의 머리를 향해 가장자리에서 4 1.5-2 mm 직교 인하합니다.
- 접시에 천공 니트로 셀룰로오스 막 담가 부드럽게 그것을 통해 망막을 드래그GCL면을 위로. 전체 마운트 망막을 준비 할 때 중앙 홀에 시신경의 머리를 놓습니다. 또 다른 깨끗한 접시에 망막과 멤브레인을 전송합니다. 부드럽게 몰타 십자가 모양과 구멍을 통해 네 개의 모서리를 배치하기 위해 미세 페인트 브러시와 망막을 평평.
- 망막의 일부가 한 번에 조사 할 경우, 색소 상피 세포가 부착 상태를 유지하여 면도날 3-4 개로 단계 3.3에서 제조 한 각각의 아이 컵 잘랐다. carbogenated 외부 용액에 빛에서 사용되지 않는 부분을 보호하고 12 시간 내에서 사용합니다.
- 건조 필터 종이와 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 가릴와 집게로 유리체 및 내부 경계 막 및 페인트 브러시를 제거합니다.
- 모든 망막 가장자리가 완전히 바닥에 밀봉 된 유리 커버 슬립으로 기록 챔버로 어셈블리를 전송하기 전에 막에 부착되어 있는지 확인하십시오. 커버 슬립과 rehydrat에 진공 그리스와 멤브레인을 고정외부 솔루션 망막 전자. 어셈블리 아래에 공기 방울 트랩에주의하지 말라.
- 직립 현미경의 무대에 챔버를 설정합니다. 분당 ~ 3 ㎖의 속도로 따뜻한 (34-35 ℃) carbogenated 외부 용액으로 관류 챔버.
- 미분 간섭 대비 (DIC) 및 / 또는 표면 형광 아래 GCL 및 INL 뉴런을 볼 수있는 60 배 물 침지 렌즈를 사용하여 먼저 10 배 대물 렌즈에서 망막을 검사합니다. tdTomato 발현 보안 인증을 시각화 흰색은 554 나노 미터의 여기 필터 및 581 나노 미터의 방출 필터와 조합 된 LED 광원을 사용한다.
평면 마운트 망막 4. 전체 셀 패치 클램프 녹음
- 사용자 지정 백업 광고 필라멘트에 주사기 필터를 통해 내부 솔루션을 필터링합니다.
- 갓 뽑아 마이크로 피펫으로 필라멘트를 삽입하고 솔루션>의은 전극 와이어를 커버 할 때까지 끝 근처의 내부 솔루션을 분배5mm. 가압 또는 튜브에 연결된 10 ㎖ 플라스틱 주사기의 플런저를 당김으로써 조정될 수있는 전극 내부의 압력을 통해 흡입 극 전극 홀더 상에 마이크로 피펫을 고정.
- 목적 아래 피펫을 찾아 망막 위 ~ 100 μm의 아래로 가져. 전류 종동 모드 (I = 0)에서 DC가 기립 DC 전압 신호를 제로로 오프셋을. 이 욕에있는 동안 피펫을 고정 크기의 구형파 전류를 주입 전류 클램프 (I 클램프) 모드에서 피펫 저항을 측정하고 Raccess 노브를 돌려서 차이를 중화. 옴의 법칙에 의해 피펫 저항을 계산하기 위해 Raccess 노브에 읽기를 사용합니다.
- 천천히 10 μm의 망막 위의 전극에 ~를 가져온다. 전극에 긍정적 인 압력을 적용합니다. 이 망막에 접근 피펫 팁 근처의 반사 변화를보십시오. 신속하게 그러나 부드럽게 GCL에 피펫을 강제하고 긍정적 인 pressu을 감소즉시 다시.
- 표지 된 신경 세포를 향해 피펫을 이동합니다. 다른 신경, 혈관과 뮐러 세포의 endfeet 접촉하지 마십시오. 전극의 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 더 긍정적 인 압력을 적용합니다.
- 딤플이 보일 때까지 레이블 신경 세포의 중간 선 근처에 피펫 팁을 배치합니다. 긍정적 인 압력을 해제하고 세포막은 피펫 팁에 다시 반송 할 수 있습니다.
- 기가 옴 밀봉의 형성을 돕기 위해 피펫 20 120 pA에 부정적인 전류를 적용합니다. 피펫으로 세포막을 당길 필요 부드러운 흡입을 적용한다. 세포막을 파열 인감 형성 후 5 분을 기다립니다. 이 누출 된 내부 솔루션은 superfusion에 의해 삭제 될 수 있습니다. 부드럽게 흡인 막 파열.
- 막 파열 후 현재 클램프 모드에있는 동안, 다리의 균형을 전환하고 Raccess 노브를 사용하여 조정합니다.
주 : 어떤 경우 SAC 같은 작은 세포의 경우, 단지 약간의 조정이 필요하다. Alternatively, 기록 흥분성 각각 (0 MV 주위)에 (-75 MV 주변) 클로라이드의 반전 전위에서 셀과 글루타메이트를 유지하여 전압 클램프 모드 (V 클램프)의 억제 시냅스 전류. 확인하고 가끔 망막 및 / 또는 미세 조작기 드리프트를 수용하기 위해 필요한 경우 피펫 위치를 조정합니다. - 신선에 (예 CNQX, AP5, 피크로 톡신, tubocurarine 등) 및 채널 변조기 (예 flupirtine, 도파민 meclofenamic 산 등) 시냅스 차단제 준비 과정 및 약물 치료 전후 막 전위 또는 전류 변화를 기록 할 냉동 주식에서 실험의 날. carbogenated 링거액과 함께 약물을 희석. 관류를 통해 일괄 적으로 적용 할 수 있습니다.
- 녹화 후, 부드럽게 소마에서 피펫을 제거합니다. 깨끗한 접시에 실에서 어셈블리를 전송합니다. 분리 및 천공 HOL하지 않고 다른 평평 니트로 셀룰로오스 막에 망막을 재 부착ES는 고정 동안 망막 평탄도를 확인합니다.
- RT에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드에 침지하여 망막 수정. 니트로 셀룰로오스 막에서 망막을 제거하고 1X PBS로 광범위하게 그것을 씻어. 4 ° C (14)에 0.4 % 트리톤 X-100과 1X PBS에 희석 염료 결합 된 스트렙 타비 딘과 O / N 염색으로 기록 된 세포의 형태를 알 수있다. antifade 매체에서 망막을 마운트하고 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 기록 된 세포를 관찰합니다.
참고 : 휘발성과 독성이 파라 포름 알데히드를 포함하는 절차는 안전을위한 초안 챔버에서 수행되어야한다.
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Representative Results
ON-와 deafferentated 마우스 망막에서 OFF 형 주머니의 대표적인 녹음은 그림 1에 나타내었다. GCL 및 INL 모두 콜린성 세포를 안정적으로 tdTomato 형광에 의해 식별 및 DIC에서 전체 셀 패치 클램프 녹음 대상이 될 수 있습니다 (그림 1A) 그들의 막 전위 (상단 트레이스) 및 (하단 흔적, 그림 1B)를 구동 시냅스 전류의 진동을 공개합니다. 억제 및 흥분성 시냅스 전류는 전압 클램프 조건 (그림 1B, 바닥 흔적)에서 각각 0 MV과 -75 MV,에서 세포를 잡고 공개됩니다. IPL을 (그림 1C)에서 전형적인 SAC 수지상 arborization 및 층화 수준은 내부적으로 투석 biocytin에 대한 사후 스트렙 타비 딘 염색으로 시각화 할 수 있습니다. 의 리듬과 막 잠재적 인 변동과 시냅스 현재 변경의 빈도 수전력 스펙트럼 밀도를 계산하여 정량화 될 수있다. 약리 봉쇄 또는 그 부족은 막 전위 발진 7 기본 다른 시냅스 메커니즘을 식별하는데 사용될 수있다.
그림 1. 형태와 멤브레인 놉 마우스 망막의 오프 - 스타 버스트 무 축삭 세포의 전위. (A) 두 INL에서 GCL에서 ON-보안 인증 및 OFF-보안 인증은 쉽게 Cre 호텔 구동 tdTomato의 발현에 의해 식별과 기록의 대상이되었다 DIC에서. 나타낸 바와 같이, 스케일 바는 20 μm의 동일. (B) 상단 흔적 바와 같이 오프 - 보안 인증에서 기록 막 잠재적 인 변화입니다. 바닥 흔적 대표 리듬 흥분성 시냅스 현재 가능한 잠재적와 부정맥 억제 시냅스 전류 (IPSC) 막의 진동 드라이브 (EPSC). (C) 기록 세포의 사후 조직 학적 특성은 IPL의 전형적인 SAC 수지상 형태와 계층화 수준을 나타냅니다. 스케일 바는 바와 같이 50 μm의 동일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
많은 실험실이 준비 15-18을 마운트 평평에서 GCL 신경 세포에서 기록했지만, 우리의 절차는 INL 뉴런에서 기록 할 수 있습니다. 우리는 이에 성공 일상적인 레코딩을위한 중요한 몇 가지 단계를 강조한다.
망막의 신선도 및 평탄성 기록 피펫을 관통 중요하다. 이 점에있어서, 상기 천공 된 니트로 셀룰로오스 막에 대한 망막의 확고한 부착 최우선 적시 재수 (단계 3.4-3.6)이어서 용액의 과도 흡수에 의해 달성된다. 이 짧은 기간 동안, 보통 미만 30 초, 유리체는 느슨한 젤리처럼 동작 및 박리 할 수있다. 유리체 수동 용액 17,19 또는 18,20 효소 작업에 의해 제거되어 여러 문서 절차에 비해 우리의 기술이 더 효율적이다. 또 다른 자주 사용되는 방법은 각 셀에 대해 빈 패치 피펫을 사용하여 떨어져 내 경계 막 찢어하는 것입니다21, 22를 기록합니다. 우리는 망막을 해체 두려워 인열 방법을 추구하지 않았다. 그러나, 어느 정도 투명한 젤리 같은 유리체 오프를 박리하는 시간에 막에서 망막을 제거 할 수 있습니다. 이 때문에, 니트로 셀룰로오스 막에 대한 망막의 유지가 INL 뉴런를 기록하기위한 필수적으로 실행을 필요로하는 단계이다. 좋은 방법은 잘 평평 완전히 수화 된 니트로 셀룰로스 멤브레인을 사용하는 것이다. 여기서 주목할 점은 기록 가능 영역 사이의 명백한 트레이드 오프 (즉, 펀칭 구멍의 크기), 망막의 평탄성과 막에의 부착 탄력. 더 큰 기록 윈도우가 바람직하지만, 더 큰 펀칭 구멍 망막 첨부 적은 막 영역이 존재한다는 것을 의미한다. 유사하게, 작은 구멍을 통해 망막 장착하는 확고한 부착을 보장하지만, 평탄성이 저하 될 수 있고, 그래서 기록 영역이다.
로 유리체를 통해 전극을 삽입하려면GCL 및 INL는 (단계 4.4), 우리는 전극 걸림을 방지하는 정압을 적용한다. 망막에 침투 할 때이 압력의 즉각적인 감소는 또한 염색 배경을 감소 및 진동을 보존하는 것이 중요합니다. 중요한 체크 포인트는 침투와 인감, GCL 신경 및 INL 뉴런 60 초 내에 바람직하게는 30 초를 얻기까지의 시간을 단축하는 것입니다. 또 다른 중요한 점은 기가 옴 시일의 형성 후, 막 파열되기 전에 5 분의 대기 시간이다. 이러한 대기 기간은 상기 전극의 경로에서 유출 된 내부 용액의 클리어링을 보장하고 높은 칼륨 함량이 일시적으로 이웃하는 신경 세포 탈분극 및 진동을 방해 할 수 있기 때문에 칼륨 계 내부의 용액이 사용되는 경우 특히 적합하다. 마지막으로, 우리의 방법 (단계 4.7)의 다소 비 전통적인 기능은 셀 접근 우리하는 기가 옴 시일을 형성하고 전류 클램프 MO하에 전체 세포 액세스 있다는드, 우리의 초기 전기 생리 녹음으로 우리를 도와 버지니아 커먼 웰스 대학의 박사 로리 McQuiston에 의해 권고있다. 이 방법은 침입시 신속하게 저항 변화 (오실로스코프를 통해 볼 수) 전압 변화에 의해 촬영 된 전체 세포 수준에서 막 전위의 갑작스러운 스윙에서 기록 된 세포를 보호 할 수 있습니다. 우리의 방법의 다른 유용한 특성은 양으로 하전 된 인지질 막 유치 도움 시일 형성을 용이하게 전극 팁에인가되는 네거티브 전류이다.
횡 망막 회로 보존에 관해서는, 망막 (20)의 가로로 얇게 제조 제안되었다. 이 방법이 효율적 가로 확장 돌기 및 기록을위한 촬상 IPL 시냅스 연결을 노출하지만, 수직 통로 불행히도 파괴되고, 따라서이 방법은 제한된 용도로 사용될 수있다. 마지막으로, 개선은 우리의 구현조직 준비 및 기록 절차는 OFF-보안 인증 (7) 등의 INL 뉴런의 일상적인 목표로 녹음 할 수 있습니다. 다양한 조명 조건에서 기록 패치 클램프의 바깥 얼기 층 근처 바이폴라 세포와 수평 세포를 대상으로, 두 광자 이미징을 통합 및 대비가 현미경을 강화함으로써 이제 평면 마운트 준비 가능 간주됩니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
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