Summary
Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.
Abstract
La rétine est un tissu de mammifère en couches composée de plusieurs types de neurones. Pour comprendre comment les signaux visuels sont traités au sein de son réseau synaptique complexe, des enregistrements électrophysiologiques sont fréquemment utilisés pour étudier les liens entre les neurones individuels. Nous avons optimisé une préparation plate-support pour l'enregistrement patch clamp de neurones génétiquement marqués dans les deux GCL (couche de cellules ganglionnaires) et INL (couche nucléaire interne) de rétines de souris. Enregistrement neurones INL en-supports plats sont favorisés par rapport aux tranches car les connexions verticales et latérales sont conservées dans l'ancienne configuration, permettant des circuits rétiniens avec de grands composants latéraux à étudier. Nous avons utilisé cette procédure pour comparer les réponses des neurones miroirs en partenariat dans rétines telles que les cellules amacrines Starburst cholinergiques (ZSC).
Protocol
L'approbation éthique - les procédures impliquant des sujets animaux ont été menées en conformité avec les règles et règlements des Instituts nationaux de la santé des lignes directrices pour les animaux de recherche, tel qu'approuvé par la protection des animaux et l'utilisation comité du Baylor College of Medicine.
1. externe et interne Solutions
- Utilisez la solution de Ringer mammifère lors de la dissection rétine et que la solution externe pour l'enregistrement électrophysiologique ultérieure. Préparer la solution de Ringer de mammifère à partir de 10x solution mère (sans calcium) le jour de l' enregistrement, et ajoutez CaCl2 goutte à goutte au bout de 15 min de carbogenation (95% O 2 et 5% de CO 2). La solution finale 1x contient (en mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO 3, 0,8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 et 10 D-glucose.
- Utilisez deux solutions internes pour caractériser les oscillations SAC. Testerl'utilité des solutions préparées dans les enregistrements de patch clamp à cellules entières sur de longues RGC de souris adultes et de stocker les lots vérifiés dans 500 uL d'aliquotes à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Pour l'enregistrement d'une membrane d'oscillation potentielle, utilisant une solution interne à base de potassium qui contient (en mM): 125 K-gluconate, le 8 NaCl, 4 ATP-Mg 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES et 0,2% de la biocytine (p / v). Ajuster le pH à 7,3 avec KOH.
- Pour l'enregistrement d'excitateur et des courants postsynaptiques inhibiteurs, en utilisant une solution interne à base de césium, qui contient (en mM): 100 Cs méthanesulfonate, 8 NaCl, 4 ATP-Mg 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES et 0,2% de la biocytine ( p / v). Ajuster le pH à 7,3 avec CsOH.
2. Préparation de la Journée de l'enregistrement
- Pour préparer une membrane de nitrocellulose avec des trous ouverts, poinçon manuellement la membrane avec un perforateur sur mesure fabriqué à partir d'un 16 G aiguille de seringue émoussé et aplatir la membrane entre deux plaques de verre propres. Pour un sistesrétine monter, faire un trou central de 0,2 mm de diamètre et de l'entourer par 4 grands trous qui sont 1-1,2 mm de diamètre.
- Pour faire un filament de remplissage personnalisé pour le chargement de solution interne en électrodes, faire fondre une pointe de pipette 10 pi au milieu et d'allonger délicatement la partie fondue jusqu'à ce qu'il se refroidit et se durcit. Juste avant l'utilisation, utiliser une lame de rasoir propre pour couper le filament jusqu'à ce qu'il soit légèrement plus long que les pipettes de patch.
- Tirez pipettes de patch dans un extracteur programmable de tube de verre borosilicate avec un filament interne. Fabrication micropipettes le jour de l'expérience et de les utiliser immédiatement.
NOTE: Pour ZSC d'enregistrement, nous utilisons le réglage de traction suivant: la chaleur: 484; tirez: 0; vitesse: 25; temps de retard: 1; pression: 400 et une valeur de rampe 462. Le diamètre extérieur et de l'ID des tubes de borosilicate sont 1,65 mm et 1,0 mm, respectivement. Résistance des pipettes est 10-14 MQ. - Une heure avant la récolte des tissus, décongeler un tube de solution interne par shaking sur un vortex pendant> 30 min.
3. Retina Dissection
- Anesthetize l'animal de 4% d'isoflurane dans de l'oxygène jusqu'à ce que l'animal perd la réactivité à un pincement de l'orteil. Sacrifiez l'animal par dislocation cervicale.
- Couper les deux globes oculaires au large des nerfs optiques à 1-2 mm de la tête du nerf optique avec iris droites-ciseaux pointus.
- Rouler les yeux sur une serviette en papier propre pour enlever le sang, puis les plonger dans une solution de Ringer mammifère carbogenated. Percez un trou sur le limbe avec une aiguille 23 G et bisect les globes oculaires en coupant le long du limbe avec des micro-ciseaux. Retirez la cornée et le cristallin en utilisant une pince fine.
- Pour la rétine entière montage, retirez délicatement toute la rétine de l'épithélium pigmentaire avec une pince fine et faire des coupes quatre 1,5-2 mm orthogonales à partir du bord vers la tête du nerf optique.
- Immergez une membrane de nitrocellulose poinçonné dans le plat et doucement glisser la rétine dessus avecGCL vers le haut. Placez la tête du nerf optique dans le trou central lors de la préparation entière monter une rétine. Transférer la membrane avec la rétine dans un autre plat propre. aplatir délicatement la rétine avec un pinceau fin pour ressembler à une croix de Malte et de jeter les quatre bords sur les trous.
- Si une fraction de la rétine doit être examinée à la fois, couper chaque œilleton préparé à partir de l'étape 3.3 en 3-4 morceaux avec une lame de rasoir avec l'épithélium pigmentaire reste attaché. Protéger les morceaux inutilisés de la lumière dans la solution externe carbogenated et de les utiliser dans les 12 heures.
- Tamponnez la membrane de nitrocellulose avec un morceau de papier filtre sec et retirer la membrane vitreuse et intérieure limitant avec une pince et un pinceau.
- Assurez-vous que tous les bords de la rétine sont entièrement attachés à la membrane avant de transférer l'ensemble dans la chambre d'enregistrement avec une lamelle de verre scellé au fond. Fixer la membrane avec de la graisse à vide à la lamelle et rehydrate la rétine avec la solution externe. Veillez à ne pas piéger les bulles d'air en dessous de l'ensemble.
- Réglez la chambre sur la scène d'un microscope droit. Perfuser la chambre avec chaud (34-35 ° C) solution externe carbogenated à un taux de ~ 3 ml par min.
- Examiner la rétine sous un objectif 10x d'abord, puis utiliser une lentille 60x immersion dans l'eau pour voir les neurones GCL et INL sous contraste d'interférence différentiel (DIC) et / ou épifluorescence. Pour visualiser ZSC tdTomato exprimant, utiliser une LED blanche source de lumière en combinaison avec un filtre d'excitation de 554 nm et un filtre d'émission de 581 nm.
4. Le total des cellules Patch Clamp Enregistrement de Flat-mount Retina
- Filtrer la solution à travers un filtre interne de la seringue dans le filament de remplissage personnalisée.
- Insérez le filament dans une micropipette fraîchement tirée et distribuer la solution interne près de la pointe jusqu'à ce que la solution couvre le fil d'électrode d'argent pour>5 mm. Fixer la micropipette sur un porte-électrode avec un pôle d'aspiration, à travers lequel la pression à l'intérieur de l'électrode peut être réglée en poussant ou en tirant le piston d'une seringue de 10 ml en matière plastique en forme de tube relié.
- Trouver la pipette sous l'objectif et de le ramener à ~ 100 um au-dessus de la rétine. Dans le mode courant suiveur (I = 0), l'utilisation de décalage continu à zéro le signal debout de tension continue. Mesurer la résistance de la pipette sous la pince de courant de mode (I Clamp) par injection d' amplitude fixe courants d'onde carrée par la pipette alors qu'il est dans le bain et de neutraliser la différence en tournant le bouton raccess. Utilisez la lecture sur le bouton de raccess pour calculer la résistance de la pipette par la loi d'Ohm.
- Ramenez lentement l'électrode à ~ 10 um au-dessus de la rétine. Appliquer une pression positive à l'électrode. Regardez le changement de réflexion à proximité de la pointe de la pipette à l'approche de la rétine. Rapidement, mais forcer doucement la pipette dans le GCL et réduire le PRESSU positifre immédiatement.
- Déplacer la pipette vers un neurone marqué. Éviter tout contact avec d'autres neurones, des vaisseaux sanguins et des cellules endfeet Muller. Appliquer une pression plus positive si nécessaire pour empêcher l'électrode de colmatage.
- Positionner la pointe de la pipette près de la ligne médiane d'un neurone marqué jusqu'à une fossette est visible. Relâchez la pression positive et permettre à la membrane plasmique de rebondir sur la pointe de la pipette.
- Appliquer 20 à 120 pA courants négatifs à la pipette pour aider à la formation d'un joint d'étanchéité giga-ohms. Appliquer une légère aspiration si nécessaire pour tirer la membrane plasmique dans la pipette. Attendre 5 min après la formation du joint d'étanchéité pour rompre la membrane cellulaire. Cela permet à la solution interne renversé est interceptée par surfusion. Rompre la membrane par une aspiration douce.
- Après la rupture de la membrane et en mode de pince de courant, allumez l'équilibre du pont et de l'ajuster en utilisant le bouton raccess.
NOTE: Pour une petite cellule comme le SAC, seulement un léger ajustement est nécessaire, le cas échéant. Alterntivement, record excitateurs et courants postsynaptiques inhibiteurs dans le mode de verrouillage de tension (V Clamp) en maintenant la cellule à des potentiels d'inversion de chlorure (environ -75 mV) et le glutamate (environ 0 mV), respectivement. Vérifier et régler la position de la pipette si nécessaire pour accueillir la rétine occasionnelle et / ou la dérive du micromanipulateur. - Pour enregistrer le potentiel de membrane ou de changement de courant avant, pendant et après le traitement pharmacologique, préparer les bloqueurs synaptiques (par exemple, CNQX, AP5, picrotoxine, tubocurarine, etc.) et des modulateurs de canaux (par exemple, la flupirtine, la dopamine, l' acide méclofénamique, etc.) frais sur le jour de l'expérience à partir de stocks congelés. Diluer les médicaments avec la solution de carbogenated Ringer. Appliquez-les dans une manière discontinue par perfusion.
- Après l'enregistrement, retirez délicatement la pipette du soma. Transférer l'ensemble de la chambre à un plat propre. Détachez et re-fixer la rétine sur une autre membrane de nitrocellulose aplati sans hol perforées pour assurer la planéité rétine lors de la fixation.
- Fixer la rétine par immersion dans du paraformaldehyde à 4% pendant 30 min à température ambiante. Retirer la rétine à partir de la membrane de nitrocellulose et rincer abondamment avec PBS 1x. Révéler la morphologie des cellules enregistrées par O / N coloration avec de la streptavidine conjugué à un colorant dilué dans 1 x PBS avec 0,4% de Triton X-100 à 4 ° C 14. Monter la rétine en milieu antifade et observer les cellules enregistrées à l'aide d'un microscope confocal à balayage.
NOTE: Les procédures impliquant paraformaldehyde, qui est volatile et toxique, devraient être menées dans un projet de chambre pour la sécurité.
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Representative Results
Enregistrements représentatifs de ON- et OFF de type ZSC d'une rétine de souris deafferentated sont présentés dans la figure 1. Cellules cholinergiques dans les deux GCL et INL peuvent être identifiés de façon fiable par tdTomato fluorescence et ciblées pour l' ensemble de cellules d' enregistrement patch clamp sous DIC (figure 1A) pour révéler l' oscillation de leurs potentiels de membrane (top traces) et les courants synaptiques qui l' animent (traces de fond, figure 1B). Les courants synaptiques excitateurs et inhibiteurs sont révélés en maintenant les cellules à 0 mV et -75 mV, respectivement, dans des conditions de tension de serrage (figure 1B, les traces du bas). SAC arborisation et stratification des niveaux typiques dendritiques dans l'IPL (figure 1C) peuvent être visualisés par courrier streptavidine coloration hoc pour la biocytin dialysée en interne. La rythmicité et la fréquence de potentiel membranaire fluctuations et les changements actuels peuvent postsynaptiquesquantifier par calcul de la densité spectrale de puissance. Le blocage pharmacologique, ou l'absence de celui - ci, peuvent être utilisés pour discerner les différents mécanismes synaptiques sous - jacents membrane oscillation potentielle 7.
Figure 1. Morphologie et membranaires potentiels de bilan et hors-starburst cellules amacrines dans la rétine de souris Nob. (A) Les deux ON-ZSC à GCL et OFF-ZSC au INL ont été facilement identifiés par l' expression de tdTomato Cre-driven et ciblés pour l' enregistrement sous CIVD. Les barres d'échelle égal à 20 um comme indiqué. (B) Les premières traces sont des changements potentiels membranaires enregistrés à partir sur et hors-ZSC comme indiqué. Les traces de fond sont rythmiques représentant actuel post-synaptique excitateur (RPEC) qui conduisent l'oscillation du potentiel de membrane et le courant post-synaptique inhibitrice arythmique (IPSC). (C) Poster caractérisation histologique hoc de cellules enregistrées indique la morphologie et la stratification des niveaux dendritiques typiques SAC dans l'IPL. Les barres d'échelle égal à 50 um comme indiqué. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
De nombreux laboratoires ont enregistré des neurones GCL dans la préparation 15-18 plate-montage, mais nos procédures permettent l' enregistrement à partir de neurones INL. Nous soulignons par la présente plusieurs étapes qui sont essentielles pour les enregistrements de routine avec succès.
La fraîcheur et la planéité de la rétine sont importantes pour pénétrer avec une pipette d'enregistrement. A cet égard, la fixation solide de la rétine à la membrane de nitrocellulose perforée est primordiale et est obtenue par absorption d'une solution transitoire suivie d'une réhydratation en temps voulu (étape 3.4 à 3.6). Pendant cette courte période, généralement moins de 30 secondes, le corps vitré se comporte comme une gelée lâche et peut être décollée. Notre technique est plus efficace par rapport à plusieurs procédures publiées, où le corps vitré est retiré manuellement en solution 17,19 ou par des actions enzymatiques 18,20. Une autre méthode fréquemment utilisée consiste à déchirer la membrane limitante interne au large à l'aide d'une pipette de patch vide pour chaque celluleà enregistrer 21,22. Nous ne recherchons pas la méthode de déchirement, de peur de démonter la rétine. Cependant, le pelage hors vitreux transparent et un peu analogue à une gelée peut parfois déloger la rétine de la membrane. Ceci est donc une étape qui exige la pratique que la conservation de la rétine sur la membrane de nitrocellulose est essentielle pour l'enregistrement des neurones INL. Une bonne pratique consiste à utiliser une membrane de nitrocellulose bien aplatie et entièrement hydratée. Un point à noter ici est le compromis apparent entre la zone enregistrable (ie, la taille d'un trou perforé), la planéité de la rétine, et la fermeté de l' attachement à la membrane. Une fenêtre d'enregistrement plus grand est préféré, mais un plus grand trou poinçonné signifie qu'il y a moins de surface de la membrane de la rétine pour attacher. De même, le montage de la rétine sur un trou plus petit assure une fixation ferme mais planéité peut être réduite, et est donc zone enregistrable.
Pour insérer une électrode à travers le corps vitré enGCL et INL (étape 4.4), nous appliquons une pression positive pour empêcher l'électrode de brouillage. La réduction immédiate de cette pression lors de la pénétration dans la rétine est également essentielle pour réduire la coloration de fond et pour la préservation de l'oscillation. Un point de contrôle important est de réduire le temps entre la pénétration et l'obtention de l'étanchéité, de préférence moins de 30 secondes pour les neurones GCL et à moins de 60 secondes pour les neurones INL. Un autre point important est la période d'attente de 5 minutes après la formation du joint giga-ohm et avant la rupture de la membrane. Cette période d'attente assure la compensation de la solution interne renversé dans le chemin de l'électrode et est particulièrement pertinent quand une solution interne de potassium à base est utilisée parce que la forte teneur en potassium peut dépolariser temporairement les neurones voisins et de perturber l'oscillation. Enfin, une caractéristique peu conventionnelle de notre approche (étape 4.7) est que nous approcher une cellule, former un joint giga-ohms, puis accéder à cellules entières sous le mo de pince de courantde, tel que recommandé par le Dr Rory McQuiston de l'Université Virginia Commonwealth, qui nous a aidés avec nos enregistrements électrophysiologiques initiaux. Cette méthode permet le changement de résistance rapide à la rupture pour être capturé par des changements de tension (visibles à travers un oscilloscope) et protège la cellule enregistrée à partir de l'oscillation soudaine du potentiel de membrane au niveau de cellule entière. Une autre caractéristique utile de notre méthode est le courant négatif appliqué à la pointe de l'électrode, ce qui permet d'attirer des phospholipides membranaires chargés positivement et facilite la formation d'étanchéité.
En ce qui concerne la préservation des circuits latéraux de la rétine, une préparation des tranches à l' horizontale de la rétine 20 a été suggérée. Bien que cette méthode expose efficacement les dendrites en expansion horizontale et les connexions synaptiques dans l'IPL pour l'enregistrement et l'imagerie, la voie verticale est malheureusement perturbée et donc cette méthode ne peut être utilisée à des fins limitées. Enfin, les améliorations que nous mettre en œuvre dansles procédures de préparation des tissus et d' enregistrement permettent des enregistrements de routine ciblée de neurones INL tels que OFF-ZSC 7. En intégrant l'imagerie à deux photons et d'amélioration du contraste microscopie, en ciblant les cellules bipolaires et les cellules horizontales près de la couche plexiforme externe pour l'enregistrement patch clamp dans diverses conditions d'éclairage est maintenant considéré comme faisable dans une préparation plate-montage.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed-stage fluorescent microscope with DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Micromanipulators | Sutter | MP-225 | |
| Patch clamp amplifier | A-M System | AM2400 | |
| AD converter | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Heater controller | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline heater | Warner Instrument | SC-20 | |
| Peristaltic pump | Rainin | Dynamax | |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Glass tube with filament | King Precision Glass | Customized | |
| Stimulator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-methanesulfonate | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Syringer filter | Nalgene | 171 | |
| 1 ml syring | Rainin | 17013002 | |
| 10 μl pipette tip | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
References
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