Summary
इस लेख का पता लगाने और मुफ्त जोनल केशिका वैद्युतकणसंचलन का उपयोग संयंत्र सामग्री से कार्बनिक अम्ल की मात्रा का ठहराव के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। इस विधि के संभावित आवेदन, कॉफी के बीज में कार्बनिक अम्ल के स्तर पर एक माध्यमिक किण्वन के प्रभाव का निर्धारण करने का एक उदाहरण है, प्रदान की जाती है।
Abstract
कार्बोक्जिलिक एसिड एक या एक से अधिक टर्मिनल carboxyl (COOH) कार्य समूहों से युक्त कार्बनिक अम्ल होते हैं। छोटी श्रृंखला कार्बोक्जिलिक एसिड (SCCAs; कार्बोक्जिलिक एसिड तीन से छह कार्बन युक्त) ऐसे Malate और साइट्रेट के रूप में, कई जैविक प्रणालियों, जहां वे सेलुलर श्वसन में काम करते हैं और सेल स्वास्थ्य के संकेतक के रूप में सेवा कर सकते हैं के समुचित कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं। खाद्य पदार्थों में, कार्बनिक अम्ल सामग्री स्वाद पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है, एक खट्टा या "एसिड" स्वाद में जिसके परिणामस्वरूप वृद्धि हुई SCCA के स्तर के साथ हो सकता है। इस वजह से, कार्बनिक अम्ल के स्तर के तेजी से विश्लेषण के लिए तरीके खाद्य और पेय उद्योगों के लिए विशेष रुचि के हैं। दुर्भाग्य से, हालांकि, ज्यादातर SCCA मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया तरीकों समय लेने वाली खतरनाक अभिकर्मकों के साथ नमूनों की आवश्यकता होती है derivatization प्रोटोकॉल पर निर्भर कर रहे हैं, महंगा chromatographic और / या बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण द्वारा पीछा किया। इस विधि का विवरण पता लगाने और ओआरजी की मात्रा का ठहराव के लिए एक वैकल्पिक विधिसंयंत्र सामग्री और मुक्त जोनल केशिका वैद्युतकणसंचलन (CZE) का उपयोग भोजन के नमूने से anic एसिड होता है, कभी कभी बस केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) के रूप में भेजा। CZE का पता लगाने के एक कम सीमा (0.005 मिलीग्राम / एमएल) के साथ SCCAs को मापने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका प्रदान करता है। यह लेख संयंत्र के नमूने से निकासी और SCCAs की मात्रा का ठहराव का विवरण। प्रदान की विधि कॉफी बीन्स से SCCAs की माप पर केंद्रित है, प्रदान की विधि कई संयंत्र आधारित खाद्य सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
1. नमूना तैयार
- लघु श्रृंखला कार्बोक्जिलिक एसिड (SCCA) निकासी के लिए नमूने इकट्ठे। वह पर्याप्त नमूना प्रसंस्करण के बाद ही रहेगा सुनिश्चित करने के लिए एक समय में कॉफी के बीज की 1.0 ग्राम तैयार करें।
- नमूने पीस प्रक्रिया से पहले जमे हुए थे, तो ऊतक प्रसंस्करण भर जमे हुए फ्रीज / पिघलना नुकसान और नमूना ऑक्सीकरण रोकने के लिए रहते हैं। फ्रीजर या उप शून्य भंडारण से नमूना के रूप में ही पीस के लिए आवश्यक निकालें।
- तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज ताजा नमूने तुरंत पीस नमूना करने से पहले। उन्हें एक मोर्टार तरल नाइट्रोजन के साथ पहले से भरा में रखकर नमूना हैंडलिंग, फ्लैश फ्रीज नमूने कम से कम।
- तुरंत पीढ़ी, या फ़्लैश -20 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्रीज या विश्लेषण जब तक -80 डिग्री सेल्सियस निम्नलिखित तरल नमूनों का विश्लेषण। विश्लेषण करने से पहले, भंडारण से जमे हुए नमूने को हटाने और पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं। तरल नमूने के लिए प्रसंस्करण के लिए कदम करने के लिए (3.5) के लिए आगे बढ़ें।
- पहनें appropriate व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण तरल नाइट्रोजन के साथ काम करने से पहले (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, और प्रयोगशाला कोट सहित)।
- एक समान रूप से ठीक पाउडर (यानी, वर्दी कण आकार के) तरल नाइट्रोजन में करने के लिए ट्रिपल-पीस ऊतकों के नमूनों एक चीनी मिट्टी मोर्टार और मूसल का उपयोग कर।
नोट: एक वर्दी कण आकार बनना SCCA निकासी दक्षता बढ़ाने के लिए आवश्यक है।- मोर्टार पूर्व ठंड और नमूने के अलावा पहले तरल नाइट्रोजन के साथ मूसल। तरल नाइट्रोजन के रूप में नमूना जोड़ा जाता है की एक छोटी मात्रा के साथ भरा मोर्टार रखें।
- एक करछुल का उपयोग करना, मोर्टार के लिए पर्याप्त तरल नाइट्रोजन जोड़ने के लिए पूरी तरह से नमूना डूब।
- तरल नाइट्रोजन के लिए, इस तरह के पत्ते या भुना हुआ कॉफी के रूप में आसानी से जमीन के नमूने, जोड़ें और एक परिपत्र गति का उपयोग पीस कुचलने। नमूने पीसने के लिए जब तरल नाइट्रोजन का स्तर जहां यह बात अभी मुश्किल से नमूने को शामिल किया गया कमी आई है शुरू।
- नमूने, इस तरह के एक पीसने के लिए मुश्किल जोड़ेकच्चे कॉफी के बीज, तरल नाइट्रोजन के लिए और उन्हें पीस से पहले 10-30 सेकंड (या जब तक तरल नाइट्रोजन सख्ती उबलते बंद हो जाता है) के लिए फ्रीज करने के लिए अनुमति देते हैं। एक ऊर्ध्वाधर पेराई गति का उपयोग छोटे टुकड़ों में तोड़ ऊतक, और फिर पूरा ऊतक एक परिपत्र गति का उपयोग पीस पीस।
- , दोहराएँ इतना है कि नमूने तीन बार की कुल भूमि रहे हैं कदम दो बार अधिक 1.3.2-1.3.4। आमतौर पर, पीस की लगातार तीन दौर की एक आटा की तरह स्थिरता के साथ एक पाउडर के नमूने कम हो जाएगा।
- एक आटा की तरह स्थिरता हासिल नहीं है, तो चरणों को दोहराएँ 1.3.2-1.3.4 तक नमूने समान छोटे कण आकार की एक पाउडर के लिए कम कर रहे हैं (निकासी दक्षता व्युत्क्रमानुपाती कण आकार के लिए आनुपातिक है)।
- कांच की शीशियों या 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए पाउडर स्थानांतरण। डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण आरंभ तुरंत पीसने के बाद (अनुशंसित), या नमूने जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर नमूने निकासी के लिए तैयार हैं।
- नमूनों से पहले संग्रहित किया जाना चाहिएविश्लेषण, 500 मिलीग्राम aliquots (या तरल नमूने के लिए 500 μl aliquots) और भंडारण के लिए कई ट्यूबों के बीच विभाजित में नमूना विभाजित। दोहराया / फ्रीज पिघलना चक्र के लिए नमूने subjecting से बचें, क्योंकि ये नमूना संरचना में परिवर्तन और नकारात्मक भविष्य नमूना माप प्रभाव हो सकता है।
2. कार्बनिक अम्ल मानक तैयारी
- ब्याज की SCCAs के लिए प्रामाणिक मानकों इकट्ठा करो। ये SCCA सांद्रता निर्धारित करने में उपयोग के लिए बाह्य और आंतरिक मानक समाधान बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। कॉफी के नमूनों ब्याज और आंतरिक मानक के रूप में वसीय अम्ल की एसिड के रूप में साइट्रिक, सेब, एसिटिक, और लैक्टिक एसिड शामिल करने के लिए।
- सुनिश्चित करें कि चयनित आंतरिक मानक नमूने में प्राकृतिक रूप से नहीं पाया जाता है, और नमूना प्रोफ़ाइल में अन्य चोटियों के साथ कि मानक नहीं है सह-Elute सुनिश्चित करें।
- ब्याज की प्रत्येक SCCA के लिए मानक घटता चलाएँ, और (प्रत्येक SCCA के लिए रेखीय प्रतिक्रिया सीमा निर्धारित संस्थान चलाने के लिए धारा 4 देखेंउपद्रव)। प्रत्येक SCCA के लिए मानक घटता चलाने के लिए सुनिश्चित नमूने में मापा जाना सुनिश्चित करें।
नोट: मानक घटता या तो बफर या नमूने की पृष्ठभूमि यत्न किया जा करने के लिए चलाया जा सकता है। दूसरे मामले ( "मानक अलावा") में, प्रत्येक मानक वक्र बिंदु के चोटी के क्षेत्र के लिए मूल्यों के नमूने की पृष्ठभूमि दूर घटाकर द्वारा निर्धारित किया जाएगा। - पूर्व लेबल सभी ट्यूब और कांच के बने पदार्थ SCCA एसिड नाम, एकाग्रता, और परख की तारीख के साथ की जरूरत है।
- एक ज्ञात एकाग्रता (10 मिलीग्राम / एमएल) के एक फ्लास्क का उपयोग कर मानक तैयार करने के दौरान सटीकता सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक स्तर के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें।
- एकाग्रता स्टॉक समाधान के लिए वांछित लक्ष्य को हासिल करने के लिए ultrapure पानी (18.2 MΩ) में ठोस SCCA मानकों (साइट्रिक एसिड और मैलिक एसिड) भंग।
- एक 10 मिलीलीटर फ्लास्क करने के लिए मानक के 100 मिलीग्राम जोड़कर एक 10 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान बनाएँ। करने के लिए ultrapure पानी के साथ 10 मिलीलीटर लाइन बड़ा फ्लास्क भरें घएसिड issolve।
- एसिड मानक का एक कम एकाग्रता बनाने के लिए या धीरे ड्राइव करने के लिए, SCCA मानकों मुश्किल-भंग वसीय अम्ल की तरह समाधान में बोतल गर्मी।
- ultrapure पानी में तरल चरण एसिड मानकों (एसिटिक एसिड और लैक्टिक एसिड) पतला वांछित एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
- ultrapure पानी के 5 मिलीलीटर के साथ एक बड़ा फ्लास्क पहले से भरना। पर्याप्त एसिड एक 10 मिलीग्राम / एमएल समाधान फ्लास्क (विक्रेता द्वारा प्रदान एसिड घनत्व उपयोग कर की गणना) तैयार करने के लिए जोड़ें, और उसके बाद 10 मिलीलीटर के समाधान के अंतिम मात्रा लाने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें।
- एकाग्रता स्टॉक समाधान के लिए वांछित लक्ष्य को हासिल करने के लिए ultrapure पानी (18.2 MΩ) में ठोस SCCA मानकों (साइट्रिक एसिड और मैलिक एसिड) भंग।
- एक polytetrafluoroethylene (PTFE) टोपी लाइन में खड़ा के साथ, एक साफ 15 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब के लिए प्रत्येक शेयर समाधान स्थानांतरण, और प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ सील। स्टॉक समाधान 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सील ट्यूबों में संग्रहित किया जा सकता है।
- सुनिश्चित करें कि SCCA मानकों का उपयोग करने से पहले समाधान के बाहर उपजी नहीं किया है, तो शेयर समाधान prepar बाद प्रशीतित कर दिया गया हैसमझना। ड्राइव कोमल हीटिंग के माध्यम से समाधान में वापस precipitates।
- SCCA निकासी के समाधान तैयार है। एक एकाग्रता के नमूनों में पता लगाने के लिए पर्याप्त (0.05 मिलीग्राम / एमएल) में आंतरिक मानक को शामिल करें। सभी नमूनों को निकालने के लिए पर्याप्त समाधान तैयार है।
- ultrapure पानी में 0.05 मिलीग्राम / मिलीलीटर के लिए आंतरिक मानक शेयर समाधान गिराए द्वारा SCCA निकासी के समाधान के 50 मिलीलीटर की तैयारी। पानी की 49.75 मिलीलीटर के लिए आंतरिक मानक शेयर समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) के 250 μl जोड़ें।
- ताकि अंतिम एकाग्रता मात्रा का ठहराव की सीमाओं के भीतर गिर जाएगी निकालने पतला करने की जरूरत है, निष्कर्षण समाधान में आंतरिक मानक एकाग्रता को समायोजित (एक detectable दे रही है, लेकिन न अधिक संतृप्त, शिखर, नीचे 5.2.2 देखें) कमजोर पड़ने के बाद सीई प्रणाली (0.05 मिलीग्राम / एमएल)।
- एक्सट्रेक्शन की प्रत्येक श्रृंखला के लिए नए सिरे से निकासी समाधान (यानी, प्रत्येक प्रयोगात्मक श्रृंखला के लिए) तैयार करें।
- मानक वक्र नमूने तैयारब्याज की SCCAs के लिए (उचित dilutions की एक श्रृंखला), कम से कम 5 अंक की एक न्यूनतम का उपयोग कर। नियोजित मानक वक्र सांद्रता एक दिया SCCA के लिए रेखीय प्रतिक्रिया दायरे में रहने की जरूरत है, और SCCA सांद्रता नमूनों में उम्मीद की अवधि जाएगा।
- मानक वक्र समाधान में चयन आंतरिक शामिल मानक नमूनों में आंतरिक मानक की मात्रा का ठहराव की अनुमति है। आंतरिक मानक चोटी की पहचान और गणना के निष्कर्षण दक्षता (धारा 6) में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
- ऊपर चुना गया सांद्रता के लिए प्रत्येक SCCA पतला (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 मिलीग्राम / एमएल, ऊपर देखते हैं, 2.4.2) नई microcentrifuge ट्यूब में (प्रत्येक एकाग्रता / मानक वक्र बिंदु के लिए एक) ultrapure पानी का उपयोग कर। प्रत्येक मानक वक्र एकाग्रता बिंदु के लिए समाधान के 1 मिलीलीटर की तैयारी। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक एकाग्रता बिंदु सभी चार एसिड मानकों और सही एकाग्रता में आंतरिक मानक शामिल हैं।
- प्रत्येक सेट के लिए नए मानक वक्र अंक तैयारनमूनों की केशिका वैद्युतकणसंचलन सिस्टम पर चलाने के लिए। विश्लेषण जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर मानक वक्र SCCA नमूने पकड़ है, जो लक्ष्य ऊतकों (धारा 3) से SCCAs की निकासी के बाद हो जाएगा।
3. कार्बनिक एसिड निकासी
- प्री-लेबल नमूना ट्यूबों, प्रत्येक नमूना के लिए कम से कम एक ट्यूब की तैयारी कर निकाला जाता था।
- हटाये नमूने भंडारण से निकाला जा करने के लिए और बर्फ पर उन्हें जगह है, जबकि निकासी के लिए माल बाहर वजन।
- SCCA निकासी के लिए नमूने के 100 मिलीग्राम वजन।
- प्रत्येक नमूना वजन के बाद, एक साफ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब ऊतक हस्तांतरण। नमूना की राशि के रूप में संभव के रूप में लक्ष्य के करीब बड़े पैमाने पर परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए बाहर उपाय।
- , (नीचे 6.5.2 देखें) प्रत्येक नमूना मापा के द्रव्यमान का ट्रैक रखने के रूप में पहचान SCCAs की मात्रा का नमूना बड़े पैमाने का उपयोग कर सामान्य हो जाएगा।
- सभी नमूनों वजन के बाद, निष्कर्षण समाधान के 1 मिलीलीटर (wate जोड़नेआर + नमूना ट्यूबों में से प्रत्येक के 2.4 कदम से आंतरिक मानक मिश्रण)। (इस मामले में 100 ± 5 मिलीग्राम ऊतक के लिए 1 मिलीलीटर) ऊतक जन सब एक्सट्रेक्शन भर में एक ही करने के लिए निकासी के समाधान के अनुपात रखें। 10 सेकंड के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
- नमूने 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बैठने की अनुमति दें। इस समय के दौरान, 3.4 कदम के रूप में प्रत्येक ट्यूब हर 15 मिनट मिश्रण।
- निकासी के 1 घंटे के बाद, नमूने एक अंतिम समय मिश्रण है और एक microcentrifuge के लिए नमूना ट्यूबों हस्तांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र के नमूने, 10 मिनट के लिए 10,000 XG ठोस सामग्री (सेल दीवारों, बात कण, आदि) के वेग।
- तरल नमूने संसाधित करते समय,, आंतरिक मानक के उचित एकाग्रता जोड़ने के संक्षिप्त और सेंट्रीफ्यूज मिश्रण। centrifugation के बाद, ठोस नमूनों से निकालने को हूबहू तरल नमूने का इलाज।
- इस बात की पुष्टि की है कि वे पता लगाने किट में चल रहे बफर के पीएच रेंज के साथ संगत कर रहे हैं नमूनों की जाँच पीएच (कदम 4.6) या ईएमपी जा रहा प्रणाली बफरloyed। जैसा कि नमूना की मात्रा आम तौर पर काफी छोटे हैं, पीएच पीएच पेपर का उपयोग पर नजर रखी जा सकती है।
- सिरिंज घुड़सवार डिस्क फिल्टर (3.8) का उपयोग कर नमूने फिल्टर करने के लिए तैयार करें।
ध्यान दें: यह सुनिश्चित करना कि प्रत्येक फिल्टर सही ढंग से सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरित करने से पहले एक सिरिंज से जुड़ा हुआ है द्वारा नमूना नुकसान को रोकने के। एक डिस्क फिल्टर के लिए प्रत्येक नमूना (मानक वक्र नमूने सहित) का विश्लेषण किया जा करने के लिए के साथ सुसज्जित एक सिरिंज तैयार करें। - नमूने की centrifugation और सिरिंज फिल्टर की तैयारी के बाद, एक 3 मिलीलीटर 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ सुसज्जित सिरिंज के लिए प्रत्येक नमूने से सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण। प्रत्येक नमूना के लिए एक नया फिल्टर और सिरिंज का प्रयोग करें। मानक वक्र नमूने और बफर नियंत्रण, सीई सिस्टम पर चलने से पहले सहित सभी नमूने, फ़िल्टर।
- नमूना एक साफ microcentrifuge ट्यूब में सीधे फिल्टर। छानने के बाद, ट्यूब युक्त छानना को बंद करने और सिरिंज / फिल्टर तंत्र त्यागें।
- इसके तत्काल बाद छान नमूने रखेंSCCA का पता लगाने के लिए सीई प्रणाली में; 4 डिग्री सेल्सियस पर या दुकान के नमूने रात भर। नमूने रात भर संग्रहीत करने के लिए कर रहे हैं, गैस विनिमय और नमूना वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ ट्यूब सील।
- नमूनों को छानने के बाद एक दिन से अधिक समय संग्रहित किया जाना चाहिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन या फ्रीज में फ्लैश फ्रीज अर्क। विगलन के बाद, हालांकि, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना यदि आवश्यक हो तो वेग गठन और फिल्टर के लिए जांच की जाती है (3.6 कदम के रूप में)।
4. SCCA जांच भागो की स्थापना
- प्रोग्रामिंग और नियंत्रण सॉफ्टवेयर विशेष जानकारी के लिए सीई उपयोगकर्ता पुस्तिका से परामर्श करें।
- SCCA का पता लगाने के लिए केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) नमूना शीशियों तैयार करें। सुनिश्चित करें शीशियों ठीक से, लेबल साफ है, और दोष से मुक्त कर रहे हैं।
- धो और उपयोग करने से पहले सीई शीशियों की टोपियां सूखी।
- उन्हें ultrapure पानी में डूब गए हैं और उन्हें रात भर लेना करने की अनुमति देकर टोपी धो लें। टोपियां भिगोने के बाद, सोख त्यागनेसमाधान हैैं और ultrapure पानी के साथ दो बार अधिक टोपियां कुल्ला।
- स्थानांतरण के लिए एक साफ सुखाने सतह प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक के साथ लाइन में खड़ा करने के लिए टोपियां rinsed और उन्हें हवा शुष्क करने की अनुमति। सुनिश्चित करें टोपियां उपयोग करने से पहले पूरी तरह से सूखे दबाव विफलताओं से बचने के लिए कर रहे हैं।
- प्रत्येक सीई शीशी के लिए नमूने के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण, गलती से शीशी की गर्दन में नमूना splashing से बचने के लिए सावधान किया जा रहा। हस्तांतरण के बाद, प्रत्येक शीशी पर एक सीई टोपी रखें।
- ultrapure पानी का उपयोग कर सीई शीशी में सीधे 100: एक कमजोर पड़ने की जरूरत है, पतला कॉफी बीज के नमूने 1:10 या 1। 1 से अधिक dilutions के लिए: 100, एक मध्यवर्ती कमजोर पड़ने pipetting त्रुटियों से बचने के लिए पैदा करते हैं।
- सीई शीशियों के लिए 2.5 कदम से मानक वक्र समाधान (1.0 एमएल) के हस्तांतरण से प्रत्येक मानक वक्र बिंदु के लिए एक शीशी तैयार करें। हस्तांतरण के बाद प्रत्येक ट्यूब टोपी।
- एक बीकर में 90 मिलीलीटर ultrapure पानी से युक्त करने के लिए NaOH के 0.04 ग्राम जोड़कर और छर्रों टी की अनुमति देकर सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के एक 0.1 एम समाधान तैयारओ भंग। एक 100 मिलीलीटर फ्लास्क में 0.1 एम NaOH समाधान स्थानांतरण और 100 मिलीलीटर के लिए कुल मात्रा लाने के लिए।
- एक साफ सीई शीशी और टोपी के लिए 0.1 एम NaOH समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- नमूने के प्रत्येक बैच के लिए सीई बफर शीशियों को तैयार सीई सिस्टम पर चलाने के लिए। जुदाई किट उपलब्ध हैं या कस्टम बफ़र्स 13 का इस्तेमाल किया जा सकता है।
- बफर समाधान और टोपी शुरू के 1 मिलीलीटर के साथ 1 शीशी तैयार करें।
- 1 मिलीलीटर बफर समाधान और टोपी चल रहा से प्रत्येक के साथ तीन शीशियों तैयार करें। नमूने और मानक वक्र अंक के प्रत्येक बैच से पहले चल रहे बफर बदलें, या 35 नमूनों के बाद, जो भी पहले होता है।
- ultrapure पानी के 1 मिलीलीटर के साथ तीन अतिरिक्त शीशियों भरें और प्रत्येक शीशी टोपी।
- टोपी के साथ 1 खाली "बेकार" शीशी तैयार करें।
- शीशियों कदम 4.8 में वर्णित तैयार करने के बाद, केशिका वैद्युतकणसंचलन व्यवस्था के बफर ट्रे में buffers और पानी युक्त शीशियों, साथ ही कचरे शीशियों (कदम 4.8.2-5 से) लोडमंदिर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 15। ध्यान से ऑटो पारखी प्रोग्रामिंग के लिए प्रत्येक शीशी की स्थिति पर ध्यान दें।
- मानक वक्र अंक युक्त शीशियों लोड और निर्माता के निर्देशों के रूप में वर्णित नमूने युक्त शीशियों, इनलेट नमूना ट्रे में यत्न किया जाएगा। नोट ऑटो पारखी प्रोग्रामिंग के लिए प्रत्येक शीशी की स्थिति (कदम नीचे 4.11.1 देखें)।
- कंडीशनिंग और नमूना जुदाई तरीकों (इन कार्यक्रमों के लिए टेबल्स 1 और 2, क्रमशः में प्रदान की जाती हैं) तैयार करें, और साधन ऑपरेटिंग निर्देश के अनुसार एक नमूना अनुक्रम फ़ाइल लिखें। जुदाई विधि तालिका 2 में विस्तृत उपयोग: 0.2 मिनट के लिए सर्जक (20 साई) के साथ स्तंभ कुल्ला; 0.5 मिनट के लिए त्वरक (20 साई) से कुल्ला, 12 मिनट के लिए 20 केवी पर 0.09 मिनट के लिए स्तंभ पर नमूने (0.5 साई) इंजेक्षन, अलग नमूने, 0.5 मिनट के लिए NaOH (20 साई) से कुल्ला, और अंत में पानी से कुल्ला ( 20 साई) 0.5 मिनट के लिए।
- यूएसआईएनजी सीई नियंत्रण सॉफ्टवेयर, (यानी, worklist; एक सूची जिस क्रम में नमूनों का विश्लेषण किया जाएगा ब्यौरा फ़ाइल, और विधि प्रत्येक नमूना अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) के बारे में नमूना चल अनुक्रम "अनुक्रम" स्प्रेडशीट इंटरफ़ेस का उपयोग कर। स्प्रेडशीट पर प्रत्येक पंक्ति एक नमूना रन के अनुरूप है और एक एकल डेटा फ़ाइल का उत्पादन होगा।
- सुनिश्चित करें कि जब अनुक्रम फ़ाइल लेखन, नमूने नमूना ट्रे में सही स्थिति का उपयोग पहचाने जाते हैं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक डेटा फ़ाइल पिछले फ़ाइलों को अधिलेखित करने से सॉफ्टवेयर को रोकने के लिए एक अनूठा नाम है। कार्यक्रम सीई अनुक्रम नमूना जुदाई विधि युक्त रन करने से पहले एक अलग दृश्य के रूप में केशिका कंडीशनिंग रन।
- नमूना अनुक्रम मानक वक्र समाधान के साथ चलाने के लिए, SCCA नमूने के द्वारा पीछा शुरू, और मानक वक्र के समाधान के लिए एक दूसरे रन के साथ खत्म होता है। यह किसी भी संकेत हानि नमूना विश्लेषण के दौरान होने वाली की डिग्री प्राप्त की एक गणना के लिए अनुमति देगा। </ राजभाषा>
- यूएसआईएनजी सीई नियंत्रण सॉफ्टवेयर, (यानी, worklist; एक सूची जिस क्रम में नमूनों का विश्लेषण किया जाएगा ब्यौरा फ़ाइल, और विधि प्रत्येक नमूना अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) के बारे में नमूना चल अनुक्रम "अनुक्रम" स्प्रेडशीट इंटरफ़ेस का उपयोग कर। स्प्रेडशीट पर प्रत्येक पंक्ति एक नमूना रन के अनुरूप है और एक एकल डेटा फ़ाइल का उत्पादन होगा।
तालिका 1: कंडीशनिंग विधि केशिका के माध्यम से लघु श्रृंखला कार्बोक्जिलिक एसिड अलग होने के लिए केशिका तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया कार्यक्रम एक वैद्युतकणसंचलन।
तालिका 2: जुदाई विधि लघु श्रृंखला कार्बोक्जिलिक एसिड विश्लेषण करने के लिए के माध्यम से केशिका एक वैद्युतकणसंचलन इस्तेमाल किया कार्यक्रम।
5. SCCA जांच भागो निष्पादन और डाटा संग्रह
- केशिका कंडीशनिंग रन आरंभ करें। केशिका दो या तीन बार हालत पहले स्तंभ नमूना अलग होने के लिए तैयार है की उम्मीद है। कॉलम कंडीशनिंग के रूप में तालिका 1 में वर्णित किया जाना चाहिए। संक्षेप में, 1 मिनट के लिए 0.1 एम NaOH (20 साई) के साथ स्तंभ कुल्ला पानी (20 साई) के लिए से कुल्ला1 मिनट, अंत में 0.5 मिनट के लिए सर्जक (20 साई), 10 मिनट के लिए 30 केवी पर 0.5 मिनट, अलग त्वरक के लिए त्वरक (20 साई) के साथ rinsed से कुल्ला 0.5 मिनट के लिए 0.1 एम NaOH (20 साई) के साथ स्तंभ कुल्ला, और 0.5 मिनट के लिए पानी (20 साई) के साथ स्तंभ कुल्ला।
- केशिका प्रत्येक नमूना क्रम को चलाने के लिए पूर्व शर्त है। जुदाई वोल्टेज रखकर उचित कंडीशनिंग पाना रन के दौरान स्थिर और photodiode सरणी का पता लगाने पर एक फ्लैट आधारभूत मना रहा है।
- कंडीशनिंग के बाद, (यानी, पर क्लिक करके) सॉफ्टवेयर में "नियंत्रण" मेनू खोलने और चयन करके नमूना जुदाई आरंभ "चलाने के अनुक्रम।" photodiode सरणी (पीडीए) का पता लगाने पर नजर रखने के लिए उचित जुदाई सुनिश्चित करने के लिए।
- पहले पता लगाने का निरीक्षण करें और यह सुनिश्चित करने के लिए एक फ्लैट आधारभूत है और सफाई से सुलझाया (आधारभूत संकल्प) कि, व्यक्ति एसिड चोटियों। अधिक भरी हुई नमूने लंबे शिखर पूंछ, या चोटी पीछा दिखाई देगा, और (चित्रा 1) पतला करने की आवश्यकता होगी।
चित्रा 1:। पीडीए की तुलना से एक अतिभारित नमूना पर प्रकाश डाला निशान analyte एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में, अलग-अलग चोटी ज्यामिति विषम बनने के लिए शुरू कर सकते हैं। (क) 0.05 मिलीग्राम / एमएल, एसिटिक एसिड एक अच्छी तरह से परिभाषित, द्विपक्षीय सममित शिखर प्रस्तुत करता है। एसिटिक एसिड बढ़ जाती है की एकाग्रता के रूप में (ख) 0.07 मिलीग्राम / एमएल और (ग) 0.10 मिलीग्राम / एमएल, एक चोटी पूंछ रूपों (तीर)। इस शिखर पीछा एक अच्छा संकेत है कि नमूना ओवरलोड है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- अनुक्रम रन के समापन पर, डेटा फ़ाइलों सीई विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक समय में एक खोलने के लिए और चोटियों को एकीकृत।
- नमूना चोटियों एकीकृत।
- पहली फ़ाइल खोलेंऔर रन (जहां वोल्टेज, और इसलिए स्तंभ प्रवाह की दिशा, 1 टेबल में वर्णित के रूप में उलटा है) के पहले 3 मिनट के बाहर करने के लिए स्वत: एकीकरण कदम निर्धारित किया है। एक ही मेनू में, 50 इकाइयों की एक न्यूनतम शिखर चौड़ाई और 100 इकाइयों (या निर्माता की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स) के शिखर क्षेत्र के लिए चोटी के चयन के मापदंड निर्धारित है, चयनात्मकता के एक मध्यम उच्च स्तर प्रदान करने के लिए पता लगाने में पृष्ठभूमि शोर से एसिड चोटियों अलग।
- स्वयं एक पीडीए का पता लगाने के लिए उचित चोटी एकीकरण सुनिश्चित करने के लिए पीक चौके और आधार रेखा की जाँच करें। अनुचित तरीके से एकीकृत चोटियों (यानी, एक थोड़ा विषम SSCâ शिखर कि स्वचालित सॉफ्टवेयर द्वारा दो अलग-अलग चोटियों के रूप में एकीकृत किया गया है) किया जा मैन्युअल फिर से एकीकृत करने की आवश्यकता होगी।
- नमूना चोटियों एकीकृत।
- एकीकरण के बाद, प्रतिशत क्षेत्र रिपोर्ट देखने, तब प्रकाश डाला और प्रतिशत क्षेत्र की रिपोर्ट को कॉपी और यह एक अलग स्प्रेडशीट में पेस्ट करें। प्रत्येक नमूना भरा रन शिखर repor का निर्माण करने के लिए दोहराएँप्रत्येक पंक्ति एक भी चोटी का प्रतिनिधित्व करने के साथ टी (यानी।, प्रत्येक चोटी एक भी यौगिक यदि जुदाई में अच्छी तरह से काम कर रहा है को शामिल करना चाहिए)।
6. डेटा विश्लेषण
- स्प्रेडशीट में (5.4) निर्माण का उपयोग कर विश्लेषण के लिए डेटा तैयार करें। , मानक वक्र बिंदुओं में से प्रत्येक के लिए एसिड मानकों लेबलिंग आंतरिक मानक सहित द्वारा विश्लेषण शुरू।
- कि नमूने में आंतरिक मानक की अवधारण समय से नमूने में प्रत्येक चोटी के लिए अवधारण समय विभाजित करके प्रत्येक चोटी के लिए एक अवधारण सूचकांक की गणना। डेटा प्रतिधारण जिसके परिणामस्वरूप सूचकांक द्वारा निर्धारित प्रत्येक नमूने में ब्याज की चोटियों की पहचान के आधार पर क्रमबद्ध।
- ब्याज की प्रत्येक एसिड के लिए चोटी की पहचान करने के बाद, बाहरी मानक वक्र अंक का उपयोग कर प्रत्येक एसिड के लिए मानक घटता का निर्माण।
- Xa पर SCCA मानकों के प्रत्येक एकाग्रता के लिए चोटी के क्षेत्र का निर्धारण, और साजिश रचने एकाग्रता से प्रत्येक SCCA मानक के लिए एक मानक (एकाग्रता) वक्र उत्पन्नXis बनाम y अक्ष पर चोटी के क्षेत्र। प्रत्येक SCCA मानक वक्र के लिए रेखीय प्रतिगमन प्लॉट और ढलान समीकरण को परिभाषित (y = mx + b)।
- सुनिश्चित करें कि रेखीय प्रतिगमन के आर 2 मूल्यों 0.90 या अधिक कर रहे हैं के रूप में quantifications सबसे सही मानक वक्र के रैखिक सीमा में प्रदर्शन कर रहे हैं।
- एक नमूना शिखर क्षेत्र और मानक वक्र (ऊपर 6.3.2 में गणना) के रेखीय प्रतिगमन लाइन के लिए ढाल समीकरण का उपयोग में एक भी SCCA के लिए एसिड एकाग्रता की गणना। संक्षेप में, कि एसिड के मानक वक्र के लिए प्रतिगमन लाइन की ढलान से एक दिया एसिड के लिए मनाया शिखर क्षेत्र को विभाजित।
- आंतरिक मानक (कदम 6.5) का उपयोग प्रसंस्करण के दौरान नमूना घटाने के लिए कदम 6.4 में गणना कच्चे एकाग्रता मान सही।
- आंतरिक मानक का उपयोग कर प्रत्येक नमूने के लिए सुधार कारक की गणना।
- (यानी, kno आंतरिक मानक के वास्तविक एकाग्रता फूट डालोWN राशि नमूने में आंतरिक मानक (मनाया मूल्य द्वारा प्रयोग की शुरुआत में जोड़ा) यानी, राशि आंतरिक मानक के लिए मानक वक्र के ढलान समीकरण उपयोग कर की गणना)। इस सुधार के पहलू से नमूने में प्रत्येक SCCA के कच्चे एकाग्रता मूल्यों गुणा करें।
- नमूना मास में किसी भी बदलाव के लिए सही करने के लिए निकासी के लिए इस्तेमाल नमूना के द्रव्यमान से SCCA एकाग्रता को सही आंतरिक मानक फूट डालो। इस गणना (एमजी SCCA प्रति मिलीग्राम इस उदाहरण में जमीन कॉफी), जो तब दिए गए अध्ययन के लिए उपयुक्त इकाइयों (मिलीग्राम / मिलीग्राम, एमजी / जी के लिए परिवर्तित किया जा सकता है, जी / जी, आदि के नमूने के प्रति जन analyte की राशि पैदावार )।
- SCCA सांद्रता की गणना के बाद (या तो बड़े पैमाने पर [ठोस या तरल नमूने के लिए] या मात्रा [तरल नमूने के लिए] के लिए सामान्यीकृत), प्रयोगात्मक डिजाइन और ब्याज के सवालों की मांग के अनुसार सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इन मूल्यों का उपयोग करें।
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक हरी कॉफी के बीज की SCCA सामग्री पर बीज उपचार के प्रभाव को मापने के लिए उपयोग किया गया है। इस प्रयोग में, छह उपचार थे: Leuconostoc की एक संतृप्त माइक्रोबियल निलंबन अपनी मध्यम विकास में तनाव GCP674 pseudomesenteroides (1), पानी में GCP674 रोगाणुओं का एक जलीय निलंबन (2), एसिटिक और लैक्टिक एसिड (0.15 और 0.4 का एक जलीय समाधान मिलीग्राम क्रमश / एमएल) (3), एक बिताया एम 1 मध्यम विकास उपचार (4), DH 2 हे पानी (5), और एक संयुक्त राष्ट्र के इलाज नियंत्रण (कोई पदार्थ के बीज को जोड़ा गया) (6)। उपचार आवेदन किया है और 24 घंटे के लिए उबाल अनुमति दी गई। चार स्वतंत्र प्रतिकृति प्रत्येक उपचार के लिए मूल्यांकन किया गया। विश्लेषण के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में वसीय अम्ल का उपयोग कर साइट्रिक (सी), सेब (एम), एसिटिक (ए) और लैक्टिक (एल) एसिड के स्तर के लिए आयोजित किया गया।
प्रत्येक SCCA और आंतरिक मानक, मानक घटता फैले टी के लिएवह सांद्रता की सीमा कॉफी नमूने (5, 10, 20, 40, 60, और 80 एनजी / μl) उत्पन्न किया गया में होने की भविष्यवाणी की। जैसी कि उम्मीद थी, प्रत्येक एसिड साइट्रिक एसिड, मैलिक एसिड के लिए 0.9987, एसिटिक एसिड के लिए 0.9998, और लैक्टिक एसिड के लिए 0.9999 के लिए .9876 के आर चुकता मूल्यों के साथ इस एकाग्रता रेंज के लिए एक रेखीय प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया। आंतरिक मानक (वसीय अम्ल) भी इस एकाग्रता रेंज पर एक रेखीय प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया .9984 के एक आर चुकता मूल्य उपज। पहले नमूने के लिए विश्लेषण, का पता लगाने (लोद) और quantitation की सीमा (LOQ) की सीमा प्रत्येक SCCA और आंतरिक मानक (वसीय अम्ल) के लिए निर्धारित किया गया है। साइट्रिक, सेब, एसिटिक, और वसीय अम्ल का पता लगाने की सीमा 1 एनजी / μl था; और लैक्टिक एसिड के लिए लोद 2 एनजी / μl था। साइट्रिक, वसीय, एसिटिक, और लैक्टिक एसिड के quantitation की सीमा 4 एनजी / μl था; और मैलिक एसिड के लिए LOQ 2 एनजी / μl था। प्रतिशत वसूली SCCAs और वसीय अम्ल की गणना करने के लिए, कॉफी व्यक्ति SCCAs या वसीय अम्ल और processe के साथ नुकीला थाडी प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित का उपयोग कर। प्रतिशत वसूली उसके बाद निम्न सूत्र का उपयोग करके गणना की गई (- x 100 [नुकीला नमूना {बफर + SCCA / वसीय अम्ल कील का विश्लेषण करके उत्पन्न} की गणना की एकाग्रता की / सैद्धांतिक शिखर क्षेत्र {शिखर क्षेत्र नियंत्रण नमूना शिखर क्षेत्र नमूना नुकीला}]) । इस विधि का प्रयोग, हम ± साइट्रिक एसिड, मैलिक एसिड के लिए ± 1.15 98.35%, ± एसिटिक एसिड के लिए 3.07 91.94%, ± लैक्टिक एसिड के लिए 1.48 97.42%, और वसीय अम्ल के लिए 100.19% ± 2.57 के लिए 12.66 106.08% का प्रतिशत वसूली के गणना की थी।
विधि का सटीक निर्धारण करने के लिए, माप के अंतर और अंतर-दिन परिवर्तनशीलता का उपयोग कर CZE भी गणना की गई बनाया है। इंट्रा-डे में परिवर्तनशीलता का निर्धारण करने के लिए, प्रत्येक SCCA और वसीय अम्ल के नमूने एक 24 घंटे की अवधि में पांच बार एक भी कॉफी नमूना से मापा गया, और परिवर्तनशीलता के गुणांक (COV; शिखर क्षेत्र [या एकाग्रता] में मानक विचलन विभाजित करके गणना foआर प्रत्येक SCCA औसत चोटी प्रत्येक परिसर के लिए) क्षेत्र [या एकाग्रता] कि SCCA के लिए, और फिर 100 से गुणा करके परिणाम शिखर क्षेत्र का उपयोग कर की गणना की गई। आंतरिक मानक का उपयोग कर नमूने को सही करने के महत्व का आकलन करने के लिए, प्रत्येक SCCA के लिए विचरण के गुणांक भी प्रत्येक SCCA की सांद्रता एक आंतरिक मानक के रूप में वसीय अम्ल उपयोग कर की गणना का उपयोग कर की गणना की गई। जैसी कि उम्मीद थी, CZE विधि ठीक SCCAs और वसीय अम्ल को मापने के लिए, साइट्रिक एसिड के लिए 3.02% की COVs साथ, मैलिक एसिड के लिए 2.64%, एसिटिक एसिड के लिए 3.74%, और वसीय अम्ल के लिए 2.01% सक्षम था (लैक्टिक एसिड लोद नीचे था / सभी कॉफी के नमूनों के लिए LOQ मापा जाता है)। इन मापों एक पांच दिन की अवधि भर में दोहराया गया है, और सीवी साइट्रिक एसिड के लिए 2.11-5.25%, मैलिक एसिड के लिए 2.01-5.32%, एसिटिक एसिड के लिए 1.72-3.74%, और वसीय अम्ल के लिए 1.26-3.82% से लेकर। जब शिखर क्षेत्रों आंतरिक मानक का उपयोग कर सही और गणना SCCA की सांद्रता COVs गणना करने के लिए प्रयोग किया गया था, अंतर दिन COVs लेकर चROM साइट्रिक एसिड के लिए 1.08-4.17%, मैलिक एसिड के लिए 1.47-3.40%, और एसिटिक एसिड के लिए 2.68-5.10%। अंतर-दिन परिवर्तनशीलता का आकलन करने के लिए, एक भी कॉफी नमूने में SCCAs एक पांच दिन की अवधि में प्रति दिन एक बार मापा गया। इस प्रयोग तो प्रत्येक SCCA और वसीय अम्ल के लिए पांच बार दोहराया गया था। प्रत्येक SCCA के लिए COV तो उस SCCA के लिए औसत शिखर क्षेत्र (या एकाग्रता) द्वारा प्रत्येक SCCA के लिए शिखर क्षेत्र (या एकाग्रता) में मानक विचलन को विभाजित और 100 से गुणा करके गणना की गई आंतरिक का उपयोग कर सही करने के लिए नमूने के महत्व का आकलन करने के लिए स्टैंडर्ड, COVs भी प्रत्येक SCCA की सांद्रता एक आंतरिक मानक के रूप में वसीय अम्ल उपयोग कर की गणना का उपयोग कर की गणना की गई। CZE विधि मज़बूती SCCA माप पुन: पेश करने के लिए, साइट्रिक एसिड के लिए 5.24-10.02%, मैलिक एसिड के लिए 6.55-9.47%, एसिटिक एसिड के लिए 7.67-8.63%, और वसीय अम्ल के लिए 3.08-6.57% से लेकर COVs के साथ कर रहा था। जब शिखर क्षेत्रों आंतरिक मानक का उपयोग कर सही और गणना SCCA की सांद्रता थे सीए करने के लिए इस्तेमाल किया गयाlculated COVs, अंतर-दिन COVs साइट्रिक एसिड के लिए 4.56-6.23%, मैलिक एसिड के लिए 3.39-4.99%, और एसिटिक एसिड के लिए 9.5-10.94% से लेकर।
चित्रा 2: उदाहरण पीडीए निशान चोटियों के साथ संकेत दिया ग्रीन कॉफी के नमूनों सीई शीशियों में लोड करने से पहले पतला 1:10 थे।। ब्याज की एसिड संकेत कर रहे हैं। एसिटिक एसिड (ए), साइट्रिक एसिड (सी), लैक्टिक एसिड (एल), मैलिक एसिड (एम) और आंतरिक मानक, वसीय अम्ल (है) इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा।
सांख्यिकीय विश्लेषण एक सामान्य रेखीय मॉडल (GLM) का उपयोग निर्धारित करने के लिए किया जाए या नहीं उपचार कार्बनिक अम्ल का स्तर बदल सुधारा एसिड सांद्रता पर आयोजित किया गया। एक मॉडल शामिल "इलाज" x "रन" (एक यादृच्छिक कारक के रूप में कोडित) implemen था GLM के लिए टेड। 95% विश्वास पर Tukey जोड़ो में तुलना परिवर्तन की दिशात्मकता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया।
उपचार हरी कॉफी में बदल SCCA सांद्रता। एसिटिक एसिड काफी कोई इलाज नियंत्रण (GLM, पी <0.0001) पर सभी उपचार में समृद्ध था।
। चित्रा 3: हरी कॉफी उपचार में उपचार के प्रभाव कार्बनिक अम्ल के स्तर पर हरी कॉफी (क) में साइट्रिक या मैलिक एसिड के स्तर पर कोई प्रभाव पड़ा। हालांकि, सभी उपचार काफी कोई इलाज नियंत्रण (GLM, पी <0.001) की तुलना में वृद्धि हुई (ख) एसिटिक एसिड का स्तर। एसिटिक एसिड स्तर में वृद्धि सूक्ष्म जीव + मध्यम उपचार के साथ सबसे बड़ी थे। पत्र में 95% से कम Tukey जोड़ो में तुलना से महत्वपूर्ण अंतर से संकेत मिलता है।e.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सबसे ज्यादा वृद्धि सूक्ष्म जीव + मीडिया इलाज है, जो (GCP674 में 0.5 बनाम 0.4 मिलीग्राम / छ कॉफी बनाम NT) 0.25 गुना वृद्धि हुई है में मनाया गया। ऐसा ही एक प्रवृत्ति लैक्टिक एसिड का स्तर में मनाया गया, हालांकि वे काफी अलग नहीं थे। कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन या ट्रैक (साइट्रिक एसिड और मैलिक) अन्य एसिड में रुझान रहे थे।
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Discussion
किसी भी विश्लेषणात्मक तकनीक के साथ के रूप में, वहाँ कई महत्वपूर्ण कारक है कि काफी गुणवत्ता और उत्पन्न आंकड़ों की विश्वसनीयता को प्रभावित कर सकते हैं। सबसे पहले, यह / फ्रीज पिघलना चक्र की एक न्यूनतम के साथ कुशलता से नमूने संसाधित करने के लिए महत्वपूर्ण है। दोहराया ठंड और विगलन प्रसंस्करण या विश्लेषण से पहले नमूना की रासायनिक संरचना का समझौता कर सकते हैं। दूसरा, यह लगातार और समान रूप से सभी नमूनों को इस प्रोटोकॉल के चरणों को लागू करने के लिए महत्वपूर्ण है। असंगत नमूना तैयार करने और हैंडलिंग से उत्पन्न होने वाली तकनीकी त्रुटियों को काफी उत्पन्न डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित है, और वृद्धि "शोर" SCCA माप में हो सकती है। उदाहरण के लिए, नमूना के बाद पीस के कण आकार की गति और SCCA निकासी की क्षमता प्रभावित होगी। इसलिए यह सुनिश्चित करना है कि नमूने एक वर्दी कण आकार के लिए भूमि रहे हैं महत्वपूर्ण है, के रूप में इस नमूने भर में निकासी दक्षता बनाए रखने और नमूना नमूना परिवर्तनशीलता को कम करने में मदद मिलेगी। सिमilarly, मानक समाधान, नमूना जनता का सही माप, और निकासी के समय से सावधान निगरानी (और सामान्य) की तैयारी के दौरान सही माप और pipetting और अधिक समान डेटा की पीढ़ी में परिणाम होगा। समय लेते हुए सावधानी से सामान्य करने के लिए, माप, और इन मानकों में से प्रत्येक अभिलेख आंकड़ों की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने और किसी भी प्रसंस्करण त्रुटियों जो उत्पन्न हो सकने के लिए डेटा की सटीक पद रन सुधार के लिए अनुमति देगा। तीसरा, यह चयन और एक उचित आंतरिक मानक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। अंतिम analyte एकाग्रता की गणना प्रत्येक नमूने में मनाया आंतरिक मानक के शिखर क्षेत्र के आधार पर सटीक सुधार पर काफी निर्भर करेगा। इस वजह से, यह महत्वपूर्ण आंतरिक मानक होना है कि दोनों सही और ठीक मापा जाता है; और आदर्श नमूना या अन्य यौगिकों के साथ सह Elute में स्वाभाविक रूप से घटित नहीं होना चाहिए। न केवल उचित चयन और सभी नमूनों में एक आंतरिक मानक के उपयोग को नियंत्रित करने के लिए शोधकर्ता सक्षम करता हैआर निकासी दक्षता में मतभेद की वजह से मनाया मेटाबोलाइट के स्तर में परिवर्तन; यह भी बहुत डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण और शिखर पहचान सरल करता है। अंत में, यह चोटी की पहचान और एकीकरण की प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए आवश्यक है। जबकि स्वचालित प्रसंस्करण एल्गोरिदम उपयोगी होते हैं, वे सही नहीं हैं। इस तकनीक द्वारा उत्पन्न डेटा एकीकरण की सटीकता पर निर्भर है, और निशान मैन्युअल एकीकरण की घटनाओं, विशेष रूप से चोटी चौके और आधार रेखा की परिभाषा की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए जाँच की जानी चाहिए।
एक: किसी भी विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के साथ के रूप में, यह स्थापित करने के लिए है कि यहाँ प्रस्तुत CZE विधि है महत्वपूर्ण है। सटीक: एक दिया SCCA वर्तमान की राशि का निर्धारण करने में सक्षम; ख। सटीक: reproducibly ही दिन के भीतर और विश्लेषण के कई दिनों के पार किए गए माप में SCCAs बढ़ाता करने में सक्षम; और सी। मजबूत: नमूने में SCCAs वर्तमान के सबसे उबरने में सक्षम विश्लेषण किया जा रहा है। प्रतिनिधि रेस में ऊपर दिखाया गया हैults, विधि यहाँ वर्णित सही नमूनों में SCCAs वर्तमान की मात्रा का निर्धारण करने में सक्षम है। सभी SCCAs मापा (साइट्रिक, सेब, एसिटिक, और लैक्टिक एसिड) और आंतरिक मानक (वसीय अम्ल) 0-80 एनजी / μl एकाग्रता रेंज में एक रेखीय प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया। इसके अतिरिक्त, LOQs और LODs इन अम्लों के लिए 2-4 एनजी / μl और 1-2 एनजी / μl, क्रमशः से बताया गया। विधि को भी सटीक था, SCCAs मापा और वसीय अम्ल आंतरिक मानक कम अंतर दिन परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन सभी के रूप में, सभी SCCAs के लिए शिखर क्षेत्र के 2.0-5.5% (या गणना की एकाग्रता के 1.0-5.2% के बीच) के बीच गिरने मापा। SCCA माप के अंतर-दिन परिवर्तनशीलता भी अपेक्षाकृत कम थी, मापा सभी SCCAs के लिए शिखर क्षेत्र (या गणना की एकाग्रता की 3.30-10.95% के बीच) की 3.05-10.10% के बीच गिरने। दिलचस्प है, एसिटिक एसिड के अपवाद के, जिस पर लगातार था या सभी कॉफी के नमूनों analyz में पता लगाने / मात्रा का ठहराव की सीमा के करीब के साथएड, वसीय अम्ल का उपयोग कर नमूने को सही करने के लिए एक आंतरिक मानक अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप और परिवर्तनशीलता के गुणांक में कमी (प्रतिनिधि परिणाम देखते हैं, ऊपर) में हुई है। इन आंकड़ों से पहले प्रकाशित परिणामों एक आंतरिक मानक के साथ कि सुधार के संकेत के साथ संगत कर रहे हैं समय 16 से अधिक का विश्लेषण करती है सीई में परिशुद्धता बनाए रखने में आवश्यक है। कुछ तरीकों के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में अकार्बनिक आयनों कार्यरत है, जबकि हमने महसूस किया कि वसीय अम्ल CZE विधि के लिए एक अधिक उपयुक्त मानक यहां प्रस्तुत किया है, के रूप में यह एक कार्बनिक अम्ल है और इसलिए अधिक नमूना तैयार करने में हानि का अनुभव होने की संभावना है कि करने के लिए इसी तरह के कदम था नमूने में ब्याज की SCCAs से अनुभव किया। वसीय अम्ल कॉफी के नमूनों में उपस्थित नहीं होने का अतिरिक्त लाभ जांच की जा रही थी, इस अध्ययन में SCCAs के लिए इस्तेमाल एक ही सांद्रता भर में एक रेखीय प्रतिक्रिया का प्रदर्शन, प्रदर्शन अपेक्षाकृत कम लोद / LOQ मूल्यों (1 एनजी / μl और 4 एनजी / μl, क्रमशः), एककॉफी मैट्रिक्स से दा उच्च प्रतिशत वसूली (± 2.57 100.19%), यह कॉफी के नमूनों में SCCAs बढ़ाता के लिए एक उपयोगी मानक बना रही है। दिलचस्प है, उच्च प्रतिशत वसूली वसीय अम्ल के लिए मनाया इस अध्ययन में मापा सभी कार्बनिक अम्ल, जो 91.94-106.08% से लेकर प्रतिशत वसूली मूल्यों का प्रदर्शन के लिए प्राप्त किया गया था। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि यहाँ प्रस्तुत CZE विधि कॉफी के नमूनों में SCCAs वर्तमान के सबसे उबरने में सक्षम है।
नया नमूना प्रकार के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल प्रारंभिक आंकड़ों के संग्रह, साहित्य या अनुभवजन्य साक्ष्य के आधार पर, लक्षित analytes की उम्मीद मात्रा के विषय में की आवश्यकता है। इस जानकारी में मदद मिलेगी प्रयोगात्मक डिजाइन, नमूना तैयार करने, और मानक वक्र निर्माण गाइड। सही नमूना कमजोर पड़ने का निर्धारण का उपयोग करने के लिए आसानी से एक परीक्षण निकालने के कमजोर पड़ने श्रृंखला चल रहे एक उचित काम कमजोर पड़ने मिल द्वारा अनुभव से पूरा किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया थाSCCAs उदाहरण के परिणामों में उल्लिखित है, लेकिन यह आसानी से इस तरह जुदाई वोल्टेज, दबाव, या समय के रूप में जुदाई मापदंडों बदलकर अन्य SCCAs का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह याद रखना महत्वपूर्ण है, तथापि, कि जुदाई के मापदंडों में फेरबदल रन है कि जुदाई buffers की एक भी सेट पर पूरा किया जा सकता है, क्योंकि इन बफ़र्स उपयोग के साथ नीचा की संख्या बदल सकता है। आधारभूत गिरावट या वर्तमान में परिवर्तन अक्सर पर इस्तेमाल किया / समाप्त buffers की अभिव्यक्ति कर रहे हैं। चल बफर की जगह और केशिका reconditioning अक्सर इन समस्याओं को हल कर सकते हैं। बढ़ाया उपयोग के बाद, analytes को हल करने के लिए केशिका की क्षमता के रूप में अच्छी तरह से कम हो जाएगा। आधारभूत स्थिरता, अवधारण समय में भारी परिवर्तन, और कम शिखर संकल्प में कमी सभी संकेत हैं कि केशिका के लिए जगह की जरूरत हो सकती है। यह भी एक बीमार ढाले शीशी टोपी या एक दोषपूर्ण शीशी के कारण नमूना शीशी और केशिका के बीच अनुचित सीलिंग से उत्पन्न दबाव त्रुटि प्राप्त करने के लिए संभव है। सुनिश्चित करेंटोपियां नमूना शीशियों में snugly फिट इस त्रुटि को रोकने के लिए।
परंपरागत रूप से, इस तरह के जीसी एमएस, जीसी खूंटी, या एचपीएलसी के रूप में chromatographic तरीकों matrices की एक विस्तृत श्रृंखला, हवा, पानी, मिट्टी, और संयंत्र के नमूने 14 सहित SCCAs पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। जबकि प्रभावी, इन तरीकों में एक बड़ी खामी का पता लगाने से पहले SCCAs derivatize करने की जरूरत है। Derivatization खतरनाक अभिकर्मकों पता लगाने की सीमा अक्सर derivatization प्रतिक्रिया 13,14 की दक्षता से प्रभावित होता है उपयोग करता है। CZE के माध्यम से गैर-derivatized SCCAs का पता लगाने के प्रसंस्करण के दौरान analyte हानि, खतरनाक derivatizing एजेंटों से संपर्क बचा जाता है, और नमूना तैयार करने के लिए समय कम कर देता है। इन लाभों को उच्च प्रतिशत वसूली दर (91.94-106.08% के बीच) सभी SCCAs इस अध्ययन में मापा के लिए गणना में देखा जा सकता है। इसके अलावा, SCCAs की मात्रा का ठहराव CZE रेंज ओ में जीसी एमएस, जीसी खूंटी, और एचपीएलसी के लिए साहित्य में रिपोर्ट उन लोगों के बराबर का पता लगाने की सीमा है, को प्राप्त होता हैअरब 13,14 प्रति भागों में प्रति दस लाख च भागों। जब उच्च गति रन बार, उच्च संकल्प जुदाई शक्ति के साथ संयुक्त, सीधे आगे नमूना प्रसंस्करण विश्लेषण के इस विधि द्वारा नियोजित प्रोटोकॉल, संवेदनशीलता और CZE की सुविधा के लिए यह पारंपरिक जीसी या एचपीएलसी के तरीकों के लिए एक आकर्षक विकल्प हैं।
हालांकि, यह ध्यान दें कि, जबकि CZE खत्म जीसी एमएस एचपीएलसी कई लाभ प्रदान करता है, या नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस आधारित SCCA विश्लेषण के तरीकों महत्वपूर्ण है, यह सभी के लिए SCCA विश्लेषण उचित नहीं है। उदाहरण के लिए, CZE विधि यहाँ वर्णित spectrophotometric का पता लगाने पर पूरी तरह से निर्भर करता है के बाद से, यह नमूना, या बड़े पैमाने पर वर्णक्रम की रूपरेखा के माध्यम से SCCA पहचान की पुष्टि में मौजूद अज्ञात SCCAs की पहचान के लिए अनुमति नहीं है। इस वजह से, जीसी एमएस या नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस के तरीकों बेहतर अनुकूल SCCA के लिए अज्ञात SCCAs की बड़ी संख्या, या नमूने जिसमें यह मौजूद सभी SCCAs की पहचान की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें नमूनों में विश्लेषण किया जाएगा।इसके अतिरिक्त, जैसा कि पहले बताया नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस आधारित विधियों का पता लगाने के निचले सीमा (LODs) -ओं औसत 0.05 माइक्रोग्राम के लिए / एमएल के लिए अनुमति नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस 17 बनाम 1 माइक्रोग्राम / CZE के लिए मिलीलीटर प्रस्तुत यहां-नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस SCCAs की मात्रा का ठहराव आधारित नमूने जिसमें SCCAs बहुत कम या मात्रा का पता लगाने में मौजूद हैं के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता पद्धति का उपयोग करके प्राप्त की।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल निष्कर्षण और संयंत्र के ऊतकों से कम श्रृंखला कार्बोक्जिलिक एसिड (SCCAs) की मात्रा का ठहराव पर केंद्रित है। इस तकनीक में दक्षता प्राप्त करने के अलग-अलग शोधकर्ता के लिए इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए दरवाजे खुल जाएगा। कार्यप्रणाली में केवल मामूली बदलाव के साथ इस तकनीक को सफलतापूर्वक नमूने और substrates की एक विविध आबादी में SCCAs के विश्लेषण में नियोजित किया गया है, खाद्य उत्पादों और ऊतकों के नमूनों से पर्यावरण पानी और मिट्टी के नमूने 8 को लेकर। इसके अतिरिक्त, रासायनिक प्रिंसिपलों अंतर्निहित के साथ परिचित पानेइस तकनीक के इस प्रोटोकॉल हालांकि इस तरह कार्बोहाइड्रेट या धातुओं 8,13 के रूप में अन्य यौगिकों के विश्लेषण का प्रयास करने की जरूरत ज्ञान के आधार के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करेगा। केशिका वैद्युतकणसंचलन के विश्लेषणात्मक लचीलापन यह प्रयोगात्मक आवेदनों की एक बहुत बड़ी संख्या के लिए उपयुक्त एक असाधारण शक्तिशाली उपकरण बनाती है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
- Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
- Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
- Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
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