Summary
Denne artikkelen presenterer en metode for påvisning og kvantifisering av organiske syrer fra plantemateriale ved hjelp av gratis sone kapillær elektroforese. Et eksempel på den potensielle anvendelsen av denne fremgangsmåten, å bestemme virkningene av en sekundær gjæring på organiske syrenivåer i kaffe frø, er gitt.
Abstract
Karboksylsyrer er organiske syrer inneholdende én eller flere terminal karboksylgruppe (COOH) funksjonelle grupper. Kortkjedede karboksylsyrer (SCCAs; karboksylsyrer inneholdende tre til seks karbonatomer), slik som malat og citrat, er kritisk for korrekt funksjon av mange biologiske systemer, hvor de funksjonerer i cellulær respirasjon og kan tjene som en indikator på celle helse. I mat, kan innhold av organisk syre ha betydelig innvirkning på smak, med økte SCCA nivåer som resulterer i en sur eller "syre" smak. På grunn av dette, fremgangsmåter for rask analyse av organiske syrenivåer er av spesiell interesse for næringsmiddelindustrien. Dessverre har imidlertid de fleste fremgangsmåter som benyttes for scca kvantifisering er avhengig tidkrevende protokollene krever derivatisering av prøver med farlige reagenser, fulgt av kromatografisk kostbare og / eller massespektrometrisk analyse. Denne metoden detaljer en alternativ metode for påvisning og kvantifisering av orgANIC syrer fra plantemateriale og matvarer prøver ved hjelp fri sone kapillær elektroforese (CZE), noen ganger bare referert til som kapillær elektroforese (CE). CZE gir en kostnadseffektiv metode for å måle SCCAs med lav deteksjonsgrense (0,005 mg / ml). Denne artikkelen detaljer utvinning og kvantifisering av SCCAs fra planteprøver. Selv om fremgangsmåten gitt fokuserer på måling av SCCAs fra kaffebønner, kan fremgangsmåten gitt anvendes på flere plante-baserte næringsmidler.
Protocol
1. Prøvepreparering
- Monter prøver for kort kjetting karboksylsyre (SCCA) ekstraksjon. Fremstille 1,0 g av kaffe frø ved en tid for å sikre at tilstrekkelig prøve vil være igjen etter behandlingen.
- Hvis prøvene ble frosset før maleprosessen, holde vevet frosset gjennom hele behandlingen for å hindre at fryse / tine-skade og prøven oksidasjon. Fjern prøven fra fryseren eller sub-null lagring bare etter behov for sliping.
- Flash fryse ferske prøver i flytende nitrogen umiddelbart før prøve sliping. For å minimalisere prøvehåndtering, flash fryse prøvene ved å plassere dem i en morter pre-fylt med flytende nitrogen.
- Analyser væskeprøver umiddelbart etter generasjon, eller flash fryse i flytende nitrogen og oppbevares ved -20 ºC eller -80 ºC til analyse. Før analyse fjerne frosne prøver fra lagring og la det tine. For væskeprøver videre til trinn (3,5) for behandling.
- Wear appromessig personlig verneutstyr (inkludert vernebriller, hansker og frakk) før du arbeider med flytende nitrogen.
- Trippel-malings vevsprøver til en ensartet fint pulver (dvs. med ensartet partikkelstørrelse) i flytende nitrogen ved hjelp av en keramisk morter og pistill.
MERK: Å oppnå en uniform partikkelstørrelse er avgjørende for å maksimere SCCA utvinning effektivitet.- Pre-chill morter og støter med flytende nitrogen før tilsetning av prøven. Hold mørtel fylt med et lite volum av flytende nitrogen når prøven tilsettes.
- Ved hjelp av en øse, legger nok flytende nitrogen til mørtelen helt dukke prøven.
- Legg lett malte prøver, slik som blader eller brent kaffe, til den flytende nitrogen og knuse ved hjelp av et sirkelslipebevegelse. Begynner å male prøver når det flytende nitrogen nivået har minsket til et punkt der det dekker bare knapt prøvene.
- Legg vanskelig å male prøver, slik ens rå kaffe frø, til flytende nitrogen og tillate dem å fryse for 10-30 sek (eller til flytende nitrogen slutter kraftig kokende) før sliping. Bryt vevet i mindre fragmenter ved hjelp av en vertikal knusing bevegelse, og sliping med sirkel sliping bevegelse deretter ferdig vev.
- Gjenta trinnene 1.3.2-1.3.4 to ganger til, slik at prøvene blir malt totalt tre ganger. Vanligvis vil tre påfølgende runder med sliping redusere prøver til et pulver med en mel-lignende konsistens.
- Hvis en mel-lignende konsistens ikke er oppnådd, gjentas trinnene 1.3.2-1.3.4 inntil prøvene er redusert til et pulver av ensartet liten partikkelstørrelse (ekstraksjonseffektiviteten er omvendt proporsjonal med partikkelstørrelse).
- Overfør pulver til glass, flasker eller 1,5 ml mikrosentrifugerør. Initiere nedstrøms behandling umiddelbart etter sliping (anbefales), eller lagre prøvene ved -80 ºC inntil prøvene er klare for utvinning.
- Hvis prøvene må lagres føranalyse, splitte prøven i 500 mg porsjoner (eller 500 ul porsjoner for væskeprøver) og delt mellom flere rør for lagring. Unngå å utsette prøvene til gjentatte fryse / tine sykluser, da disse kan endre prøven sammensetning og negativt påvirke fremtidige prøve målinger.
2. Organic Acid Standard Forberedelse
- Monter autentiske standarder for SCCAs av interesse. Disse vil bli brukt til å lage eksterne og interne standardløsninger for anvendelse ved bestemmelse SCCA konsentrasjoner. For kaffeprøvene inkluderer sitronsyre, eplesyre, eddiksyre og melkesyre som syrer av interesse og adipinsyre som indre standard.
- Sørge for at den interne standarden valgt ikke finnes naturlig i prøven, og at standarden ikke samtidig eluer med andre topper i prøve-profil.
- Kjør standardkurver for hver SCCA av interesse, og bestemme lineære responsområde for hver SCCA (se kapittel 4 for å kjøre instructions). Sørg for å kjøre standardkurver for hver SCCA å bli målt i prøven.
MERK: Standardkurver kan kjøres i enten buffer eller bakgrunnen av prøven som skal analyseres. I det andre tilfellet ( "standard tilsetning"), vil verdier for toppområdet av hver standardkurve punkt bestemmes ved å subtrahere bort bakgrunn av prøven. - Pre-label alle rør og glass som trengs med scca syre navn, konsentrasjon, og datoen for analysen.
- Fremstille stamløsninger for hver standard ved en kjent konsentrasjon (10 mg / ml) ved anvendelse av en volumetrisk kolbe for å sikre nøyaktighet under standard preparat.
- Oppløs faste SCCA standarder (sitronsyre og eplesyre) i ultrarent vann (18,2 Megohm) for å oppnå den ønskede for stamløsning konsentrasjon.
- Skape en 10 mg / ml stamløsning ved å tilsette 100 mg av standard til en 10 ml målekolbe. Fyll målekolbe til 10 ml tråd med ultrarent vann til dissolve syren.
- Skape en lavere konsentrasjon av syre standard eller forsiktig oppvarming av kolbene for å drive vanskelige å oppløse SCCA standarder, som adipinsyre, i løsning.
- Fortynne flytende fase syre standarder (eddiksyre og melkesyre) i ultrarent vann for å oppnå den ønskede konsentrasjon.
- Pre-fylle en målekolbe med 5 ml av ultrarent vann. Tilsett nok syre til å fremstille en 10 mg / ml oppløsning (beregnet ved anvendelse av syrevekten gitt av leverandøren) til kolben, og deretter legge til nok vann til å bringe det endelige volum av løsningen til 10 ml.
- Oppløs faste SCCA standarder (sitronsyre og eplesyre) i ultrarent vann (18,2 Megohm) for å oppnå den ønskede for stamløsning konsentrasjon.
- Overfør hver stamløsning til et rent 15 ml glassrør, med en polytetrafluoretylen (PTFE) foret hette, og forsegle med plastfilm parafin. Lagerløsninger kan lagres i forseglede rør ved 4 ° C i 1 uke.
- Sørg for at SCCA standardene ikke har skilt seg ut av løsningen før bruk hvis lagerløsninger har blitt nedkjølt etter FORBEREDELSERasjon. Drive utfellinger tilbake til løsning gjennom forsiktig oppvarming.
- Klargjør SCCA utvinning løsning. Omfatter den indre standard ved en konsentrasjon som er tilstrekkelig for deteksjon i prøvene (0,05 mg / ml). Forbered nok løsning for å trekke ut alle prøvene.
- Fremstille 50 ml scca ekstraksjon oppløsning ved fortynning av intern standardstamløsning til 0,05 mg / ml i ultrarent vann. Tilsett 250 ul av den indre standardløsning (10 mg / ml) til 49,75 ml vann.
- Hvis avtrekks må fortynnes, justere internstandardkonsentrasjon i ekstraksjonsløsningen, slik at sluttkonsentrasjonen vil falle innenfor grensene for kvantifisering (noe som gir en påvisbar, men ikke overmettet, topp, se 5.2.2 nedenfor) av CE-system etter fortynning (0,05 mg / ml).
- Forbered fersk utvinning løsning for hver serie med utdrag (dvs., for hver forsøksserie).
- Forbered standardkurve prøver(En serie av passende fortynninger) for SCCAs av interesse, ved hjelp av et minimum av minst 5 poeng. Standardkurven konsentrasjonene som blir anvendt må være i den lineære responsområde for en gitt scca, og spenner scca konsentrasjoner som forventes i prøvene.
- Omfatter den valgte indre standard i standardkurven løsninger for å tillate mengdebestemmelse av det indre standard i prøvene. Intern standard vil bli brukt til å hjelpe til med identifikasjon topp og beregning ekstraksjonseffektiviteten (seksjon 6).
- Fortynn hver scca til de konsentrasjonene som er fastsatt ovenfor (0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 mg / ml, se ovenfor, 2.4.2) i nye mikrosentrifugerør (en for hver konsentrasjon / standardkurve punkt) ved hjelp av ultrarent vann. Forbered 1 ml oppløsning for hver standardkurve konsentrasjon punkt. Sørg for at hver konsentrasjon punkt inneholder alle fire syre standarder og intern standard i riktig konsentrasjon.
- Forbered nye standardkurve poeng for hvert settprøver som skal kjøres på kapillær elektroforese system. Hold standardkurve SCCA prøver ved 4 ºC til analyse, som vil oppstå etter utvinning av SCCAs fra målet vev (seksjon 3).
3. Organic Acid Extraction
- Pre-label prøverør, forbereder det minste ett rør for hver prøve som skal ekstraheres.
- Fjern prøver å være hentet fra lagring og plassere dem på is mens veier ut materiale for utvinning.
- Vei opp 100 mg prøve for SCCA utvinning.
- Etter veiing av hver prøve, overføre vev til et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør. Mål opp en mengde av prøve som nær målet massen som mulig for å redusere variabilitet.
- Holde styr på massen av hver prøve måles, da mengdene av SCCAs oppdages vil bli normalisert ved hjelp av prøvemasse (se 6.5.2, nedenfor).
- Etter veiing alle prøvene, tilsett 1 ml utvinning løsning (water + intern standard blandingen fra trinn 2.4) til hvert av prøverørene. Holde forholdet for utvinning løsning vevsmasse den samme for alle ekstraksjoner (i dette tilfelle 1 ml til 100 ± 5 mg vev). Bland godt med vortex i 10 sek.
- Tillate prøvene å stå ved romtemperatur i 1 time. I løpet av denne timen, blande hvert rør hver 15 minutter som i trinn 3.4.
- Etter en time for utvinning, bland prøvene en siste gang og overføre prøverør til en mikro. Sentrifuger prøvene ved 4 ° C, til 10 000 xg i 10 minutter utfelles fast materiale (cellevegger, partikler, etc.).
- Ved behandling av væskeprøver, tilsett passende konsentrasjon av intern standard, bland kort og sentrifuger. Etter sentrifugering behandle væskeprøver identisk til utdrag fra faste prøver.
- Kontroller pH-verdien av prøvene for å bekrefte at de er kompatible med de pH-området av den rennende buffer i deteksjonssettet (trinn 4.6) eller buffersystemet er employed. Ettersom volumene av prøven er vanligvis ganske små, kan pH-verdien overvåkes ved hjelp av pH-papir.
- Forbered deg på å filtrere prøver ved hjelp av sprøytemontert skivefiltre (3,8).
MERK: Forhindre prøvetap ved å sikre at hvert filter er riktig festet til en sprøyte før du overfører supernatant. Fremstille en sprøyte utstyrt med et skivefilter for hver prøve som skal analyseres (inkludert standard kurve prøver). - Etter sentrifugering av prøvene og fremstilling av sprøytefiltre, overføre supernatanten fra hver prøve til en 3 ml sprøyte utstyrt med en 0,2 um sprøytefilter. Bruk et nytt filter og sprøyte for hver prøve. Filter alle prøvene, inkludert standard kurve prøver og buffer kontroller, før du kjører på CE-systemet.
- Filtrer prøven direkte inn i en ren mikrosentrifugerør. Etter filtrering lukke røret som inneholder filtratet og kast sprøyten / filterapparat.
- Umiddelbart filtrerte prøverinn i CE system for SCCA deteksjon; eller lagre prøvene ved 4 ° C over natten. Hvis prøvene skal lagres over natten, tette rørene med plast parafin film for å hindre gassutveksling og prøve fordampning.
- Hvis prøvene skal oppbevares lenger enn en dag etter filtrering, flash fryse ekstrakter i flytende nitrogen eller fryse ved -20 ºC. Etter tining imidlertid sørge for at hver prøve blir kontrollert for presipitatdannelse og filter om nødvendig (som i trinn 3.6).
4. Sette opp SCCA Detection Run
- Rådfør CE bruksanvisningen for programmering-og kontrollprogramvarespesifikke detaljer.
- Forbered kapillær elektroforese (CE) prøverør for SCCA deteksjon. Sørg ampuller er riktig merket, ren og fri for feil.
- Vask og tørk caps av CE hetteglass før bruk.
- Vask caps ved å senke dem i ultrarent vann og la dem suge over natten. Etter bløtlegging caps, kast sugeing og skyll lokkene to ganger mer med ultrarent vann.
- Overføring skylles caps til en ren tørking overflaten foret med klut som ikke loer, og la dem lufttørke. Sørg caps er helt tørre før bruk for å unngå trykk feil.
- Overfør 1 ml prøve til hvert CE hetteglass, være forsiktig for å unngå uhell plasket prøven inn i halsen på hetteglasset. Etter overføring, plassere en CE cap på hvert hetteglass.
- Hvis en fortynning er nødvendig, fortynne kaffe frøprøver 1:10 eller 1: 100 direkte i CE hetteglasset ved hjelp av ultrarent vann. For fortynninger på mer enn 1: 100, skape en mellom fortynning for å unngå pipettering feil.
- Forbered en ampulle for hver standardkurve punkt ved å overføre standardkurve løsninger (1,0 ml) fra trinn 2,5 til CE ampuller. Cap hvert rør etter overføring.
- Fremstille en 0,1 M løsning av natriumhydroksyd (NaOH) ved tilsetning av 0,04 g NaOH i et beger inneholdende 90 ml ultrarent vann, og slik at pellets to oppløses. Overfør 0,1 M NaOH-løsning til en 100 ml volumetrisk kolbe, og bringe det totale volum til 100 ml.
- Tilsett 1 ml 0,1 M NaOH-løsning til en ren CE ampulle og cap.
- Forbered CE buffer ampuller for hvert parti prøver som skal kjøres på CE-systemet. Separasjon Pakkene er tilgjengelig eller egendefinerte buffere kan brukes 13.
- Forbered en ampulle med 1 ml starter bufferløsning og cap.
- Forbered tre ampuller med 1 ml hver av buffer løsning og cap. Skift buffer før hvert parti av prøver og standardkurvepunkter, eller etter 35 prøver, avhengig av hva som inntreffer først.
- Fyll ytterligere tre ampuller med 1 ml ultrarent vann og cap hvert hetteglass.
- Forbered en tom "avfall" hetteglass med lokk.
- Etter å ha forberedt hetteglassene er beskrevet i trinn 4.8, laste ampuller som inneholder buffere og vann, samt avfall hetteglass (fra trinn 4.8.2-5) inn i bufferbrettet av kapillær elektroforese system, i henhold til produsentens instruksjoner 15. Legg nøye merke posisjonen til hvert hetteglass for auto-sampler programmering.
- Laste ampuller inneholdende standardkurvepunktene og ampuller inneholdende prøvene som skal analyseres inn i innløpsprøvebrettet, slik det er beskrevet i produsentens instruksjoner. Legg merke til plasseringen av hvert hetteglass for auto-sampler programmering (se trinn 4.11.1 nedenfor).
- Forbered condition og prøveseparasjonsmetoder (programmer for disse er gitt i tabell 1 og 2, henholdsvis), og skrive et eksempel sekvens fil som per instrument bruksanvisningen. Bruk separasjonsmetoden beskrevet i tabell 2: skylling av kolonnen med initiatoren (20 psi) i 0,2 min; skyll med akselerator (20 psi) i 0,5 min, injisere prøver (0,5 psi) på kolonnen for 0,09 min, separate prøver ved 20 kV i 12 minutter, skyll med NaOH (20 psi) i 0,5 min, og til slutt skylles med vann ( 20 psi) i 0,5 min.
- USIng CE kontroll programvare, skrive prøven kjører sekvens (dvs. arbeidsliste, en liste fil detaljering rekkefølgen prøvene vil bli analysert, og metoden som skal brukes for å skille hver prøve) å bruke "sekvens" regneark grensesnitt. Hver rad i regnearket vil tilsvare en prøve kjøre og produsere en enkelt datafil.
- Pass på at når du skriver sekvensen filen, blir prøvene identifisert ved hjelp av riktig posisjon i prøvetakings skuffen. Sørg for at hver datafil har et unikt navn for å hindre programvaren i å overskrive tidligere filer. Programmet CE-kapillære kondisjone løper som en separat sekvens forut for sekvensen løp inneholdende prøven separasjonsmetoden.
- Begynn prøven sekvensen kjøres med standardkurveløsninger, etterfulgt av SCCA prøver, og ender med en andre kjøring av standardkurven løsninger. Dette vil gi en beregning av graden av enhver signaltapet som oppstår under prøveanalyser. </ Ol>
- USIng CE kontroll programvare, skrive prøven kjører sekvens (dvs. arbeidsliste, en liste fil detaljering rekkefølgen prøvene vil bli analysert, og metoden som skal brukes for å skille hver prøve) å bruke "sekvens" regneark grensesnitt. Hver rad i regnearket vil tilsvare en prøve kjøre og produsere en enkelt datafil.
Tabell 1: Conditioning metode program som brukes til å forberede kapillær for kort kjetting karboksylsyre separasjon via kapillær elektroforese en.
Tabell 2: Separering metode program som brukes til analyser kortkjedede karboksylsyrer via kapillærelektroforese en.
5. SCCA Detection Run Execution og datainnsamling
- Initiere kapillær condition kjører. Forvent å pleie den kapillær to eller tre ganger før kolonnen er klar for prøveseparasjon. Kolonne kondisjonering bør utføres som beskrevet i Tabell 1. I korthet skylle kolonnen med 0,1 M NaOH (20 psi) i 1 min, skyll med vann (20 psi) i1 min, skyll med initiator (20 psi) i 0,5 min, renset med akselerator (20 psi) i 0,5 min, separate gasspedalen ved 30 kV i 10 minutter, skyll kolonne med 0,1 M NaOH (20 psi) i 0,5 min, og endelig skylling av kolonnen med vann (20 psi) i 0,5 min.
- Kondisjonere den kapillære før hver prøve sekvens løp. Oppnå riktig condition ved å holde separasjonen spenningen er konstant gjennom hele kjøringen og observere en flat baseline på fotodiode spor.
- Etter conditioning, starte prøveseparasjon ved å åpne "kontroll" menyen i programmet og velge (dvs. klikke på) "kjøre sekvens." Overvåk fotodioden array (PDA) spor for å sikre riktig separasjon.
- Observer første spor og sørge for at den har en flat baseline og renslig løst (baseline oppløsning), individuelle syretopper. Over belastede prøvene vil vise lenge rush haler, eller peak tailing, og må fortynnes (figur 1).
Figur 1:. En sammenligning av PDA spor er å fremheve en overbelastet prøve Som analyse konsentrasjonen øker, kan enkelte peak geometri begynner å bli asymmetrisk. Ved (a) 0,05 mg / ml, presenterer eddiksyre et veldefinert, bilateralt symmetrisk topp. Ettersom konsentrasjonen av eddiksyre øker til (b) 0,07 mg / ml og (c) 0,10 mg / ml, en topp hale former (piler). Denne toppen tailing er en god indikasjon på at prøven er overbelastet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Ved avslutningen av sekvensen løp, åpne datafiler én av gangen i CE analyse programvare og integrere toppene.
- Integrer prøve topper.
- Åpne den første filenog sette de automatiske integreringsfremgangsmåten for å utelukke den første 3 minutter av kjøringen (hvor spenningen, og derfor retningen av kolonnen strømnings, er invertert som beskrevet i tabell 1). I den samme menyen, sette peak utvalgskriterier til et minimum peak bredde på 50 enheter og toppareal på 100 enheter (eller produsentens standardinnstillinger) for å gi en moderat høy grad av selektivitet, skille sure topper fra bakgrunnsstøy i sporet.
- sjekke manuelt peak grenser og grunnlinjene for hver PDA spor for å sikre riktig peak integrering. Feilaktig integrerte topper (dvs. en litt asymmetrisk SSCA topp som har blitt integrert som to separate topper ved automatisert programvare) må re-integrert manuelt.
- Integrer prøve topper.
- Etter integrasjon, se prosent området rapport, deretter markere og kopiere prosent området rapporten og lim det inn i et eget regneark. Gjenta for hver prøve å konstruere en full gjennomgang peak REPORt med hver rad representerer en enkelt topp (f.eks., bør hver topp inneholde en enkelt forbindelse hvis separer fungerer bra).
6. Data Analysis
- Forbered data for analyse ved hjelp av regnearket bygget i (5.4). Begynn analyse ved å merke de sure standardene for hvert av standardkurvepunkter, inkludert den indre standard.
- Beregne en Etensjonsindeksen for hver topp ved å dele oppholdstiden for hver topp i prøven ved retensjonstiden for den indre standard i den prøven. Sortere datasettet ved den resulterende etensjonsindeksen for å identifisere toppene av interesse i hver prøve.
- Etter identifisering av toppen for hver syre av interesse, å konstruere standardkurver for hvert syre ved anvendelse av de eksterne standard kurvepunkter.
- Generer et standard (konsentrasjon) kurve for hver scca standard ved å bestemme topparealet for hver konsentrasjon av scca standarder, og plotte konsentrasjonen på xaXIS vs. topparealet på y-aksen. Plotte den lineære regresjon for hver scca standardkurve og definerer helningen ligning (y = mx + b).
- Sikre at R2-verdiene for de lineære regresjoner er 0,90 eller høyere som de quantifications blir mest nøyaktig utført i det lineære området av standardkurven.
- Beregn syrekonsentrasjonen for en gitt scca i en prøve ved hjelp av topparealet og skråningen ligningen for den lineære regresjonslinjen av standardkurven (beregnet i 6.3.2 over). I korthet, dele den observerte topparealet for en gitt syre med helningen av regresjonslinjen for at syren er standardkurve.
- Korriger rå konsentrasjonsverdier beregnet i trinn 6.4 for prøve tap under behandlingen ved hjelp av intern standard (trinn 6.5).
- Beregn korreksjonsfaktor for hver prøve ved å bruke den interne standard.
- Fordel den virkelige konsentrasjonen av den interne standard (dvs. den known mengde tilsatt ved begynnelsen av eksperimentet) ved den observerte verdien av den interne standard i prøven (dvs. den mengde beregnes ved bruk av ligningen helningen av standardkurven for den indre standard). Multipliser rå konsentrasjonsverdier for hver SCCA i prøven ved denne korreksjonsfaktor.
- Fordel den indre standard korrigerte scca konsentrasjon av massen av prøven som brukes for ekstraksjon for å korrigere for enhver variasjon i prøvemasse. Denne beregningen gir mengden av analytt pr masse av prøve (mg scca per mg malt kaffe i dette eksemplet), som deretter kan omdannes til de aktuelle enheter for en gitt studie (mg / mg, mg / g g / g, etc. ).
- Etter beregning SCCA konsentrasjoner (normalisert til enten massen [for faste eller flytende prøver] eller volum [for væskeprøver]), kan du bruke disse verdiene for statistisk analyse i henhold til kravene i eksperimentell design og spørsmål av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen har blitt brukt til å måle effekten av frø behandlinger på SCCA innholdet av grønne kaffe frø. I dette eksperimentet, de seks behandlinger var: en mettet mikrobiell suspensjon av Leuconostoc pseudomesenteroides belastning GCP674 i sitt vekstmedium (1), en vandig suspensjon av GCP674 mikrober i vann (2), en vandig oppløsning av eddiksyre og melkesyre (0,15 og 0,4 mg / ml) (3), en brukt M1 vekstmedium behandling (4), dH 2 O vann (5), og en ubehandlet kontroll (ingen substans tilsatt til frø) (6). Behandlinger ble påført og fikk gjære i 24 timer. Fire uavhengige replikater ble undersøkt for hver behandling. Analyse ble utført for sitronsyre (C), eplesyre (M), eddiksyre (A) og melkesyre (L) syre nivåer ved hjelp av adipinsyre som en intern standard.
For hver scca og den indre standard, standardkurver som strekker seg than konsentrasjonsområde anslått til å være i kaffeprøver (5, 10, 20, 40, 60, og 80 ng / ul) ble generert. Som forventet, hver syre oppviste en lineær respons for dette konsentrasjonsområde med R-kvadrerte verdier på 0,9876 til sitronsyre, 0,9987 for eplesyre, 0,9998 for eddiksyre, og 0,9999 til melkesyre. Den indre standard (adipinsyre) også oppviste en lineær respons over dette konsentrasjonsområde, noe som ga en R-kvadrert verdi på 0,9984. Før prøveanalyser, ble påvisningsgrenser (LOD) og grensene for kvantifisering (LOQ) for hver scca og den interne standard (adipinsyre). Påvisningsgrensen av sitronsyre, eplesyre, eddiksyre, og adipinsyre var 1 ng / ul; og LOD for melkesyren var 2 ng / ul. Grensen for kvantifisering av sitronsyre, adipinsyre, eddiksyre, melkesyre og var 4 ng / ul; og den LOQ for eplesyre var 2 ng / ul. For å beregne prosent utvinning SCCAs og adipinsyre, ble kaffe tilsatt individuelle SCCAs eller adipinsyre og processed ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor. Den prosentvise gjenvinning ble så beregnet ved hjelp av følgende formel ([{toppareal tilsatt prøve - toppareal kontrollprøve} / teoretisk toppareal av beregnede konsentrasjon av pigg prøven {genereres ved å analysere buffer + scca / adipinsyre pigg}] x 100) . Ved hjelp av denne metoden, vi beregnet prosent inngang på 106,08% ± 12,66 for sitronsyre, 98,35% ± 1,15 for eplesyre, 91,94% ± 3,07 for eddiksyre, 97,42% ± 1,48 til melkesyre, og 100,19% ± 2,57 for adipinsyre.
For å bestemme nøyaktigheten av fremgangsmåten, den intra- og inter-dag variasjon av målinger gjort ved hjelp CZE ble også beregnet. For å bestemme intra-dag variabilitet, ble prøver av hver scca og adipinsyre målt fra en enkelt kaffe prøve fem ganger over en 24-timers periode, og koeffisienter for variasjon (COV, beregnet som forholdet mellom standardavviket i toppareal [eller konsentrasjon] for hver scca av den gjennomsnittlige topparealet [eller konsentrasjon] for det scca, og deretter multiplisere resultatet med 100) for hver forbindelse ble beregnet ved hjelp av topparealet. For å vurdere betydningen av å korrigere prøver ved hjelp av den indre standard, ble koeffisienten av varians for hver scca også beregnet ved anvendelse av konsentrasjoner av hver scca beregnet ved hjelp av adipinsyre som en intern standard. Som forventet, CZE metoden var i stand til nøyaktig å måle SCCAs og adipinsyre, med COVs på 3,02% for sitronsyre, 2,64% for eplesyre, 3,74% for eddiksyre, og 2,01% for adipinsyre (melkesyre var under LOD / LOQ for alle kaffe prøvene målt). Disse målingene ble gjentatt over en fem-dagers periode, og CV-ene varierte 2,11 til 5,25% av sitronsyre, 2,01 til 5,32% for eplesyre, 1,72 til 3,74% for eddiksyre, og 1,26 til 3,82% for adipinsyre. Når topparealene ble korrigert ved hjelp av intern standard og er beregnet konsentrasjoner av scca ble brukt for å beregne COVs, intra-dagers COVs varierte fROM 01.08 til 04.17% for sitronsyre, 1,47 til 3,40% av eplesyre, og 2,68 til 5,10% for eddiksyre. For å vurdere inter-dag variasjon, ble SCCAs i en enkelt kaffeprøve målt en gang per dag over en fem-dagers periode. Dette eksperimentet ble deretter gjentatt fem ganger for hvert scca og adipinsyre. COV for hver scca ble deretter beregnet ved å dividere standardavviket i toppområdet (eller konsentrasjon) i hver scca av den gjennomsnittlige topparealet (eller konsentrasjon) for at scca og multiplisere med 100. For å vurdere betydningen av å korrigere prøver ved hjelp av den interne standard, COVs ble også beregnet ved anvendelse av konsentrasjoner av hver scca beregnet ved hjelp av adipinsyre som en intern standard. Den CZE-metoden var i stand til pålitelig å reprodusere SCCA målinger, med COVs som strekker seg 5,24 til 10,02% for sitronsyre, 6,55 til 9,47% for eplesyre, 7,67 til 8,63% for eddiksyre, og 3,08 til 6,57% for adipinsyre. Når topparealene ble korrigert ved hjelp av intern standard og er beregnet konsentrasjoner av scca ble anvendt til ca.lculated COVs, inter-dagers COVs varierte 4,56 til 6,23% for sitronsyre, 3,39 til 4,99% for eplesyre, og 9,5 til 10,94% for eddiksyre.
Figur 2: Eksempel PDA spor med topper indikerte Grønne kaffe Prøvene ble fortynnet 1:10 før du legger inn CE ampuller.. Syrer av interesse er angitt. Eddiksyre (A), sitronsyre (C), melkesyre (L), eplesyre (M) og den interne standard, adipinsyre (IS) Klikk her for å se en større versjon av denne figur.
Statistisk analyse ble utført på korrigert syrekonsentrasjoner ved anvendelse av en generell lineær modell (GLM) for å bestemme hvorvidt eller ikke-behandlinger endret organiske syrenivåer. En modell inneholdende "behandling" x "run" (kodet som en tilfeldig faktor) var iverk ted for GLM. Tukey parvise sammenligninger ved 95% konfidens- ble anvendt for å bestemme retningen av endringene.
Behandling endret SCCA konsentrasjoner i den grønne kaffen. Eddiksyre ble betydelig anriket i alle behandlinger over det ingen behandling kontroll (GLM, p <0,0001).
Figur 3:. Effekt av behandling på organisk syre nivåer i grønn kaffe behandling hadde ingen innvirkning på (a) sitron eller eplesyre nivåer i grønn kaffe. Men alle behandlinger betydelig økt (b) eddiksyre nivåer sammenlignet med ingen behandling kontroller (GLM, p <0,001). Økning i eddiksyrenivået var størst med mikroben + medium behandling. Bokstaver indikerer signifikant forskjell ved Tukey parvise sammenligninger på 95%.e.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den største økning ble observert i mikroben + media behandling, noe som økte 0,25 ganger (0,5 vs 0,4 mg / g kaffe i GCP674 vs. NT). En lignende tendens ble observert i melkesyre nivåer, selv om de ikke var signifikant forskjellig. Det var ingen signifikante endringer eller trender i andre syrer spores (sitronsyre og eplesyre).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som med alle analytisk teknikk, er det flere viktige faktorer som i vesentlig grad kan påvirke kvaliteten og påliteligheten av data generert. For det første er det viktig å behandle prøvene effektiv måte, med et minimum av fryse / tine-sykluser. Gjentatt frysing og tining kan kompromittere den kjemiske sammensetning av prøven før behandling eller analyse. For det andre er det viktig å bruke trinnene i denne protokollen til alle prøver konsekvent og jevnt. Tekniske feil som skyldes inkonsekvent prøveopparbeidelse og håndtering kan ha betydelig innvirkning på kvaliteten av data generert, og resultere i økt "støy" i SCCA målinger. For eksempel, vil partikkelstørrelsen i prøven etter sliping innvirkning på hastigheten og effektiviteten av scca ekstraksjon. Det er derfor viktig å sikre at prøvene er malt til en jevn partikkelstørrelse, da dette vil opprettholde ekstraksjonseffektivitet på tvers av prøvene og bidra til å redusere sample-til-sample variabilitet. Similarly, vil nøyaktig måling og pipettering under utarbeidelsen av standardløsninger, nøyaktig måling av prøve massene, og nøye overvåking (og normalisering) av utvinning ganger resultere i generering av mer ensartede data. Tar tid å nøye normalisere, måle og registrere hver av disse parametrene vil sikre påliteligheten av dataene og gir mulighet for nøyaktig post-run korreksjon av data for behandlingsfeil som kan oppstå. For det tredje er det viktig å velge og bruke en passende intern standard. Beregninger av den endelige analyttkonsentrasjon blir avhengige av nøyaktig korreksjon basert på topparealet av den interne standard observert i hver prøve. På grunn av dette, er det viktig at den indre standard være både nøyaktig og presist målt; og bør ideelt sett ikke forekommer naturlig i prøven eller ko-eluerte med andre forbindelser. Ikke bare det riktige valg og bruk av en intern standard i alle prøver gjør det mulig for forskeren til å kontrollere for endringer i metabolitter observert på grunn av forskjeller i utvinning effektivitet; det også forenkler nedstrøms prosessering og topp identifikasjon. Til slutt, er det nødvendig å overvåke topp identifikasjon og integrasjonsprosessen. Mens automatiserte prosesseringsalgoritmer er nyttige, er de ikke perfekt. De data som genereres av denne teknikken er avhengig av nøyaktigheten av integrasjon, og sporene må kontrolleres manuelt for å sikre kvaliteten av integrasjonshendelser, særlig definisjonen av topp grenser og grunnlinjene.
Som med en hvilken som helst analysemetode, er det viktig å fastslå at CZE metoden presentert her er: et. nøyaktig: i stand til å bestemme mengden av et gitt scca til stede; b. presist: stand til reproduserbart kvantifisere SCCAs innen samme dag og i målinger gjort over flere dager med analyse; og c. robust: stand til å utvinne det meste av SCCAs til stede i prøvene som blir analysert. Som vist ovenfor i de representative results, metoden som er beskrevet her er i stand til nøyaktig å bestemme mengdene av SCCAs til stede i prøvene. Alle de målte SCCAs (sitronsyre, eplesyre, eddiksyre og melkesyre) og den interne standard (adipinsyre) oppviste en lineær respons på 0-80 ng / mL konsentrasjonsområde. I tillegg er LOQs og lods for disse syrene varierte 2-4 ng / mL og 1-2 ng / mL, respektivt. Fremgangsmåten var også nøyaktig, som alle SCCAs målte og adipinsyre indre standard oppviste lav intra-dagers variabilitet, faller mellom 2,0 til 5,5% av topparealet (eller mellom 1,0 til 5,2% av den beregnede konsentrasjon) for alle SCCAs målt. Den inter-dag variasjon av SCCA målinger var også relativt lav, falt mellom 3,05 til 10,10% av topparealet (eller mellom 3,30 til 10,95% av den beregnede konsentrasjon) for alle SCCAs måles. Interessant, med unntak av eddiksyre, som var jevnt ved eller nær grensen for påvisning / kvantifisering i alt kaffeprøvene analyzed, korrigere prøver ved hjelp av adipinsyre som en intern standard resulterte i mer reproduserbare målinger og en reduksjon i koeffisienten for variasjon (se Representative resultater, ovenfor). Disse data er i overensstemmelse med tidligere publiserte resultater indikerer at korreksjonen med en intern standard er essensielt for å opprettholde nøyaktighet i CE-analyser over tid 16. Mens noen fremgangsmåter har anvendt uorganiske ioner som indre standard, følte at adipinsyre var et mer passende standard for CZE-metoden presentert her, siden det er en organisk syre og er derfor mer utsatt for å få tap i prøvepreparering trinn lik den som er oppleves av SCCAs av interesse i prøven. Adipinsyre hadde de ytterligere fordeler som ikke er tilstede i kaffeprøvene som skal undersøkes, som oppviser en lineær respons over de samme konsentrasjoner som brukes for SCCAs i denne studien, som oppviser forholdsvis lav LOD / LOQ-verdier (1 ng / mL og 4 ng / ul, henholdsvis), enda høy prosent gjenoppretting fra kaffe matrise (100,19% ± 2,57), noe som gjør det en nyttig standard for kvantifisering SCCAs i kaffeprøver. Interessant, den høye prosentvise gjenvinning observert for adipinsyre var oppnåelig for alle organiske syrer som måles i denne studien som utviste prosent gjenvinning av verdier i området 91,94 til 106,08%. Disse data indikerer at den CZE metoden presentert her er i stand til å utvinne det meste av SCCAs tilstede i kaffeprøvene.
Tilpasning denne protokollen til nye prøvetyper krever innsamling av foreløpige data, basert på litteratur eller empirisk bevis, om de forventede mengder målrettet analytter. Denne informasjonen vil hjelpe den eksperimentelle design, prøveopparbeidelse, og standardkurve konstruksjon. Å bestemme riktig prøvefortynning å bruke lett kan oppnås empirisk ved å kjøre en serie fortynning av en prøve ekstrakt for å finne en riktig fungerende fortynning. Denne protokollen ble utviklet for å detektereSCCAs beskrevet i eksempel resultater, men det kan lett bli tilpasset til å detektere andre SCCAs ved å endre separasjons parametere, slik som separasjon spenning, trykk eller tid. Det er viktig å huske på, men at forandre separasjons parametrene kan endre antallet turer som kan oppnås på et enkelt sett av separasjons buffere som disse buffere nedbrytes med bruk. Baseline degradering eller endringer i gjeldende er ofte manifestasjoner av over-brukt / utarmet buffere. Skifte buffer og rekondisjonering kapillær kan ofte løse disse problemene. Etter lengre tids bruk vil muligheten av kapillaren for å løse analytter reduseres også. Redusert baseline stabilitet, drastiske endringer i oppholdstid, og redusert maksimal oppløsning er alle tegn på at kapillær kanskje må byttes ut. Det er også mulig å motta et trykk feil som skyldes feilaktig tetning mellom prøveglass og den kapillære på grunn av en dårlig tilpasset korken eller en defekt flaske. Sørge forcaps passe perfekt inn i prøverør for å hindre at denne feilen.
Tradisjonelt har kromatografiske metoder så som GC-MS, GC-FID, eller HPLC blitt anvendt for å detektere SCCAs i et bredt spekter av matriser, herunder luft, vann, jord og planteprøver 14. Mens effektiv, er en vesentlig ulempe ved disse fremgangsmåter er behovet for å derivatisere SCCAs før deteksjon. Derivatisering anvender farlige reagenser påvisningsgrensen blir ofte påvirket av effektiviteten av derivatiseringen reaksjons 13,14. Påvisning av ikke-avledede SCCAs gjennom CZE unngår analytt tap under behandlingen, eksponering for farlige derivatiseringsmidler, og reduserer prøveopparbeidelse tid. Disse fordelene kan sees i høy prosent utvinningsgraden (varierer mellom 91,94 til 106,08%) beregnet for alle SCCAs målt i denne studien. I tillegg CZE kvantifisering av SCCAs oppnår påvisningsgrenser kan sammenlignes med de som er rapportert i litteraturen for GC-MS, GC-FID, og HPLC, i området of deler per million til deler per milliard 13,14. Når det kombineres med høy hastighet kjøretider, høy oppløsning separasjon makt, rett-frem utvalgets behandling protokoller ansatt ved denne metoden for analysen, følsomhet og praktiske CZE gjør det til et attraktivt alternativ til tradisjonelle GC eller HPLC-metoder.
Det er imidlertid viktig å merke seg at, mens CZE gir flere fordeler i forhold til GC-MS HPLC, eller LC-MS / MS-baserte metoder for scca analyse, er det ikke egnet for alle scca analyser. For eksempel, siden CZE metoden beskrevet her bygger utelukkende på spektrofotometrisk deteksjon, det tillater ikke for identifisering av ukjente SCCAs tilstede i prøven, eller bekreftelse av SCCA identitet via masse spektral profilering. På grunn av dette, vil GC-MS eller LC-MS / MS-metoder være bedre egnet for scca analyser på prøver inneholdende et stort antall ukjente SCCAs, eller prøver hvor det er avgjørende for å bekrefte identiteten til alle SCCAs tilstede.I tillegg, som tidligere rapportert LC-MS / MS-baserte metoder gir mulighet for nedre grense for deteksjon (Lods) -on gjennomsnitt, 0,05 mikrogram / ml for LC-MS / MS 17 vs. 1 ug / ml for CZE oppnådd ved bruk av fremgangsmåten som presenteres her-LC-MS / MS basert kvantifisering av SCCAs kan være mer hensiktsmessig for prøver hvor SCCAs er til stede i meget små mengder eller spormengder.
Protokollen som presenteres her fokuserer på utvinning og kvantifisering av kortkjedede karboksylsyrer (SCCAs) fra plantevev. Innhenting av ferdigheter i denne teknikken vil åpne døren til et bredt spekter av anvendelser av denne teknologien for den enkelte forsker. Denne teknikk, med bare små variasjoner i metoden, har blitt anvendt i analysen av SCCAs i en mangfoldig populasjon av prøver og substrater, som strekker seg fra næringsmidler og vevsprøver til miljø vann og jordprøver 8. I tillegg få kjennskap til de kjemiske prinsipper som ligger til grunndenne teknologien skjønt denne protokollen vil gi forskere med kunnskapsbase som trengs for å forsøke analyse av andre forbindelser, så som karbohydrater eller metaller 8,13. Den analytiske fleksibiliteten av kapillær elektroforese gjør det til et usedvanlig kraftig verktøy egnet for en myriade av eksperimentelle anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ceramic Moarter and Pestle | Coorstek | 60310 | |
| Beckman Coulter P/ACE MDQ CE system | Beckman Coulter | Various | |
| Glass sample vials | Fisher Inc. | 033917D | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Inc. | 02-681-5 | |
| LC/MS grade water | Fisher Inc. | W6-1 | Milli-Q water (18.2 MΩ·cm) is also acceptable |
| 15 ml glass tube/ Teflon lined cap | Fisher Inc. | 14-93331A | |
| Parafilm M | Fisher Inc. | 13-374-12 | |
| CElixirOA detection Kit pH 5.4 | MicroSolv | 06100-5.4 | |
| BD Safety-Lok syringes | Fisher Inc. | 14-829-32 | |
| 17 mm Target Syringe filter, PTFE | Fisher Inc. | 3377154 | |
| 32 Karat, V. 8.0 control software | Beckman Coulter | 285512 | |
| capillary electrophoresis (CE) sample vials | Beckman Coulter | 144980 | |
| caps for CE vials | Beckman Coulter | 144648 | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | Liquid nitrogen is available from most facilities services |
References
- Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
- Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
- Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
- Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
- López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
- Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
- Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
- Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
- Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
- Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
- Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
- Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
- Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384 (2008).
- Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
- ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
- Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
- Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).
