In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג'ל עכבר
Summary
אנו מציגים פרוטוקול ללמוד אינטראקציות אנדותל-pericyte אדם העכבר באמצעות וריאציה של assay אנגיוגנזה תקע ג'ל מטריקס.
Abstract
Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.
Introduction
אנגיוגנזה הוא התהליך שבו כלי דם חדשים נוצרים מרשת וסקולרית קיים 1 והוא במוקד מחקר המתמשך על פני תחומים רבים, החל התפתחות תקינה למחלות. תהליך דינאמי זה כרוך ההתפשטות וההגירה של תאי האנדותל (EC) וגיוס pericytes לבנות צינור כלי דם כי היא מכוונת כלפי האתר שצריך העברת חמצן וחומרי הזנה 2. כדי ללמוד את התהליך הזה דורש assay דינמית לא פחות, והכי חשוב אחד שיכול לשחזר את הטבע תלת ממדי של היווצרות צינור. במבחנת מבחני מטריקס 3D פותחו כדי לתת מענה לצורך הזה עבדו היטב על מנת לאפשר לחוקרים לקבוע את הצעדים הבדידים במרחב ובזמן שבו אנגיוגנזה מתקיים 3, 4, 5, 6. עם זאת, מודלים מטריקס במבחנה 3D אלה מוגבלים ללימוד כלי הלא perfusedד ולכן הם חסרים רכיבים קריטיים רלוונטיים לתהליך אנגיוגנזה (למשל, במחזור צמיחה וגורם מעכבים, מתח טבעי / כוחות לרוחב מיטת כלי הדם) ולא מצליח לדמות את הסביבה המורכבת נוכח רקמת חיים. כדי לטפל מגבלה זו, כמה in vivo מבחני אנגיוגנזה פותחו 7, כולל assay תקע מטריקס ג'ל אשר יהיה המוקד של הדו"ח שלנו 8, 9.
את assay תקע ג'ל מטריקס הוא assay אנגיוגנזה ומבוסס in vivo שמושך חוקר כפי שהוא מספק פלטפורמה יציבה על מנת לבחון את התפקידים של תאים וחומרים שונים אנגיוגנזה. ג'ל מטריקס הוא פתרון קרום במרתף זמין מסחרי כי מופרש על ידי Engelbreth-הולם-הנחיל (EHS) שורת תאי סרקומה עכבר מבצרת לחומר דמוי ג'ל על 37 מעלות צלזיוס. הג'ל מטריקס ניתן לערבב עם תאים ו / או חומרים, כגון גורמי גדילה, ו Injected מתחת לעור לתוך העכבר. מארח ECS יפלוש התקע למעלה מ -14 ימים, יוצר רשת כלי דם, ולהפוך להיות perfused עם של דם המארח. נכון להיום, מבחני תקע ג'ל מטריקס התמקדו אך ורק על חקר התנהגות תא האנדותל במהלך אנגיוגנזה, עם זאת, למיטב ידיעתנו לא נעשה מאמץ עדיין לקבוע אם assay זה יכול לשמש כדי תאי האנדותל שיתוף תרבות pericytes ללמוד כיצד סוגי תאים אלה שני אינטראקציה במהלך אנגיוגנזה. באופן ספציפי, הבנת הקשר בין ECS ו pericytes היא בעל ערך לחקר מחלות שבו אובדן כלי דם הוא פתולוגי, כולל איסכמיה כלי דם ומחלות היקפיות וסקולרית 10, 11, 12.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מציג pericytes נגזרות האנושיות לתערובת ג'ל מטריקס יחד עם ECS האדם גורם גדילה פיברובלסטים (bFGF). תערובת זו לאחר מכן ניתן מוזרק מתחת לעור in את dorsum של עכברי SCID כדי לאפשר היווצרות של מצופית מתפקד במלואה, pericyte, כלי היברידי. הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד להכין אטמי ג'ל מטריקס המכילים ECS אדם עם או בלי pericytes האנוש, שם לעכברי SCID וכיצד לנתח את הסעיפים היסטולוגית עבור נקודות קצה אנגיוגנזה קריטיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
את assay תקע ג'ל מטריקס הוכיחה להיות שיטה נוחה וחזקה כדי להעריך ויסות הגנים ב אנגיוגנזה, תרכובות angiogenic ו antiangiogenic in vivo, וכדי להשלים בדיקות במבחנה. כאן אנו מתארים בפרוטרוט assay תקע ג'ל מטריקס הרומן של אנגיוגנזה אדם שחוקר את האינטראקציה בין תאי האנדותל pericytes במה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.
Materials
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28G 1cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5mL microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
- Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
- Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
- Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
- Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
- Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
- Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
- Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
- Buchwalow, I. B., Bocker, W. . Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
- Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).
