This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.
Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene’s role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.
تنبيغ الزرع هو طريقة مفيدة لنموذج الأورام الخبيثة الدموية في الفئران. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة لدراسة الأورام الخبيثة النخاعي التي يعود تاريخها إلى اول دليل على ان التعبير خارج الرحم من BCR-ABL1 يمكن أن ألخص بأمانة ابيضاض الدم النقوي المزمن في الفئران 1. وقد سهلت هذه التقنية فيما بعد دراسة مستفيضة من JAK2 V617F وMPL W515K / L تحور مرض تكاثر نقوي (MPN).
مبن مجموعة من الأورام الخبيثة الدموية التي تتميز الافراط في خلايا الدم النخاعي ناضجة وتليف نخاع العظام. تنشأ هذه الأمراض عموما من توسع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم الذي حصل طفرة جسدية في أي JAK2، MPL، أو CALR. تنبيغ-زرع JAK2 V617F وMPL W515K / نماذج L معرض المظاهر السريرية فيرا كثرة الحمر وتليف النقي 2-5 </ سوب>. في الآونة الأخيرة، كما تم إنشاء نموذج الفأر من-تحور calreticulin مبن مع أسلوب التنبيغ الزرع 6. هذه الفئران تطوير مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع زيادة الصفائح الدموية، وزيادة عدد الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. معا، وقد وفرت هذه النماذج ليس فقط الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على المرضية الجزيئية من مبن، ولكن أيضا القدرة على تطوير ودراسة العلاجات في أجواء ما قبل السريرية.
توفر هذه المخطوطة وصفا مفصلا لمنهجية التنبيغ الزرع مع التركيز على طفرة CALRdel52. تتضمن هذه التقنية زرع خلايا نخاع العظام transduced retrovirally معربا عن متحولة بناء في الفئران المتلقي مسانج المشع.
يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية إجراء عمليات زرع نخاع العظام في الفئران أن ألخص مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع التقدم إلى تليف النقي مع CALRdel52 طفرة باعتباره المحرك من المرض. زراعة ناجحة من الخلايا معربا عن النتائج CALRdel52 في زيادة الصفائح الدموية، وتوسيع الخلا?…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).
CELL LINES | |||
DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
PLASMIDS | |||
EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
CONSUMABLES | |||
27G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
10cm dishes | Fisher | 172931 | |
15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
60mm dishes | Fisher | 150288 | |
Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
5-FU | Fisher | A13456-06 | |
100um cell strainers | Fisher | 22363549 | |
50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
6-well plate | Fisher | 130184 | |
FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
0.45um syringe filters | Fisher | 0974061B | |
Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
EQUIPMENT | |||
BD Accuri C6 | |||
X-ray irradiator |