Introduction
تنبيغ الزرع هو طريقة مفيدة لنموذج الأورام الخبيثة الدموية في الفئران. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة لدراسة الأورام الخبيثة النخاعي التي يعود تاريخها إلى اول دليل على ان التعبير خارج الرحم من BCR-ABL1 يمكن أن ألخص بأمانة ابيضاض الدم النقوي المزمن في الفئران 1. وقد سهلت هذه التقنية فيما بعد دراسة مستفيضة من JAK2 V617F وMPL W515K / L تحور مرض تكاثر نقوي (MPN).
مبن مجموعة من الأورام الخبيثة الدموية التي تتميز الافراط في خلايا الدم النخاعي ناضجة وتليف نخاع العظام. تنشأ هذه الأمراض عموما من توسع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم الذي حصل طفرة جسدية في أي JAK2، MPL، أو CALR. تنبيغ-زرع JAK2 V617F وMPL W515K / نماذج L معرض المظاهر السريرية فيرا كثرة الحمر وتليف النقي 2-5 </ سوب>. في الآونة الأخيرة، كما تم إنشاء نموذج الفأر من-تحور calreticulin مبن مع أسلوب التنبيغ الزرع 6. هذه الفئران تطوير مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع زيادة الصفائح الدموية، وزيادة عدد الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. معا، وقد وفرت هذه النماذج ليس فقط الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على المرضية الجزيئية من مبن، ولكن أيضا القدرة على تطوير ودراسة العلاجات في أجواء ما قبل السريرية.
توفر هذه المخطوطة وصفا مفصلا لمنهجية التنبيغ الزرع مع التركيز على طفرة CALRdel52. تتضمن هذه التقنية زرع خلايا نخاع العظام transduced retrovirally معربا عن متحولة بناء في الفئران المتلقي مسانج المشع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة وتنفيذها وفقا لتوصيات لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة كاليفورنيا في ايرفين. تم تنفيذ كافة الإجراءات تحت التخدير الأيزوفلورين وبذلت كل الجهود للحد من المعاناة.
1. توليد Ecotropic الارتجاعي
- إعداد البلازميدات ذات جودة عالية مع تركيز لا يقل عن 1 ميكروغرام / ميكرولتر باستخدام مجموعة ماكسي الإعدادية التجارية أو تنقية كلوريد السيزيوم.
ملاحظة: وتشمل ناقلات MSCV العمود الفقري ترميز الجينات في المصالح (في هذه الحالة CALR 7،8) وعلامة الاختيار (GFP، النيو، الخ) وكذلك البلازميد التعبئة والتغليف ecotropic، ترميز هفوة-بول-الحياة الفطرية (المشار هنا البلازميد). - ذوبان الجليد وتوسيع-مرور منخفض خلايا 293T في DMEM تستكمل مع 10٪ FBS ولام الجلوتامين مع البنسلين / الستربتومايسين (D10). لوحة 5 × 10 6 الخلايا في الأنسجة طبق المعالجة ثقافة 10 سم في ترطيبنسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- توسيع الخلايا 293T في الثقافة. في اليوم قبل ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني وطاف نضح في قارورة فراغ.
- يعرض للتريبسين الخلايا، إضافة 2 مل 0.05٪ التربسين واحتضان الأطباق في نسيج الثقافة الحاضنة ترطيب ل2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- لوقف trypsinization، إضافة D10 3 مل لطبق ونقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تدور الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
- نضح طاف في قارورة فراغ و resuspend بيليه خلية في 2 مل D10.
- عدد الخلايا عن طريق الأزرق الاستبعاد التريبان باستخدام عدادة الكريات.
- البذور 2 × 10 6 خلايا في طبق إلى ثلاثة الأنسجة أطباق المعالجة ثقافة 10 سم في الفيروس الذي تم إنشاؤه.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا تسمح للخلايا تتجاوز 30-50٪ التقاء في وقت ترنسفكأيشن أو يمكن الحصول على عائد فيروس الفقراء. - على الفور قبل ترنسفكأيشن،وسائل الاعلام نضح في قارورة فراغ واستبدالها مع 5 مل D10 جديدة.
- لكل 10 سم طبق بتري أن transfected إعداد العقيمة أنبوب microcentrifuge 1.5 مل الفردي.
- ماصة 760 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل في كل أنبوب microcentrifuge، ثم يضاف بعناية 40 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مباشرة إلى وسائل الإعلام. احتضان الأنابيب في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 30 ميكروغرام من ناقلات MSCV مع الجين (15 ميكروغرام في حالة استخدام ناقلات فارغة)، فضلا عن 5 ميكروغرام البلازميد إلى كل أنبوب منها والمزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. يحضن في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة إضافية.
ملاحظة: ناقلات أصغر تميل إلى أن تكون عائدات الفيروسية أعلى. - بعناية إضافة الحجم الكلي لكل من رد فعل (حوالي 800 ميكرولتر) قطرة من الحكمة في كل منها 10 سم طبق بتري وإمالة بلطف طبق من جانب إلى آخر لخلط. عودة الخلايا إلى مكعب الأنسجة مرطبحاضنة lture.
- بعد ساعة 8 أو الحضانة بين عشية وضحاها في نسيج الثقافة الحاضنة، ووسائل الإعلام نضح في قارورة فراغ وبلطف استبدال مع 10 مل من D10 جديدة.
- في 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن جمع طاف في حقنة 35 مل وتصفية من خلال 0.45 ميكرون غشاء لإزالة الحطام الخلية.
- يمكن حصادها مكان 10 مل D10 جديدة مرة أخرى على خلايا 293T وفيروس إضافية في 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن: اختياري.
- التخلص من الخلايا 293T في نفايات بيولوجية عندما يتم جمع أي فيروس إضافية.
- طاف الفيروسي قسامة في أحجام تستخدم مرة واحدة (على سبيل المثال 1 مل لعيار الفيروس أو 6.5 مل للعدوى BM). فيروس فلاش التجميد بالنيتروجين السائل وفيروس مخزن في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: تجنب تكرار دورات تجميد / الذوبان كما أنها تقلل إلى حد كبير عيار الفيروس.
2. تحديد عيار الفيروسية النسبي بواسطة التدفق الخلوي
- ذوبان الجليد 3T3 الخلايا والحفاظ في D10. ثقافة الخلايا في 10 سمالأنسجة الثقافة تعامل طبق في نسيج الثقافة حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- أداء عيار الفيروسية في ثلاث نسخ. لإعداد الخلايا، وغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني وطاف نضح في قارورة فراغ.
- يعرض للتريبسين الخلايا، إضافة 2 مل 0.05٪ التربسين واحتضان الأطباق في نسيج الثقافة حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- لوقف trypsinization، إضافة D10 3 مل لطبق ونقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تدور الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
- نضح طاف في قارورة فراغ و resuspend بيليه خلية في 2 مل D10.
- عدد الخلايا عن طريق الأزرق الاستبعاد التريبان باستخدام عدادة الكريات.
- البذور 3T3 الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 5 الخلايا في الأنسجة خمسة عشر أطباق المعالجة ثقافة 60 ملم واحتضان بين عشية وضحاها.
- جعل 1: 3، 01:10، 01:30 و 1: 100 التخفيفات من طاف الفيروسي إذابة باستخدام D10 في مجموعه 1 مل. تشمل أيضا التحكم خالية من الفيروسات.
- نضح ليديا من 3T3 الخلايا في قارورة فراغ واستبدالها مع 4 مل من D10.
- تراكب الخلايا 3T3 مع التخفيفات من طاف الفيروسي وإضافة polybrene إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / مل إلى كل طبق. احتضان لمدة 48 ساعة في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- تحديد عيار الفيروسية النسبي التدفق الخلوي:
- لغسل الخلايا، ونضح وسائل الإعلام في قارورة فراغ وإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني.
- نضح في برنامج تلفزيوني في قارورة فراغ. إضافة 1 مل 0.05٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة لفصل الخلايا من الطبق.
- إضافة 3 مل D10 وماصة صعودا وهبوطا لفصل أي الخلايا المتبقية من لوحة. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
- صب طاف وغسل الخلايا مع 3 مل برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، وطاف صب. resuspend في 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
- خلايا تعمل على تدفق عداد الكريات 9. جمع بين 20،000 - 30،000 الأحداث داخل رعاش بوابة الخلية (التي يحددها FSC مقابل SSC) وحساب نسبة GFP + وGFP - الخلايا.
ملاحظة: يعتبر عيار الفيروسية مقبول عند التخفيف 1:30 من عائدات طاف الفيروسية لا يقل عن 50٪ GFP + 3T3 الخلايا. إذا ثم يمكن الحصول على هذه النتائج التخفيف في أقل من 50٪ GFP + الخلايا النتائج التنبيغ دون المستوى الأمثل. تم تعديل الحساب لتحديد عيار الفيروسية من ليمون وآخرون. ، الدم (1997) 9. - لتحديد عيار الفيروس النسبي، استخدم المعادلة: عيار الفيروس = الجسيمات تشكيل وحدات (PFU) / مل = [(عدد 3T3 الخلايا × التردد من GFP + الخلايا) / حجم (مل) طاف] × التخفيف عامل.
3. تنبيغ المانحة خلايا نخاع العظم
- لإعداد الفئران المانحة لنخاع العظم (BM) الحصاد، أول تخدير الفئران عن طريق المرذاذ الأيزوفلورين مع معدل تدفق إضافي 5٪ جنبا إلى جنبالأكسجين في 1 لتر / دقيقة. قرصة القدم لتقييم الاستجابة.
ملاحظة: الفئران المانحة (أقل من 8 أسابيع من العمر) يجب أن تكون مستعدة قبل 5 أيام الحصاد نخاع العظم (8 أيام قبل الزرع). وسيكون أحد الفئران المانحة توفير ما يكفي من الخلايا لا يقل عن 2 المتلقين. - حقن 150 ملغ / كغ 5 فلورويوراسيل (5-FU) عن طريق الحقن الرجعية المدارية في الفئران تخدير باستخدام 27 G × ½ "إبرة.
الحذر! 5-FU وكيل العلاج الكيميائي لمكافحة السرطان. التعامل دائما 5-FU داخل شهادة غطاء الدخان الكيميائية أو خزانة أنبوبي السلامة الأحيائية. التشاور مع لجنة سلامة المختبرات والحيوان المؤسسة لتحديد وضع العلامات المناسبة من الفئران التي عولجت مع 5-FU.- ضع الماوس تخدير على جانبها وكبح جماح باستخدام كل من الإبهام والسبابة بحيث العين يبرز قليلا من الرأس.
- بدءا من جانبي الإبرة إلى الموق الإنسي ومع شطبة مواجهة، أدخل الإبرة في 45° زاوية في اتجاه وسطي، ووقف عند إدخال الإبرة في منتصف الطريق. ببطء حقن الخلايا وإزالة إزالة بعناية إبرة.
ملاحظة: إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح، يجب أن العين يتراجع قليلا، وينبغي أن يشعر أي مقاومة على إدخال الإبرة. - دراسة الماوس عن أي دلائل على الإصابة مثل تورم أو نزيف.
- حصاد نخاع العظام 5 أيام بعد 5-FU العلاج (قبل 3 أيام الزرع).
- تخدير الفئران عن طريق المرذاذ الأيزوفلورين مع معدل التدفق من 5٪ أكسجين جنبا إلى جنب في 1 لتر / دقيقة. قرصة القدم لتقييم الاستجابة.
- التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم. تعقيم الماوس عن طريق الرش بسخاء مع 70٪ ETOH حتى يصبح الفراء الرطب.
- باستخدام مقص تشريح، إجراء شق في الجلد وتشريح اللفافة بعيدا عن عضلات الساق. بعد ذلك، تشريح الساق بعيدا عن الماوس عن طريق قطع عظم الفخذ في الورك والساق في الكاحل.
- ينحنيالمحطة في شكل "L" وفصل كل عظم الساق عن طريق قطع عند مفصل الركبة مع مقص تشريح.
- لإزالة الغضروف في نهايات البعيدة كل عظم الساق، واستخدام مقص تشريح لكشط بلطف العضلات نحو واحدة من نهاية عظم الساق حتى يتم فض الاشتباك الغضروف.
- استخدام المحاقن مع 27 G س ½ بوصة إبرة، دافق كل عظم الساق مع برنامج تلفزيوني تستكمل مع 2٪ FBS على غشاء النايلون 100 ميكرومتر في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. عظم دافق حتى العظم يتحول الأبيض لزيادة عدد الخلايا التي تحصد.
- استخدام المكبس من حقنة لهرس الخلايا من خلال غشاء النايلون في أنبوب مخروطي 50 مل للحصول على تعليق خلية واحدة. كرر مع الساق الماوس الأخرى.
- خلايا الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 400 x ج وتجاهل طاف. و resuspend BM في مل البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم (ACK) عازلة 5 إلى ليز خلايا الدم الحمراء. احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني لوقف تحلل الخلية. Centriخلايا fuge في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 400 x ج وتجاهل طاف. كرر الخطوة تحلل إذا كان بيليه BM لديه لون أحمر.
- resuspend في 5 مل برنامج تلفزيوني والعد الخلايا عن طريق الأزرق الاستبعاد التريبان باستخدام عدادة الكريات.
- Resuspend الخلايا في 2 × 10 6 خلايا للمتر مع 2X كوكتيل قبل STIM التي تحتوي على DMEM تستكمل مع 20٪ FBS، L-الجلوتامين، البنسلين / الستربتومايسين، IL-3 (14 نانوغرام / مل)، IL-6 (24 نانوغرام / مل)، وصندوق إنقاذ الطفولة (112 نانوغرام / مل). لوحة 2 مل لكل بئر في 6 لوحات جيدة.
- احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- إضافة 2 مل من طاف الفيروسي لاحتواء جيدا كل الخلايا BM وإضافة polybrene (8 ميكروغرام / مل). لوحات تدور عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في 1500 x ج ثم يعود لوحة الحاضنة زراعة الأنسجة بين عشية وضحاها.
- ماصة تعليق خلية في أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 400 x ج، لا تجاهل لوحة. Resuspend الخلايا في 2 مل جديدة 2X كوكتيل قبل STIM لكل بئر والعودة إلى الآبار الأصلية. إجراء spinoculation 2 الثانية بتكرار الخطوات 3،7-3،9.
4. خلايا زرع المانحة في الفئران مستلم
- إعداد الفئران المتلقي مسانج للزرع مع جرعة قاتلة إجمالي إشعاع الجسم <قبل 24 ساعة إلى حقن الخلايا BM.
ملاحظة: قاتلة تشعيع جرعة لBALB / ج الفئران عادة 800-900 CGY و1،000-1،200 CGY لC57B / 6 10. يتم تقسيم الجرعة عادة إلى جلستين من أشعة متباعدة على الأقل 3-4 ساعات بعيدا. - استمر من الخطوة 3.11 الحصاد transduced الخلايا المانحة من 6 لوحات جيدا قبل pipetting بلطف طاف في أنابيب مخروطية. يغسل كل جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لجمع الخلايا المتبقية وإضافة إلى أنابيب مخروطية 50 مل.
- إضافة 0.5 مل من التربسين 0.05٪ إلى الآبار واحتضان عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1 مل D10 إلى الآبار وفصل أي الخلايا المتبقية قبل pipetting لطيف. إضافة الخلايا إلى أنبوب منهاالصورة من الخطوة 4.2 و بيليه بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على 400 ز س.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على 400 ز س. resuspend في 5 مل برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات التي كتبها استبعاد التريبان الأزرق.
ملاحظة: إذا كان متجه لديها علامة GFP ثم تحديد النسبة المئوية للخلايا GFP إيجابية مع تدفق عداد الكريات. - و resuspend 5 × 05-02 أكتوبر × 10 6 خلايا في 50-100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني للحقن في الفئران.
- حقن الخلايا عن طريق الحقن الرجعية المدارية في الفئران تخدير باستخدام معقم 27 G س ½ "إبرة.
ملاحظة: تقنيات حقن أخرى تشمل الذيل الوريد، الطحال، أو الفخذ.- تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلورين وقرصة القدم لتقييم الاستجابة.
- ضع الماوس على جانبها وكبح جماح باستخدام كل من الإبهام والسبابة بحيث العين يبرز قليلا من الرأس.
- مع شطبة مواجها لها، تضاف نeedle الوحشي لحاظ وسطي بزاوية 45 درجة.
ملاحظة: إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح، يجب أن العين يتراجع قليلا، وينبغي أن يشعر أي مقاومة على إدخال الإبرة. - دراسة الماوس عن أي دلائل على الإصابة مثل تورم أو نزيف.
ملاحظة: التالي الفئران زرع يكون انخفاض تعداد الدم لعدة أسابيع وذلك عرضة للإصابة. الوقاية بالمضادات الحيوية أو استخدام المياه المحمضة يمكن استخدام.
- شهر واحد بعد زرع، وقياس GFP٪ في الدم المحيطي كمؤشر للخلايا المانحة المغروسة التدفق الخلوي.
ملاحظة: GFP وحدها لا يمكن تحديد نجاح engraftment من الخلايا. قد فشلت تنبيغ الفيروسية بعد engraftment قد حدث. في هذه الحالة، سوف يتم الكشف عن أي GFP خلايا +، ولكن كان engraftment من الخلايا التي تم زرعها بنجاح.- يستغرق 10 ميكرولتر من الدم الطرفية بذ ثقب الوريد الصافن الساق مع 21 G × 1 ½ "حقنة وإضافته إلى 100 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني لمنع تجلط الدم.
- إضافة 1 مل ACK إلى الدم وليز على الجليد لمدة 10 دقيقة. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
- نضح طاف في قارورة فراغ وإضافة 1 مل PBS تستكمل مع 2٪ FBS لوقف تحلل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة.
- نضح طاف في قارورة فراغ وبيليه resuspend في 100 ميكرولتر PBS تستكمل مع FBS 2٪.
- تشغيل العينات على تدفق عداد الكريات وجمع 300،000 ضمن فعاليات بوابة الخلية الحية (التي يحددها FSC مقابل SSC) وحساب نسبة GFP + وGFP - خلايا 9.
- بالإضافة إلى ذلك في 1 الشهر بعد الزرع، نفذ تعداد الدم الكامل (CBC) باستخدام الآلي البيطري أمراض الدم محلل 18 لمراقبة تطور المرض.
ملاحظة: مواصلة رصد المرض٪GFP في الدم المحيطي وCBC شهريا. - لإنهاء التجربة، تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلورين وقرصة القدم لتقييم الاستجابة. تضحية الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم والطحال ونخاع العظام حصاد لأمراض الأنسجة.
ملاحظة: طول التجربة الذاتية وينبغي تقييم تاريخ الإنهاء على أساس النمط الظاهري المرض المتوقع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نتائج تقنية التنبيغ الزرع في إعادة المكونة للدم من الفئران المتلقي مع الخلايا معربا عن الجينات في المصالح. ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن نموذج الفأر التنبيغ-زرع calreticulin تحور MPN. لفترة وجيزة، الارتجاعي معربا عن CALRwt أو CALRdel52 يستخدم لتصيب الخلايا BM من الماوس المانحة C57B / 6. يتم زرع خلايا Transduced في المشع C57B / 6 الماوس المتلقي والخلايا المانحة engraftment يحدث خلال الشهر الأول بعد زرع. أدلة على وجود النمط الظاهري يصبح المرض واضحة 3 أشهر بعد زرع فيها الفئران المعرض زيادة الصفائح الدموية والخلايا السوية العرطلة، تليها نخاع العظام التليف في 6-10 شهرا بعد زرع. إذا فشلت الخلايا المانحة إلى تدبر، قد تحدث الوفاة الماوس في غضون الأسابيع 2 الأولى بعد الزرع. بالإضافة إلى ضعف حقن أو الصدمة خلال الحقن، ويمكن أن أخطاء فنية أخرى تسبب engraftment الفقراء من تنبيغخلايا د أو الموت الماوس. وتشمل هذه الأشعة دون المستوى الأمثل من الفئران المتلقي، إذا كان هذا يحدث معظم الخلايا المكونة للدم سوف يكون المتلقي بدلا من أصل المانحة. من ناحية أخرى، التشعيع المفرط للمتلقي يمكن أن يسبب الفئران لتطوير المرض الناجم عن إشعاع أو حتى الموت. والتتر الفيروسية منخفضة يؤدي إلى انخفاض كفاءة إصابة الخلايا المانحة. ونتيجة لذلك انخفاض أعداد الخلايا المانحة والتعبير عن الجينات في المصالح وحتى الفئران قد لا يظهر النمط الظاهري المطلوب. لهذا السبب، فإنه من الأهمية بمكان أن فيروس مع التتر عالية يستخدم لتنبيغ الخلايا المانحة. ويوضح الشكل 2 كيفية حساب عيار الفيروسية النسبي حيث يتم حساب GFP٪ من الأحداث التي تم جمعها من بوابة الخلية الحية. ويوضح الشكل 2B عيار مع الجسيمات أكثر من واحد الفيروسي في الخلية (1: 3 تمييع) وكذلك التتر مع الجسيمات الفيروسية واحدة في كل خلية (1:30، 1:10، و 1: 100 طاف). من الناحية المثالية، سوف لا يقل عن 50٪ GFP + الخلايا يكون DETECتيد مع 1:30 التخفيف من طاف الفيروسي. الرقم 3 يظهر دليل على المتلقي زرع ناجحة حيث الفئران CALRdel52 يحمل النمط الظاهري مبن مع زيادة الصفائح الدموية، وزيادة السوية العرطلة في نخاع العظام، وتليف نخاع العظام.
الشكل 1: نظرة عامة على تنبيغ-زراعة الفأر نموذج من التكاثر النقيي الأورام. أ) يحدث جيل الارتجاعي وتحديد عيار الفيروسية 1-2 أسابيع قبل زرع. ب) D (-8) (خمسة أيام قبل الحصاد نخاع العظام)، يتم التعامل مع الفئران المانحة مع 5-FU في استنزاف خلايا النسب التي ارتكبت وحمل المكونة للدم الدراجات الخلايا الجذعية. C) في (-3 D)، يتم حصاد نخاع العظام من عظام الساق والمثقف في 2X بين عشية وضحاها قبل STIM للحث على الدراجات خلية من الخلايا الجذعية المكونة للدم. D) الخلايا المانحة مصابون طاف الفيروسي على (-2) D ووطرد الخلايا في 400 x ج عند 30 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للشارع spinoculation 1. E) في د (-1)، يتم تنفيذ spinoculation 2 الثانية على الخلايا المانحة. بالإضافة إلى ذلك، الفئران المعرضة للإشعاع في استنزاف الخلايا في نخاع العظم المضيف المتخصصة للسماح engraftment الخلية المانحة. تزرع F) الخلايا المانحة Transduced في الفئران المتلقي مسانج المشع على D0. G) إذا فشلت الخلايا المانحة إلى تدبر ثم الموت سوف يحدث بعد يوم 12-14 بعد الزرع إذا تم استخدام الفتاكة جرعة التشعيع. H) يصبح النمط الظاهري مبن واضح من 3 أشهر بعد زرع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
JPG "/>
الشكل 2: تحديد عيار الفيروسية التي التدفق الخلوي. وtransduced خلايا 3T3 مع تركيزات مختلفة من الكفاءة فيروس وتنبيغ يتم مراقبتها عن طريق التدفق الخلوي. أ) يتم جمع الأحداث داخل بوابة الخلية الحية كما تصور من قبل FSC مقابل SSC. يتم استبعاد الخلايا الميتة من تحليل GFP. عرض ب) المدرج الإحصائي٪ GFP لكل وحدة تخزين من طاف الفيروسية التي تم اختبارها. عيار الفيروسي هو مقبول عند 50٪ على الأقل من 3T3 الخلايا GFP + عند المصابين مع تخفيف 1:30 من طاف الفيروسي. باستخدام المعادلة من الخطوة 2.11.6، تم احتساب عيار الفيروسية بناء على عدد خلايا من 400،000 الخلايا. حساب لعيار الفيروسية في التخفيف 01:30 يلي: [(400،000 س 0.56) / 1) × 30] = 6.72 × 10 6 PFU / مل. في خطوة 3.7، إصابة 4 × 10 6 الخلايا مع 2 مل من طاف الفيروسي من شأنه أن يؤدي في كل خلية استقبال 3 الجسيمات الفيروسية.ديزيل / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): والدليل على نجاح الخلية المانحة Engraftment ومبن النمط الظاهري. الفئران المتلقي المشع على قيد الحياة بعد 2 أسابيع بعد زرع تشير engraftment الناجح لحقن الخلايا. أ) يمكن رصدها الخلايا المانحة المزروعة التي كتبها٪ GFP في الدم المحيطي. ب) بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تؤخذ التهم CBC لمراقبة تطور المرض. تم الكشف عن زيادة الصفائح الدموية في وقت مبكر من 2 أشهر بعد زرع في CALRdel52 بالمقارنة مع CALRwt ومكافحة ناقلات الفارغة. C) في وقت إنهاء والفئران CALRdel52 يحمل ملامح كلاسيكية من النمط الظاهري مبن بما في ذلك تضخم الطحال (لا يظهر)، ونخاع العظام فرط، والتوسع في megakaryocyقسم التدريب والامتحانات في نخاع العظام، وتليف نخاع العظام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خطأ فني | الأسباب | نتيجة |
| حقن الفقراء أو الصدمة | زرع الرفض | الفشل زراعة |
| نوعية سيئة من الخلايا المانحة | زرع الرفض | فشل زرع أو الموت |
| انخفاض عيار الفيروس | تنبيغ الفقراء من شهادة الثانوية العامة | الفشل زراعة |
| عالية الإشعاع الجرعة | تشعيع المرض الناجم | الموت |
| منخفضة الإشعاع دوحد ذاتها | زرع الرفض | الفشل زراعة |
| الفئران المانحة القديمة (+12 أسابيع) | انخفاض المدخلات شهادة الثانوية العامة | الفشل زراعة |
الجدول 1: أخطاء الفنية التي يمكن أن تؤدي في الماوس الموت أو فشل زراعة. يسرد هذا الجدول أمثلة من الأخطاء الفنية والأسباب المرتبطة بها التي يمكن أن تحدث مع بروتوكول العظام زرع نخاع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لكيفية إجراء عمليات زرع نخاع العظام في الفئران أن ألخص مرض الضرورية مثل كثرة الصفيحات مع التقدم إلى تليف النقي مع CALRdel52 طفرة باعتباره المحرك من المرض. زراعة ناجحة من الخلايا معربا عن النتائج CALRdel52 في زيادة الصفائح الدموية، وتوسيع الخلايا السوية العرطلة، وتليف نخاع العظام. كما زرع نخاع العظام هي عملية متعددة الخطوات، من المهم أن نعترف الخطوات التي يمكن تجنبها خطأ فني لمنع engraftment الفقراء من الخلايا معربا عن الجينات في المصالح أو حتى الموت الماوس.
وثمة عامل حاسم لنموذج التنبيغ الزرع الناجحة التي غالبا ما يتم تجاهله هو نوعية الفيروس. فيروس مع التتر عالية يسهل كفاءة ترنسدوكأيشن جيدة، وبالتالي أساسا قويا لمرض، في حين باستخدام فيروس المرتبطة عيار منخفضة سيؤدي إلى عدد أقل من الخلايا معربا عن الجينات في المصالح. effici تنبيغency يمكن أن تتعزز الكواشف أن زيادة الاتصالات بين الفيروس والخلايا مثل polybrene وretronectin. ومن المعروف تنبيغ HSCs من الصعب حتى مع وجود تركيزات عالية من الفيروس، الارتجاعي ecotropic فقط يصيب تقسيم الخلايا. والغرض من وسائل الإعلام "قبل STIM" (التي تحتوي على SCF، IL-3، وIL-6) هو للحث على ركوب الدراجات من HSCs هادئة. ويمكن استخدام نظام lentiviral كنهج بديل إذا إصابة الخلايا غير تقسيم أمرا ضروريا.
ومن العوامل الأخرى التي يمكن أن يكون لها تأثير على جيل الفيروس هو نوع من كاشف ترنسفكأيشن المستخدمة. وينبغي أن تحدد الكواشف ترنسفكأيشن الأمثل تجريبيا كما لوحظت اختلافات ملحوظة في سمية خلية بين المجموعات البحثية. وقد أدى الكاشف ترنسفكأيشن المستخدمة هنا في المحصول الفيروسي جيدة مع سمية الخلايا منخفضة. وتشمل الكواشف ترنسفكأيشن المشتركة الأخرى فوسفات الكالسيوم 11 و nonliposomal كاشف ترنسفكأيشن مثل Fugene. يستخدم هذا البروتوكول البلازميد كماناقلات التعبئة والتغليف مع trophisms الأنسجة محددة للماوس والفئران. إذا النظر في النماذج الحيوانية الأخرى لالتنبيغ الزرع، وناقلات التعبئة والتغليف الأخرى مع trophisms أوسع ويمكن أيضا أن تستخدم لتوليد amphotrophic (الجرذان والفئران والبشرية) أو pantrophic (trophisms نطاق واسع) الارتجاعي.
ميزة إضافية لنخاع العظم نموذج التنبيغ الزرع هو القدرة التحقيق الميزة التنافسية لاثنين من السكان المانحة مختلف أو التعبير عن جينات متعددة من الفائدة في وقت واحد باستخدام علامات فريدة من نوعها لتعيين كل السكان من الاهتمام. إجراء عمليات زراعة الأعضاء غالبا ما تستخدم مسانج C57BL / 6 الفئران لتعقب الخلايا المانحة وراء استخدام علامة GFP متكاملة. لأن مسانج C57BL / 6 الفئران يمكن أن تعبر عن علامات الكريات البيض إما CD45.1 أو CD45.2، ويمكن الحصول على الخلايا المانحة من خلفية واحدة وزرع في الآخر. وعلاوة على ذلك، سلالة F1 الهجين يمكن أن تتولد لإنتاج ذرية التعبير عن كل CD45.1 وCD45.2علامات. بدلا من ذلك، ناقلات فيروسات MSCV متاح مع العديد من علامات مختلفة، بما في ذلك unicistronic (على سبيل المثال، FLAG HA) أو bicistronic (على سبيل المثال، GFP، طلب تقديم العروض، YFP، mCherry، hCD4) يبني. ويمكن استخدام هذه التركيبات بشكل متزامن في زرع تنافسية لتمكين التمييز بين السكان المانحة ويمكن أن تكون مفيدة بشكل خاص في الحالات التي يكون فيها التمايز عن طريق التعبير CD45.1 / CD45.2 غير متوفرة، مثل / ج الماوس سلالة BALB.
ميزة أخرى لالتنبيغ الزرع هي القدرة على معرفة مدى مساهمة أنواع معينة من الخلايا لبدء المرض. بينما يصف هذا البروتوكول فقط تنبيغ-زرع نخاع العظم كله، قد تصاميم تجريبية أخرى يستلزم تخصيب أو العزلة من المقصورات شهادة الثانوية العامة المختلفة. في هذه الحالات، فإن عدد الخلايا المانحة تختلف وفقا لعدد السكان المانحة المحددة المستخدمة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا الإنقاذ من متبرع السذاجة ينبغيأن تستخدم كمكمل لدعم الماوس حتى شهادة الثانوية العامة engraftment والتوسع يمكن أن يحدث. ويبين الجدول 2 عدد الموصى بها من الخلايا المانحة للزرع من مختلف نخاع العظام المقصورات 12-15.
| # من خلايا / زرع مستلم | # من خلايا الدعم / زرع مستلم | |
| كله نخاع العظام | 500،000-2،000،000 | ن / أ |
| ج-كيت + | 1،000-10،000 | 200000 |
| لين-ج-كيت + هيئة السلع التموينية-1 + (LKS) | 100-10،000 | 200000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200000 |
الجدول 2. عدد الخلايا المانحة لزرع.
وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن يؤديها زرع الثانوي لتقييم قدرة الخلايا transduced لزرع متسلسل المرض.
تنبيغ الزرع هو طريقة تنوعا للغاية وأكثر تكلفة أسرع بكثير وبشكل كبير كفاءة بالمقارنة مع المعدلة وراثيا، ونماذج تدق في، أو طعم أجنبي. فإنه يسمح احد لتحديد ما إذا كان هذا الجين من الفائدة كافية لإحداث الأورام الخبيثة الدموية، ويمكن استخدامها لتكون نموذجا في الجسم الحي ما قبل السريرية لاختبار الأدوية. فوائد أخرى للتقنية التنبيغ الزرع هي أنه يتجنب التعبير في الخلايا غير المكونة للدم والتي يخدمها الموقع الإدراج فيروسات كعلامة نسيلي. القيود المفروضة على هذه امب تقنيةالبريد مستويات غير الفسيولوجية من الجينات transduced والاختلاف في موقع التكامل بين الجينات 16،17. أخذ كل الفوائد المذكورة أعلاه والقيود في الاعتبار، التنبيغ الزرع هو الخيار الواضح لنمذجة الأولي في الجسم الحي من الجينات المسرطنة للدم المفترضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al.
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L.
- Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).
