This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.
Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene’s role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.
Transduksjon-transplantasjon er en nyttig metode for å modellere hematologisk malignitet i mus. Denne teknikken har vært spesielt verdifullt for å studere myeloide maligniteter som går tilbake til den første demonstrasjonen som ektopisk uttrykk for BCR-ABL1 kunne trofast rekapitulere kronisk myelogen leukemi hos mus 1. Denne teknikken har senere muliggjort omfattende studie av JAK2 V617F og MPL W515K / L mutert myeloproliferativ svulst (MPN).
MPN er en gruppe av hematologisk ondartede sykdommer karakterisert ved overproduksjon av modne myeloide celler og benmargs fibrose. Disse sykdommene vanligvis oppstår fra klonal ekspansjon av en stamcelle som har kjøpt en somatisk mutasjon i enten JAK2, MPL eller CALR. Transduksjon-transplantasjon JAK2 V617F og MPL W515K / L-modellene utstillings kliniske kjennetegn polycytemi vera og myelofibrose 2-5 </ Sup>. Nylig har en musemodell for calreticulin-mutert MPN også blitt generert med transduksjon-transplantasjon metode 6. Disse musene utvikler en essensiell trombocytemi-lignende sykdom med økt blodplater, økt antall av megakaryocytter, og benmargs fibrose. Sammen utgjør disse modellene har ikke bare gitt mulighet til å få innsikt i den molekylære patogenesen av MPN, men også kapasitet til å utvikle og studere therapeutics i en pre-klinisk setting.
Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av transduksjon-transplantasjon metodikk med fokus på CALRdel52 mutasjon. Denne teknikk innebærer transplantasjon av retroviralt transdusert benmargceller som uttrykker det muterte bygge inn i bestrålte syngeniske resipientmus.
Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av hvordan du utfører benmargstransplantasjon hos mus å rekapitulere en essensiell trombocytemi lignende sykdom med progresjon til myelofibrose med CALRdel52 mutasjon som føreren av sykdommen. Vellykket transplantasjon av celler som uttrykker CALRdel52 resulterer i økede blodplater, ekspansjon av megakaryocytter og benmargs fibrose. Som benmargstransplantasjon er en flertrinns prosess, er det viktig å erkjenne trinn hvor teknisk feil kan unngås for å forebygge dårli…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the V Foundation Scholar (AGF) and the MPN Research Foundation (AGF).
CELL LINES | |||
DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
PLASMIDS | |||
EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
CONSUMABLES | |||
27G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
10cm dishes | Fisher | 172931 | |
15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
60mm dishes | Fisher | 150288 | |
Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
5-FU | Fisher | A13456-06 | |
100um cell strainers | Fisher | 22363549 | |
50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
6-well plate | Fisher | 130184 | |
FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
0.45um syringe filters | Fisher | 0974061B | |
Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
EQUIPMENT | |||
BD Accuri C6 | |||
X-ray irradiator |