Introduction
İletimi transplantasyon farelerde hematolojik maligniteler modellemek için yararlı bir yöntemdir. Bu teknik geri BCR-ABL1 ektopik ifadesi sadakatle farelerde 1 kronik miyeloid lösemi özetlemek olabilir ilk gösteriye kadar uzanan miyeloid malignitelerini çalışmak için özellikle değerli olmuştur. Bu teknik daha sonra miyeloproliferatif neoplazmı (MPN) mutasyona uğramış JAK2 V617F ve MPL W515K / L yoğun çalışma kolaylaştırmıştır.
MPN olgun miyeloid hücreleri ve kemik iliği fibrozisi aşırı ile karakterize hematolojik kanserlerde bir grup. Bu hastalıklar, genel olarak, JAK2, MPL veya CALR ya somatik mutasyon kazanmış bir hematopoietik kök hücrenin klonal büyümesi ortaya çıkar. İletimi-transplantasyon JAK2 V617F ve MPL W515K / L modelleri sergi polisitemi vera ve miyelofibrozisin 2 klinik özellikleri - 5 </ Sup>. Son zamanlarda, kalretikülin mutasyonlu MPN bir fare modeli de transdüksiyon transplantasyon yöntem 6 oluşturuldu. Bu fareler artmış trombositler, megakaryositler sayısının artması, ve kemik iliği fibrozisi olan bir esansiyel trombositemi benzeri hastalığı gelişebilir. Birlikte, bu modeller MPN moleküler patogenezi içgörü kazanmak için fırsat değil, aynı zamanda geliştirmek ve klinik öncesi ortamda terapötiklerin çalışma kapasitesi sağlamıştır sadece.
Bu yazının CALRdel52 mutasyon odaklanarak iletim-transplantasyon metodolojisi ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bu teknik, bir mutant ışınlanmış singeneik alıcı farelere yapısını ifade eden retroviral kalıt kemik iliği hücrelerinin nakli kapsar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma onaylanmış ve California, Irvine Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından önerileri doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Tüm işlemler izofluran anestezi altında yapılan ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır.
Ekotropik retrovirüs 1. Üretim
- ticari bir maksi-hazırlık kiti ve sezyum klorür arıtma kullanarak en az 1 ug / ml bir konsantrasyonda yüksek kaliteli plazmidler hazırlayın.
Not: Bu, bir MSCV omurgası (CALR 7,8 bu durumda) ilgili geni kodlayan vektör ve (vs GFP, Neo) seçim işaretleyici olarak ekotropik bir paketleme plazmiti kodlayan gag-pol-env içerir (de ifade burada plazmid gibi). - DMEM çözülme ve genişletme düşük geçiş 293T hücreleri, penisilin / streptomisin (D10) ile,% 10 FBS ve L-glutamin ile takviye edilmiştir. Nemlendirilmiş bir 10 cm doku kültürü ile muamele edilmiş çanak levha 5 x 10 6 hücredoku kültürü, 37 ° C'de kuluçka% 5 CO2.
- kültür içinde, 293T hücreleri genişletmek. Transfeksiyondan bir gün önce, bir vakum şişesi içine, 1 ml PBS ve aspirat süpernatan ilave edilerek hücrelerin yıkanması.
- Hücreleri tripsinize edin için, 2 mi% 0.05 tripsin ekleyip inkübe yemekler 2 nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde - 3 dakika 37 ° C'de ve% 5 CO2.
- , Trypsinization durdurmak 15 ml konik tüp çanak 3 ml D10 ve transfer hücreleri ekleyin. 10 dakika boyunca 400 xg'de hücreleri dönerler.
- 2 ml D10 bir termos ve tekrar süspansiyon hücre pelet haline Süpernatant aspire.
- hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama hücreleri saymak.
- Tohum oluşturulan virüs başına üç 10 cm doku kültürü ile tedavi edilen yemeklerin içine çanak başına 2 x 10 6 hücre.
NOT: En iyi sonuçlar için, hücreler 30 aşmasına izin vermez - transfeksiyon veya kötü virüs verim elde edilebilir anda% 50 izdiham. - Transfeksiyondan hemen önceve bir termos içine aspire medya 5 ml taze D10 ile değiştirin.
- Her 10 cm Petri kabı bağımsız bir 1.5 mL steril mikrosantrfuj tüp hazırlanması transfekte edilmesi.
- Pipet her mikrosantrifüj tüpe düşük serum ortamında 760 ul, daha sonra dikkatlice doğrudan ortama transfeksiyon reaktif 40 ul ekleyin. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında doku kültürü kaputu inkübe edin.
- ilgili gen (boş vektör kullanılarak 15 ug varsa) olarak her bir ilgili tüp plazmid 5 ug MSCV vektörünün 30 ug ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme yavaşça karıştırın. ilave bir 15 dakika boyunca doku kültürü kaputu oda sıcaklığında inkübe edin.
NOT: Daha küçük vektörler yüksek viral verim sahip olma eğilimindedir. - Dikkatle damla damla, ilgili 10 cm Petri kabı içine her reaksiyon (yaklaşık 800 ul) toplam hacmi ekleyin ve hafifçe karıştırın yanlara doğru çanak eğin. nemlendirilmiş doku cu hücreleri dönünlture inkübatör.
- doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir 8 saat veya bir gece inkübe edildikten sonra, yavaşça aspire bir vakum şişesi içine ortam ve taze D10, 10 ml ile değiştirin.
- 48 saat sonra, transfeksiyondan 'de 35 ml şırınganın içine süpernatan toplamak ve hücre debrisini uzaklaştırmak için 0.45 um'lik bir membrandan filtre.
- İSTEĞE BAĞLI: 293T hücreleri ve ek virüs yerleştirin 10 ml taze D10 geri 72 saat sonrası transfeksiyon hasat edilebilir.
- Hiçbir ek virüs tahsil edildiğinde biyolojik tehlike atık 293T hücrelerinin imha edin.
- (Örneğin virüs titresi 1 ml veya BM enfeksiyonu için 6.5 ml için) tek kullanımlık birimlere kısım viral süpernatant. -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza virüsü ile flaş dondurma virüsü.
NOT: onlar büyük ölçüde virüs titresi azaltmak olarak tekrarlanan donma / çözülme döngüleri kaçının.
2. Sitometrisi ile Bağıl Viral titresi belirlemek
- 3T3 hücreleri çözülme ve D10 korumak. 10 cm Kültür hücreleridoku kültürü CO2, 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde çanak muamele edilmiş ve% 5.
- üç kopya halinde viral titresi gerçekleştirin. vakum balona 1 ml PBS ve aspirat süpernatant ekleyerek hücreleri yıkayın, hücreler hazırlamak.
- Hücreleri tripsinize edin için, 2 mi% 0.05 tripsin ekleyip inkübe yemekler nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde, 37 ° C'de ve% 5 CO2.
- , Trypsinization durdurmak 15 ml konik tüp çanak 3 ml D10 ve transfer hücreleri ekleyin. 10 dakika boyunca 400 xg'de hücreleri dönerler.
- 2 ml D10 bir termos ve tekrar süspansiyon hücre pelet haline Süpernatant aspire.
- hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama hücreleri saymak.
- Tohum 3T3 beş 60 mm doku kültürü ile muamele edilmiş kaplarına 1 x 10 5 hücre yoğunluğunda hücreler ve gece boyunca inkübe edilir.
- 3, 1:10 1:30, ve 1: 1 ml toplam D10 kullanılarak çözündürüldü viral süpernatanın 100 dilüsyonları 1 sağlayın. Ayrıca virüssüz kontrolünü içerir.
- beni aspirebir vakum şişesi içine 3T3 hücrelerinden çap ve D10, 4 ml ile değiştirin.
- Viral süpernatan seyreltileri ile 3T3 hücreleri Yerleşimi ve her bir çanak 8 ug / ml bir son konsantrasyona kadar polibren ekleyin. 37 ° C'de doku kültürü kuluçka makinesi içinde 48 saat ve% 5 CO2 inkübe edin.
- flow sitometri ile göreli viral titresi belirlemek:
- Hücreleri yıkamak için, bir vakum balona medya aspire ve 5 ml PBS ekleyin.
- vakum şişe içine PBS aspire. 1 mi% 0.05 tripsin ilave edin ve 2 37 ° C de inkübe - 5 dakika çanak hücreleri ayırmak için.
- plaka kalan hücreleri ayırmak için aşağı 3 ml D10 ekleyin ve yukarı pipet ve. 10 dakika boyunca 400 xg'de FACS tüp ve santrifüj hücreleri aktarın.
- süpernatant süzün ve 3 ml PBS ile yıkama hücreleri. 10 dakika ve decant süpernatant 400 x g'de santrifüj. 200 ul PBS içinde süspanse.
- 9 bir akış sitometre üzerinde çalıştırın hücreler. t içinde 30.000 olayları - 20.000 arasında toplayıno (SSC vs FSC tarafından belirlenen) hücre kapısı yaşamak ve GFP + ve GFP yüzdesini hesaplamak - hücreler.
Not: bir viral titresi olarak kabul edilebilir olarak kabul edilir zaman viral süpernatan verim, en az% 50, GFP + 3T3 hücrelerinin 1:30 seyreltme. Eğer en az% 50, GFP + hücreleri, bu seyreltme sonuçlar daha sonra optimal iletim sonuçlar elde edilebilir. Viral titresini belirlemek için hesaplama Limon ve ark uyarlanmıştır. , Blood (1997) 9. - Virüs titresi = parçacık oluşturan birimler (PFU) / ml = [(GFP + hücrelerin frekansı x 3T3 hücre sayısı) yardımıyla yüzücünün (mi) / hacim] x seyreltme faktörü: göreli virüs titresini belirlemek için denklem kullanır.
3. transduce Donör Kemik İliği Hücreleri
- kemik iliği için donör fareler hazırlamak için (BM) hasat önce% 5 Birleştirilen tamamlayıcı olan bir akış oranı ile izofluran buharlaştırıcı ile fareler anestezi/ Dakika, 1 L oksijen. reaksiyonunu değerlendirmek için ayak sıkıştırın.
NOT: (az 8 haftalık) Donör fareler (8 gün önce transplantasyon) 5 gün önce kemik iliği hasat hazırlanmalıdır. Bir donör fareler en az 2 alıcılar için yeterli hücre sağlar. - Enjekte 150 mg / kg, 27 G x ½ "iğne kullanılarak, anestezi uygulanmış farelerde retroorbital enjeksiyon yoluyla 5-fluorourasil (5-FU).
DİKKAT! 5-FU, bir anti-kanser kemoterapötik madde. Her zaman yetkili bir kimyasal bir davlumbaz veya kanallı biyogüvenlik kabini içinde 5-FU anlaştım. 5-FU ile tedavi edilen farelerin uygun etiketleme belirlemek için kurumun laboratuvar ve hayvan güvenliği komitesi danışın.- yan anestezi fare getirin ve göz kafası biraz çıkıntı şekilde başparmak ve işaret parmağı hem de kullanılarak dizginlemek.
- medial canthus ve yukarı bakacak şekilde eğim ile iğne yanal ile başlayarak, bir 45 ° iğneyimedial yönde açısı ° ve iğne yarım takıldığında durdurun. Yavaşça hücreleri enjekte ve dikkatlice iğneyi kaldır.
NOT: Bu teknik doğru yapılırsa, göz hafifçe geri çekilmelidir ve hiçbir direnç iğne sokulması üzerine keçe edilmelidir. - Böyle şişme veya kanama gibi yaralanma herhangi bir işaret için fareyi inceleyin.
- Hasat kemik iliği 5 gün (transplantasyonundan 3 gün önce), 5-FU tedavisi sonrası.
- / Dakika, 1 L% 5 Birleştirilen ilave oksijen akış hızı ile izofluran buharlaştırıcı ile fareler anestezi. reaksiyonunu değerlendirmek için ayak sıkıştırın.
- servikal dislokasyon ile fare Kurban. kürk ıslak hale gelinceye kadar% 70 EtOH ile cömertçe püskürtülerek fare sterilize edin.
- diseksiyon makas kullanarak, deride bir kesi yapmak ve uzak bacak kaslarından fasya teşrih. Sonra, kalça femur ve ayak bileğinde tibia kesilmesinin fare uzak bacak teşrih.
- virajBir "L" şeklinde bacak ve diseksiyon makas ile diz eklemi keserek her bacak kemiği ayırın.
- her bacak kemiğin distal uçlarında kıkırdak kaldırmak için, kıkırdak devre kadar yavaşça bacak kemik bir uca doğru kas kazımak için kesme makasları kullanın.
- 27 x g ½ inç iğne ile bir şırınga kullanılarak, PBS ile yıkayın, her bacak kemiği 50 ml konik bir tüp içinde 100 uM bir naylon membran üzerinde% 2 FBS ile takviye edilmiştir. Kemik kadar yıkayın kemik hasat hücrelerin sayısını arttırmak için beyaz olur.
- tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 50 mL konik tüp içine naylon membran aracılığı ile hücreler arasında püre bir şırınga pistonu kullanın. diğer fare bacak ile tekrarlayın.
- 4 ° C'de santrifüje hücreler 400 x g'de 10 dakika ve süpernatan atılır. Süspanse BM 5 mi amonyum klorit, potasyum (ACK) tampon içinde, kırmızı kan hücreleri lize etmek için. 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri.
- hücre parçalama durdurmak için PBS ile tüp doldurun. Centri4 ° C'de fuge hücreler 400 x g'de 10 dakika ve süpernatan atılır. BM pelet kırmızı rengi varsa parçalama adımı yineleyin.
- 5 ml PBS içinde süspanse ve hemasitometre kullanarak tripan mavi dışlama hücreleri saymak.
- DMEM% 20 FBS, L-glutamin, penisilin / streptomisin ile takviye içeren 2x ön-Stim kokteyl m başına 2 x 10 6 hücre yeniden süspanse hücre, IL-3, (14 ng / ml), IL-6 (24 ng / mi) ve SCF (112 ng / ml). Plaka 6 yuvalı plakalar içinde oyuk başına 2 mi.
- 37 ° C'de gece boyunca inkübe hücreleri ve% 5 CO2.
- içeren her BM hücrelerinin viral süpernatan 2 ml ilave edilir ve polybrene (ug / ml 8 mg) ekleyin. 1,500 x g'de 90 dakika boyunca 30 ° C 'de dönel Plakalar daha sonra gece boyunca bir doku kültürü kuluçka makinesine plaka dönüş.
- Pipet hücresi konik tüpler içine süspansiyonu ve 400 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj plaka atın yoktur. 2 ml yeniden süspanse hücreleri taze 2x öncesi stim kuyu başına kokteyl ve özgün kuyulara geri dönün. Adımları 3,7-3,9 yineleyerek bir 2. spinoculation gerçekleştirin.
Alıcı Fare içine 4. Nakli Donör Hücreleri
- 24 saat önce BM hücrelerinin enjeksiyonu için ölümcül doz, toplam vücut ışınlaması ile <nakli için singeneik alıcı fareler hazırlayın.
NOT: BALB / c farelerde için ölümcül doz ışınlama tipik 800-900 cGy ve C57B / 6 10 1,000-1,200 cGy olduğunu. doz tipik olarak, en azından 3-4 saat aralıklı ışınlama iki oturum ayrılmıştır. - yavaşça konik tüpler içine süpernatant pipetleme 6 kuyucuğu aşama 3.11, hasat transdüksiyona donör hücrelerinden devam etti. Kalıntı hücreleri toplamak ve 50 ml konik tüp eklemek 1 ml PBS ile iyice her yıkama.
- oyuklara% 0.05 tripsin 0.5 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca doku kültür inkübatörü içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- kuyulara 1 ml D10 ekleyin ve yumuşak pipetleme kalan hücreleri ayırmak. ilgili tüp hücreleri ekleme400 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile adım 4.2 ve pelet s.
- 400 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de PBS ve santrifüj ile hücreler yıkanır. tripan mavi dışlama hemasitometre kullanarak 5 ml PBS içinde süspanse ve saymak hücreleri.
Not: vektör, bir GFP etiketi vardır, o zaman, bir akış sitometresiyle GFP pozitif hücrelerin yüzdesi miktarı belirlenir. - Farelere enjeksiyon için 100 ul PBS - 50, 2 x 10 6 hücre - 5 x 10 5 süspanse edin.
- steril bir 27 G x ½ "iğne kullanılarak anestezi farelere retroorbital enjeksiyon yoluyla hücreleri enjekte edilir.
NOT: Diğer enjeksiyon teknikleri kuyruk ven, dalak, ya da femoral içerir.- reaksiyonunu değerlendirmek için izofluran ve tutam ayak kullanarak fare anestezisi.
- yan fare yerleştirin ve göz kafası biraz çıkıntı şekilde başparmak ve işaret parmağı hem de kullanılarak dizginlemek.
- konik yukarı bakacak şekilde, n eklemek45 ° açıyla medial canthus lateral eedle.
NOT: Bu teknik doğru yapılırsa, göz hafifçe geri çekilmelidir ve hiçbir direnç iğne sokulması üzerine keçe edilmelidir. - Böyle şişme veya kanama gibi yaralanma herhangi bir işaret için fareyi inceleyin.
NOT: Aşağıdaki nakli fareler birkaç hafta için düşük kan sayımı var ve bu yüzden enfeksiyona duyarlı olacaktır. antibiyotikler veya asitleştirilmiş su kullanımı ile profilaksisi kullanılabilmektedir.
- Nakil sonrası bir ay flow sitometri engrafted donör hücreleri bir göstergesi olarak periferik kanda% GFP ölçün.
NOT: Tek başına GFP hücrelerinin engraftman başarısını belirleyemiyor. Viral iletimi başarısız olmuş olabilir ama engraftmınt meydana gelmiş olabilir. Bu durumda, hiçbir GFP + hücreler tespit ama nakledilen hücrelerin melezleşmesi başarılı olacaktır.- periferik kan b 10 ul alıny 21 G x 1 ½ "şırınga ile safen bacak ven delinmesiyle ve pıhtılaşmasını önlemek için PBS içinde 100 mM EDTA ekleyin.
- 10 dakika boyunca buz üzerinde, kan ve eritmek için 1 mi ACK ekleyin. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
- Aspire bir vakum şişesi içinde yüzer ve 1 ml PBS ilave lizis durdurmak için% 2 FBS ile takviye edilmiştir. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
- 100 ul PBS içinde bir vakum şişe ve tekrar süspansiyon pelet aspire süpernatan% 2 FBS ile takviye edilmiştir.
- Bir akış sitometresinde örnekleri çalıştırın ve (SSC vs FSC tarafından belirlenir) canlı hücre kapısının içinde 300.000 olayları toplamak ve GFP + ve GFP yüzdesini hesaplamak - hücrelerinden 9.
- Ayrıca 1 ay nakil sonrası da, hastalığın ilerlemesini izlemek için otomatik bir veteriner hematoloji analizörü 18 kullanılarak tam kan sayımı (CBC) gerçekleştirin.
NOT:% oranında hastalığı izlemeye devam edinAylık periferik kan ve CBC GFP. - Denemeyi sonlandırmak için, yanıt değerlendirmek için izofluran ve tutam ayak kullanarak fare uyutmak. histopatoloji için servikal dislokasyon ve hasat dalak ve kemik iliği tarafından fare Kurban.
NOT: Deneyin uzunluğu öznel ve bitiş tarihi beklenen hastalık fenotipi dayalı değerlendirilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
transdüksiyon Nakil tekniği hücreler, ilgilenilen geni eksprese eden alıcı farelerin hematopoietik sulandırma ile sonuçlanır. Şekil 1 MPN mutasyona uğramış kalretikulin transdüksiyon-transplantasyon fare modelinin bir özetini göstermektedir. Kısaca, CALRwt ya CALRdel52 eksprese retrovirüs bir C57B / 6 verici fare BM hücrelerini enfekte etmek için kullanılır. Transduced hücreler ilk ay sonrası nakli sırasında meydana ışınlanmış C57B / 6 alıcı fare ve donör hücre engraftment nakledilmektedir. 10 ay transplantasyon sonrası - bir hastalık fenotipi kanıtı belirgin 3 ay 6 kemik iliği fibrozisi ardından fareler sergi trombositleri ve megakaryokit artan post-transplant, olur. donör hücreleri aşılamak için başarısız olursa, fare ölüm nakli takip eden ilk 2 hafta içinde ortaya çıkabilir. Enjeksiyon sırasında uygun olmayan enjeksiyon veya travma ek olarak, diğer teknik hatalar transdüksiyonu zayıf melezleşmesini neden olabilird hücreleri veya fare ölüm. bu en hematopoietik hücreler yerine alıcı verici kökenli olacak oluşursa, bu, alıcı farelerin optimal ışınlama bulunmaktadır. Öte yandan, alıcı aşın ışınlama kaynaklı hastalık veya ölüm geliştirmek için fareler neden olabilir. Düşük viral titreler donör hücrelerin düşük enfeksiyon verimi ile sonuçlanır. Sonuç olarak donör hücreleri düşük sayıda ilgilenilen geni ifade edecek ve böylece fareler istenen bir fenotip gösteren olmayabilir. Bu nedenle, yüksek titrelerle virüsü donör hücreleri nakletmek için kullanılan çok önemlidir. Şekil 2% GFP canlı hücre kapısından toplanan olaylardan hesaplanan göreli viral titresi nasıl hesaplanacağını göstermektedir. (: 3 seyreltme oranı: 1) hem de hücre başına tek bir viral partikül titreleri (1:30, 1:10 ve 1: 100 süpernatan) Şekil 2B, birden fazla virüs hücre başına parçacık titresi gösterilmektedir. İdeal olarak, en az% 50, GFP + hücreleri DETEC olurViral süpernatant 01:30 seyreltme ile ted. Şekil 3 CALRdel52 fareler artmış trombositler ile MPN fenotip sergileyen başarılı bir nakil alıcının kanıt gösterir, kemik iliğinde megakaryokit artmış ve kemik iliği fibrozu.
Şekil 1: Myeloproliferatif Neoplaziler İletimi-Transplantasyon Fare Modeli Genel Bakış. Transplanttan önce 2 hafta - A) Retrovirüs üretimi ve virüs konsantrasyonunun belirlenmesi 1 oluşur. B) D (-8) (beş gün), kemik iliği hasattan önce verici farenin soyu işlenen hücreleri tüketir ve hematopoetik kök hücre döngüsünün uyarılması için 5-FU ile muamele edilir. D (-3), c), kemik iliği hematopoetik kök hücre hücre döngüsünün uyarılması için bacak kemiklerinin elde edilmiş ve 2 x ön-Stim gece boyunca kültürlenir. D) Donör hücreleri D (-2) viral süpernatan bulaştırılır ve hücreler, 1. spinoculation için 1.5 saat boyunca 30 ° C'de 400 x g'de santrifüje tabi tutulur. D E) (-1), 2. bir spinoculation donör hücreleri üzerinde gerçekleştirilir. Ayrıca, fareler donör hücre engraftman sağlamak için konak kemik iliği niş hücreleri yok etmek ışınlanmış vardır. F) kalıt donör hücreleri D0 üzerinde ışınlanmış singeneik alıcı farelere nakledilen. G) donör hücreleri aşılamak için başarısız olursa o zaman ölüm 12. günde ortaya çıkar - öldürücü doz ışınlama kullanılmış ise nakli aşağıdaki 14. H) MPN fenotip 3 ay transplantasyon sonrası ile belirginleşir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
jpg "/>
Şekil 2: Akış Sitometrisi ile virüs konsantrasyonunun belirlenmesi. 3T3 hücreleri akış sitometrisi ile izlenir virüsü ve transdüksiyon verimliliği farklı konsantrasyonları ile iletilir. SSC vs FSC tarafından görüntülenmiştir olarak A) Olaylar canlı hücre kapısının içinde toplanır. Ölü hücreler GFP analiz dışında tutulmuştur. B) Histogramlar test viral süpernatant her birim için% GFP göstermektedir. Bir viral titresi virüs süpernatan 1:30 seyreltme ile enfekte olduğunda 3T3 hücrelerinin en az% 50, GFP + zaman kabul edilebilir. Aşama 2.11.6 denklem kullanılarak viral titre 400.000 hücre bir hücre sayımına bağlı olarak hesaplanmıştır. Bir 01:30 seyreltme viral titresi için hesaplama aşağıdaki gibidir: [(400.000 x 0.56) / 1) x 30] = 6.72 x 10 6 PFU / ml. 3 viral partikülleri alan her bir hücre olmasına neden olur, viral süpernatanın 2 ml 4 x 10 6 hücre enfekte adım 3.7 başı.iles / ftp_upload / 54624 / 54624fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Başarılı Donör Hücre Aşı ve MPN Fenotip kanıtı. 2 hafta ötesinde post-transplant kalan ışınlanmış alıcı fareler enjekte edilen hücrelerin başarılı bütünleşmesini gösterir. A) nakledilen verici hücreler periferik kanda% GFP ile izlenebilir. B) Ayrıca, CBC sayımı hastalığın ilerlemesini izlemek için alınmalıdır. CALRwt ve boş vektör kontrolü ile karşılaştırıldığında artmış trombositler CALRdel52 kadar erken 2 olarak ay transplantasyon sonrası tespit edilir. C) Fesih zamanda, CALRdel52 fareler splenomegali (gösterilmemiştir), kemik iliği hiper-, megakaryocy genişlemesi de dahil olmak üzere MPN fenotip klasik özelliklerini sergilemekkemik iliği TES ve kemik iliği fibroz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| teknik hata | nedenler | Sonuç |
| Kötü Enjeksiyon veya Travma | nakli Reddetme | nakli Hatası |
| Donör Hücrelerinin kötü kalite | nakli Reddetme | Nakli Başarısızlık ya da Ölüm |
| Düşük Virüs Titre | HSC yoksul İletimi | nakli Hatası |
| Yüksek Işınlama Doz | Işınlama kaynaklı hastalık | Ölüm |
| Düşük Işınlama Dose | nakli Reddetme | nakli Hatası |
| Alt donör farelerden (12 hafta) | Düşük HSC Girdi | nakli Hatası |
Tablo 1: Fare Ölüm veya Nakli başarısızlıkla sonuçlanabilir Teknik Hatalar. Bu tablo kemik iliği nakli protokolü ile meydana gelebilecek teknik hataların örneklerini ve bunların ilişkili nedenleri listeler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, hastalığın şoförü olarak CALRdel52 mutasyonu myelofibrotik doğru ilerledikçe bir esansiyel trombositemi gibi hastalık özetlemek için farelerde kemik iliği nakli nasıl gerçekleştirileceği ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. artan trombositler, megakaryositler genişlemesi ve kemik iliği fibrozis CALRdel52 sonuçlarını ifade eden hücrelerin başarılı nakli. Kemik iliği nakli çok aşamalı bir süreçtir gibi, teknik bir hata çıkar, hatta fare ölüm geni eksprese eden hücrelerin kötü engraftman önlemek için önlenebilir adımlar kabul etmek önemlidir.
genellikle gözden kaçan, başarılı bir iletim-transplantasyon modeline bir kritik faktör virüsü kalitesidir. yüksek titrelerin olduğu virüs ilgili geni eksprese eden daha az hücre neden düşük titreye ilişkili bir virüs kullanılarak ise, iyi bir transdüksiyon verimliliği ve hastalık için bu şekilde güçlü bir temel kolaylaştırır. iletimi efficiEnsi virüsü ve polibren ve retronectin gibi hücreler arasında teması geliştirmek reaktiflerle arttırılabilir. HKH'lerin İletimi bile virüsün yüksek konsantrasyonlarda zor olduğu bilinen, ekotropik retrovirüs sadece bölünen hücreleri enfekte eder. (SCF, IL-3 ve IL-6 ihtiva eden) "pre-stim" medyanın amacı durgun HKH'lerin bisiklet neden olmaktır. lentiviral sistemi bölünmeyen hücrelerin enfeksiyonu, gerekli ise, alternatif bir yaklaşım olarak kullanılabilir.
Virüs üretimi üzerinde bir etkiye sahip olan diğer bir etken kullanılan transfeksiyon reaktifi türüdür. Hücre toksisitesinde belirgin farklılıklar araştırma grupları arasında gözlenmiştir optimal transfeksiyon reaktifleri ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. Burada kullanılan transfeksiyon reaktifi düşük hücre toksisitesi ile iyi viral verimle sonuçlanmıştır. Diğer yaygın transfeksiyon reaktifleri gibi Fugene kalsiyum fosfat 11 ve nonliposomal transfeksiyon ayıracı bulunur. Bu protokol, plazmid kullanırFare ve sıçan için spesifik doku trophisms ambalaj vektörü. transdüksiyon nakli için diğer hayvan modelleri dikkate ise, daha geniş trophisms diğer ambalaj vektörleri de amfotrofık (fare, sıçan, insan) ya da pantrophic (geniş aralık trophisms) retrovirüs oluşturmak için kullanılabilir.
Kemik iliği nakil nakli modeli bir avantajı yeteneği iki farklı donör popülasyonlarının rekabet avantajı araştırmak ya da eş zamanlı olarak ilgi her nüfusu belirlemek için benzersiz belirteçleri kullanarak ilgi birden genleri bildirmektir. Bu tür nakiller genellikle entegre bir GFP işaretleyici kullanılması dışında donör hücreleri izlemek için konjenik C57BL / 6 fareleri kullanır. konjenik C57BL / 6 fareleri CD45.1 ya CD45.2 ya lökosit işaretlerini ifade edebilir, çünkü verici hücreleri bir arka plan elde edilen ve transplante edilebilir. Ayrıca, bir melez F1 soyu CD45.1 ve CD45.2 hem de ifade yavrular elde etmek oluşturulabilirbelirteçler. Alternatif olarak, MSCV retroviral vektörü (örneğin, BAYRAK HA) ya da bicistronic (örneğin, GFP, RFP, YFP, mCherry, hCD4) unicistronic oluşturur dahil olmak üzere birçok farklı etiketler ile kullanılabilir. Bu yapılar donör nüfus arasında ayrımcılık sağlamak için rekabetçi nakli aynı anda kullanılabilir ve bu tür BALB / c fare suşu olarak CD45.1 / CD45.2 ifadesi yoluyla farklılaşma mevcut olmadığı durumlarda, özellikle yararlı olabilir.
transdüksiyon nakli diğer bir avantajı, hastalığın başlangıcında özel hücre tiplerinin katılım araştırmak yeteneğidir. Bu protokol, tüm kemik iliği sadece iletim-transplantasyon tarif ederken, diğer deneysel tasarımlar, farklı HSC bölmeleri zenginleştirme veya izolasyon gerektirebilir. Bu gibi durumlarda, donör hücrelerin sayısı, kullanılan spesifik verici nüfusa göre değişir. Ayrıca, bir naif bir donörden alınan kurtarma hücreleri gerekirek olarak kullanılacak HSC engraftman ve oluşabilecek genişleme kadar fareyi destekleyecek. 15 - Tablo 2, çeşitli kemik iliği nakli için donör hücreleri önerilen sayısı 12 bölmeleri özetliyor.
| Hücreleri # / Nakli Alıcı | Destek Hücreleri # / Nakli Alıcı | |
| Tüm Kemik İliği | 500,000-2,000,000 | N / A |
| c-Kit + | 1,000-10,000 | 200.000 |
| Lin-c-Kit + Sca-1 + (LKS) | 100-10.000 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD48 - SP | 1-100 | 200.000 |
| LKS CD150 + CD34 - | 1-100 | 200.000 |
Donör Hücreleri 2. sayısı nakli için Tablo.
Ayrıca, ikincil nakil da seri hastalık nakli için kalıt aktarımlı hücrelerin özelliklerini belirlemek için gerçekleştirilebilir.
İletimi-transplantasyon, knock-in veya ksenograft modelleri transgenik kıyasla çok daha hızlı ve çok daha fazla maliyet etkin bir çok yönlü bir yöntemdir. Bu bir hızla ilgi konusu gen, bir hematolojik habisliğin oluşturmak için yeterli olup olmadığını belirlemek için, ilaçlar test etmek için in vivo ön-klinik modeli olarak kullanılabilir sağlar. transdüksiyon-transplantasyon tekniği diğer faydaları dışı hematopoetik hücrelerde ve retroviral ekleme sitesi klonal belirteç olarak hizmet ettiğini ifade önler vardır. Bu teknik dahil olmak SınırlamalarıE fizyolojik olmayan transduced genin düzeyleri ve gen 16,17 entegrasyonu sitesinde farklılıklar. Hesaba yukarıda belirtilen yararları ve sınırlılıkları, tüm alarak, transdüksiyon-transplantasyon varsayılan hematopoetik onkogenlerin ilk in vivo modelleme için bariz bir seçimdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| DMEM | Corning | MT-10-013-CV | |
| 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| 3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | |
| Plasmids | |||
| EcoPak, also known as pCL-Eco | Addgene | 12371 | Retroviral packaging cell lines, such as EcoPack 2-293, may be used in place of the EcoPak plasmid and standard 293T cells. Additional γ-retrovirus envelope and packaging plasmids are available from Addgene and others. |
| MSCV-IRES-GFP (MIG) | Addgene | 20672 | Additional γ-retroviral transfer plasmids are available from Addgene and others. |
| Consumables | |||
| 27 G x 1/2" needles | BD | 305620 | |
| Fetal bovine serum | Corning | MT-35-010-CV | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Corning | MT-30-009-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | MT-25-052-CI | Can be homemade |
| PBS | Corning | MT-21-031-CV | |
| 10 cm dishes | Fisher | 172931 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 12565268 | |
| 60 mm dishes | Fisher | 150288 | |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | |
| 5-FU | Fisher | A13456-06 | |
| 100 µm cell strainers | Fisher | 22363549 | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 12565270 | |
| 6-well plate | Fisher | 130184 | |
| FACS tubes | Fisher | 14-959-5 | |
| 0.45 μm syringe filters | Fisher | 0974061B | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| ACK buffer | Lonza | 10-548E | Can be homemade |
| Recombinant murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant murine SCF | Peprotech | 250-03 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365809001 | Transfection reagent |
| 1.5 ml centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Equipment | |||
| BD Accuri C6 | |||
| X-ray irradiator |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science(New York, N.Y.). 247 (4944), 824-830 (1990).
- Wernig, G., Mercher, T., Okabe, R., Levine, R. L., Lee, B. H., Gilliland, D. G. Expression of Jak2V617F causes a polycythemia vera-like disease with associated myelofibrosis in a murine bone marrow transplant model. Blood. 107 (11), 4274-4281 (2006).
- Lacout, C., Pisani, D. F., Tulliez, M., Gachelin, F. M., Vainchenker, W., Villeval, J. L. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood. 108 (5), 1652-1660 (2006).
- Zaleskas, V. M., Krause, D. S., et al. Molecular pathogenesis and therapy of polycythemia induced in mice by JAK2 V617F. PloS One. 1, e18 (2006).
- Bumm, T. G. P., Elsea, C., et al. Characterization of murine JAK2V617F-positive myeloproliferative disease. Cancer Res. 66 (23), 11156-11165 (2006).
- Marty, C., Pecquet, C., et al. Calreticulin mutants in mice induce an MPL-dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis. , Blood. (2015).
- Klampfl, T., Gisslinger, H., et al.
- Araki, M., Yang, Y., et al. Activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood. , (2016).
- Limón, A., Briones, J., et al. High-Titer Retroviral Vectors Containing the Enhanced Green Fluorescent Protein Gene for Efficient Expression in Hematopoietic Cells. Blood. 90 (9), 3316-3321 (1997).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Challen, G. A., Boles, N., Lin, K. K., Goodell, M. A. Mouse Hematopoietic Stem Cell Identification And Analysis. Cytometry A. 75 (1), 14-24 (2009).
- Ergen, A. V., Jeong, M., Lin, K. K., Challen, G. A., Goodell, M. A. Isolation and characterization of mouse side population cells. Methods Mol. Bio. (Clifton, N.J.). 946, 151-162 (2013).
- Weksberg, D. C., Chambers, S. M., Boles, N. C., Goodell, M. A. CD150- side population cells represent a functionally distinct population of long-term hematopoietic stem cells. Blood. 111 (4), 2444-2451 (2008).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Li, J., Kent, D. G., Chen, E., Green, A. R. Mouse models of myeloproliferative neoplasms: JAK of all grades. Dis. Model. Mech. 4 (3), 311-317 (2011).
- Mullally, A., Lane, S. W., Brumme, K., Ebert, B. L.
- Scil animal care company GmbH. , Source: http://www.scilvet.us/company-downloads (2005).
