Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En nedsänkt filterpapper Sandwich för långsiktigt Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54636
Automatic Translation
*1, *1, 2
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam, MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center Amsterdam
* These authors contributed equally

Abstract

På grund av sin tillgänglighet, låg kostnad, platt geometri, och transparens, ex ovo kycklingembryo har blivit en stor ryggradsdjur modell för studier av morfogenetiska händelser, såsom gastrulation 2, neurulation 3-5, somitogenesis 6, hjärta bock 7, 8 och hjärna bildning 9-13, under tidig embryogenes. Nyckeln till att förstå morfogenetiska processer är att följa dem dynamiskt av time-lapse avbildning. Förvärvet av tidsförlopp filmer av chick embryo ex ovo har begränsats antingen korta tidsfönster eller behovet av en inkubator för att styra temperatur och fuktighet runt embryot 14. Här presenterar vi en ny teknik för att kultur kycklingembryon ex ovo för högupplöst time-lapse avbildning genomfallande ljusmikroskop. Nedsänkt filterpapper sandwich är en variant av den väletablerade filterpapper bärare teknique (EG-kultur) 1 och medger odling av kycklingembryon utan behov av en klimatkammare. Embryot är inklämd mellan två identiska filterpappersbärare och hålls helt nedsänkt i en enkel, temperaturstyrd mediet som täcks av ett skikt av lätt mineralolja. Med utgångspunkt från primitivstrimman stadiet (Hamburger-Hamilton steget 5, HH5) 15 upp till åtminstone 28-somit stadium (HH16) 15, kan embryon odlas med antingen deras ventrala eller ryggsidan uppåt. Detta möjliggör förvärv av tidsförlopp filmer som omfattar cirka 30 timmar av embryonal utveckling. Representativa time-lapse ramar och filmer visas. Embryon jämförs morfologiskt till ett embryo odlas i standard EG-kultur.

Nedsänkt filterpapper sandwich ger en stabil miljö för att studera tidig dorsala och ventrala morfogenetiska processer. Det möjliggör också för levande fluorescens avbildning och micromanipulations, såsom mikro, pärla implantation, mikroinjektion, geners uttryck, och elektroporering, och har en stor potential att kombineras med dopp mål för laserbaserad avbildning (inklusive ljus ark mikroskopi).

Introduction

Embryogenes har fascinerat människan sedan början av historien. Hur ser strukturen och morfologin hos ett embryo utvecklas på ett sådant väldefinierad tids- och rums sätt? Kycklingembryo har blivit en av de klassiska ryggradsdjur djurmodeller för embryogenes av flera skäl: Det är lätt tillgänglig, billig, transparent i sin linda, och tillgängligt för experimentella manipulationer, eftersom den utvecklas utanför modern. Dessutom har det en nästan platt geometri under tidiga morfogenetiska händelser, såsom hjärta och hjärna bildning, gastrulation, neurulation och somitogenesis 15.

Morfogenetiska processer kan förstås bäst om de studeras dynamiskt, till exempel genom förvärv av tidsförlopp bilder. Kycklingembryo kan visualiseras i ovo 16 men med dålig tillgänglighet för experimentella manipulationer och begränsad sikt för överföring ljusmikroskop avbildning. Därför avskiljaal tekniker har föreslagits till kultur kycklingembryon ex ovo, antingen i hela gulan odlingssystem 13,17 - 19 eller som Explantation kulturer 1,20 - 23. I hela äggula odlingssystem förblir embryot på toppen av den intakta äggula och hela innehållet i ägget överförs till en annan behållare för inkubation. Denna behållare kan vara ett surrogat äggskal 17, en petriskål 19, eller en hängmatta av plast klänga wrap 13,18. Embryon i hela äggula kulturer kan idealt odlas tills kläckning och är tillgängliga för micromanipulations. Dessa tekniker är särskilt användbara för att studera utvecklingen av embryon efter initieringen av blodcirkulationen (vilket ökar kontrasten), medan yngre embryon förblir svåra att visualisera. Dessa tidiga embryon kan avbildas bäst om de skärs ut från gulan och odlades som in vitro explantaten. Explantaten är lättillgängliga för experimental manipulationer och kräver mindre utrymme för odling. Under många år, en teknik uppfunnen av Denis Nytt i 1955 och dess variationer var gyllene standarder för Explantation odlingsmetoder för kycklingembryon, vilket gör embryot tillgänglig för time-lapse mikroskopi och mikro insatser 20,21. Trots sin stora framgång, är New teknik relativt krävande och tidskrävande. Den BLASTODERM ofta lossnar när vitellinmembranet, bärande den BLASTODERM, sträcks runt en glasring för att uppnå den rätta spänningen 1. Dessutom kan embryot endast odlas med dess ventrala sida upp. EG (Early Chick) kultur, en teknik senare utvecklats av Chapman och Collignon 1, kringgår den sträckning av vitellinmembranet genom användning av ett filterpappersbärare med en central öppning. Filterpapper fäster vitellinmembranet, och därigenom bibehålla dess naturliga spänning, och omger embryot som en tavelram en.Embryon odlas därefter på ett agar-äggvita botten, vanligen med sin ventrala sidan uppåt. Odling ryggsidan uppåt verkar bara möjligt för embryon vid HH8 15 och äldre. Många grupper har anpassat filterpapper bäraren till deras behov, till exempel genom att ersätta den agar-albumin botten med ett stöd gjord av kirurgiska sutur fibrer 24 eller en kollagenbelagd membran 25. Ofta är embryon odlade med nya teknik eller med EG-kulturen utsätts, med sin rygg eller ventrala yta för luft för att underlätta syrediffusion 1,20. Dessa Explantation kulturer måste hållas i en fuktig atmosfär för att undvika avdunstning av mediet och för att förhindra att embryot inte torkar ut. Detta uppnås genom att inkubera plattan med explantatet kultur i en större petriskål med fuktat mjukpapper 1. Förvärvet av tidsförlopp bilder av dessa embryon kräver antingen användning av en klimatkontrollerad inkubator runt hela mikroskop eller ett temperamentratur styrd behållare med en uppvärmd lock för att förhindra kondens i ljusvägen 14. Däremot kan kycklingembryon också utveckla ex ovo helt nedsänkt i odlingsmedium som filterpapper kulturer 25, inklämt mellan ett skikt av tung mineralolja och äggvita i anpassningar i New teknik 2,21, eller som vikta BLASTODERM explantat i "Cornish Pasty kultur "23,26, utan direkt kontakt med luften.

Nedsänkt filterpapper sandwich är en ny variant av filterpappersbärare teknik. Genom att kombinera tidigare kunskap om odling kycklingembryon ex ovo, det gör klimatkontrollerade inkubator och uppvärmt lock onödigt. Embryot är inklämd mellan två identiska (laserskurna) filterpappersbärare 24 och odlas helt nedsänkta i en enkel odlingsmedium (Pannett-Compton saltlösning 27,28 och tunna äggvita i en 3: 2-förhållande) i en temperaturstyrd innehållerer. Ett skikt av lätt mineralolja flyter på toppen av mediet förhindrar avdunstning 2,21 och minimerar värmeförlust till omgivningen. Den nedre delen av behållaren har ett glasfönster, och hela installationen utförs på en upprätt långa arbetsavstånd zoom mikroskop. Denna inställning gör det möjligt förvärv av högupplösta ljusfält och mörkfälts time-lapse filmer på cirka 30 timmar av embryonal utveckling, från tidig primitivstrimman stadiet till 28-somit steget (motsvarande Hamburger Hamilton steg 5-16, HH5-16 ) 15. Embryon kan odlas lika bra med sin ventrala eller ryggsidan uppåt. Därför embryon är tillgängliga för observation och manipulering av ventrala (t ex tidigt hjärta 7,8 och somitogenesis 6) och rygg (t.ex. sen gastrulation 2, neuralrörsdefekter stängning 3-5, och hjärnans tidiga 9-13) utveckling. Nedsänkt filterpapper smörgås provides en enkel och stabil miljö för mikro, pärla implantation, mikroinjektion, geners uttryck, och elektroporering studier. Dess imaging potential kan skjutas mycket längre genom att använda laserbaserad avbildning (inklusive ljus ark mikroskopi) och dopp mål.

Protocol

Alla experimentella procedurer genomfördes i enlighet med den nederländska Försök på djur lagen.

OBS! Nedsänkt filterpapper sandwichmetoden ändras från en.

1. Undervattensfilterpapper Sandwich Förberedelse

  1. Pannett-Compton (PC) -saline 27,28
    1. Bereda stamlösningar A (1 L av ultrarent H2O, 121 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,42 g CaCl2 • H2O, och 12,7 g MgCl2 · 6H 2 O) och B (1 L av ultrarent H2O, 2,365 g Na 2 HPO 4 · 2 H2O, och 0,188 g NaH 2 PO 4 · 2 H2O) i rena 1-L flaskor. Förvara dem vid 4 ° C.
    2. Förbereda ett L av PC-saltlösning genom att blanda 900 ml ultrarent H2O med 40 ml av stamlösning A och 60 ml av stamlösning B (i denna ordning för att undvika utfällning). Förbered PC-saltlösning nyligen frabout förrådslösningar A och B varje vecka.
      OBS: Stamlösningar kan lagras vid 4 ° C i flera månader. Autoklavering och / eller lägga till antibiotika eller antimykotika inte är nödvändiga.
  2. Inkubation av befruktade hönsägg
    1. I en fuktad inkubator, lägga ägg på deras sida och inkubera dem vid 37,5 ° C till dess att de når den önskade åldern.
      OBS: Förvara ägg inte längre än två veckor (företrädesvis 12-15 ° C) före experimentet, eftersom kläckbarhet minskar avsevärt
  3. Filterpappersbärare (anpassad från 1)
    1. Om tillgängligt, använd en laserskärmaskin för att skära timglasformade filterpappersföretag från tjockt filtreringspapper (28 mm x 22 mm). Taper bredden i mitten från 22 mm till 10,4 mm. Skära ut en central elliptisk öppning (10,6 mm x 5,5 mm), med den längre axeln hos ellipsen orienterad parallellt med den större sidan av filterpappersbärare (Figur 1-M).
      1. Eventuellt förbereda en kartong stencil med rätt mått och överföra dess kontur och av det centrala hålet till tjockt filtreringspapper med hjälp av en penna. Klipp ut filterpapper bärare med användning av fina saxar.
    2. Skär två identiska filterpappersbärare för varje embryo att explanterade. Förbered extra filterpappersföretag som backup i fall ett embryo försvinner under explantation.
  4. Temperaturstyrd oljebad (på dagen för experimentet)
    1. Placera den temperaturstyrda bägare i centrum av den motoriserade xy-steg av upprätt zoommikroskop och anslut bägaren till dess temperaturregulator.
    2. Sätta fyra stora ringar av rostfritt stål (30 mm ytterdiameter, 4 mm i höjd, 1,5 mm väggtjocklek) i en 6 cm Petriskål för att agera som vikter och placera skålen i mitten av den temperaturstyrda bägare.
      OBS: Denna petriskål tjänar bara som en platshållare för att justera olje level.
    3. Fyll den temperaturstyrda bägare med 130 ml lätt mineralolja. Justera oljenivån vid behov så att den slutar ungefär 3 mm under den övre kanten av den 6 cm petriskål.
    4. Ta bort 6 cm petriskål från den temperaturstyrda bägare och ställa in temperaturen till 40 ° C.

2. Nedsänkt filterpapper Sandwich Produktion

  1. Odlingsmedium (på dagen för experimentet)
    1. Häll 30 ml av PC-saltlösning (såsom framställd i steg 1.1.1 till 1.1.2) i en 50 ml centrifugrör. Förbered en 50 ml centrifugrör fylld med 30 ml PC-saltlösning för varannan embryon explanterade.
    2. Försiktigt knäcka en icke ruvade ägg i en 10 cm petriskål.
    3. Skörda tunna äggvita genom att flytta en plast överföringspipett längs väggarna i petriskålen och sugande i de tunna äggvita. Samla 30 ml tunna äggvita i en 50 ml centrifugrör för varje två embryon som skall explanteras. Se till att få endast thin äggvita.
      OBS: Vanligtvis 3 - 4 ägg tillåta skörd av cirka 30 ml av tunna äggvita.
    4. Häll 20 ml av tunna äggvita i varje PC-saltlösning fyllt 50 ml centrifugrör (framställd i steg 2.1.1).
    5. Blanda PC-saltlösning med de tunna äggvita genom att försiktigt vända rören flera gånger. Låt det nöja sig med flera minuter och kontrollera om blandningen, kallad odlingsmedium härifrån och framåt, är tydlig. Om odlingsmediet är inte klart, bered nya PC-saltlösning från stamlösningen och skörda färska tunna äggvita.
  2. Placera två små ringar av rostfritt stål (20 mm ytterdiameter, 4 mm i höjd, 1,5 mm väggtjocklek, 6,5 mm gap i ringen) så långt ifrån varandra som möjligt i en ny 6 cm plast petriskål och fyll den med 22 ml av kultur medium (som framställts i steg 1.4.1 till 1.4.4) med användning av en 25 ml plastpipett (Figur 1-H). Se till att skräp som samlats på toppen av mediet förblir i centrifugröret.
  3. Ta bort eventuellt skräp or bubblor från mediet med hjälp av en plast överföringspipett.
  4. Fylla en 10 cm petriskål med 75 ml PC-saltlösning (som skall användas i steg 2,15).
  5. Ta bort ett ägg från inkubatorn och låt den vila på bänken på sin sida under 1 min för att låta embryot komma till början av äggulan.
  6. Noggrant knäcka ägget i en petriskål (Figur 1-A). Blötlägg kanten av en bit fint silkespapper i de tjocka äggvita och centrera BLASTODERM genom att dra om det behövs.
  7. Ta bort det mesta av de tunna och tjocka äggvita från petriskål med en plast överföringspipett (med spetsen avskuren för att underlätta spridningen av de tjocka albumin).
  8. Skapa ett fönster i de tjocka äggvita runt embryot genom att försiktigt torka bort de tjocka albumin med en bit papper, rör sig bort från centrum (Figur 1-B). Förhindra mjukpapper från att fästa till vitellinmembranet.
  9. Med hjälp av en pincett, försiktigt placera en filterpappersbärare på vitelline membran runt embryot, med den längre axeln för den elliptiska öppningen parallellt med främre-bakre axeln av embryot (Figur 1-C).
  10. Nypa en spets av de nagelsaxar genom vitellinmembranet nära filterpappersbärare och skär snabbt runt hela filterpappersbärare (fig 1-D).
  11. Med användning av pincett, lyfta filterpapper bäraren bort från gulan i en sned riktning parallell med den främre-bakre axeln av embryot (Figur 1-E).
  12. Vrid filterpappersbäraren runt för att ha den ventrala sidan av embryot på toppen och dränka det i PC-saltlösning. Sänk ned filterpapper bäraren längs främre-bakre axeln av embryot i en sned riktning.
  13. Bli av med alla äggulan fortfarande fäst vitellinmembranet och BLASTODERM genom att försiktigt spola det med PC-saltlösning från en plast överföringspipett. Håll helheten av filterpappersbärare nedsänkt i enll gånger (figur 1-F).
  14. Ta bort filterpappersbärare från PC-saltlösning längs främre-bakre axeln av embryot i en sned riktning och bli av med överskottsvätskan genom att badda kanten av filterpappersbärare på en tissuepapper.
  15. Hålla filterpappret horisontellt, med den ventrala sidan av embryot vänd uppåt, och placera ett annat filter pappersbärare på toppen av den första en, med hjälp av ett andra par av pincett. Deras öppningar ska matcha exakt, varisandwich embryot mellan de två skikten av filterpapper (Figur 1-G).
  16. Omedelbart dränka filtrerpappret bäraren sandwich in i odlingsmediet i en sned riktning utmed den främre-bakre-axeln av embryot. Placera den i området som sträcker sig över utrymmet mellan de två stålringar (Figur 1-H).
  17. Fäst filterpapper smörgås genom att placera två stålringar ovanpå de andra två, och se till att öppning med embryo förblir helt avtäckt (Figur 1-I).
  18. Kontrollera medelhög nivå och se till att den övre distans bara är nedsänkt i mediet. Om det är nödvändigt, lägga till eller ta bort små mängder av medium.
  19. Placera försiktigt petriskål i mitten av temperaturreglerade oljebad och stabilisera skålen i sidled genom att placera tre stora rostfria ringar (30 mm yttre diameter, 4 mm i höjd, 1,5 mm väggtjocklek) bredvid skålen i oljan . Se till att stålringarna vidrör sidorna av skålen (Figur 1-J).
  20. Långsamt pipettera ungefär 6 ml lätt mineralolja på toppen av mediet med en plast överföringspipett, så att mediet är täckt med ett kontinuerligt skikt av mineralolja (Figur 1-K).
  21. Ställ in time-lapse förvärv.
    OBS: Imaging embryon som horisontella panoramabilder av fem överlappande delbilder (plattor) möjliggör detaljerad avbildning (5X objektiv), med en allmän overview av morfologin 29 till 30. Imaging intervall mellan 3 och 10 minuter möjliggöra detaljerad spårning av morfologiska förändringar 31 och förvärv av mindre z-stackar (fem till sju olika plan med ett avstånd av 30 pm) kompenserar för en stor del av förtjockning och svarvning av embryot 30 . Z-plan som ger bäst kontrast kan väljas före ytterligare bearbetning 32 av enskilda bildrutor i tidsförlopp filmer (se representativa resultat för detaljerad information om bildtagning).

Figur 1
Figur 1: Ställa in Nedsänkt filterpapper Sandwich. (A) Ett ägg krackas i en petriskål. (B) De flesta av de tjocka och tunna äggvita avlägsnas från petriskål med en plast överföringspipett (ej visat). Därefter ett fönster i de tjocka albumin skapat enrunt embryot genom att försiktigt torka bort de tjocka albumin med en silkespapper. (C) En filterpappersbärare placeras runt BLASTODERM ovanpå äggulan. (D) Filterpapperet bärare skärs loss från den omgivande vitellinmembranet och (E) avlägsnas från toppen av äggulan. (F) Den återstående äggulan är försiktigt tvättas bort i en PC-saltbad. (G) Embryot varvas med en andra identisk filterpappersbärare. (H) Filterpapperet sandwich är nedsänkt i mediet och placeras på två metallringar av rostfritt stål (embryo inför rygg eller ventrala sidan uppåt). (I) Två ringar stabilisera sandwich från toppen. (J) Den petriskål med embryot överförs till den temperaturstyrda oljebad. Rostfritt stålringar stabilisera petriskål i sidled. (K) Odlingsmediet är täckt med ett lager av mineralolja.(L) Schematisk bild av den nedsänkta filtret smörgås. (M) mått filter papper som används för nedsänkt filterpapper smörgås. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

figur 2
Figur 2: morfologisk Jämförelse mellan embryon i EG Kultur 1 och i Submerged Filter Paper Sandwich kultur. Utvalda tidsförlopp ramar visar embryon vid 3 h intervall. Ramar storlek för att ge en översikt över hela embryo morfologi. Embryon åldersmatchade till 7-somit stadium (HH9) 15. 0 h indikerar början av varje experiment. Främre är alltid till vänster. Bilderna har förvärvats med hjälp mörkfält belysning. (A) Embryo i EG kultur 1, odlade ventrala sidan uppåt på en agar-albumin botten 1,33. Högkvalitativa bilder kan förvärvas, eftersom embryot är begränsad i z-riktningen. (B och C) Två embryon odlade i nedsänkt filterpapper smörgås: (B) ventralsidan upp och (C) ryggsidan uppåt.Embryon i filterpapper smörgås utvecklas utan kvalitativa skillnader i minst 27 timmar. De utvecklar funktionell blodcirkulation och kranial och livmoderhalscancer böjning och vrid framgångsrikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Time-lapse förvärv beror på mikroskopsystemet tillgängligt. I denna studie, en lång arbetsavstånd, var upprätt zoom mikroskop används. Zoomfaktorn sattes till 5X. I kombination med 16X förstoring okularet, resulterade detta i 80X total förstoring, med en teoretisk upplösning på 1,3 um / pixel (som anges i mikroskop programvara) 30. För att öka fält of-view, var embryon avbildas som horisontella panoramabilder av fem under bilder (plattor). Därför en bricka region bestående av fem överlappande plattor, definierades 29. Detta kakel regionpositionerades så att den helt täcker den elliptiska öppningen av filterpappersbärare i dess horisontella förlängning (Figur 2B - 0 h). Varje platta hade en storlek på 2,048 x 2,048 pixlar, som täcker ett område-of-view på ca 2,7 mm, och plattor förvärvades med en överlappning på 10%, vilket resulterar i totala fältet-of-view på ungefär 12 mm x 2,7 mm för panorama. Den motoriserade xy-stadium förflyttas i förhållande till målet med en hastighet av ungefär 1,75 mm / sek mellan förvärv av de separata plattorna 29. Den levande bilden fokuserades på den främre presomitic mesoderm och de nyligen bildade somites (forsknings fokus för vår grupp). För att kompensera för förtjockning och krusning av embryona i z-riktningen, tillsattes små z-stackar (fem till sju olika plan med ett avstånd av 30 ^ m) förvärv vid varje tidpunkt 30. Dessa valdes ut runt fokalplanet för den främre spetsen av presomitic mesoderm. Varaktigheten av tidsförlopp ACQuisition sattes till 50 timmar, och bild intervall av 3, 4, eller 10 min valdes 31. Kvaliteten på time-lapse förvärv skulle kunna förbättras genom att fokusera varje 5-10 timmar och omdefiniera z-stack runt den nya optimala fokalplanet. Vid slutet av experimentet, var hela tidsserier redigeras manuellt, och underuppsättningar av bilder som innehåller z-planet med det bästa fokus skapades och sparas i en separat mapp 32. Dessa grupper av bilderna var tids sys för att skapa en komplett tidsserie av bilder med optimal fokus. Brickor av varje bild av denna fullständiga tidsserierna sys och smält samman utan skuggning korrigering 30, och time-lapse ramar exporterades som JPEG-bilder av 100% storlek och 95% kompression 32. Time-lapse ramar importerades som en bildsekvens i professionell video-redigeringsprogram. De detaljerade 100% zoom stabiliserades, och den totala kontrasten justerades till våra önskemål. De tids förfaller slut var kodad med H.264 codec och exporteras i MPEG-4 behållare. Filmer visas på en bildhastighet på 15 bilder / sek (fps) och en upplösning på 1920 x 1080 pixlar.

Figur 2 visar en jämförelse mellan ett embryo i EG kultur 1 (figur 2A) och två embryon i den nedsänkta filterpapper smörgås kultur, en som odlas ventrala sidan uppåt (figur 2B) och den andra ryggsidan uppåt (figur 2C). Alla embryon var åldersmatchade till de sju somit steget (HH9) 15 och avbildas med en temporal upplösning på 4 min (Figur 2A och B) eller 10 min (figur 2C). Utvalda ramar av 3 timmars intervall är avbildade. EG kultur (Figur 2A) får mycket stabil avbildning på grund av embryot vilar på en stabil agar-albumin botten 1,33. Hela embryo kvar i ett fokalplan hela than hela tidsförlopp. Detta kan vara fördelaktigt för kortare experiment (flera timmar) och mycket tidiga embryon, men det kommer med en stark inneslutning av embryot i z-riktningen, möjligen hindrar sin framgångsrika tredimensionell utveckling på lång sikt. I början, endast den inneslutning resulterade i en svag lateral plattning av embryot huvud jämfört med ett embryo odlades i den nedsänkta filterpapper sandwich med dess ventrala sida upp (jämför Figur 2A och 2B vid 0 h). Senare blev den vridning av huvudet ned (Figur 2A - 21 h) och hjärtslag avtog. Blodcirkulation nästan stoppad. Se Kompletterande Movie 1 för hela tidsförlopp av embryot i EG kultur. Den övre panelen i den här filmen visar en fullständig överblick av embryot, medan panelen på nedre vänstra visualiserar hjärtat utveckling i full upplösning. Segmenteringen av presomitic mesoderm i somites kan vara sigen i detalj i det nedre högra.

Embryon i den nedsänkta filterpapper sandwich, å andra sidan, var begränsade i deras tredimensionell expansion endast av den naturliga spänningen av membranen som omger dem. De kan odlas antingen med sin ventrala (Figur 2B) eller ryggsidan uppåt (figur 2C). Hursomhelst, embryona uppvisade kontinuerlig somitogenesis, och deras huvuden vände. De utvecklade hjärn och livmoderhalscancer böjning och funktionell blodcirkulation. Båda embryon i filterpapper smörgås avbildades med fokus på segmente mesoderm, så att delar av huvudet gradvis flyttat fokus som embryona växte, förtjockad och började slå, medan segmentera en del av mesoderm kvar i fokus (jämför figur 2B och 2C på 21 timmar till 27 timmar). Kompletterande Movie 2 visar den fullständiga time-lapse film av embryot avbildasi figur 2B. Avbildnings intervallet var 4 min. Den övre panelen i den här filmen visar en fullständig överblick av embryot. Utvecklingen av embryot avbildades i följd under 46 timmar, men efter cirka 30 timmar, fick fokus på segmente mesoderm förloras på grund av den övergripande förtjockning och vridning av embryonal vävnad. Den nedre vänstra panelen visar den tidiga utvecklingen av hjärtat i full upplösning från de förvärvade time-lapse ramar. Genom fusion av den parade hjärt primordia på båda sidor om mittlinjen, är en nästan rak rörformig struktur bildad, som senare börjar slå och böjning åt höger. Den nedre högra panelen visar de senast bildade somites och den främre spetsen av presomitic mesoderm i full upplösning och spårar bildandet av nya somites över tiden. Kompletterande Movie 3 visar en annan embryo odlade och avbildas ventrala sidan uppåt i den nedsänkta filterpapper smörgås. Avbildnings intervallet var 4 min. Filmen omfattar the utveckling av embryot från steg HH5-6 till cirka steg HH14 15, över ungefär 27 timmar kulturtiden. Huvudet vika former och utvecklas bakåt. Hjärtat former från sitt bilaterala primordia, börjar slå, och böjer till höger. De första tre till fyra somites bildar samtidigt. Ytterligare somiter knoppas av sekventiellt från den främre spetsen av presomitic mesoderm. Den nedre panelen visar huvudområdet av embryot i full upplösning, vilket gör att observation av huvudet veck och tidig hjärtbildning i hög detalj. På grund av öppenheten i embryot, kan observeras stängningen av neuralröret i framtiden huvudregionen. Kompletterande Movie 4 visar somit bildning i samma embryo i full upplösning över hela avbildningstiden i den undre panelen. Kompletterande Movie 5 visar den fullständiga tidsförlopp av embryot odlade ryggsidan uppåt (figur 2C). Avbildnings intervallet var 10 min. Medan upper panel visar utvecklingen av embryot från sju somit steget (HH9) till cirka steget HH16-17 är den undre panelen beskärs för att visa morfologiska förändringar i hjärnans tidiga i detta skede i full upplösning. Den lokala svullnad av neuralröret kan observeras, vilket leder till en regionalisering av framhjärnan, mitthjärnan, och bakhjäman, som kommer att dela in de fem delområden av embryonala hjärnan vid senare stadier 13. Dessutom kan tillväxten av de optiska vesiklar ses tydligt. Efter ca 30 h i kultur, är embryot dör.

För att visa kompatibiliteten hos den nedsänkta filterpapper smörgås med mikro manipulationer, flera polystyren mikrokulor (~ 40 mikrometer i diameter) implanterades i eller i närheten av presomitic mesoderm av ett kycklingembryo i den nedsänkta filterpapper smörgås kultur. Mikropärlorna tvättades i PBS för att avlägsna buffertlagring och implanted före täcker odlingsmediet med skiktet av lätt mineralolja (jämför till steg 2,18 i protokollet avsnitt). Ett glas pasteurpipett användes för att överföra pärlorna till embryot ytan, under observation genom okularen i mikroskopet. Fem hål skapades i endoderm genom att försiktigt skrapa den med en akupunkturnål. En skräddarsydd J-format verktyg, som skapas genom att sträcka och böjning av en glas pasteurpipett i en flamma, användes för att manipulera pärlorna och pressa dem noggrant i hålen tills de blev orörliga. Tre hål fylldes med en pärla vardera (figur 3A - 0 h och 3B *) och två hål med två kulor vardera (figur 3A - 0 h). Figur 3A visar, i utvalda tidsförlopp ramar, utvecklingen av kycklingembryo efter mikrokirurgisk implantation av pärlorna. Tre kulor framgångsrikt införlivas i vävnaden vid önskad plats, och deras rörelse avbildades överexperimentets förlopp i hög detalj (figur 3B). Utvecklingen av embryot inte verkar försämras av manipulering eller närvaron av kulorna. Se Kompletterande Movie 6 för hela time-lapse film. Avbildnings intervallet var 4 min.

Figur 3
Figur 3: Time-lapse avbildning efter mikrokorn implantation. Proof-of-principle experiment visar kompatibilitet nedsänkt filterpapper smörgås med mikrokornet implantation. Chefen för embryot är till vänster, men det var inte avbildas under detta experiment. Bilderna har förvärvats med hjälp mörkfält belysning. (A) Vald time-lapse ramar som visar den manipulerade embryot vid 3 h intervall efter implantationen av sju mikropärlor (~ 40 | im i diameter). Embryot långsträckt och kontinuerligt formade ytterligare Somites. Tre kulor verkar ha fast ordentligt och flyttas medialt med vävnaden flödet över 18 timmar av kultur. De övriga fyra pärlor hoppat ur sina hål mellan sex och nio timmar av kultur och drev bakåt. (B) detaljerad vy av tre enkel pärlor (B1 till B3) implanteras i presomitic mesoderm i början av experimentet (0 h, B *) och efter 12 h inkubation (B **). Antalet av de just-formnings somiter indikeras (S9 i B * och S18 i B **). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

filmen 1
Kompletterande Movie 1: EG-kultur ventrala sidan upp. Embryo i EG kultur 1, odlade ventrala sidan uppåt, från sju somit stadiet (HH9) 15 och framåt på en agar-albumin Bottom 1,33. Avbildnings intervallet var 4 min. Den relativa tiden visas i det övre vänstra hörnet. Högkvalitativa bilder kan förvärvas, eftersom embryot var begränsad i z-riktningen. Efter 21 timmar var hjärtslag och blodflöde nästan greps och embryot hade börjat falla sönder. Den övre panelen visar en omformaterad översikt av embryot, medan de nedre panelerna visualisera hjärt utveckling (till vänster) och segmentering av presomitic mesoderm (högra panelen) i full upplösning (100% zoom). (Högerklicka för att ladda ner).

film 2
Kompletterande Movie 2: Undervattensfilterpapper Sandwich ventrala sidan upp. Embryo odlas i den nedsänkta pappers smörgås från sju somit stadiet (HH9) 15 och framåt, ventrala side uppåt. Avbildnings intervallet var 4 min. Den relativa tiden visas i det övre vänstra hörnet i h och min, starta efter 24 timmar. Det övre fältet visar en omformaterad översikt över utvecklingen av embryot under 46 h, efter varandra. Den nedre vänstra panelen visualiserar tidigt hjärta utveckling under de första 10 h av bildtagning i full upplösning (100% zoom). Den nedre högra panelen skildrar att segmentera mesoderm under cirka 30 timmar för utveckling i full upplösning (100% zoom) tills fokus förloras på grund av övergripande förtjockning och svarvning av embryonal vävnad. (Högerklicka för att ladda ner).

film 3
Kompletterande Movie 3: Head vikformning. Embryo odlade ventrala sidan uppåt i den nedsänkta filterpapper smörgås från hanad-process / head-faldig stadiet (HH5-6) 15 till ungefär 22-somit stadium (HH14) 15 över ungefär 27 timmar kulturtiden. Avbildnings intervallet var 4 min. Den relativa tiden visas i det övre vänstra hörnet i h och min, starta efter 24 timmar. Det övre fältet visar en omformaterad översikt över utvecklingen av embryot. Den undre panelen visar huvudregionen av embryot i full upplösning (100% zoom). kan observeras bildandet av huvudet veck och tidigt hjärta och stängningen av neuralröret. (Högerklicka för att ladda ner).

film 4
Kompletterande Movie 4: Somitogenesis. Embryo odlade ventrala sidan uppåt i den nedsänkta filterpapper smörgås från huvudprocessen / head-faldig steg (HH5-6) 15till ungefär 22-somit stadium (HH14) 15 över ungefär 27 timmar kulturtiden. Avbildnings intervallet var 4 min. Den relativa tiden visas i det övre vänstra hörnet i h och min, starta efter 24 timmar. Det övre fältet visar en omformaterad översikt över utvecklingen av embryot. Den nedre panelen visar segmentera paraxiella mesoderm i full upplösning (100% zoom). (Högerklicka för att ladda ner).

filmen 5
Kompletterande Movie 5: Nedsänkt filterpapper Sandwich ryggsidan uppåt. Embryo odlade ryggsidan uppåt i den nedsänkta filterpapper smörgås från sju somit steget (HH9) 15 till ungefär HH16-17 steget 15. Avbildnings intervallet var 10 min. Den relativa tiden visasi det övre vänstra hörnet i h och min, starta efter 24 timmar. Det övre fältet visar en omformaterad översikt över utvecklingen av embryot. Den nedre panelen visar morfologiska förändringar i hjärnans tidiga i full upplösning (100% zoom). Embryot dog efter ungefär 30 timmar i kultur. (Högerklicka för att ladda ner).

film 6
Kompletterande Movie 6: mikropärlor implanteras. Embryo odlade ventrala sidan uppåt i den nedsänkta filterpapper smörgås för cirka 19 timmar, med början från nio somit steget (HH9-10) 15. Avbildnings intervallet var 4 min. Den relativa tiden visas i det övre vänstra hörnet i h och min. Den övre panelen visar en omformaterad översikt över svansregionen med sju mikrokulor implanteras i presomitic mesoderm. Den nedre panelen visar regionen med implanterade mikrokulor i full upplösning (100% zoom). (Högerklicka för att ladda ner).

Discussion

Som en ny variant av den väletablerade EG kultur en underlättar den nedsänkta filterpapper smörgås förvärv av långsiktiga bright och mörkfält time-lapse filmer i början kycklingembryo ex ovo genom att göra en temperatur- och fuktighetskontrollerad inkubator runt mikroskopet onödigt. Snarare än att vara odlade på ett halvfast agar-äggviteämne botten, är embryona hålls helt nedsänkt i en enkel odlingsmedium bestående av PC-saltlösning och tunna äggvita. Indunstning och värmeförluster minimeras genom ett lager av mineralolja som flyter på toppen av odlingsmediet. Embryon kan odlas lätt, antingen rygg eller ventrala sidan uppåt, utan synliga skillnader i kvalitet. Som visas här, embryon i den nedsänkta filterpapper sandwich är tillgängliga för mikro insatser, liksom tillämpningen av morfogen-indränkt pärlor. Framtida tillämpningar inkluderar levande fluorescens avbildning, microinjections och elektroporering och geners uttryck till manipulate och studera ett brett spektrum av morfogenetiska händelser under ventrala (t.ex. tidigt hjärta och somitogenesis) och rygg (t.ex. sen gastrulation, neuralrörsdefekter stängning, och hjärnans tidiga) utveckling. En tidsberoende drogbehandling är möjlig om petriskålen innehållande filterpapper sandwich är ersatt med en perfusionskammaren, vilket tillåter utbyte av odlingsmediet under mineraloljeskiktet. Nedsänkt filterpapper smörgås kommer att utveckla sin fulla imaging potential i kombination med laserbaserad avbildning (inklusive ljus ark mikroskopi) och dopp mål.

Vissa svårigheter med beredningen av den nedsänkta filterpapper smörgås kommer att tas upp i följande punkter. Även om det kräver endast en måttlig mängd träning för att överföra ett embryo från gule in i filterpapper sandwich, kan flera steg fortfarande betydligt påverka kvaliteten av embryot i kultur. Innan filterpappersbäraren ärplaceras på äggulan, bör vitellinmembranet runt embryot befrias från alla tjocka äggvita. Först då kommer anslutningen mellan filterpapper och vitellinmembranet vara stark nog att stå emot tvättning i PC-saltlösning. Filterpappersbärande embryot bör korsa den vätska / luftgränssnittet så lite som möjligt för att minimera spänningen på membranen. När förs in i PC-saltlösning för tvättning, måste hela filterpapper bärare vistelse helt nedsänkt vid alla tidpunkter. Tiden i PC-saltbad måste begränsas till omkring 30-60 sek, som vitellinmembranet börjar släppa från filterpapper. Ändå bör rengöring av embryot köras mycket noggrant, eftersom äggula rester kommer senare skymma sikten av embryot. Under tvättning, aldrig peka strömmen från överföringspipetten direkt på embryot, men alltid radiellt bort från den. Efter avlägsnande av embryot från PC-saltlösning, se till att hålla filterpapper horisontellt för att minimeraspänning på de embryonala membranen. Då, stabilisera embryo med den andra filterpappersbärare. När den andra filterpappershållaren placeras, undvika att skapa någon lateral spänning, som skulle kunna förskjuta filterpappersbärare i förhållande till varandra och riva de embryonala membranen. När filterpapper sandwich bringas i odlingsmediet, bör det också korsa luft / vätskegränsytan endast en gång för att minimera spänningar på membranen. Det andra paret av ringar av rostfritt stål som används för att stabilisera filterpapper sandwich från toppen bör placeras mycket långsamt och utan något tryck för att minimera komprimering av de embryonala membranen. Små sprickor i området opaca av embryot vanligtvis läka under den första timmen av kultur, men en skadad embryo kan och bör alltid ersättas med ett nytt prov innan oljeskiktet pipetteras ovanpå odlingsmediet.

Till bilden en hel embryo eller flera prover för högupplösta time-lapse filmer, microscope måste vara utrustad med en motordriven xy-stadium, som kontrolleras av mikroskop programvara. Det är av avgörande betydelse att ha xy-scenen flytta med en minimal hastighet för att undvika skador på embryon och turbulens i odlingsmediet och oljan, som kommer att minska bildkvaliteten. För förvärvet av tidsförlopp filmer som presenteras här, flyttade motoriserade xy-scenen med en hastighet av ungefär 1,75 mm / sek. I framtiden kan avbildning förbättras ytterligare genom att först flytta scenen till önskad position och skaffa bilden efter en kort viloperiod för att låta vibrationer och turbulens blekna bort.

Som en begränsning, bör potentiella användare vara medvetna om den relativt långa arbetsavstånd (ca 1 cm) är nödvändiga för denna odlingsmetod om en upprätt mikroskop utan nedsänkning mål används. Detta arbetsavståndsresultat från skiktet av mediet och mineralolja på toppen av embryot. I 6 cm Petriskål, har oljeskiktet en tjocklekars av ungefär 1-1,5 mm, och embryot är nedsänkt ungefär 4 mm djupa i odlingsmediet. Beroende på diametern av målet, kan den övre kanten av den 6 cm petriskål även begränsa tillgången till embryot. Detta kan kringgås genom användning av en större antenn.

Arbetsavståndet från toppen skulle kunna minskas något genom att minimera tjockleken hos vätskeskikt. Dessutom kan arbetsavståndet underifrån minimeras genom att embryot längre ned till botten av petriskålen och minska tjockleken på glasfönstret hos den uppvärmda bägaren. Medan protokollet optimerad för att fungera med en upprätt långa arbetsavstånd zoom mikroskop, kan det monteras på ett inverterat mikroskop också. Framtida användare bör ha i åtanke att dränka embryot alltför djupt i odlingsmediet kan leda till O 2 -diffusion problem, även om preliminära experiment tyder på att begränsad diffusion inte verkar vara en problem, så länge som embryot är omgiven av en tillräckligt-stor reservoar av odlingsmedium och filterpapperet inklämt inte trycks till botten av petriskålen.

En annan begränsning är temperaturstyrningen. Genom att justera temperaturen hos styrenheten för den uppvärmda bägaren till 40 ° C, temperaturen i mediet i jämvikt till 37,5 ° C runt embryona när mediet är täckt med mineralolja. Detta visar att en del energi går förlorad mellan bägarens botten, där värmeelementen och temperatursensorn är belägna, och platsen för embryona. Kontrolltemperaturen kunde optimeras genom att flytta sensorn och omfördelning av värmeelementen.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna erkänner ekonomiskt stöd från en ZonMW-VICI bidrag 918.11.635 (Nederländerna). Författarna vill tacka verktygsverkstad i Vrije Universiteit Amsterdam för sina praktiska förslag och för tillverkning av installationskomponenter och Jarno Voortman av Carl Zeiss Nederländerna för användbara råd om mikroskopi. Marjolein Blaauboer var ett stort stöd i kritiskt kommentera flera utkast av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1 L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2·H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2·6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4·2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4·2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
Accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25 ml Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
  2. Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
  3. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
  4. Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
  5. Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
  6. Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
  7. Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
  8. Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
  9. Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
  10. Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
  11. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  12. Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
  13. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  14. Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  16. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
  17. Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).
  19. Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
  20. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
  21. Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
  22. Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
  23. Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
  24. Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
  25. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).
  26. Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
  27. Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
  28. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
  29. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Software Guide ZEN 2 - The Tiles & Positions Module. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/9943124DA6FFBA5DC1257E9300412F8B/$FILE/ZEN2_Tiles_and_Positions_Module_Software_Guide.pdf (2015).
  30. Carl Zeiss Microscopy. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide. , V1.0 en, Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014).
  31. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Acquiring multidimensional images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf (2014).
  32. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf (2014).
  33. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).

Tags

Utvecklingsbiologi tidsförlopp avbildning filterpapper smörgås kycklingembryo EC kultur, Mikromanipulation somitogenesis neurulation hjärta utveckling hjärna bildning
En nedsänkt filterpapper Sandwich för långsiktigt<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse avbildning av tidig kycklingembryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, M., Nelemans, B. K. A.,… More

Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter