Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En Submerged filterpapir Sandwich for Long-term Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54636
Automatic Translation
*1, *1, 2
1Department of Orthopaedic Surgery, VU University Medical Center Amsterdam, MOVE Research Institute Amsterdam, 2Department of Anatomy, Embryology & Physiology, Academic Medical Center Amsterdam
* These authors contributed equally

Abstract

På grunn av sin tilgjengelighet, lave kostnader, flat geometri, og åpenhet, ex ovo kylling embryo har blitt en stor virveldyr dyremodell for studiet av morfogenetiske hendelser, for eksempel gastrulation 2, neurulation 3-5, somitogenesen 6, hjerte bøying 7, 8, og hjerne formasjon 9-13, i løpet av tidlig embryogenese. Nøkkelen til å forstå morfogenetiske prosesser er å følge dem dynamisk av time-lapse imaging. Oppkjøpet av tids-lapse filmer av dama embryogenese ex ovo har vært begrenset til enten å korte tidsvinduer eller til behovet for en kuvøse for å kontrollere temperaturen og luftfuktigheten rundt embryoet 14. Her presenterer vi en ny teknikk for å kultur kyllingfostre ex ovo for høy oppløsning time-lapse avbildning ved hjelp overført lys mikroskopi. Det nedsenkede filter papir sandwich er en variant av den veletablerte filter papir carrier technik (EC-kultur) 1 og gir mulighet for dyrkning av kyllingfoster uten behov for et klimakammer. Embryoet er klemt mellom to identiske filterpapirbærer og holdes helt nedsenket i en enkel, temperaturregulert medium dekket av et lag av lett mineralolje. Med start fra den primitive strek trinn (Hamburger-Hamilton trinnet 5, HH5) 15 opp til minst den 28-somitt trinn (HH16) 15, kan embryoene bli dyrket med enten deres baksiden eller ryggsiden opp. Dette gjør at oppkjøpet av tids-lapse filmer som dekker ca 30 timer av embryonal utvikling. Representative time-lapse rammer og filmer vises. Embryoer er sammenlignet morfologisk til et embryo dyrket i standard EC-kultur.

Det nedsenkede filter papir smørbrød gir et stabilt miljø for å studere tidlig rygg og ventral morfogenetiske prosesser. Den gjør det også for live fluorescens bildebehandling og micromanipulations, slik som mikrokirurgi, perle implantation, mikroinjeksjon, gene silencing, og elektroporering, og har et stort potensial til å bli kombinert med nedsenking mål for laserbaserte imaging (inkludert lys-ark mikroskopi).

Introduction

Embryogenese har fascinert mennesket siden begynnelsen av historien. Hvordan struktur og morfologi av et foster utvikler seg i en slik veldefinert temporal og romlig måte? Den kyllingembryo har blitt en av de klassiske virveldyr dyremodeller for embryogenese av flere grunner: Det er lett tilgjengelig, billig, gjennomsiktig i en tidlig fase, og tilgjengelig for eksperimentelle manipulasjoner, som det utvikler seg utenfor moren. Dessuten har den en nesten flat geometri under tidlig morfogenetiske hendelser, slik som hjerte og hjerne formasjon, gastrulation, neurulation, og somitogenesen 15.

Morfogenetiske prosesser kan forstås best hvis de er studert dynamisk, for eksempel gjennom oppkjøpet av tids-lapse bilder. Den dama embryo kan visualiseres i ovo 16, men med dårlig tilgjengelighet for eksperimentelle manipulasjoner og begrenset sikt for overføring lysmikroskopi bildebehandling. Derfor several teknikker har blitt foreslått til kultur kyllingfoster ex ovo, enten i hele plomme kultursystemer 13,17 - 19, eller som eksplantering kulturer 1,20 - 23. I hel eggeplomme kultursystemer, forblir embryo på toppen av det intakte eggeplomme, og hele innholdet i egget blir overført til en annen beholder for inkubasjon. Denne beholderen kan være et surrogat egg skall 17, en petriskål 19, eller en hengekøye laget av plast seg vikle 13,18. Embryoer i hele plomme kulturer kan ideelt sett være kultivert til klekking og er tilgjengelig for micromanipulations. Disse teknikkene er spesielt nyttige for å studere utviklingen av embryoer etter initiering av blodsirkulasjon (som øker kontrasten), mens yngre embryoer forblir vanskelig å visualisere. Disse tidlige embryoer kan avbildes best hvis de er fjernet fra plommen og kultivert som in vitro explants. Eksplantatene er lett tilgjengelig for eksperimental manipulasjoner og krever mindre plass for dyrking. For mange år, en teknikk utviklet av Denis nytt i 1955 og dens varianter var de gylne standarder for eksplantering kultur metoder for kyllingfostre, og dermed gjøre embryo tilgjengelig for time-lapse mikroskopi og mikrokirurgisk inngrep 20,21. Til tross for sin store suksess, er New teknikk relativt krevende og tidkrevende. Den blastoderm løsner ofte når vitelline membran, bærer blastoderm, er strukket rundt en glassring for å oppnå riktig spenning en. Dessuten kan embryoet bare dyrkes med sin ventrale side opp. EC (Early Chick) kultur, en nyere teknikk utviklet av Chapman og Collignon 1, omgår strekking av vitelline membranen ved hjelp av en filterpapirbærer med en sentral åpning. Filterpapiret festes til vitelline membranen, og dermed opprettholde sin naturlige strekk, og omgir embryoet som en bilderamme 1.Embryoet blir deretter dyrket på en agar-albumen bunn, vanligvis med sin ventral siden opp. Dyrking dorsal side opp virker bare mulig for embryoer på HH8 15 og eldre. Mange grupper har tilpasset filterpapirbæreren til deres behov, for eksempel ved å erstatte den agar-eggehvitestoff bunn med en støtte laget av kirurgisk sutur fibre 24 eller en kollagenbelagt membran 25. Ofte er embryoer dyrket med New teknikk eller med EC kultur utsatt, med sin dorsal eller ventral overflaten til luft for å lette oksygen diffusjon 1,20. Disse eksplantering kulturer må holdes i en fuktig atmosfære for å unngå fordampning av mediet, og for å hindre at embryoet fra uttørking. Dette oppnås ved å inkubere fatet med eksplantatet kultur i et større petriskål som inneholdt fuktig silkepapir 1. Oppkjøpet av tids-lapse bilder av disse embryoer krever enten bruk av et klimakontrollert inkubator rundt hele mikroskop eller et temperamentperatur styrt beholder med et oppvarmet lokk for å unngå kondens i lysbanen 14. Imidlertid kan kyllingembryo også utvikle ex ovo helt nedsenket i dyrkingsmedium som filter papir kulturer 25, klemt mellom et lag med tung mineralolje og albumin i tilpasninger av New Teknikken 2,21, eller som brettes blastoderm explants i "Cornish Pasty Culture "23,26, uten direkte kontakt med luften.

Den neddykkede filterpapir sandwich er en ny variant av filterpapirbæreren teknikk. Ved å kombinere tidligere kunnskap om dyrking kyllingfoster ex ovo, gjør det klima-kontrollerte inkubator og det oppvarmede lokket unnværlig. Embryoet er klemt mellom to identiske (laserskåret) filterpapirbærer 24 og dyrket helt nedsenket i en enkel dyrkningsmedium (Pannett-Compton saltvann 27,28 og tynne eggehvitestoff i et 3: 2 forhold) i en temperaturregulert inneholdeer. Et lag av lett mineralolje som flyter på toppen av medium forhindrer fordampning 2,21 og minimerer varmetap til omgivelsene. Bunnen av beholderen har et glassvindu, og hele oppsettet er utført på en oppreist lang arbeidsavstand zoom mikroskop. Dette oppsettet gjør at oppkjøpet av høyoppløselige lysfelt og mørkefelt time-lapse filmer på ca 30 timer av embryoutvikling, som strekker seg fra tidlig primitive streak scenen til 28-somitt scenen (tilsvarer Hamburger Hamilton stadier 5-16, HH5-16 ) 15. Embryoet kan dyrkes like godt med sine ventral eller dorsal side opp. Derfor embryoer er tilgjengelige for observasjon og manipulering av ventral (f.eks tidlig hjerte 7,8 og somitogenesen 6) og rygg (f.eks sent gastrulation 2, neural tube nedleggelse 3-5, og tidlig hjerne 9-13) utvikling. Det nedsenkede filter papir smørbrød provides en enkel og stabilt miljø for mikrokirurgi, perle implantasjon, mikroinjeksjon, gene silencing, og electroporation studier. Imaging potensialet kan skyves mye ytterligere ved hjelp av laserbaserte imaging (inkludert lys-ark mikroskopi) og nedsenking mål.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med de nederlandske dyreforsøk loven.

MERK: Det nedsenkede filterpapiret sandwich-metoden er endret fra 1.

1. Submerged Filter Paper Sandwich Forberedelse

  1. Pannett-Compton (PC) -saline 27,28
    1. Fremstille stamløsninger A (1 liter ultrarent H2O, 121 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,42 g CaCl2 · H 2 O, og 12,7 g MgCl2 · 6H 2 O) og B (1 liter ultra H 2 O, 2,365 g Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, og 0,188 g NaH 2 PO 4 · 2H 2 O) i rene 1-L flasker. Oppbevar dem ved 4 ° C.
    2. Fremstille 1 liter av PC-saltløsning ved å blande 900 ml ultrarent H2O med 40 ml av stamoppløsning A og 60 ml av stamoppløsning B (i denne rekkefølge for å unngå utfelling). Forbered PC-saltvann fersk from stamløsninger A og B hver uke.
      MERK: Stamløsninger kan lagres ved 4 ° C i flere måneder. Autoklavering og / eller legge antibiotika eller antimykotika er ikke nødvendig.
  2. Inkubasjon av befruktede kylling egg
    1. I en fuktet inkubator, legge egg på sin side og inkuber dem ved 37,5 ° C inntil de når den ønskede alder.
      MERK: Lagre egg ikke lenger enn to uker (fortrinnsvis 12-15 ° C) før forsøket, som hatchability vil avta betydelig
  3. Filter papir bærere (tilpasset fra 1)
    1. Hvis tilgjengelig, kan du bruke en laser cutter å kutte timeglassformede filterpapir bærere av tykk filtrering papir (28 mm x 22 mm). Taper bredden i midten fra 22 mm til 10,4 mm. Skjær ut et sentralt elliptisk åpning (10,6 mm x 5,5 mm), med den lengre akse av ellipsen orientert parallelt med den større side av filterpapirbæreren (figur 1-M).
      1. Eventuelt lage en papp sjablong med riktige dimensjoner og overføre sin disposisjon og at av de sentrale åpning til tykt filtrering papir ved hjelp av en blyant. Skjær ut filterpapiret bærer hjelp av gode saks.
    2. Skjær to identiske filter papir bærere for hvert embryo skal Eksplanterte. Forbered ekstra filter papir bærere som backup i tilfelle et embryo blir tapt under eksplanteres.
  4. Temperaturregulert oljebad (på dag av eksperimentet)
    1. Plasser det temperaturkontrollerte begerglass i sentrum av den motordrevne xy-trinnet i oppreist zoom mikroskop og koble begeret til sin temperaturregulator.
    2. Sette fire store rustfrie stålringer (30 mm ytre diameter, 4 mm i høyde, 1.5 mm veggtykkelse) inn i en 6 cm petriskål for å fungere som vekter, og plassere formen i midten av det temperaturkontrollerte begerglass.
      MERK: Dette petriskål fungerer bare som plassholder for å justere olje level.
    3. Fylle det temperaturkontrollerte begerglass med 130 ml lett mineralolje. Juster oljenivået hvis nødvendig, slik at den slutter omkring 3 mm under den øvre kant av 6 cm petriskål.
    4. Fjern 6 cm petriskål fra temperaturkontrollerte beger og sett temperaturen til 40 ° C.

2. Submerged Filter Paper Sandwich Produksjon

  1. Kulturmedium (på dag av eksperimentet)
    1. Hell 30 ml PC-saltløsning (som fremstilt i trinn 1.1.1 til 1.1.2) til et 50 ml sentrifugerør. Fremstille en 50 ml sentrifugerør fylt med 30 ml av PC-saltløsning for hver to embryoer for å bli eksplantert.
    2. knekke nøye en ikke-inkuberes egg inn i en 10 cm petriskål.
    3. Høste tynne albumen ved å bevege en plastisk overføring pipette langs veggene i petriskålen og suger i de tynne albumen. Samle 30 ml tynne eggehvitestoff i et 50 ml sentrifugerør for hver to embryoene som skal eksplantert. Sørg for å få bare thin albumen.
      MERK: Vanligvis 3 - 4 egg tillate høsting av ca 30 ml tynne albumen.
    4. Hell 20 ml tynne, albumin i alle PC-saltløsning fylt 50 ml sentrifugerør (som fremstilt i trinn 2.1.1).
    5. Bland PC-saltvann med de tynne albumen ved forsiktig å snu rørene flere ganger. La det avgjøre i flere minutter og sjekk om blandingen, kalt kulturmedium herfra og utover, er klart. Dersom kulturmediet er ikke klart, forberede fersk PC-saltvann fra stamløsning og høste friske tynne albumen.
  2. Plasser to små ringer i rustfritt stål (20 mm ytre diameter, 4 mm i høyden, 1,5 mm veggtykkelse, 6,5 mm gap i ringen) så langt fra hverandre som mulig i en fersk 6 cm plast petriskål og fylle den med 22 ml kultur medium (som fremstilt i trinn 1.4.1 til 1.4.4) ved bruk av en 25 ml pipette plast (figur 1-H). Sørge for at rusk samlet seg på toppen av mediet forblir i sentrifugerøret.
  3. Fjern eventuelle rester or bobler fra mediet med en plast overføringspipetten.
  4. Fylle en 10 cm petriskål med 75 ml PC-saltløsning (som skal anvendes i trinn 2.15).
  5. Fjerne en egg fra inkubatoren og la den hvile på benken på sin side i 1 min for å la embryoet kommer til toppen av eggeplomme.
  6. Knekke forsiktig egget i en petriskål (figur 1-A). Sug kanten av et stykke fine silkepapir i de tykke albumen og sentrere blastoderm ved å dra, om nødvendig.
  7. Fjerne det meste av de tynne og tykke albumen fra Petri-skålen ved hjelp av en plast overføring pipette (med spissen avskåret for å lette opptaket av de tykke albumen).
  8. Opprett et vindu i de tykke albumen rundt embryo ved å forsiktig tørke bort de tykke albumen med et stykke silkepapir, beveger seg bort fra sentrum (Figur 1-B). Hindre silkepapir fra å feste seg vitelline membran.
  9. Ved hjelp av pinsett, plassere et filter papir bærer forsiktig på Vitelline membran rundt embryoet, med den lengre akse av det elliptiske åpning parallelt med anterior-posterior aksen av embryoet (figur 1-C).
  10. Klemme en spiss av spikeren saksen via vitelline membranen nær filterpapiret bæreren og raskt skjære seg rundt hele filterpapirbæreren (figur 1-D).
  11. Ved hjelp av pinsetter, løft filterpapirbæreren bort fra eggeplomme i en skrå retning parallelt med anterior-posterior aksen av embryoet (figur 1-E).
  12. Vri filterpapiret bærer rundt å ha ventral side av embryoet på toppen og senk den i PC-saltvann. Senkes ned filterpapirbæreren langs anterior-posterior aksen av embryoet i en skrå retning.
  13. Bli kvitt all plommen fortsatt festet vitelline membranen og blastoderm ved forsiktig å spyle den med PC-saltvann fra en plast overføringspipetten. Holde helheten av filterpapirbæreren neddykket ved enll ganger (figur 1-F).
  14. Fjern filterpapiret fra bæreren PC-salt langs anterior-posterior aksen av embryoet i en skrå retning og bli kvitt overskuddet av væske ved dabbing kanten av filterpapirbæreren på et silkepapir.
  15. Holde filterpapiret horisontalt, med den ventrale side av embryoet vender opp, og plassere en annen filterpapirbærer på toppen av den første, ved hjelp av et andre par av pinsetter. Deres åpninger bør stemme nøyaktig overens, for derved å sandwiching embryoet mellom de to lag av filterpapir (figur 1-G).
  16. Umiddelbart senk filterpapirbæreren smørbrød i kulturmediet i en skrå retning langs det anterior-posterior-aksen av embryoet. Plasser det i området som spenner over rommet mellom de to stålringer (figur 1-H).
  17. Fest filterpapiret sandwich ved å plassere to stålringer på toppen av de to andre, og pass på at åpningen med embryo forblir helt avdekket (figur 1-I).
  18. Sjekk middels nivå og sørge for at den øvre avstands er bare neddykket i mediet. Om nødvendig, legge til eller fjerne små mengder av medium.
  19. Forsiktig petriskål i sentrum av den temperaturkontrollert oljebad og stabilisere formen sideveis ved å plassere tre store rustfrie stålringer (30 mm ytre diameter, 4 mm i høyde, 1.5 mm veggtykkelse) ved siden av fatet i oljen . Pass på at stålringene berører sidene av parabolen (Figur 1-J).
  20. Sakte pipette ca. 6 ml lett mineralolje på toppen av medium med en plast overføring pipette, slik at mediet er dekket med et kontinuerlig lag av mineralolje (figur 1-K).
  21. Sett opp time-lapse oppkjøpet.
    MERK: Imaging embryoene som horisontale panoramabilder av fem overlappende underbilder (tiles) gir detaljerte imaging (5X objektiv), med en generell overview av morfologi 29-30. Imaging intervaller mellom 3 og 10 min åpner for detaljert sporing av morfologiske endringer 31, og oppkjøpet av små z-stabler (fem til syv forskjellige plan med en avstand på 30 mikrometer) kompenserer for mye av jevning og sliping av embryoet 30 . Z-fly med den høyeste kontrasten kan velges før videre behandling 32 av enkeltbilder i time-lapse filmer (se Representant Resultater seksjon for detaljert informasjon om bildeopptak).

Figur 1
Figur 1: Sette opp Submerged Filter Paper Sandwich. (A) Et egg er sprukket i en petriskål. (B) De fleste av de tykke og tynne, albumin blir fjernet fra petriskål med en plast overføring pipette (ikke vist). Deretter blir et vindu i de tykke albumen opprettet enrundt embryo ved å forsiktig tørke bort de tykke albumen med silkepapir. (C) En filterpapirbærer er plassert rundt blastoderm på toppen av eggeplomme. (D) Filterpapiret bæreren er skåret løs fra den omgivende vitelline membranen og (e) fjernes fra toppen av eggeplomme. (F) De restereggeplomme blir omhyggelig vasket bort i et PC-saltholdig bad. (G) Et embryo er klemt sammen med en annen identisk filterpapirbærer. (H) Filterpapiret-sandwich er neddykket i mediet og plassert på to metall rustfri stålringer (embryo dorsal vender eller ventrale side opp). (I) To ringer stabilisere sandwich fra toppen. (J) Petriskålen inneholdende embryo overføres til temperaturkontrollert oljebad. Rustfritt stål ringer stabilpetriskål sideveis. (K) Et kulturmedium er dekket med et lag av mineralolje.(L) Skjematisk av neddykket filter sandwich. (M) Mål på filterpapiret bærere som benyttes for det neddykkede filterpapiret sandwich. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

Figur 2
Figur 2: Morfologiske Sammenligning mellom Embryoet i EF Kultur 1 og i Submerged Filter Paper Sandwich Culture. Valgte intervallrammer viser embryoene på 3 timers mellomrom. Rammer er endret for å gi en oversikt over hele embryo morfologi. Embryoet ble alders matchet til 7-somitt scenen (HH9) 15. 0 hr indikerer starten av hvert eksperiment. Anterior er alltid til venstre. Bilder ble anskaffet ved hjelp mørkefelt belysning. (A) Embryo i EF kultur 1, kultivert ventral siden opp på en agar-albumin bunn 1,33. bilder av høy kvalitet kan bli kjøpt opp, da fosteret er begrenset i z-retning. (B og C) To embryoer dyrket i neddykket filterpapir-sandwich: (B) Ventral side opp og (C) ryggsiden opp.Embryoer i filterpapiret smørbrød utvikle seg uten kvalitative forskjeller i minst 27 timer. De utvikler funksjonelle blodsirkulasjonen og kranie og livmorhals bøyning og slå vellykket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Time-lapse oppkjøpet er avhengig av mikroskop system er tilgjengelig. I denne studien en lang arbeidsavstand, ble oppreist zoom mikroskop. Zoomfaktor ble satt til 5X. I kombinasjon med 16X forstørrelse av okularet, dette resulterte i 80X total forstørrelse, med en teoretisk oppløsning på 1,3 mikrometer / pixel (som nevnt i mikroskop programvare) 30. For å øke felt-of-view, ble embryoer avbildes som horisontale panoramabilder av fem under bilder (fliser). Derfor er en flis region, som består av fem overlappende fliser, ble definert 29. Denne flisen regionble plassert slik at den fullstendig dekker den elliptiske åpning av filterpapirbæreren i dens horisontale utstrekning (figur 2B - 0 time). Hver flis hadde en størrelse på 2048 x 2048 bildeelementer, som dekker et felt-for-visning av omtrent 2,7 mm, og flisene ble ervervet med en overlapping på 10%, noe som resulterer i totalt felt-of-view på omtrent 12 mm x 2,7 mm for panorama. Den motoriserte xy-scenen flyttet i forhold til målet med en hastighet på ca. 1,75 mm / sek mellom kjøp av de enkelte fliser 29. Det levende bildet ble fokusert på fremre presomitic mesoderm og de nylig dannet somites (forskning fokus for vår gruppe). For å kompensere for jevning og curling av embryoene i z-retning, ble små z-stabler (fem til syv forskjellige plan med en avstand på 30 mikrometer) kjøpt på hvert tidspunkt 30. Disse ble valgt rundt fokalplanet til den fremre spissen av presomitic mesoderm. Varigheten av time-lapse ACQuisition ble satt til 50 timer, og bildebehandlings intervaller på 3, 4, eller 10 min ble valgt 31. Kvaliteten på time-lapse oppkjøpet kan forbedres ved refocusing hver 5-10 timer og redefinerte z-stack rundt den nye optimal fokusplan. Ved slutten av forsøket ble hele tidsserie redigert manuelt, og undergrupper av bilder som inneholder den z-planet med det beste fokus ble opprettet og lagret i en egen mappe 32. Disse undergrupper av bildene var tid stiftet for å skape en komplett tidsserie av bilder med optimal fokus. Fliser av hvert bilde av denne komplette tidsserier ble sydd og smeltet sammen uten skygge korreksjon 30, og time-lapse rammer ble eksportert som JPEG-bilder av 100% størrelse og 95% komprimering 32. Time-lapse rammer ble importert som en bildesekvens til profesjonelle videoredigeringsprogramvare. De detaljerte 100% zoom ble stabilisert, og den generelle kontrasten ble justert til vår smak. De endelige tidsbortfaller var koded med H.264-kodeken og eksporteres i MPEG-4 beholdere. Filmer vises på en bildefrekvens på 15 bilder / sek (fps) og en oppløsning på 1920 x 1080 piksler.

Figur 2 viser en sammenligning mellom et foster i EF kultur 1 (figur 2A) og to embryoer i neddykket filterpapiret smørbrød kultur, en som dyrkes ventral siden opp (figur 2B), og den andre en dorsal side opp (figur 2C). Alle embryoer var alders matchet til syv somitt scenen (HH9) 15 og avbildes med en tidsmessig oppløsning på 4 min (Figur 2A og B) eller 10 min (figur 2C). Valgte rammer av 3 timers intervaller er avbildet. EF kultur (figur 2A) tillot svært stabil bilde grunn embryoet hviler på en stabil agar-albumin bunn 1,33. Hele embryo forble i en fokusplanet hele than hele time-lapse. Dette kan være fordelaktig for kortere eksperimenter (flere timer) og meget tidlige embryoer, men det kommer med en sterk begrensning av embryoet i z-retningen, eventuelt hindrer dens vellykkede tredimensjonale utvikling på lang sikt. I begynnelsen, innesperring bare resulterte i en liten side utflating av embryo hode i forhold til et embryo dyrket i neddykket filterpapiret sandwich med sin ventral siden opp (sammenlign figur 2A og 2B ved 0 time). Senere ble den snu hodet svekket (Figur 2A - 21 timer) og hjerteslag bremset ned. Blodsirkulasjonen nesten stoppet. Se Supplemental Movie 1 for hele time-lapse av embryoet i EF kultur. Den øvre panel i denne filmen viser en full oversikt over embryo, mens panelet på nedre venstre visualiserer hjertet utviklingen i full oppløsning. Segmentering av presomitic mesoderm inn somites kan være seg selvno i detalj på nedre høyre.

Embryoene i neddykket filterpapir sandwich, på den annen side, var begrenset i sin tredimensjonal ekspansjon bare av den naturlige spenning av membraner som omgir dem. De kunne dyrkes enten med sine ventral (figur 2B) eller dorsal siden opp (figur 2C). Uansett, embryoene viste kontinuerlig somitogenesen, og hodet snudd. De utviklet kranie og cervical bøyning og funksjonelle blodsirkulasjon. Begge embryoer i filterpapiret-sandwich ble fotografert med fokus på segmentering mesoderm, slik at deler av hodet gradvis beveget ut av fokus som embryoene vokste, fortykket, og begynte å svinge, mens den segmentering del av mesoderm forble i fokus (sammenlign figur 2B og 2C på 21 timer til 27 timer). Supplemental Movie 2 viser hele time-lapse film av embryoet avbildeti figur 2B. Den bildeintervallet var 4 min. Den øvre delen av denne filmen viser en full oversikt over embryo. Utviklingen av fosteret ble fotografert etter hverandre i løpet av 46 timer, men etter ca 30 timer, fikk fokus på segmentering mesoderm tapt på grunn av den generelle jevning og sliping av embryonale vev. Den nedre venstre panelet viser den tidlige utviklingen av hjertet i full oppløsning fra de oppkjøpte time-lapse rammer. Ved sammensmelting av de parede hjerte primordia på begge sider av midtlinjen, blir en nesten rett rørformet struktur dannes, og senere begynner å slå og bøying til høyre. Høyre panel nederst viser de mest nylig dannet somites og fremre spissen av presomitic mesoderm i full oppløsning og sporer dannelsen av nye somites over tid. Supplemental Movie 3 viser en annen embryo kultivert og avbildes ventral siden opp i neddykket filter papir sandwich. Den bildeintervallet var 4 min. Filmen dekker the utvikling av embryo fra scenen HH5-6 til ca iscenesette HH14 15, over omtrent 27 timer med kultur tid. Hodet fold former og utvikler seg baktil. Hjertet skjemaer fra det bilaterale primordia, begynner å slå, og svinger til høyre. De første tre til fire somites danner samtidig. Andre somites knopp av sekvensielt fra fremre spissen av presomitic mesoderm. Det nedre panel viser hoderegionen av embryoet i full oppløsning, som tillater observasjon av hodet folden og tidlig hjertedannelse i høy detalj. På grunn av gjennomsiktigheten av embryoet, kan lukke av nevralrøret observeres i fremtiden hoderegionen. Supplemental Movie 4 skjermer somitt formasjon i samme embryo i full oppløsning over hele bilde tid i nedre panel. Supplemental Movie 5 viser hele time-lapse av embryoet kultivert dorsal side opp (figur 2C). Den bildeintervallet var 10 min. Mens upper panelet viser utviklingen av embryoet fra de syv somitt trinn (HH9) til ca. trinn HH16-17, er det nedre panel beskåret for å vise de morfologiske forandringer i begynnelsen av hjernen på det stadiet i full oppløsning. Den lokal hevelse av nevralrøret kan observeres, som fører til regionalisering av forhjernen, midthjernen, og bakhjernen, som vil dele inn i fem underområder av embryonale hjernen på senere stadier 13. I tillegg kan veksten av de optiske vesikler sees tydelig. Etter ca 30 timer i kultur, er embryoet døende.

For å vise kompatibiliteten til den neddykkede filterpapir sandwich med mikromanipuleringer, flere polystyren-mikroperler (~ 40 mikrometer i diameter) ble implantert inn i eller i nærheten av presomitic mesoderm av en kylling embryo i det nedsenkede filterpapiret sandwich-kultur. Mikroperlene ble vasket i PBS for å fjerne lagringsbuffer og implanted før dekke kulturmediet med sjiktet av lett mineralolje (sammenlign trinn 2,18 til protokollen avsnitt). Et glass Pasteur pipette ble brukt til å overføre perlene til embryoet overflaten, under observasjon gjennom okularene i mikroskop. Fem hull ble opprettet i endoderm ved å forsiktig skrape den med en akupunkturnål. En skreddersydd J-formet verktøy, laget ved å strekke og bøye et glass Pasteur pipette i en flamme, ble brukt til å manipulere perler og presse dem forsiktig inn i hullene før de ble immobile. Tre hull ble fylt med en perle hver (figur 3A - 0 timer og 3B *) og to hull med to perler hver (figur 3A - 0 time). Figur 3A viser, i utvalgte time-lapse rammer, utviklingen av kylling embryo etter at mikro implantering av kulene. Tre perler ble med hell inkorporert i vevet på det ønskede sted, og deres bevegelse er avbildet over heleløpet av eksperimentet i høy detalj (figur 3B). Utviklingen av fosteret ikke synes å være svekket av manipulering eller tilstedeværelse av perlene. Se Supplemental Movie 6 for full time-lapse film. Den bildeintervallet var 4 min.

Figur 3
Figur 3: Time-lapse Imaging etter mikro Implantasjon. Proof-of-prinsippet eksperiment viser kompatibiliteten til nedsenket filterpapiret sandwich med mikro implantasjon. Lederen av embryoet er til venstre, men det ble ikke fotografert under dette eksperimentet. Bilder ble anskaffet ved hjelp mørkefelt belysning. (A) valgt time-lapse rammer som viser den manipulerte embryo ved 3 timers intervaller etter implantering av syv mikroperler (~ 40 mikrometer i diameter). Embryoet langstrakt og kontinuerlig dannet ekstra somites. Tre perler synes å ha blitt skikkelig festet og flyttet medialt med vevet flyt over 18 timer med kultur. De andre fire perler spratt ut av sine hull mellom seks og ni timer av kultur og drev baktil. (B) Detaljert visning av de tre enkelts perler (B1 til B3) implantert i presomitic mesoderm ved begynnelsen av eksperimentet (0 hr, B *) og etter 12 timers inkubasjon (B **). Tallet på bare-forming somites vises (S9 i B * og S18 i B **). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

film 1
Supplemental Movie 1: EC-kultur Ventralt Side Up. Embryo i EF kultur 1, kultivert ventral siden opp, fra de syv somitt scenen (HH9) 15 og utover på en agar-albumen bottom 1,33. Den bildeintervallet var 4 min. Den relative tiden vises i øvre venstre hjørne. bilder av høy kvalitet kan overtas, som fosteret ble innesperret i z-retning. Etter 21 timer ble hjerterytme og blodstrøm nesten arrestert og fosteret hadde begynt å gå i oppløsning. Det øvre panelet viser en ny størrelse oversikt av embryoet, mens den nedre paneler visual hjerte utvikling (venstre panel) og segmentering av presomitic mesoderm (høyre panel) i full oppløsning (100% zoom). (Høyreklikk for å laste ned).

Movie 2
Supplemental Movie 2: Submerged Filter Paper Sandwich Ventralt Side Up. Embryo dyrket i neddykket papir sandwich fra sju somitt scenen (HH9) 15 og utover, ventral side vendt opp. Den bildeintervallet var 4 min. Den relative tiden vises i øvre venstre hjørne i hr og min, starte på nytt etter 24 timer. Det øvre panelet viser en ny størrelse oversikt over utviklingen av embryo i løpet av 46 timer, etter hverandre. Den nedre venstre panelet visualiserer tidlig hjerte utvikling i løpet av de første 10 timer av bildet oppkjøpet i full oppløsning (100% zoom). Høyre panel lavere skildrer segmentere mesoderm i løpet av ca. 30 timer av utviklingen i full oppløsning (100% zoom) til fokus er tapt på grunn av generell jevning og sliping av embryonale vev. (Høyreklikk for å laste ned).

Movie 3
Supplemental Movie 3: Leder Fold-formasjonen. Embryo kultivert ventral siden opp i neddykket filterpapiret sandwich fra hanad-prosess / head-fold scenen (HH5-6) 15 til ca 22-somitt scenen (HH14) 15 i løpet av omtrent 27 timer med kultur tid. Den bildeintervallet var 4 min. Den relative tiden vises i øvre venstre hjørne i t og min, starte på nytt etter 24 timer. Det øvre panelet viser en ny størrelse oversikt over utviklingen av embryoet. Det nedre panel viser hoderegionen av embryoet i full oppløsning (100% zoom). Dannelsen av hodet fold og tidlig hjerte og nedleggelse av nevralrøret kan observeres. (Høyreklikk for å laste ned).

Movie 4
Supplemental Movie 4: somitogenesen. Embryo kultivert ventral siden opp i neddykket filterpapiret sandwich fra head-prosess / head-fold scenen (HH5-6) 15til ca 22-somitt scenen (HH14) 15 i løpet av omtrent 27 timer med kultur tid. Den bildeintervallet var 4 min. Den relative tiden vises i øvre venstre hjørne i t og min, starte på nytt etter 24 timer. Det øvre panelet viser en ny størrelse oversikt over utviklingen av embryoet. Den nederste panelet viser segmentering paraksialt mesoderm i full oppløsning (100% zoom). (Høyreklikk for å laste ned).

Movie 5
Supplemental Movie 5: Submerged Filter Paper Sandwich Dorsal Side Up. Embryo kultivert ryggsiden opp i den nedsenkede filterpapiret sandwich fra sju somitt scenen (HH9) 15 til omtrent HH16-17 scenen 15. Den bildeintervallet var 10 min. Den relative tiden visesi øvre venstre hjørne i hr og min, starte på nytt etter 24 timer. Det øvre panelet viser en ny størrelse oversikt over utviklingen av embryoet. Det nedre panel viser morfologiske forandringer i tidlig hjernen i full oppløsning (100% zoom). Embryoet døde etter ca 30 timer i kultur. (Høyreklikk for å laste ned).

Movie 6
Supplemental Movie 6: mikro implantert. Embryo kultivert ventral siden opp i neddykket filter papir sandwich for ca 19 timer, fra ni somitt scenen (HH9-10) 15. Den bildeintervallet var 4 min. Den relative tiden vises i øvre venstre hjørne i t og min. Det øvre panelet viser en ny størrelse oversikt av halen regionen med syv mikroperler implantert i presomitic mesoderm. Den nederste panelet viser regionen med implanterte mikroperler i full oppløsning (100% zoom). (Høyreklikk for å laste ned).

Discussion

Som en ny variant av den veletablerte EC kultur 1, forenkler nedsenket filterpapiret smørbrød kjøp av langsiktige lysfelt og mørkefelt time-lapse filmer fra tidlig kylling embryo ex ovo ved å lage en temperatur- og fuktighetsstyrt inkubator rundt mikroskop unnværlig. Snarere enn å være dyrket på et halvfast agar-albumen bunn, blir embryoene holdes helt nedsenket i en enkel dyrkingsmedium bestående av PC-saltløsning og tynne albumen. Fordampning og varmetapet blir minimalisert ved et lag av mineralsk olje som flyter på toppen av kulturmediet. Embryoet kan dyrkes lett, enten dorsal eller ventral siden opp, uten synlige forskjeller i kvalitet. Som vist her, embryoer i neddykket filterpapiret smørbrød er tilgjengelig for mikrokirurgisk inngrep, som bruk av morfogen-gjennomvåt perler. Fremtidige bruksområder er levende fluorescens bildebehandling, microinjections og electroporation, og genet Slå til manipulate og studere et bredt spekter av morfogenetiske hendelser under ventral (f.eks tidlig hjerte og somitogenesen) og rygg (f.eks sent gastrulation, nevralrøret nedleggelse, og tidlig hjernen) utvikling. En tidsavhengig medikamentbehandling er mulig hvis petriskål inneholdende filterpapir-sandwich er erstattet med en perfusjon kammer, slik at utveksling av kulturmediet under den mineralolje lag. Det nedsenkede filter papir smørbrød vil utvikle sitt fulle bildebehandling potensial i kombinasjon med laser-baserte imaging (inkludert lys-ark mikroskopi) og nedsenking mål.

Noen problemer med utarbeidelsen av den nedsenkede filter papir smørbrød vil bli behandlet i de følgende avsnittene. Selv om det krever bare en moderat mengde trening for å overføre et embryo fra plommen til filterpapiret sandwich, kan flere trinn fortsatt betydelig innvirkning på kvaliteten av embryoet i kultur. Før filterpapiret bærerenplasseres på eggeplomme, bør vitelline membranen rundt embryoet bli frigjort fra eventuelle tykke albumen. Først da vil forbindelsen mellom filterpapiret og vitelline membranen være sterk nok til å motstå vasking i PC-saltløsning. Filterpapiret som bærer embryoet skal krysse væske / luft-grenseflaten så lite som mulig for å minimalisere strekk på membranene. Når brakt inn i PC-saltvann for vask, må hele filterpapiret bærer være helt under vann til enhver tid. Tiden i PC-saltvann bad må begrenses til ca 30 - 60 sekunder, som vitelline membranen vil begynne å slippe fra filterpapiret. Likevel bør rengjøring av embryo bli gjennomført veldig grundig, så plomme rester vil senere skjule visningen av embryoet. Under vasking, aldri peke strømmen fra overføringspipetten direkte på fosteret, men alltid radialt bort fra det. Etter fjerning av embryo fra PC-saltvann, sørg for å holde filterpapiret horisontalt for å minimerespenning på embryonale membraner. Deretter stabil embryoet med den andre filterpapirbæreren. Når den andre filterpapirbæreren er plassert, unngå å skape en hvilken som helst lateral spenning, noe som kunne skifte filterpapiret bærere i forhold til hverandre og rive de embryoniske membranene. Når filterpapiret-sandwich bringes i kulturmediet, bør det også krysse luft / væske-grensesnittet bare en gang for å redusere spenningen på membranene. Det andre paret av rustfrie stålringer som brukes til å stabilisere filterpapiret sandwich fra toppen må plasseres meget langsomt og uten noe trykk for å minimere sammentrykking av embryoniske membranene. Små brudd i området opaca av embryoet helbrede vanligvis i løpet av den første timen av kulturen, men en skadet embryo kan og bør alltid erstattes av en ny prøve før oljelaget blir pipettert på toppen av kulturmediet.

Til bilde en hel embryo eller flere prøver for høy oppløsning time-lapse filmer, microscope må være utstyrt med en motorisert xy-stadium, styres av programvare mikroskop. Det er av avgjørende betydning å ha xy-scenen farten med en minimal hastighet for å unngå skade på befruktede egg og turbulens i kulturmedium og olje, noe som vil redusere bildekvaliteten. For kjøp av time-lapse filmer som presenteres her, flyttet den motoriserte xy-scenen med en hastighet på ca. 1,75 mm / sek. I fremtiden kan bildebehandling bli ytterligere forbedret ved først å flytte scenen til ønsket posisjon og henting av bildet etter en kort hvileperiode for å la vibrasjoner og turbulenser visne bort.

Som en begrensning, bør potensielle brukere være klar over den relativt lange arbeids avstand (ca. 1 cm) som er nødvendig for denne dyrkningsmetode hvis en oppreist mikroskop uten nedsenking mål er brukt. Denne arbeidsavstand resultater fra lag av mediet og mineralolje på toppen av embryoet. I 6 cm petriskål, har oljelaget a thickness på omtrent 1 til 1,5 mm, og embryoet er nedsenket omtrent 4 mm dypt i kulturmediet. Avhengig av diameteren av målet, kan den øvre kant av 6 cm petriskål også begrense tilgangen til embryoet. Dette kan omgås ved å bruke en større tallerken.

Arbeids avstanden fra toppen kan bli noe redusert ved å minimalisere tykkelsen av de flytende sjikt. I tillegg kan arbeidsavstanden fra nedenfor bli minimalisert ved å bringe den embryo videre ned til bunnen av petriskålen, og redusere tykkelsen av den glassvinduet fra den oppvarmede begerglass. Mens protokollen ble optimalisert for å fungere sammen med en opprettstående lang arbeidsavstand zoom mikroskop, kan det være montert et invertert mikroskop i tillegg. Fremtidige brukere bør huske på at å senke fosteret for dypt i kulturmediet kan føre til O 2 -diffusion problemer, selv om foreløpige forsøkene tyder på at begrenset spredning ikke synes å være et problem, så lenge fosteret er omgitt av en tilstrekkelig stor reservoar av kulturmedium, og filterpapiret inneklemt ikke er trykket mot bunnen av petriskålen.

En annen begrensning er temperaturkontroll. Ved å justere temperaturen i styreenheten for den oppvarmede begerglass til 40 ° C, temperaturen i mediet likevekt til 37,5 ° C rundt embryoene når mediet er dekket med mineralolje. Dette viser at noe energi går tapt mellom bunnen av begerglasset, hvor varmeelementene og temperatursensoren er plassert, og at plasseringen av embryoene. Temperaturkontrollen kan optimaliseres ved å flytte sensoren og redistribuere varmeelementene.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner økonomisk støtte fra en ZonMW-vici stipend 918.11.635 (Nederland). Forfatterne ønsker å takke verktøyet butikken av Vrije Universiteit Amsterdam for sine praktiske forslag og for produksjon oppsetts komponenter og Jarno Voortman av Carl Zeiss Nederland for nyttige råd om mikroskopi. Marjolein Blaauboer var en stor støtte i kritisk kommenterer flere utkast av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q Reference Water Purification System Millipore Z00QSV0WW 
Duran laboratory bottles, with caps, 1 L Sigma-Aldrich/Duran Z305200-10EA 
Name Company Catalog Number Comments
Solution A
NaCl Merck Millipore 1064041000
KCl Merck Millipore 1049361000
CaCl2·H2O Merck Millipore 1023821000
MgCl2·6H2O Merck/Sigma-Aldrich 13152-1KG-D 
Name Company Catalog Number Comments
Solution B
Na2HPO4·2H2O Merck 1065801000
NaH2PO4·2H2O Merck 1063420250
Name Company Catalog Number Comments
Whatman qualitative filter paper, Grade 595 Sigma-Aldrich 10311611
Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130 W, wavelength 10.6 µm Micro Lasersystems
Tork Extra Soft Facial Tissues Tork 140280
Latex gloves Sigma-Aldrich Z645613
EMDAMED EMDA 300.131
Transfer pipettes Sigma-Aldrich Z350613
VWR WITG5.480.003
Accu-jet pro Pipette Controller BrandTech Scientific 26332
Serological plastic pipettes, 25 ml Sigma-Aldrich CLS4251
Plastic document sleeves
Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40 Fiem
Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) Drost BV (Loosdrecht, NL)
10 cm Tissue culture dishes Sigma-Aldrich P5731
Greiner Bio-one 664160
6 cm Petri dishes Sigma-Aldrich P5481
50 ml Centrifuge tubes, Greiner centrifuge tubes or Cellstar tubes Sigma-Aldrich T2318
greiner bio-one 227261
Name Company Catalog Number Comments
Stainless steel rings, custom-made
Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness
Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring
Nail scissors
Forceps, Dumont #5, Inox Fine Science Tools , F.S.T. 11251-20
Fine, really sharp scissors for cutting filter paper VWR 21-102
M3516 Sigma-Aldrich Mineral Oil Sigma-Aldrich CAS Number 8042-47-5
Name Company Catalog Number Comments
Agar bottoms for EC culture
Agarose Sigma-Aldrich A9539 SIGMA
NaCl Sigma-Aldrich S7653 SIGMA-ALDRICH
Name Company Catalog Number Comments
Microbead implantation
Polybead Sampler Kit III (45 µm beads were used) Polysciences, Inc. 16905-1
Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30 mm SEIRIN  type J, No.02, 0.12x30mm
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023 
Name Company Catalog Number Comments
Temperature controlled beaker
RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M Omega RTD-850M
Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M Omega HSRTD-3-100-A-1M
Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50 Omega EXTT-3CU-26S-50
3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD's and Thermistors MTP-U-M Omega MTP-U-M
Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P Omega KHLV-103/(10)-P
Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC Omega CNi16D24-C4EIT-DC
Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)
Name Company Catalog Number Comments
Microscope setup
Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN Carl Zeiss AG 495010-0009-000
Objective PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56 mm Carl Zeiss AG 435281-9100-000
Manual Rotary Control MARC Carl Zeiss AG 435604-0000-000
Transillumination top 450 mot Carl Zeiss AG 435500-9000-000
Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D) Carl Zeiss AG 435465-9020-000
Insert plate S, glass 237x157x3 mm (D) Carl Zeiss AG 435465-9053-000
Controller EMS 3 Carl Zeiss AG 435610-9010-000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss AG 435611-9010-000
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera Hamamatsu C11440-22CU
Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual Carl Zeiss AG 490004-0025-000
Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US Carl Zeiss AG 410373-0200-000
LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24" Carl Zeiss AG 410350-2403-000 not available anymore
ZEN pro 2012 Hardware License key Carl Zeiss AG 410135-1002-120 not available anymore
ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key Carl Zeiss AG 410136-1045-110
ZEN module Z Stack Carl Zeiss AG 410136-0030-110
ZEN Module Tiles/ Positions Carl Zeiss AG 410136-1025-110
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss AG 410136-1031-110
ZEN Module Experiment Designer Carl Zeiss AG 410136-1022-110
ZEN Desk 2012 Hardware License Key Carl Zeiss AG 410135-1004-120 not available anymore

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).
  2. Rozbicki, E., et al. Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation. Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).
  3. Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. Neurulation: Coming to closure. Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).
  4. Schoenwolf, G. C., Sheard, P. Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker. Development. 105 (1), 17-25 (1989).
  5. Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. Towards a cellular and molecular understanding of neurulation. Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).
  6. Pourquié, O. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies. Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).
  7. Maenner, J. Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process. Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).
  8. Wittig, J. G., Münsterberg, A. The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).
  9. Layer, P. G., Alber, R. Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases. Development. 109 (3), 613-624 (1990).
  10. Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras. Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).
  11. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  12. Andermatt, I., Stoeckli, E. T. RNAi-based gene silencing in chicken brain development. Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).
  13. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).
  14. Endo, Y. Chick embryo culture and electroporation. Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  16. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).
  17. Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells. Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).
  19. Auerbach, R., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).
  20. New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro. J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).
  21. Stern, C. D., Bachvarova, R. Early chick embryos in vitro. Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).
  22. Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo. Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).
  23. Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture. Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).
  24. Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. Culturing of avian embryos for time-lapse imaging. Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).
  25. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).
  26. Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods. Methods. 66 (3), 441-446 (2014).
  27. Pannett, C., Compton, A. The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice. Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).
  28. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).
  29. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Software Guide ZEN 2 - The Tiles & Positions Module. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/9943124DA6FFBA5DC1257E9300412F8B/$FILE/ZEN2_Tiles_and_Positions_Module_Software_Guide.pdf (2015).
  30. Carl Zeiss Microscopy. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide. , V1.0 en, Available from: https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf (2014).
  31. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Acquiring multidimensional images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf (2014).
  32. Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from: http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf (2014).
  33. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. Culture of Avian Embryos. Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).

Tags

Developmental Biology time-lapse imaging filter papir sandwich kyllingembryo EC kultur, Micromanipulation somitogenesen neurulation hjerte utvikling hjerne formasjon
En Submerged filterpapir Sandwich for Long-term<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse Imaging of Early kyllingfoster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmitz, M., Nelemans, B. K. A.,… More

Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (118), e54636, doi:10.3791/54636 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter