Abstract
哺乳动物身上配备，帮助自己从病原体的入侵防御机制各层。免疫系统的专业吞噬细胞-如中性粒细胞，树突细胞，和巨噬细胞-保留来检测和通过吞噬1清除这样侵入的病原体的固有能力。吞噬作用涉及在细胞表面2,3膜重组和肌动蛋白重塑的精心策划的事件。吞噬细胞成功地内化和消灭外来分子，只有当吞噬的所有阶段都得到满足。这些步骤包括识别与通过模式识别受体驻留在细胞表面的病原体（的PRR）的结合，通过肌动蛋白富集膜突起（伪足）的形成吞噬杯包围颗粒，并随后吞噬溶酶体成熟吞噬体的断裂那结果在杀死病原体3,4。
吞噬作用的不同阶段的成像和定量是工具阐明此细胞过程的分子机制。本稿件报告的方法来研究细胞吞噬功能的不同阶段。我们描述了一个基于显微镜的方法来可视化和量化的结合，吞噬杯的形成和颗粒的吞噬细胞内化。由于当吞噬细胞受体的先天上遇到一个目标粒子大于0.5微米，我们在座的试验包括使用致病性真菌白色念珠菌和其他微粒，如酵母多糖和IgG涂层珠的配体发生吞噬。
Introduction
尽管连续暴露在病原体如细菌，病毒和真菌，我们的身体是配备了能够提供保护，免受感染的免疫机制。先天免疫系统是防御的第一线对抗入侵的病原体，主要依赖于识别和内外国目标吞噬细胞。
吞噬作用是一种进化上保守的细胞过程，包括不想要的颗粒小于0.5微米更大的吞噬。吞噬细胞表达的广泛的免疫受体（也称为模式识别受体，模式识别受体）在细胞表面，使他们能够识别病原体相关分子模式（PAMP）存在于前吞没3病原体。病原体结合后跟受体聚类在细胞表面并触发吞噬杯的形成。这将导致在突出左右的肌动蛋白驱动的膜重塑目标，最终包围它和捏断以形成离散的吞噬体的液泡2,5。吞噬体成熟，然后通过后续的融合与后期内涵体和溶酶体形成吞噬溶酶体酸化6。
虽然吞噬作用被描述为受体介导的肌动蛋白和驱动事件，这个过程也依赖于组成质膜脂质，如磷酸肌醇（PIS）和鞘脂7,8的时空修饰。而肌动蛋白聚合是通过在吞噬杯的基磷酸肌醇-4,5-二磷酸（PI（4,5）P 2）的局部积累决定的，肌动蛋白解聚取决于（PI（4,5）P的转换2到磷酸肌醇-3,4,5-二磷酸（PI（3,4,5）P 3）3,9。这两种修改是因为前者导致围绕目标伪足而后者使得能够在吞噬细胞10的胞质溶胶下沉颗粒的成功扩展必要的。
具有吞噬能力的细胞是专业的吞噬细胞，如同巨噬细胞/单核细胞，粒细胞/嗜中性粒细胞，和树突细胞（DC）或外行吞噬细胞，如成纤维细胞和上皮细胞11。由所有吞噬细胞进行吞噬作用起着组织维持和重塑中发挥中心作用，在由专业的吞噬细胞进行吞噬作用是负责对病原体的先天和适应性免疫反应的协调。专业的吞噬细胞不仅吞噬和杀死病原体，但也存在抗原的适应性免疫系统的淋巴样细胞。这有助于促炎性细胞因子的释放和淋巴样细胞的接合，因此导致感染12成功封锁。
常规生化技术一直在获得关于吞噬期间不同的细胞过程，如翻译后修饰和蛋白质之间的各种高亲和力关联的分子机制的知识的工具。然而，很难获得关于使用常规生化方法吞噬活动的空间和时间的动态信息。活细胞成像不仅使我们能够监视在时间敏感的方式的细胞事件，但也使我们在单细胞水平上获得的信息。这里，我们描述的方法来研究吞噬的不同阶段，以及spatiotemporally使用共聚焦显微镜分析的全过程。
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Protocol
1. DC2.4和RAW 264.7细胞系的制备
注：巨噬细胞样细胞系RAW 264.7和树突状细胞系DC2.4都是鼠源，并使用下述条件下生长的细胞。
- 生长在DMEM的RAW 264.7细胞（Dulbecco氏最小的Eagle培养基），补充了10％灭活胎牛血清（FBS）的在37℃在具有5％CO 2的加湿培养箱。
- 生长DC2.4细胞与RAW 264.7细胞的相似的条件，除了补充有L-谷氨酰胺代替DMEM使用RPMI（罗斯韦尔园区纪念研究所）培养基。
2.荧光共轭颗粒的制备：包被抗体白色念珠菌 ，酵母多糖，珠
- 成长白色念珠菌
- 从冷冻甘油贮存接种白色念珠菌菌株SC5314 25 YPD补充有乌里（2％细菌蛋白胨，1％的溶液酵母提取物，2％葡萄糖，并在30℃下过夜80微克/毫升尿苷）。
注意：避免增长的念珠菌培养一个多外径12的600。 - 取1毫升的白色念珠菌和自旋下来以2,000 xg离心在室温下5分钟。
- 吸出上清液并重新悬浮用1毫升的PBS沉淀。
- 收集通过离心沉淀在2000 xg离心在室温下5分钟。
- 重复步骤2.1.4。
- 计算白色念珠菌的感染复数（MOI）的关系的多重到吞噬细胞的数量，并与吞噬作用测定法进行如下的第3节的OD描述的1 600相当于每毫升2.5×10 7个白色念珠菌 。
注：念珠菌-BFP的产生在参考13进行说明。
- 从冷冻甘油贮存接种白色念珠菌菌株SC5314 25 YPD补充有乌里（2％细菌蛋白胨，1％的溶液酵母提取物，2％葡萄糖，并在30℃下过夜80微克/毫升尿苷）。
- 酵母聚糖和IgG包被珠子的制备
注：酵母聚糖是含β葡聚糖来自酿酒酵母来源真菌碳水化合物颗粒制剂。酵母聚糖已知唤起在巨噬细胞和树突状细胞的炎性信号，并且已经在吞噬作用的研究13，14，15广泛使用。- 短暂涡旋包含微粒的管中，并分装足以实验到1.5毫升管的量。
注意：通常我们使用1:10的比例（为一个小区，加10酵母多糖颗粒或IgG包被的珠子）。 - 加入1ml冰冷PBS中，并通过以10,000×g下离心1分钟收集所述颗粒。
- 吸出上清液，重悬在1ml冰冷的PBS沉淀。
- 重复步骤2.2.2-2.2.3
注意：继续执行步骤2.2.5或管保存在4℃直至使用。 - 超声处理10秒在超声浴超声波仪的微粒（120伏，50-60千赫），以避免一纽约颗粒聚集。
- 短暂涡旋包含微粒的管中，并分装足以实验到1.5毫升管的量。
3.吞噬
注：吞噬作用是一个复杂的过程，与通过的PRR的相互作用与颗粒的表面上的配体的吞噬细胞的细胞表面上的颗粒的结合开始。结合之后是肌动蛋白的组装，并在接触的部位及其相关的蛋白质，并吞噬杯的形成。随后的肌动蛋白拆卸发生在吞噬体与导致颗粒的完全吞没。下面我们描述吞噬的不同阶段。
- 结合分析
注：此实验的目的是监测吞噬的第一步涉及对目标颗粒的配位体和吞噬细胞的受体之间的相互作用。- 种子约5×10 4个细胞中的腔室滑动，使得它们在实验的时间的60-70％汇合。 Alternatively，在盖玻片上板的细胞（在24或12孔格式）或玻璃底96孔板。孵育细胞在37 5％的CO 2℃培养箱过夜。
注：细胞可以通过血细胞计数器或类似的技术来计算。 - 放置在10℃的室中滑动（或板）10分钟。
- 轻轻地从每孔用吸管或抽吸删除网上平台。
注意：执行此步骤仔细作为一个腔玻璃罩系统的每孔小;很容易扰乱细胞用移液管的尖端或吸气的强气流。 - 用细胞培养基混合荧光标记的颗粒（如上所述制备）。添加念珠菌 -BFP（以10的MOI），荧光共轭酵母多糖或乳胶珠-兔IgG-FITC（每个细胞10个粒子）细胞中。使用200μl的媒体的终体积为一个腔室以及，以确保所有的细胞都包括在内。
- 降速在277室的幻灯片XG的在10℃下3分钟。
注意：此离心步骤有助于提高微粒与细胞之间的接触，并进行同步的装订处理。 - 紧接在室滑动用5％的CO 2转移到37℃培养箱5分钟。
- 取下孵化室幻灯片，吸媒体。
- 洗细胞用冰冷的PBS 3倍。
注意：检查未结合的颗粒，用光学显微镜的存在下，必要时，用PBS洗涤多次。它从井除去未结合的粒子在分析过程中，以减少背景噪声是必不可少的。 - 通过添加在室温下30分钟温育在PBS中稀释500μl的4％低聚甲醛（PFA）固定细胞。
注意：此步骤需要使用4％PFA的这是高度有毒，腐蚀性，以及潜在的致癌物质。适当的谨慎在使用此液体时，要采取。而且，要保护样本的光。 - 重复3.1.9步骤两次。
注：在这一步骤中，填充每个小瓶删除以前的PBS之后。 - 通过用在PBS中500μl的50mM的NH 4 Cl作为10分钟孵育停止固定。
- 如在步骤3.1.10中描述，用PBS洗涤细胞两次。
- 在室温下加入250微升（在PBS中0.1％皂甙，0.2％BSA）中的结合缓冲液30分钟通透细胞。
- 通过加入荧光共轭毒伞素（：在结合缓冲液500稀释1）染色F-肌动蛋白。孵育细胞，在室温下1小时。
- 如在步骤3.1.10所述洗涤细胞三次，用PBS。
- 捕获使用共聚焦显微镜（63X目标，402 nm和488 nm激光）的图像和使用ImageJ 16分析图像。
注意：一个成功的粒子结合的特征是吞噬铜的存在下p在所在的部位微粒接触的吞噬细胞（ 图1）。请参阅步骤3.2.5。
- 种子约5×10 4个细胞中的腔室滑动，使得它们在实验的时间的60-70％汇合。 Alternatively，在盖玻片上板的细胞（在24或12孔格式）或玻璃底96孔板。孵育细胞在37 5％的CO 2℃培养箱过夜。
- 吞噬作用摄取测定
注意：此实验的目的是监测由使用共聚焦显微镜（ 图2）的吞噬细胞荧光标记颗粒的完全内化。- 种子约5×10 4个细胞中的腔室滑动，使得它们在实验的时间的60-70％汇合。可替代地，在盖玻片上板的细胞（在24或12孔格式）或玻璃底96孔板。孵育细胞在37 5％的CO 2℃培养箱过夜。
注：细胞可以通过血细胞计数器或类似的技术来计算。 - 保持腔室载玻片（或板）在10℃下10分钟。
注：冷却是必要的，以便阻止细胞内吞作用以及不必要的吞噬作用，并随后到具有一个同步吞噬作用。 - PERFORM的步骤从3.1.3至3.1.5
- 传送腔室滑动到5％的CO 2 37℃培养箱，孵育不同的时间点。修正后的30，60和90分钟后感染的细胞。观察白色念珠菌开始形成，60分钟后感染菌丝;吞噬细胞开始90分钟后8显示细胞死亡（pyroptosis）。
注意：这是一个建议，并且取决于细胞类型和所用的微粒的优化是必需的。 - 执行步骤从3.1.7至3.1.15。分析使用ImageJ 16个图像。
注意：一个成功的摄取的特征是吞噬细胞的细胞质内的颗粒的完全内化（ 图2）。与细胞表面标记物染色的吞噬细胞如鬼笔环肽有助于描绘细胞的轮廓。它也必须按顺序执行的z堆栈来确定微粒是否绑定到细胞表面或并发症etely内化。
- 种子约5×10 4个细胞中的腔室滑动，使得它们在实验的时间的60-70％汇合。可替代地，在盖玻片上板的细胞（在24或12孔格式）或玻璃底96孔板。孵育细胞在37 5％的CO 2℃培养箱过夜。
- 吞噬的实时成像
注：在这个协议中，我们描述了利用共聚焦显微镜来捕捉使用荧光酵母多糖结合吞噬的不同阶段。我们使用的树突状细胞系DC2.4稳定表达mCherry标记的F-肌动蛋白8，一种生物传感器，显示丝状肌动蛋白的活细胞中的分布。由于吞噬作用是一种肌动蛋白驱动的过程中该细胞的实时成像不仅使我们能够捕获F-肌动蛋白网络的移动和动力学，但也可视化的活细胞内的不同的吞噬活动（ 图3，电影1）。- 种子在室滑动约5×10 4个细胞的浓度，使它们在实验的时间的60-70％汇合。孵育细胞在37 5％的CO 2℃培养箱过夜。
注：细胞可以用血球或计数类似的技术。 - 保持室载玻片在冰上10分钟。
注：冷却是必要的，以阻止不需要的吸收，并且有一个同步吞噬作用。 - 执行步骤从3.1.3至3.1.5
- 预暖显微镜阶段至37℃并达到平衡，用5％ 的 CO 2的室中。等待温度和CO 2 30-45分钟开始成像之前稳定。
注：由于CO 2和温度水平是吞噬作用至关重要，它在显微镜加热器转动实验之前以平衡环境室是重要的。 - 放置装有将细胞在37℃和5％CO 2平衡的显微镜培养器外壳的腔室滑动。
- 执行实时成像17,18。
注：对于激光功率（增益，针孔等 ）的设置可以在根据第的类型而改变Ë显微镜和荧光探针使用。因此，我们建议咨询显微镜的手册最佳条件为您实时成像17,18。- 使用共聚焦激光扫描显微镜（和相关联的软件），用于实时成像。使用63X 1.4NA油浸物镜与艾里1-1.1单位针孔。
- 要启动成像，使用明场找上了玻片的代表区域。接下来，通过点击软件上的位置选项选择字段。为了检测GFP在田径1在582 nm的分束器使用的过滤器设置为488纳米的激光，检测488和582纳米之间的波长。
- 在第2道中选择使用的光束分离器在578纳米和578和纳米之间600检测的波长滤波器，用于mCherry（RFP）设置最佳的。使用488 nm和578 nm激光50％激光功率和600-700增益输出。获得的图像，每隔30秒，共90分钟。
- 种子在室滑动约5×10 4个细胞的浓度，使它们在实验的时间的60-70％汇合。孵育细胞在37 5％的CO 2℃培养箱过夜。
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Representative Results
基于显微镜对监测吞噬不同阶段的方法。通过DC2.4细胞各种荧光颗粒的吞噬过程中不同的事件被示出。使用此处描述的技术，我们研究在吞噬作用的早期阶段鞘脂的作用。为了这个目的，DC2.4树突状细胞在Sptlc2，催化在鞘脂生物合成途径的第一个和限速步骤的酶的基因缺失，被使用。相比于野生型细胞，Sptlc2 - / - DC2.4细胞已显著减少鞘脂包括神经酰胺，鞘磷脂和葡糖8的水平。 Sptlc2 - / - DC2.4细胞在，以及白色念珠菌 ，酵母多糖和IgG的胶乳珠8的摄取结合缺陷。在图1中 ，在DC2.4细胞结合的荧光的共轭酵母多糖颗粒中示出（见Sectioñ3.1详细信息）。 Sptlc2 - / - DC2.4细胞表现显著更少酵母聚糖的比对照DC2.4细胞（p值= 0.0008; 图1A）的结合。每个细胞结合的酵母多糖颗粒的数目是控制细胞比为Sptlc2显著更高- / - DC2.4细胞（P <0.0001; 图1C）。接下来，我们调查了Sptlc2的能力- DC2.4细胞吞噬白色念珠菌 - /。 Sptlc2 - / - DC2.4细胞显示出白色念珠菌显著少吞噬（P <0.0005）相比于对照细胞（ 图2A，2B）作为。正如所料，Sptlc2缺陷细胞表现显著更高数量的非吞噬细胞（P <0.05; 图1C）和降低每个单元的白色念珠菌 （ 图1C，D）的数量。这些结果强调了一个完整的鞘脂生物合成途径中的作用的结合，以及在叔他摄取的颗粒。 图3显示了时间推移图像演示吞噬的早期阶段（见3.3节详细步骤）。 电影1显示DC2.4稳定表达F-肌动蛋白，揭示丝状肌动蛋白在活细胞中（参见3.1节了解详细信息）分布的生物传感器的实时成像。
图1：酵母多糖结合含量测定中DC2.4细胞。 （ 一 ）控制和Sptlc2 - / - DC2.4细胞与荧光共轭酵母多糖孵育，他们结合激光共聚焦显微镜检查颗粒的能力。箭头指示的结合位点。比例尺= 100微米。结合酵母聚糖颗粒（B）和酵母聚糖颗粒的数目的数目（B，C）定量每Ç绑定ELL（C）中示出。结合的粒子进行了量化，并表示为相对于对照的百分比。所有图显示三个独立实验的SD，并计数每个实验至少200个细胞。非配对t检验来分析的观察到的差异的显着性。 ** P <0.001。比例尺= 100微米。从Tafesse 等许可再版。 ，2015年8。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：C的吞噬作用。 白色念珠菌在DC2.4细胞。 （A）的感染细胞用C andida -BFP如步骤3.2中所述。在90分钟后感染，将细胞固定并用荧光共轭phalloid染色并使用共聚焦显微镜成像。 （B - D）的内化念珠菌 -BFP，非吞噬细胞的数量，而每个单元念珠菌 -BFP的数量的定量被示出。所有图显示三个独立实验的SD，并计数每个实验至少200个细胞。非配对t检验来分析的观察到的差异的显着性。 ** P <0.001。比例尺= 100微米。从Tafesse 等许可再版。 ，2015年8。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 白色念珠菌的时间推移成像摄取形象化吞噬的早期阶段。野生型DC2.4细胞稳定表达F肌动蛋白 （显示为红色）-mCherry（F-肌动蛋白） 念珠菌 -BFP孵育并用激光共聚焦显微镜成像。在30秒的时间间隔拍摄的图像显示。星号吞噬期间显示肌动蛋白重塑的不同阶段。比例尺= 100微米。从Tafesse 等许可再版。 ，2015年8。 请点击此处查看该图的放大版本。
电影1： 实时成像。稳定表达F-肌动蛋白，mCherry（以绿色显示）野生型DC2.4细胞感染念珠菌 -BFP（显示为红色）。利用共聚焦显微镜如步骤3.3所述进行实时成像。从Tafesse 等许可再版。 ，2015年8。S / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi“目标=”_空白“>请点击这里观看该视频。（右键点击下载）。
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Discussion
专业的吞噬细胞如巨噬细胞和树突细胞，吞噬和消除侵入的病原体，因此使吞噬宿主防御系统的一个重要组成部分。在此过程中吞噬细胞进行大量的膜重组和骨架重排在其细胞表面8，19，20。为了更好地了解这个动态的过程，吞噬作用的不同阶段的可视化是必不可少的。在这里，我们描述了用于监测吞噬的各个步骤的基于显微镜法。
实时成像技术的主要意义在于，它提供了显着的能力，以监测在分子水平上的宿主 - 病原体接口。通过允许的微生物感染的关键步骤的可视化，实时成像提供了关键的洞察的免疫反应的基本性质对病原体8，10，21，22。除了吞噬作用，这里所描述的技术可以被扩展以研究其它类型的受体介导的内吞作用，包括巨吞饮10。实时成像也是宝贵的方法来研究细胞内细菌如结核分枝杆菌和伤寒沙门氏菌，以及包括利什曼原虫和弓形虫寄生虫的宿主-病原体关系 22，23。
有活细胞成像在其他技术几个优点，例如常规的生化方法。活细胞成像允许我们监视细胞过程8的时空动力学。此外，实时成像可以让我们获得通知在通货膨胀单个细胞第21号决议。吞噬作用是一个动态的蜂窝的过程，涉及的受体，肌动蛋白和膜脂质重构聚类在几分钟10的问题。实时成像，使我们能够捕捉时间敏感的方式，这是否则很难完成这样的信息。
该技术的主要限制是，它需要的实验条件和显微镜设置仔细优化。有成功地获得图像的关键几个关键因素。利用可视化的吞噬细胞（如F-肌动蛋白），以及用于标记微粒染料的性质的荧光蛋白（或生物传感器）的质量是成像的关键方面。对于实时成像，同样重要的是显微镜设置的环境室的平衡。取决于仪器，该平衡可以从15分钟到几个小时。思NCE 的 CO 2供给旨在向培养基内保持适当的pH，这是必要的，以允许足够的运行时间之前建立实验。在情况下，当CO 2的供给不足和/或不均匀的，两性离子的有机化学缓冲剂诸如HEPES可以补充到生长培养基。荧光微粒和活细胞长期暴露在激光共聚焦激光可以导致光毒性和漂白。优化激光功率（少曝光时间越好），并确保快门关闭图像采集之间可以减轻这些问题。总体而言，这里描述的技术非常适合在吞噬病原体研究和吞噬细胞之间的动态关系。
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Acknowledgments
我们感谢温迪三文鱼和凯克设施的尼基·沃森在麻省理工学院的Whitehead研究所成像。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
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