Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Phagocytosis के प्रारंभिक दौर Visualizing

Published: February 3, 2017 doi: 10.3791/54646
Automatic Translation
*2, *2, 1,2
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health & Science University, 2Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard
* These authors contributed equally

Abstract

स्तनधारी शरीर तंत्र के विभिन्न परतों कि रोगज़नक़ हमलों से खुद की रक्षा करने में मदद के साथ सुसज्जित है। ऐसे न्यूट्रोफिल, वृक्ष के समान कोशिकाओं, और मैक्रोफेज के रूप में - - प्रतिरक्षा प्रणाली की व्यावसायिक फ़ैगोसाइट का पता लगाने और phagocytosis 1 के माध्यम से इस तरह के हमलावर रोगजनकों स्पष्ट करने के जन्मजात क्षमता बरकरार रहती है। Phagocytosis कोशिका की सतह 2, 3 पर झिल्ली पुनर्गठन और actin remodeling के नृत्य की घटनाओं में शामिल है। Phagocytes सफलतापूर्वक internalize और विदेशी अणुओं उन्मूलन केवल जब phagocytosis के सभी चरणों को पूरा कर रहे हैं। ये कदम मान्यता और पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा रोगज़नक़ (PRRS) कोशिका की सतह पर रहने के बंधन में शामिल हैं, actin समृद्ध झिल्लीदार उभार (pseudopods) के माध्यम से phagocytic कप के गठन के कण को ​​चारों ओर, और फेगोसोम का बँटवारा phagolysosome परिपक्वता के द्वारा पीछा किया है कि में परिणामरोगज़नक़ 3, 4 की मौत हो गई।

इमेजिंग और phagocytosis के विभिन्न चरणों की मात्रा का ठहराव इस सेलुलर प्रक्रिया के आणविक तंत्र elucidating के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। वर्तमान पांडुलिपि तरीकों की रिपोर्ट phagocytosis के विभिन्न चरणों का अध्ययन करने के लिए। हम कल्पना और बंधन, phagocytic कप गठन यों तो एक माइक्रोस्कोप आधारित दृष्टिकोण, और phagocytes से कण के internalization का वर्णन है। Phagocytosis रूप में होता है जब phagocytic कोशिकाओं पर सहज रिसेप्टर्स लक्ष्य कण से भी बड़ा 0.5 माइक्रोन, assays हम यहाँ पेश रोगजनक कवक कैंडिडा सफेद और ऐसे zymosan और आईजीजी लिपटे मोतियों के रूप में अन्य विविक्त के उपयोग के समावेश पर ligands मुठभेड़।

Introduction

इस तरह के बैक्टीरिया, वायरस और कवक के रूप में रोगजनकों के लिए निरंतर प्रदर्शन के बावजूद, हमारे शरीर को अच्छी तरह से प्रतिरक्षा तंत्र है कि संक्रमण के खिलाफ संरक्षण प्रदान करने के साथ सुसज्जित है। सहज प्रतिरक्षा प्रणाली पर हमला रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है और phagocytic कोशिकाओं है कि पहचान और विदेशी लक्ष्यों को भली पर मुख्य रूप से निर्भर करता है।

Phagocytosis एक evolutionarily संरक्षित सेलुलर प्रक्रिया है कि 0.5 माइक्रोन से अधिक अवांछित विविक्त का घिराव शामिल है। Phagocytic कोशिकाओं प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स कोशिका की सतह पर है कि उन्हें रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) घिराव 3 से पहले रोगजनकों पर उपस्थित पहचान करने के लिए सक्षम है (यह भी पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स, PRRS के रूप में जाना जाता है) की एक विस्तृत श्रृंखला व्यक्त करते हैं। पैथोजन बंधन कोशिका की सतह पर रिसेप्टर क्लस्टरिंग द्वारा पीछा किया और एक phagocytic कप के गठन से चलाता है। इस actin संचालित झिल्ली remodeling है कि चारों ओर protrudes में यह परिणामलक्ष्य, अंततः इसे घेर और बन्द रखो बंद एक असतत phagosomal रिक्तिका 2, 5 के रूप में। फेगोसोम तो परिपक्व होती है और देर endosomes और लाइसोसोम कि phagolysosome 6 रूपों के साथ बाद में संलयन द्वारा acidifies।

Phagocytosis रिसेप्टर की मध्यस्थता और actin संचालित घटना के रूप में वर्णन किया गया है हालांकि, इस प्रक्रिया को भी लिपिड, ऐसे phosphoinositides (पीआईएस) और sphingolipids 7, 8 के रूप में है कि प्लाज्मा झिल्ली रचना के स्थानिक अस्थायी संशोधन पर निर्भर करता है। जबकि actin polymerization phagocytic कप के आधार पर phosphoinositol-4,5-biphosphate (पीआई (4,5) पी 2) के एक स्थानीय संचय से निर्धारित होता है, actin depolymerization की (पीआई (4,5) पी रूपांतरण पर निर्भर करता है 2 phosphoinositol-3,4,5-biphosphate करने के लिए (पीआई (3,4,5) पी 3) 3, 9। दोनों संशोधनोंलक्ष्य के आसपास pseudopods और बाद भक्षककोशिकीय 10 की cytosol में कणों की डूब में सक्षम बनाता है सफल विस्तार के लिए पूर्व सुराग के रूप में आवश्यक हैं।

प्रकोष्ठों phagocytose करने की क्षमता है कि या तो पेशेवर फ़ैगोसाइट, मैक्रोफेज / monocytes, granulocytes / न्यूट्रोफिल, और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) या ऐसे fibroblast और उपकला कोशिकाओं के रूप में 11 गैर-फ़ैगोसाइट, की तरह। सभी फ़ैगोसाइट द्वारा किया जाता phagocytosis, ऊतक के रखरखाव और remodeling में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, जबकि पेशेवर फ़ैगोसाइट द्वारा किया जाता phagocytosis रोगजनकों के खिलाफ सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के समन्वय के लिए जिम्मेदार है। व्यावसायिक फ़ैगोसाइट केवल अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं लसीकावत् के लिए मौजूद एंटीजन निगल नहीं है और रोगज़नक़ मार, लेकिन यह भी। यह समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स की रिहाई के लिए और लसीकावत् कोशिकाओं की सगाई के लिए योगदान देता है, इसलिए करने के लिए अग्रणीसंक्रमण 12 के सफल नाकाबंदी।

परंपरागत जैव रासायनिक तकनीक ऐसी बाद translational संशोधनों और प्रोटीन के बीच विभिन्न उच्च आत्मीयता संघों के रूप में phagocytosis के दौरान विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के आणविक तंत्र के बारे में ज्ञान प्राप्त करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। हालांकि, यह परंपरागत जैव रासायनिक तरीकों का उपयोग कर phagocytic घटनाओं के स्थानिक और लौकिक गतिशीलता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। लाइव सेल इमेजिंग न केवल हमें एक समय संवेदनशील तरीके से सेलुलर घटनाओं पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक एकल कोशिका स्तर पर जानकारी हासिल करने के लिए हमें सक्षम बनाता है। यहाँ हम phagocytosis के विभिन्न चरणों की जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन है, साथ ही पूरी प्रक्रिया spatiotemporally विश्लेषण करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DC2.4 और रॉ 264.7 सेल लाइनों की तैयारी

नोट: बृहतभक्षककोशिका की तरह सेल लाइन रॉ 264.7 और वृक्ष के समान सेल लाइन DC2.4 दोनों murine मूल के हैं, और निम्न स्थितियों में कोशिकाओं को विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

  1. DMEM में रॉ 264.7 कोशिकाओं (Dulbecco मिनिमल ईगल मध्यम) के साथ पूरक बढ़ो 10% 5% सीओ 2 के साथ एक humidified इनक्यूबेटर में निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. रॉ 264.7 कोशिकाओं के साथ इसी तरह की परिस्थितियों में DC2.4 कोशिकाओं को विकसित है, सिवाय इसके उपयोग RPMI (रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान) मध्यम एल Glutamine के बजाय DMEM के साथ पूरक।

2. फ्लोरोसेंट संयुग्मित particulates की तैयारी: सी सफेद, Zymosan, आईजीजी लिपटे मोतियों

  1. कैंडिडा सफेद बढ़ रहा है
    1. उरी (2% Bacto-peptone, 1% के साथ पूरक YPD के 25 मिलीलीटर में एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से सी सफेद तनाव SC5314 टीका लगानाखमीर निकालने, 2% ग्लूकोज और 80 माइक्रोग्राम / एमएल uridine) 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर।
      नोट: एक आयुध डिपो 12 के 600 से भी अधिक कैंडिडा संस्कृति बढ़ रही करने से बचें।
    2. सी albicans के 1 मिलीलीटर ले लो और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर यह नीचे स्पिन।
    3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ गोली फिर से निलंबित।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर centrifugation द्वारा गोली ले लीजिए।
    5. दोहराएँ कदम 2.1.4।
    6. फ़ैगोसाइट की संख्या के संबंध में सी albicans के संक्रमण (MOI) की बहुलता की गणना और धारा 3 एक आयुध डिपो में वर्णित के रूप में phagocytosis परख के साथ आगे बढ़ना 1 के 600 2.5 10 x 7 1 मिलीलीटर प्रति कैंडिडा सफेद करने के लिए बराबर है।
      नोट: कैंडिडा-BFP की पीढ़ी संदर्भ 13 में वर्णित है।
  2. Zymosan और आईजीजी लिपटे मोतियों की तैयारी
    नोट: Zymosan है एक β-glucan युक्तफंगल कार्बोहाइड्रेट कण तैयारी है कि Saccharomyces cerevisiae से निकाली गई। Zymosan मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं में सूजन संकेतों पैदा करने के लिए जाना जाता है, और यह phagocytosis अध्ययनों से 13, 14, 15 में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है।
    1. संक्षेप में ट्यूब कि कण होते हैं भंवर, और एक राशि एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक प्रयोग के लिए पर्याप्त विभाज्य।
      नोट: आमतौर पर हम 01:10 अनुपात का उपयोग (एक सेल के लिए, 10 zymosan कणों या आईजीजी लिपटे मोतियों जोड़)।
    2. बर्फ के ठंडे पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और कम से 10,000 एक्स जी 1 मिनट के लिए centrifuging द्वारा कणों इकट्ठा।
    3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 1 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस में गोली resuspend।
    4. दोहराएँ कदम 2.2.2-2.2.3
      नोट: 2.2.5 कदम या उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब स्टोर करने के लिए आगे बढ़ें।
    5. आदेश में एक से बचने के लिए अल्ट्रासोनिक स्नान sonicator में 10 सेकंड के लिए विविक्त (120 वी, 50-60 kHz) Sonicateएनवाई कण एकत्रीकरण।

3. Phagocytosis

नोट: Phagocytosis एक जटिल प्रक्रिया है कि कण की सतह पर ligands के साथ PRRS की बातचीत के माध्यम से फ़ैगोसाइट की कोशिका की सतह पर कणों के बंधन के साथ शुरू होता है। बंधन actin के विधानसभा और संपर्क के स्थल पर इसकी जुड़े प्रोटीन, और एक phagocytic कप के गठन के बाद है। बाद में actin disassembly फेगोसोम पर होता है और कण की पूरी घिराव में यह परिणाम है। नीचे हम phagocytosis के विभिन्न चरणों का वर्णन है।

  1. बाध्यकारी परख
    नोट: इस प्रयोग का उद्देश्य phagocytosis की दिशा में पहला कदम है कि लक्ष्य कणों पर ligands और phagocytes पर रिसेप्टर्स के बीच बातचीत शामिल की निगरानी है।
    1. एक कक्ष स्लाइड में लगभग 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं बीज इतना है कि वे प्रयोग के समय में 60-70% मिला हुआ हैं। aLTERNatively, या गिलास नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें (24 या 12 अच्छी तरह प्रारूप में) कवर फिसल जाता है पर थाली कोशिकाओं। रात भर 37 5% सीओ 2 के साथ डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: कोशिकाओं hemocytometer या इसी तरह की तकनीक का उपयोग कर गिना जा सकता है।
    2. 10 डिग्री सेल्सियस पर चैम्बर स्लाइड (या प्लेट) 10 मिनट के लिए रखें।
    3. धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से एक विंदुक या खींचने की मशीन का उपयोग करने से मध्यम निकालें।
      चेतावनी: इस कदम के लिए एक संभाग coverglass प्रणाली के प्रत्येक अच्छी तरह छोटा है सावधानी के रूप में प्रदर्शन करना; यह एक पिपेट की नोक या एक Aspirator का एक मजबूत airflow के साथ कोशिकाओं उपद्रव करने के लिए आसान है।
    4. एक सेल संस्कृति के माध्यम से fluorescently लेबल विविक्त मिक्स (जैसा कि ऊपर वर्णित तैयार)। कोशिकाओं को fluorescently संयुग्मित-zymosan या लेटेक्स मोती खरगोश आईजीजी-FITC (सेल प्रति 10 कणों) (10 के एक MOI में) कैंडिडा -BFP जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए सभी कोशिकाओं को कवर कर रहे हैं अच्छी तरह से एक कक्ष के लिए 200 μl मीडिया के अंतिम मात्रा का प्रयोग करें।
    5. 277 पर चैम्बर स्लाइड नीचे स्पिन10 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए XG।
      नोट: यह centrifugation कदम particulates और कोशिकाओं के बीच संपर्क बढ़ाने में मदद करता है, और यह बाध्यकारी प्रक्रिया सिंक्रनाइज़ करता है।
    6. इसके तत्काल बाद 5 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर चैम्बर स्लाइड हस्तांतरण।
    7. इनक्यूबेटर से चैम्बर स्लाइड निकालें और मीडिया aspirate।
    8. धो कोशिकाओं ठंडा पीबीएस के साथ 3x।
      नोट: एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ अपार कणों की उपस्थिति की जांच और पीबीएस के साथ अधिक बार धोने यदि आवश्यक है। यह विश्लेषण के दौरान पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए अच्छी तरह से अपार कणों को दूर करने के लिए आवश्यक है।
    9. 500 μl 4% paraformaldehyde (पीएफए) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए incubating द्वारा पीबीएस में पतला जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें।
      सावधानी: इस चरण 4% पीएफए ​​के उपयोग जो अत्यधिक विषाक्त संक्षारक, और संभावित कैसरजन की आवश्यकता है। उचित सावधानी जब इस तरल पदार्थ का उपयोग किया जाना चाहिए। इसके अलावा, प्रकाश से नमूनों की रक्षा करना।
    10. 3.1.9 कदम दो बार दोहराएँ।
      नोट: इस चरण में, तुरंत पिछले पीबीएस हटाने के बाद प्रत्येक शीशी फिर से भरना।
    11. 10 मिनट के लिए पीबीएस में 50 मिमी एनएच 4 सीएल के 500 μl के साथ incubating द्वारा निर्धारण बंद करो।
    12. कदम 3.1.10 में वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    13. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 250 μl (पीबीएस में 0.1% सैपोनिन, 0.2% बीएसए) बाध्यकारी बफर जोड़कर कोशिकाओं permeabilize।
    14. fluorescently संयुग्मित phalloidin (: बाध्यकारी बफर में 500 1 पतला) जोड़कर दाग एफ actin। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं।
    15. कदम 3.1.10 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    16. एक confocal खुर्दबीन (63X उद्देश्य, और 402 एनएम और 488 एनएम लेजर) का उपयोग कर छवियों पर कब्जा है और ImageJ 16 का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण।
      नोट: एक सफल कण बाध्यकारी एक phagocytic घन की उपस्थिति की विशेषता हैसाइट पर पी जहां कण संपर्क phagocytic सेल (चित्रा 1)। कदम 3.2.5 देखें।
  2. Phagocytosis तेज परख
    नोट: इस प्रयोग confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) का उपयोग कर फ़ैगोसाइट द्वारा fluorescently लेबल विविक्त की पूरी internalization की निगरानी के लिए बनाया गया है।
    1. एक कक्ष स्लाइड में लगभग 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं बीज इतना है कि वे प्रयोग के समय में 60-70% मिला हुआ हैं। वैकल्पिक रूप से, या गिलास नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें (24 या 12 अच्छी तरह प्रारूप में) कवर फिसल जाता है पर थाली कोशिकाओं। रात भर 37 5% सीओ 2 के साथ डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: कोशिकाओं hemocytometer या इसी तरह की तकनीक का उपयोग कर गिना जा सकता है।
    2. 10 मिनट के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर चैम्बर स्लाइड (या प्लेट) रखें।
      नोट: ठंडा endocytosis के रूप में अच्छी तरह से अवांछित phagocytosis को ब्लॉक करने के लिए, और बाद में एक सिंक्रनाइज़ phagocytosis है क्रम में करने के लिए आवश्यक है।
    3. perf3.1.3 से 3.1.5 के लिए ORM कदम
    4. 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर चैम्बर स्लाइड स्थानांतरण, और अलग अलग समय बिंदुओं के लिए सेते हैं। 30, 60 और 90 मिनट के बाद संक्रमण के बाद कोशिकाओं को ठीक करें। निरीक्षण सी albicans 60 मिनट के बाद संक्रमण पर hyphae फार्म लेने, फ़ैगोसाइट 90 मिनट 8 के बाद कोशिका मृत्यु (pyroptosis) दिखाने के लिए शुरू करते हैं।
      नोट: यह एक सिफारिश है, और अनुकूलन सेल प्रकार और इस्तेमाल कण के आधार पर आवश्यक है।
    5. 3.1.7 से 3.1.15 के लिए चरणों का प्रदर्शन। ImageJ 16 का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण।
      नोट: एक सफल तेज एक भक्षककोशिकीय की कोशिका द्रव्य के अंदर एक कण का एक पूरा internalization की विशेषता है (चित्रा 2)। ऐसे phalloidin के रूप में कोशिका की सतह मार्कर के साथ फ़ैगोसाइट धुंधला कोशिकाओं के समोच्च चित्रित करने के लिए मदद करता है। यह भी तय करना है कि क्या कण कोशिका की सतह या compl के लिए बाध्य है क्रम में Z ढेर प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैetely भाँति।
  3. Phagocytosis की लाइव इमेजिंग
    नोट: इस प्रोटोकॉल में हम confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग fluorescently संयुग्मित zymosan का उपयोग कर phagocytosis के विभिन्न चरणों पर कब्जा करने का वर्णन है। हम वृक्ष के समान सेल लाइन DC2.4 कि स्थिरतापूर्वक व्यक्त mCherry टैग एफ actin 8, एक biosensor कि जीवित कोशिकाओं में filamentous actin के वितरण से पता चलता का उपयोग करें। चूंकि phagocytosis एक actin चालित प्रक्रिया है इस सेल में रहते इमेजिंग न केवल आंदोलन और एफ actin नेटवर्क की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन यह भी जीवित कोशिकाओं के भीतर अलग-अलग घटनाओं phagocytic (चित्रा 3, मूवी 1) कल्पना करने के लिए।
    1. एक एकाग्रता में एक कक्ष स्लाइड में लगभग 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं बीज इतना है कि वे प्रयोग के समय में 60-70% मिला हुआ हैं। रात भर 37 5% सीओ 2 के साथ डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं।
      नोट: कोशिकाओं hemocytometer या एक का उपयोग कर गिना जा सकता हैइसी तरह की तकनीक।
    2. 10 मिनट के लिए बर्फ पर चैम्बर स्लाइड रखें।
      नोट: ठंडा अवांछित तेज ब्लॉक करने के लिए, और एक सिंक्रनाइज़ phagocytosis है क्रम में करने के लिए आवश्यक है।
    3. 3.1.3 से 3.1.5 के लिए चरणों का प्रदर्शन
    4. 37 डिग्री सेल्सियस तक खुर्दबीन मंच पूर्व गर्म और 5% सीओ 2 के साथ चैम्बर संतुलित करना। इमेजिंग शुरू करने से पहले स्थिर करने के लिए तापमान और सीओ 2 के लिए 30-45 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: सीओ 2 और तापमान के स्तर phagocytosis के लिए महत्वपूर्ण हैं के बाद से, यह पर्यावरण कक्ष संतुलित करने के लिए प्रयोग करने से पहले माइक्रोस्कोप हीटर चालू करने के लिए महत्वपूर्ण है।
    5. चैम्बर माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर बाड़े 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 equilibrated में कोशिकाओं से युक्त स्लाइड रखें।
    6. लाइव इमेजिंग 17, 18 को पूरा करें।
      नोट: लेजर पावर (लाभ, पिनहोल, आदि) के लिए सेटिंग्स वीं के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैंई माइक्रोस्कोप और फ्लोरोसेंट जांच इस्तेमाल किया। इसलिए, हम अपनी लाइव इमेजिंग 17,18 के लिए इष्टतम स्थिति के लिए माइक्रोस्कोप के मैनुअल परामर्श सलाह देते हैं।
      1. लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (और संबंधित सॉफ्टवेयर) रहते इमेजिंग के लिए प्रयोग करें। 1-1.1 हवादार इकाइयों के एक पिनहोल साथ 63X 1.4NA तेल उद्देश्य का प्रयोग करें।
      2. इमेजिंग शुरू करने के लिए, चैम्बर स्लाइड पर एक प्रतिनिधि क्षेत्र को खोजने के उज्ज्वल क्षेत्र इस्तेमाल किया। इसके बाद, सॉफ्टवेयर पर स्थिति विकल्प पर क्लिक करके क्षेत्र का चयन करें। GFP 1 ट्रैक में 582 एनएम पर एक बीम फाड़नेवाला के साथ 488 एनएम लेजर के लिए फिल्टर सेट का इस्तेमाल किया, 488 और 582 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य पता लगाने के लिए पता लगाने के लिए।
      3. ट्रैक 2 में एक फिल्टर mCherry (आरएफपी) के लिए इष्टतम सेट 578 एनएम पर एक बीम फाड़नेवाला का उपयोग कर और 578 और 600 एनएम के बीच तरंग दैर्ध्य का पता लगाने का चयन करें। 488 एनएम और 50% लेजर शक्ति और 600-700 की बढ़त के उत्पादन के साथ 578 एनएम लेज़रों का प्रयोग करें। 90 मिनट की कुल के लिए छवियों हर 30 सेकंड प्राप्त करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

माइक्रोस्कोप आधारित phagocytosis के विभिन्न चरणों की निगरानी के लिए विधि प्रस्तुत किया है। DC2.4 कोशिकाओं द्वारा विभिन्न फ्लोरोसेंट विविक्त के phagocytosis के दौरान अलग-अलग घटनाओं में दिखाए जाते हैं। तकनीक यहाँ वर्णित उपयोग करना, हम phagocytosis के प्रारंभिक दौर में sphingolipids की भूमिका की जांच की। इस प्रयोजन के लिए DC2.4 वृक्ष के समान कोशिकाओं Sptlc2, एंजाइम है कि sphingolipid biosynthetic मार्ग में पहली और दर सीमित कदम उत्प्रेरित में आनुवंशिक रूप से कमी, इस्तेमाल किया गया। जंगली प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में, Sptlc2 के रूप में - / - DC2.4 कोशिकाओं को काफी Ceramide, sphingomyelin और glucosylceramide 8 सहित sphingolipids के स्तर को कम कर दिया है। Sptlc2 - / - DC2.4 कोशिकाओं, साथ ही सी सफेद, zymosan और आईजीजी लेटेक्स मोती 8 के तेज में बंधन में खराब कर रहे हैं। चित्रा 1 में, DC2.4 कोशिकाओं में बंधन के fluorescently संयुग्मित-zymosan कणों दिखाया गया है (देखें section जानकारी के लिए 3.1)। Sptlc2 - / - DC2.4 कोशिकाओं नियंत्रण DC2.4 कोशिकाओं (चित्रा 1 ए पी = 0.0008) की तुलना में zymosan के बंधन में काफी कम देखी गई। / - - सेल प्रति बाध्य zymosan कणों की संख्या Sptlc2 लिए की तुलना में नियंत्रण कक्षों के लिए काफी अधिक था DC2.4 कोशिकाओं (पी <0.0001, चित्रा 1 सी)। / - - DC2.4 कोशिकाओं सी सफेद phagocytose करने के लिए हम अगले Sptlc2 की क्षमता की जांच की। Sptlc2 - / - DC2.4 कोशिकाओं सी albicans के काफी कम phagocytosis (पी <0.0005) के रूप में नियंत्रण कोशिकाओं (चित्रा 2A, 2 बी) की तुलना में पता चला है। जैसी कि उम्मीद थी, Sptlc2 की कमी कोशिकाओं (पी <0.05, चित्रा 1 सी) गैर phagocytic कोशिकाओं की काफी अधिक संख्या में पता चला है और सेल प्रति सी सफेद (चित्रा 1 सी, डी) की संख्या में कमी आई है। इन परिणामों के टी के रूप में, बंधन में एक अक्षुण्ण sphingolipid biosynthetic मार्ग की भूमिका को रेखांकित के रूप में अच्छी तरह सेवह विविक्त की तेज। चित्रा 3 समय चूक छवियों phagocytosis के प्रारंभिक दौर (विस्तृत प्रक्रिया के लिए धारा 3.3 देखें) का प्रदर्शन चलता। फिल्म 1 DC2.4 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त एफ actin, एक biosensor कि कोशिकाओं (अधिक जानकारी के लिए धारा 3.1 देखें) जीने में filamentous actin के वितरण का पता चलता है की लाइव इमेजिंग से पता चलता है।

आकृति 1
चित्रा 1: DC2.4 कोशिकाओं में zymosan की परख बंधन। (ए) नियंत्रण और Sptlc2 - / - DC2.4 कोशिकाओं fluorescently संयुग्मित zymosan साथ विविक्त confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की बाइंडिंग की उनकी क्षमता incubated रहे थे, और। तीर बाध्यकारी साइटों का संकेत मिलता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (बी, सी) बाध्य zymosan कणों (बी) और zymosan कणों की संख्या की संख्या की मात्रा प्रति ग बाध्यपक्ष (सी) में दिखाया गया है। बाध्य कणों की मात्रा निर्धारित और नियंत्रित करने के लिए के रूप में प्रतिशत के सापेक्ष प्रस्तुत किए गए। सभी रेखांकन प्रदर्शन तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी, और कम से कम 200 कोशिकाओं एक प्रयोग के लिए गिना रहे थे। Unpaired टी परीक्षण मनाया मतभेद के महत्व का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ** पी <0.001। स्केल बार = 100 माइक्रोन। Tafesse एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण। 2015 8। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सी के phagocytosis। DC2.4 कोशिकाओं में सफेद। (ए) प्रकोष्ठों 3.2 चरण में वर्णित के रूप में सी andida -BFP से संक्रमित थे। 90 मिनट के बाद संक्रमण में, कोशिकाओं तय की और fluorescently संयुग्मित phalloid के साथ दाग थेमें और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged। (बी - डी) भाँति कैंडिडा -BFP, गैर phagocytic कोशिकाओं की संख्या, और सेल प्रति कैंडिडा -BFP की संख्या की मात्रा दिखाया गया है। सभी रेखांकन प्रदर्शन तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एसडी, और कम से कम 200 कोशिकाओं एक प्रयोग के लिए गिना रहे थे। Unpaired टी परीक्षण मनाया मतभेद के महत्व का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ** पी <0.001। स्केल बार = 100 माइक्रोन। Tafesse एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण। 2015 8। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सी albicans के समय चूक इमेजिंग phagocytosis के प्रारंभिक दौर कल्पना करने के लिए तेज। जंगली प्रकार DC2.4 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त एफ actin -mCherry (एफ actin) कैंडिडा -BFP साथ incubated रहे थे (लाल रंग में दिखाया गया है) और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged। 30 सेकंड के अंतराल पर कब्जा कर लिया छवियों दिखाए जाते हैं। तारों के phagocytosis दौरान actin remodeling के विभिन्न चरणों को दिखाते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। Tafesse एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण। 2015 8। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
फिल्म 1: लाइव इमेजिंग। जंगली प्रकार DC2.4 स्थिरतापूर्वक व्यक्त एफ actin-mCherry (हरे रंग में दिखाया गया है) कोशिकाओं कैंडिडा -BFP (लाल रंग में दिखाया गया है) से संक्रमित थे। लाइव इमेजिंग 3.3 कदम के रूप में वर्णित confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। Tafesse एट अल से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण। 2015 8।एस / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें। (डाउनलोड करने के लिए राइट क्लिक करें।)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ऐसे मैक्रोफेज और वृक्ष के समान कोशिकाओं, के रूप में पेशेवर फ़ैगोसाइट, अपनी चपेट में ले और रोगजनकों पर हमला इसलिए phagocytosis मेजबान रक्षा प्रणाली का एक महत्वपूर्ण घटक है, जिससे समाप्त। इस प्रक्रिया के दौरान फ़ैगोसाइट उनकी कोशिका की सतह 8, 19, 20 में व्यापक झिल्ली पुनर्गठन और cytoskeleton पुनर्व्यवस्था से गुजरना। बेहतर इस गतिशील प्रक्रिया को समझने के लिए, phagocytosis के विभिन्न चरणों के दृश्य के लिए आवश्यक है। यहाँ हम एक माइक्रोस्कोप आधारित पद्धति है कि phagocytosis के विभिन्न चरणों की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया था का वर्णन किया।

लाइव इमेजिंग तकनीक का मुख्य महत्व यह है कि यह उल्लेखनीय क्षमता प्रदान करता है आण्विक स्तर पर मेजबान रोगज़नक़ इंटरफेस की निगरानी है। सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण का महत्वपूर्ण कदम के दृश्य की अनुमति करके, लाइव इमेजिंग प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मौलिक स्वभाव में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता हैरोगजनकों 8, 10, 21, 22 के खिलाफ। Phagocytosis के अलावा, यहाँ वर्णित तकनीक macropinocytosis 10 सहित रिसेप्टर की मध्यस्थता endocytosis के अन्य प्रकार, अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। लाइव इमेजिंग में भी इस तरह माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग और साल्मोनेला टाइफी के रूप में intracellular बैक्टीरिया, साथ ही लीशमैनिया और Toxoplasma gondii सहित परजीवी के मेजबान रोगज़नक़ संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण है 22, 23।

ऐसे परंपरागत जैव रासायनिक दृष्टिकोण के रूप में अन्य तकनीकों पर रहते सेल इमेजिंग के कई फायदे हैं। लाइव सेल इमेजिंग हमें सेलुलर प्रक्रियाओं 8 के स्थानिक और लौकिक गतिशीलता की निगरानी करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, लाइव इमेजिंग हमें सूचित हासिल करने के लिए अनुमति देता हैएक एकल कोशिका संकल्प 21 में समझना। Phagocytosis एक गतिशील प्रक्रिया है कि सेलुलर कुछ ही मिनट 10 के एक मामले में रिसेप्टर्स, actin और झिल्ली लिपिड remodeling के क्लस्टरिंग शामिल है। लाइव इमेजिंग एक समय संवेदनशील तरीके, जो अन्यथा पूरा करने के लिए मुश्किल है में इस तरह की जानकारी पर कब्जा करने के लिए सक्षम बनाता है।

इस तकनीक का एक प्रमुख सीमा है कि यह प्रयोगात्मक शर्तों और माइक्रोस्कोप setups के सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है। वहाँ कई महत्वपूर्ण सफलतापूर्वक छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं। फ्लोरोसेंट प्रोटीन (या biosensor) (जैसे एफ actin के रूप में) फ़ैगोसाइट के साथ ही कण लेबल करने के लिए इस्तेमाल डाई की प्रकृति की कल्पना करने के लिए उपयोग के गुणों इमेजिंग के महत्वपूर्ण पहलू हैं। लाइव इमेजिंग के लिए, समान रूप से महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोप की स्थापना के पर्यावरण कक्ष का संतुलन है। साधन पर निर्भर करता है, संतुलन कई घंटे 15 मिनट से ले जा सकते हैं। since सीओ 2 की आपूर्ति संस्कृति मीडिया के भीतर एक उचित पीएच को संरक्षित करने का इरादा है, यह काफी क्रम प्रयोग की स्थापना करने से पहले अनुमति देने के लिए आवश्यक है। मामलों में जब सीओ 2 की आपूर्ति अपर्याप्त और / या असमान है, zwitterionic कार्बनिक रसायन बफरिंग एजेंट जैसे HEPES विकास मीडिया के लिए पूरक हो सकता है। फ्लोरोसेंट particulates और जीवित कोशिकाओं के लंबी अवधि के जोखिम confocal लेज़रों phototoxicity और विरंजन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। लेजर शक्ति (कम जोखिम समय बेहतर) अनुकूलन और सुनिश्चित करें कि दरवाज़े की छवि अधिग्रहण के बीच में बंद हो जाती हैं इन समस्याओं को कम कर सकते हैं बना रही है। कुल मिलाकर, तकनीक यहाँ वर्णित phagocytosis दौरान रोगज़नक़ों और फ़ैगोसाइट के बीच गतिशील संबंध के अध्ययन के लिए आदर्श होते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

हम इमेजिंग के लिए एमआईटी के व्हाइटहेड संस्थान में वेंडी सामन और उबकना सुविधा के निकी वाटसन धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-Mercaptoethanol AppliChem A1108
Bovine serum albumin (BSA) Cell Signaling Technology  9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) ThermoFisher D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ThermoFisher BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) Gibco 11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) Corning cellgro 21-031-CV
Fetal Bovine serum Sigma Aldrich 12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads Cayman 500290
L-Glutamine 200 mM (100x) ThermoFisher 25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) Affymetrix 19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) ThermoFisher 15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488 ThermoFisher A12379
RAW 264.7 cells ATCC TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Gibco 61870
Saponin Sigma Aldrich S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) Corning cellgro MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) ThermoFisher 25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution ThermoFisher  85114
Zymosan-Alexa Fluor 594 ThermoFisher Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) ThermoFisher 155361
Glasstic slide 10 with grids Hycor 87144

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
  3. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  4. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
  5. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
  6. Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
  7. Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
  8. Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
  9. Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
  10. Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis. BBA. 1851, 805-823 (2015).
  11. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
  12. Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
  13. Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
  14. Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
  15. Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
  17. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
  18. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  19. Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
  20. Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
  21. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
  22. Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
  23. John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).

Tags

सूक्ष्म जीव विज्ञान अंक 120 phagocytosis लिपिड माइक्रोस्कोपी phagocytic कप actin remodeling zymosan लाइव इमेजिंग,
Phagocytosis के प्रारंभिक दौर Visualizing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rashidfarrokhi, A., Richina, V.,… More

Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. J. Vis. Exp. (120), e54646, doi:10.3791/54646 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter