Abstract
Der Säugetierkörper ist mit verschiedenen Schichten von Mechanismen ausgestattet, die sich von Erreger Invasionen zu verteidigen helfen. Professionelle Phagozyten des Immunsystems - wie Neutrophile, dendritische Zellen und Makrophagen - behalten die angeborene Fähigkeit , solche eindringende Krankheitserreger durch Phagozytose 1 zu erkennen und zu löschen. Phagozytose beinhaltet choreografierter Ereignisse von Membran Reorganisation und Aktin - Umbildung an der Zelloberfläche 2, 3. Phagozyten erfolgreich internalisieren und fremde Moleküle nur auszurotten, wenn alle Stufen der Phagozytose erfüllt sind. Diese Schritte umfassen die Erkennung und Bindung des Erregers durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) an der Zelloberfläche aufhalten, die Bildung von phagozytischen cup durch Actin angereicherte membranöse Vorsprünge (Pseudopodien) das teilchenförmige zu umgeben, und Spaltung der phagosome durch Phagolysosom Reifung dass Ergebnisse in derTöten des Erregers 3, 4.
Bildgebung und Quantifizierung der verschiedenen Stadien der Phagozytose ist maßgeblich für die molekularen Mechanismen dieser zellulären Prozess Aufklären. Die vorliegende Manuskript berichtet Methoden, um die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu studieren. Wir beschreiben ein Mikroskop-basierten Ansatz zu visualisieren und die Bindung, phagozytische Tasse Bildung quantifizieren und die Internalisierung von partikulären von Phagozyten. Wie Phagozytose auftritt , wenn angeborenen Rezeptoren auf phagozytischen Zellen Liganden auf einem Zielpartikel auftreten größer als 0,5 um ist , die Assays wir die Verwendung von pathogenen Pilzen Candida albicans und andere Teilchen , wie beispielsweise Zymosan und IgG beschichteten Kügelchen umfassen hier präsentieren.
Introduction
Trotz der kontinuierlichen Exposition gegenüber Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze, ist unser Körper gut mit Immun-Mechanismus ausgestattet, der Schutz gegen eine Infektion bieten. Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger und stützt sich hauptsächlich auf Phagozyten, die erkennen und ausländische Ziele verinnerlichen.
Phagozytose ist ein evolutionär konserviert zellulären Prozess, der die Phagozytose von unerwünschten Partikeln größer als 0,5 & mgr; m umfasst. Phagozytische Zellen exprimieren eine Vielzahl von Immunrezeptoren auf der Zelloberfläche (auch als pattern recognition receptors, PRR bekannt) , die es ihnen ermöglichen , 3 pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , die auf Krankheitserreger vor engulfment zu erkennen. Pathogen-Bindung wird durch Rezeptor clustering an der Zelloberfläche folgt und löst die Bildung einer phagozytischen Tasse. Dies führt zu einer Membran Remodeling Aktin-angetrieben, ragt runddas Ziel ist , umhüllen sie schließlich und Abklemmen eines diskreten phagosomalen Vakuole 2, 5 zu bilden. Die phagosome reift dann und säuert durch anschließende Fusion mit späten Endosomen und Lysosomen , die Phagolysosom 6 bildet.
Obwohl die Phagozytose als rezeptorvermittelte und Aktin-driven Ereignis beschrieben wird, stützt sich dieses Verfahren auch auf räumlich-zeitlichen Modifikation von Lipiden, die die Plasmamembran, wie Phosphoinositiden (PIs) und Sphingolipide 7, 8 zusammenzusetzen . Während Aktin - Polymerisation durch eine lokale Ansammlung von Phosphoinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) an der Basis des phagozytischen cup diktiert wird, hängt Aktin Depolymerisation auf der Umwandlung von (PI (4,5) P 2 bis Phosphoinosit-3,4,5-bisphosphat (PI (3,4,5) P 3) 3, 9. Beide Änderungensind wichtig , da Ersteres führt zu einer erfolgreichen Verlängerung der Pseudopodien um das Ziel und die letztere ermöglicht 10 von Teilchen in das Cytosol der Phagozyten sinkt.
Die Zellen, die die Fähigkeit zu phagozytieren haben , sind entweder professionelle Phagozyten, wie Makrophagen / Monozyten, Granulozyten / Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) oder nicht - professionellen Phagozyten, wie Fibroblasten und Epithelzellen 11. Die Phagozytose von allen Phagozyten ausgeführt spielt eine zentrale Rolle bei der Gewebe Wartung und Umbau, während der Phagozytose von professionellen Phagozyten durchgeführt, um die Koordination der angeborenen und adaptiven Immunantwort gegen Krankheitserreger verantwortlich ist. Professionelle Phagozyten nicht nur überfluten und den Erreger zu töten, sondern auch Antigene zu den lymphatischen Zellen des adaptiven Immunsystems. Dies trägt zur Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und den Eingriff von lymphoiden Zellen, daher führt zudie erfolgreiche Blockade der Infektion 12.
Herkömmliche biochemische Techniken haben dazu beigetragen, Wissen zu gewinnen über die molekularen Mechanismen der verschiedenen zellulären Prozessen während der Phagozytose, wie post-translationale Modifikationen und verschiedene hochaffinen Assoziation zwischen Proteinen. mit den üblichen biochemischen Methoden ist es jedoch schwierig, Informationen über die räumlichen und zeitlichen Dynamik der phagozytischen Ereignisse zu erhalten. Live-Cell-Imaging ermöglicht uns nicht nur zelluläre Ereignisse in einer Zeit, sensible Art und Weise zu überwachen, sondern auch ermöglicht es uns, Informationen auf Einzelzellebene zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die verschiedenen Stadien der Phagozytose zu untersuchen, sowie den gesamten Prozess zu analysieren raumzeitlich konfokalen Mikroskopie.
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Protocol
1. Herstellung von DC2.4 und RAW 264.7-Zelllinien
HINWEIS: Die Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 und die dendritische Zelllinie DC2.4 sind sowohl murinen Ursprungs, und die folgenden Bedingungen wurden verwendet, um die Zellen zu wachsen.
- Wachsen RAW 264.7 - Zellen in DMEM (Dulbeccos Minimal Eagle-Medium) , ergänzt mit 10% inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
- Wachsen DC2.4 Zellen unter ähnlichen Bedingungen mit der RAW 264.7-Zellen, mit der Ausnahme Gebrauch RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medium, das mit L-Glutamin anstelle von DMEM.
2. Herstellung von Fluorescent Konjugierte Partikel: C. albicans, Zymosan, IgG-beschichtete Beads
- Wachsende Candida albicans
- Impfen SC5314 C. albicans Stamm aus einem gefrorenen Glycerolstammlösung in 25 ml YPD mit Uri ergänzt (2% Bacto-Pepton, 1%Hefeextrakt, 2% Glucose und 80 ug / ml Uridin) über Nacht bei 30 ° C.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Candida - Kultur wachsen mehr als einer OD 600 von 12. - Nehmen Sie 1 ml der C. albicans und Spin es bei 2.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur nach unten.
- Aspirieren den Überstand und resuspendiere das Pellet mit 1 ml PBS.
- Sammle das Pellet durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
- Wiederholen Sie Schritt 2.1.4.
- Berechne die Multiplizität der Infektion (MOI) von C. albicans in Bezug auf die Anzahl von Phagozyten und fahren mit der Phagocytose - Assay , wie in Kapitel 3 beschrieben eine OD 600 von 1 bis 2,5 x 10 7 Candida albicans pro 1 ml entspricht.
HINWEIS: Die Erzeugung von Candida-BFP in Bezug 13 beschrieben.
- Impfen SC5314 C. albicans Stamm aus einem gefrorenen Glycerolstammlösung in 25 ml YPD mit Uri ergänzt (2% Bacto-Pepton, 1%Hefeextrakt, 2% Glucose und 80 ug / ml Uridin) über Nacht bei 30 ° C.
- Herstellung von Zymosan und IgG beschichteten Beads
HINWEIS: Zymosan ist ein β-Glucan enthaltendePilz-Kohlenhydrat - Partikelpräparat , das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet. Zymosan ist bekannt Entzündungssignale in Makrophagen und dendritischen Zellen hervorzurufen, und es wurde 13 extensiv in Phagozytose Studien verwendet wurden, 14, 15.- Kurz das Rohr Wirbel, der die Partikel enthält, und eine Menge für ein Experiment in ein 1,5-ml-Röhrchen ausreichend aliquotieren.
HINWEIS: In der Regel verwenden wir im Verhältnis 1:10 (für eine Zelle, mit 10 zymosan Partikel oder IgG-beschichtete Beads). - 1 ml eiskaltem PBS, und sammelt die Partikel durch bei 10.000 x g für 1 min zentrifugiert.
- Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml eiskaltem PBS.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.3
HINWEIS: Gehen Sie 2.2.5 zu Schritt oder lagern Sie das Röhrchen bei 4 ° C bis zur Verwendung. - Beschallen die Partikel für 10 Sekunden in Ultraschall-Ultraschallbad (120 V, 50-60 kHz), um eine zu vermeidenny Partikelaggregation.
- Kurz das Rohr Wirbel, der die Partikel enthält, und eine Menge für ein Experiment in ein 1,5-ml-Röhrchen ausreichend aliquotieren.
3. Phagozytose
HINWEIS: Die Phagozytose ist ein komplexer Prozess, der mit der Bindung der Partikel auf der Zelloberfläche der Phagozyten durch Wechselwirkung von PRRs mit Liganden auf der Oberfläche des Partikels beginnt. Bindung wird durch die Montage von Aktin und seine zugehörigen Proteine an der Stelle des Kontakts und die Bildung eines phagozytischen cup gefolgt. Die anschließende Aktin Demontage erfolgt auf phagosome und führt zur vollständigen engulfment des partikulären. Im Folgenden die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu beschreiben.
- Bindungsassay
HINWEIS: Der Zweck dieses Experiments ist es, die erste Stufe der Phagozytose zu überwachen, die die Wechselwirkung zwischen den Liganden auf den Zielpartikeln und den Rezeptoren auf den Phagozyten beinhaltet.- Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alterntiv, Platten Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden. - Legen Sie die Kammer Schieber (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min.
- Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Well einer Pipette oder Absauger verwenden.
ACHTUNG: Führen Sie diesen Schritt sorgfältig wie jede Vertiefung von einem Kammerschalennautilus Abdeckglas System ist klein; es ist leicht, Zellen mit der Spitze einer Pipette oder einer starken Luftstrom von einem Absauggerät zu stören. - Mischen Sie die fluoreszenzmarkierte Partikel mit einem Zellkulturmedium (hergestellt wie oben beschrieben). Hinzufügen Candida -BFP (bei einer MOI von 10), fluoreszenz konjugiert-Zymosan oder Latexkügelchen-Kaninchen - IgG-FITC (10 Partikel pro Zelle) auf die Zellen. Verwenden, um ein Endvolumen von 200 & mgr; l Medium für eine Kammer auch alle Zellen, um sicherzustellen, abgedeckt sind.
- Spin down die Kammer Schieber bei 277xg für 3 min bei 10 ° C.
Hinweis: dieser Zentrifugationsschritt hilft, den Kontakt zwischen den Teilchen und den Zellen zu erhöhen, und es synchronisiert den Bindevorgang. - Sofort übertragen die Kammer Folie zu einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 5 min.
- Entfernen Sie die Kammer Schlitten aus dem Inkubator und die Medien ansaugen.
- Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS 3x.
HINWEIS: Überprüfen Sie das Vorhandensein von nicht gebundenen Partikel mit einem Lichtmikroskop und mehrmals mit PBS waschen, wenn nötig. Es ist wesentlich, ungebundene Partikel aus dem Bohrloch zu entfernen, Hintergrundrauschen während der Analyse zu minimieren. - Fix-Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS verdünnt, für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
VORSICHT: Dieser Schritt erfordert die Verwendung von 4% PFA, die hoch toxisch, korrosiv ist und potentiell karzinogen. Die richtige Vorsicht ist geboten, wenn diese Flüssigkeit verwendet wird. Außerdem schützen Proben aus Licht. - Zweimal wiederholen 3.1.9 Schritt.
HINWEIS: Bei diesem Schritt füllen jedes Fläschchen unmittelbar nach dem vorherigen PBS zu entfernen. - Stoppen Sie die Fixierung von 10 min mit 500 & mgr; l von 50 mM NH 4 Cl in PBS inkubiert.
- Wasche die Zellen zweimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben.
- Permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 250 & mgr; l Bindungspuffer (0,1% Saponin, 0,2% BSA in PBS) für 30 min bei Raumtemperatur.
- Stain F-Aktin durch fluoreszenz konjugiertes Phalloidin Zugabe von (1: 500 verdünnt in Bindungspuffer). Inkubiere Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Wasche die Zellen dreimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben.
- Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop (63X Ziel, und 402 nm und 488 nm Laser) unter Verwendung von und zu analysieren , Bilder mit ImageJ 16.
HINWEIS: Eine erfolgreiche Partikelbindung durch das Vorhandensein einer Phagozyten cu gekennzeichnet istp an der Stelle , wo das partikuläre Kontakt die phagozytische Zelle (Abbildung 1). Siehe Schritt 3.2.5.
- Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alterntiv, Platten Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
- Phagozytose Uptake Assay
Hinweis: Dieses Experiment wurde entwickelt , die vollständige Internalisierung von fluoreszent markierten Partikel durch Phagozyten Mikroskopie mittels konfokaler zu überwachen (Abbildung 2).- Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alternativ Platte Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden. - Halten Sie die Kammer gleitet (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min.
HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um Endozytose sowie unerwünschte Phagozytose zu blockieren, und anschließend einen synchronisierten Phagozytose haben. - PerfORM Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5
- Übertragen , um die Kammer auf einen Objektträger 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2, und inkubiere für verschiedene Zeitpunkte. Fix-Zellen nach 30, 60 und 90 Minuten nach der Infektion. Beobachten Sie C. albicans beginnen Hyphen bei 60 min nach der Infektion zu bilden; Phagozyten beginnen nach 90 min 8 Zelltod (pyroptosis) zu zeigen.
ANMERKUNG: Dies ist eine Empfehlung und Optimierung ist wesentlich abhängig von dem Zelltyp und dem partikulären verwendet. - Führen Sie die Schritte von 3.1.7 bis 3.1.15. Analysieren von Bildern mit ImageJ 16.
HINWEIS: eine erfolgreiche Aufnahme durch eine vollständige Internalisierung eines partikulären innerhalb des Zytoplasmas einer Phagozyten (Abbildung 2) gekennzeichnet ist. Die Färbung der Phagozyten mit Zelloberflächenmarker wie phalloidin hilft, die Form von Zellen zu beschreiben. Es ist auch wichtig, z-Stacks, um zu bestimmen, ob die teilchenförmige ist gebunden an der Zelloberfläche oder kompl auszuführenetely verinnerlicht.
- Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alternativ Platte Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
- Live - Imaging von Phagozytose
HINWEIS: In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Konfokalmikroskopie die verschiedenen Stadien der Phagozytose mittels fluoreszenz konjugiert Zymosan zu erfassen. Wir verwenden die dendritischen Zelllinie DC2.4 , die stabil exprimiert mCherry-markierten F-Actin - 8, einen Biosensor, der die Verteilung von fadenförmigen Aktin in lebenden Zellen zeigt. Da Phagozytose ein Aktin-gesteuerter Prozess ist ermöglicht die Live - Bildgebung in dieser Zelle nicht nur uns , die Bewegung und Dynamik von F-Actin - Netzwerk zu erfassen, sondern auch die verschiedenen phagozytischen Ereignisse innerhalb der lebenden Zellen (Abbildung 3, Film 1) zu visualisieren.- Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer Schieber in einer Konzentration , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
HINWEIS: Die Zellen können mit Hämozytometer oder ein gezählt werdenähnliche Technik. - Halten Sie die Kammer gleitet auf Eis für 10 min.
HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um unerwünschte Aufnahme zu blockieren, und ein synchronisiertes Phagozytose haben. - Führen Sie die Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5
- Pre-warm das Mikroskoptisch bis 37 ° C und die Kammer mit 5% CO 2 ins Gleichgewicht. Warten 30-45 min für die Temperatur und das CO 2 zu stabilisieren , bevor die Abbildungs beginnen.
Hinweis: Da der CO 2 und Temperaturniveaus für die Phagozytose kritisch sind, ist es wichtig , auf dem Mikroskop Erhitzer dem Experiment vor , um den Umgebungsraum äquilibrieren. - Legen Sie die Kammer schieben Sie die Zellen im Mikroskop - Inkubator - Gehäuse ins Gleichgewicht gebracht bei 37 ° C und 5% CO 2 enthält.
- Führen Sie die Live - Darstellung 17, 18.
HINWEIS: Die Einstellungen für die Laserleistung (Verstärkung, pinhole, etc.) kann in Abhängigkeit von der Art der th variierene Mikroskop und Fluoreszenzsonde verwendet. Daher empfehlen wir die Beratung in der Bedienungsanleitung des Mikroskops für eine optimale Voraussetzung für Ihre Live - Bildgebung 17,18.- Verwenden der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (und die dazugehörige Software) für die Live-Darstellung. Verwenden Sie 63X 1.4NA Öl-Objektiv mit einer Loch von 1-1,1 Airy-Einheiten.
- Um die Bildgebung zu starten, verwendet, um das Hellfeld einen repräsentativen Bereich auf der Kammer Folie zu finden. Als nächstes wählen Sie das Feld, indem Sie auf die Software, um die Option für die Position klicken. Zum Nachweis von GFP in Spur 1 der Filtersatz bei 582 nm für 488-nm-Laser mit einem Strahlteiler verwendet, zu erfassen, Wellenlängen zwischen 488 und 582 nm.
- In Track 2 wählen einen Filter optimal für mCherry (RFP) einen Strahlteiler bei 578 nm und Wellenlängen zwischen 578 und 600 nm zu erkennen. Verwenden 488 nm und 578 nm-Laser mit 50% Laserleistung und einem Verstärkungsleistung von 600-700. Erhalten Sie Bilder alle 30 Sekunden für insgesamt 90 min.
- Samen etwa 5 x 10 4 Zellen in einer Kammer Schieber in einer Konzentration , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
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Representative Results
Mikroskopbasierten Verfahren die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu überwachen dargestellt. Die verschiedenen Veranstaltungen während der Phagozytose von verschiedenen fluoreszierenden Partikeln durch DC2.4 Zellen gezeigt. Unter Verwendung der Techniken, die hier beschrieben ist, untersuchten wir die Rolle von Sphingolipiden in den frühen Stadien der Phagozytose. Hierzu DC2.4 dendritischen Zellen genetisch defizient in Sptlc2, das Enzym, das den ersten und geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in dem Sphingolipid Biosynthesewegs katalysiert, verwendet wurden. Im Vergleich zu Wildtypzellen, Sptlc2 - / - DC2.4 Zellen haben 8 Niveau von Sphingolipiden einschließlich Ceramid, Sphingomyelin und glucosylceramide deutlich reduziert. Sptlc2 - / - DC2.4 Zellen defekt sind in Bindung sowie bei der Aufnahme von C. albicans, Zymosan und Latexkügelchen IgG 8. In Abbildung 1 ist die Bindung von fluoreszenz konjugiert-Zymosan - Partikel in DC2.4 Zellen gezeigt (siehe Section 3.1 für Details). Sptlc2 - / - DC2.4 Zellen zeigten signifikant weniger Bindung von Zymosan als die Kontroll DC2.4 Zellen (p = 0,0008; 1A). Die Anzahl der Zymosan - Partikel pro Zelle gebunden war signifikant höher für die Kontrollzellen als für Sptlc2 - / - DC2.4 Zellen (p <0,0001; 1C). Wir untersuchten als nächstes die Fähigkeit von Sptlc2 - / - DC2.4 Zellen C. albicans zu phagozytieren. Sptlc2 - / - DC2.4 Zellen zeigten signifikant weniger Phagozytose von C. albicans (p <0,0005) im Vergleich zu den Kontrollzellen (2A, 2B). Wie erwartet, zeigte Sptlc2-defizienten Zellen signifikant höhere Anzahl von nicht-phagozytische Zellen (p <0,05; 1C) und verringerte Anzahl von C. albicans pro Zelle (1C, D). Diese Ergebnisse unterstreichen die Rolle eines intakten Sphingolipid Biosyntheseweg in Bindung sowie in ter die Aufnahme von Partikeln. Abbildung 3 zeigt die Zeitrafferbilder mit den frühen Phasen der Phagozytose (siehe Abschnitt 3.3 für detaillierte Verfahren) zu demonstrieren. Film 1 zeigt die Live - Bildgebung von DC2.4 Zellen , die stabil F-Actin exprimieren, einen Biosensor, der die Verteilung von fadenförmigen Aktin in lebenden Zellen zeigt (siehe Abschnitt 3.1 für weitere Details).
Abbildung 1: Bindungsassay von Zymosan in DC2.4 Zellen. (A) Steuer- und Sptlc2 - / - DC2.4 Zellen wurden mit fluoreszenz konjugierten Zymosan inkubiert und deren Fähigkeit zur Bindung des durch konfokale Mikroskopie untersucht Partikel. Die Pfeile zeigen die Websites der Bindung. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (B, C) Quantifizierung der Zahl der gebundenen Zymosan - Partikel (B) und der Anzahl der Partikel pro Zymosan c gebundenenell (C) gezeigt. Gebundene Teilchen wurden quantifiziert und als Prozentsatz relativ zur Kontrolle dargestellt. Alle Diagramme zeigen SD von drei unabhängigen Experimenten, und mindestens 200 Zellen wurden für jedes Experiment gezählt. Ungepaarten t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz der beobachteten Unterschiede zu analysieren. ** P <0,001. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Tafesse et al. 2015 8. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Phagozytose von C. albicans in DC2.4 Zellen. (A) Die Zellen wurden mit C andida -BFP infiziert , wie in Schritt 3.2 beschrieben. Bei 90 min nach der Infektion wurden die Zellen fixiert und gefärbt mit fluoreszenz konjugierten phalloidin und konfokale Mikroskopie abgebildete verwenden. (B - D) Quantifizierung der Anzahl von internalisierten Candida -BFP, nicht-phagozytische Zellen, und die Anzahl der Candida -BFP pro Zelle gezeigt. Alle Diagramme zeigen SD von drei unabhängigen Experimenten, und mindestens 200 Zellen wurden für jedes Experiment gezählt. Ungepaarten t-Test wurde verwendet, um die Signifikanz der beobachteten Unterschiede zu analysieren. ** P <0,001. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Tafesse et al. 2015 8. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Zeitraffer-Bildgebung von C. albicans - Aufnahme die frühen Stadien der Phagozytose zu visualisieren. Wildtyp-DC2.4 Zellen F-Actin stabil exprimieren -mCherry (F-Actin) wurden mit Candida -BFP inkubiert (in rot dargestellt) und abgebildet konfokalen Mikroskopie. Bilder, die in 30 Sekunden-Intervallen dargestellt. Sternchen zeigen die verschiedenen Stadien der Aktin-Umbildung während der Phagozytose. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Tafesse et al. 2015 8. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1: Live - Bildgebung. Wildtyp - DC2.4 Zellen , die stabil F-Actin-mCherry exprimieren (grün) wurden mit Candida -BFP (rot) infiziert. Live-Aufnahmen wurden mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt, wie in Schritt 3.3 beschrieben. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Tafesse et al. 2015 8.s / ftp_upload / 54646 / 54646mov1.avi "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um dieses Video zu sehen. (Rechtsklick zum Download bereit.)
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Discussion
Professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und dendritischen Zellen, verschlingen und zu beseitigen Krankheitserreger daher macht Phagozytose ein wichtiger Bestandteil des Abwehrsystems eindringen. Während dieses Prozesses durchlaufen Phagozyten umfangreiche Membran Reorganisation und Zytoskelett Umlagerung an ihrer Zelloberfläche 8, 19, 20. Um diesem dynamischen Prozess zu verstehen, die Visualisierung der verschiedenen Phasen der Phagozytose ist von wesentlicher Bedeutung. Hier beschrieben wir ein mikroskopbasiertes Verfahren, das verwendet wurde, um die verschiedenen Schritte der Phagozytose zu überwachen.
Die Hauptbedeutung der Live-Bilderzeugungstechnik ist, dass es bemerkenswerte Fähigkeit bietet die Wirt-Pathogen-Schnittstelle auf der molekularen Ebene zu überwachen. Dadurch, dass die Visualisierung der wichtigsten Schritte der mikrobiellen Infektion, bietet die Live-Darstellung kritischen Einblick in die grundlegende Natur der Immunantwortgegen Pathogene 8, 10, 21, 22. Neben Phagozytose, die hier beschriebenen Techniken können erweitert werden , Endocytose zu studieren andere Arten von Rezeptor-vermittelter, einschließlich Makropinozytose 10. Live - Bildgebung ist auch ein wertvoller Ansatz , um die Erreger-Wirt-Beziehung von intrazellulären Bakterien, wie Mycobacterium tuberculosis und Salmonella Typhi zu studieren, sowie Parasiten einschließlich Leishmania und Toxoplasma gondii 22, 23.
Es gibt mehrere Vorteile der lebenden Zellen gegenüber den anderen Techniken, wie konventionelle biochemische Ansätze. Live - Cell - Imaging ermöglicht es uns , die räumliche und zeitliche Dynamik von zellulären Prozessen 8 zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht die Bildgebung uns informieren zu gewinnenation bei einer einzelnen Zelle Auflösung 21. Phagozytose ist ein dynamisches zellulären Prozess, der das Clustering von Rezeptoren, Actin und Membranlipid Remodeling in einer Angelegenheit von wenigen Minuten 10 beinhaltet. Live-Imaging ermöglicht es uns, diese Informationen in einer zeitkritische Weise zu erfassen, die sonst nur schwer zu erreichen.
Die wesentliche Einschränkung dieser Technik ist, dass es eine sorgfältige Optimierung der experimentellen Bedingungen und Mikroskopaufbauten erfordert. Es gibt mehrere wichtige Faktoren von entscheidender Bedeutung für die erfolgreiche Bilder zu erhalten. Die Qualitäten des fluoreszierenden Proteins (oder Biosensor) genutzt, um die Phagozyten (wie F-Actin) sowie die Art der die Partikel zu beschriften verwendete Farbstoff sichtbar sind kritische Aspekte der Bildgebung. Für die Live-Darstellung, genauso wichtig ist die Einstellung des Gleichgewichts der Umweltkammer des Mikroskopaufbau. Je nach Instrument kann die Äquilibrierung von 15 min bis zu mehreren Stunden dauern. SiNOA CO 2 -Zufuhr soll einen geeigneten pH - Wert im Kulturmedium zu erhalten, ist es notwendig , genügend Laufzeit , bevor das Experiment zur Einrichtung zu ermöglichen. In Fällen , wenn die CO 2 -Zufuhr unzureichend ist und / oder uneben, zwitterionische organische chemische Puffermittel , wie beispielsweise HEPES , um das Wachstumsmedium ergänzt werden kann. Langzeitexposition von fluoreszierenden Partikeln und lebenden Zellen zu konfokalen Laser Phototoxizität und Bleichen führen kann. Optimierung der Laserleistung (die weniger Belichtungszeit besser die) und sicherstellen, dass Fensterläden sind zwischen Bildaufnahmen geschlossen in kann diese Probleme zu reduzieren. Insgesamt sind die hier beschriebenen Techniken ideal für die dynamische Beziehung zwischen den Pathogenen und den Phagozyten während Phagozytose studieren.
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Acknowledgments
Wir danken Wendy Lachs und Nicki Watson von der Keck-Anlage am Whitehead Institute des MIT für die Bildgebung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
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- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
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