Abstract
Det pattedyrs krop er udstyret med forskellige lag af mekanismer, der hjælper til at forsvare sig mod patogene invasioner. Professionelle fagocytter i immunsystemet - såsom neutrofiler, dendritiske celler og makrofager - bevarer den medfødte evne til at detektere og fjerne sådanne invaderende patogener gennem fagocytose 1. Fagocytose indebærer koreograferede begivenheder membran reorganisering og actin remodeling på celleoverfladen 2, 3. Fagocytter held internalisere og udrydde fremmede molekyler, når alle stadier af fagocytose er opfyldt. Disse trin omfatter genkendelse og binding af patogenet ved mønstergenkendelse receptorer (PRRS) bosiddende på celleoverfladen, dannelse af fagocytisk kop gennem actin-beriget membranøse fremspring (pseudopodier) at omgive det partikelformige, og spaltning af fagosomet efterfulgt af fagolysosomet modning som resulterer iaflivning af patogenet 3, 4.
Billeddannelse og kvantificering af forskellige stadier af fagocytose er medvirkende til at belyse de molekylære mekanismer af denne cellulære proces. Den foreliggende manuskript rapporterer metoder til at studere de forskellige faser af fagocytose. Vi beskriver et mikroskop tilgang til at visualisere og kvantificere binding, fagocytiske kop dannelse, og internaliseringen af partikler af fagocytter. Som fagocytose opstår, når medfødte receptorer på fagocytiske celler støder ligander på et mål partikel større end 0,5 um, assayene vi præsenterer her omfatter anvendelsen af patogene svampe Candida albicans og andre partikler såsom zymosan og IgG-belagte kugler.
Introduction
Trods den vedvarende udsættelse for patogener, såsom bakterier, vira og svampe, er vores krop godt udstyret med immune mekanisme, der giver beskyttelse mod infektion. Det medfødte immunsystem er den første linje i forsvaret mod invaderende patogener og er hovedsageligt afhængig fagocytceller, som genkender og internaliserer udenlandske mål.
Fagocytose er en evolutionært bevaret cellulær proces, der omfatter engulfment af uønskede partikler større end 0,5 um. Fagocytiske celler udtrykker en bred vifte af immune receptorer (også kendt som mønstergenkendelse receptorer, PRRS) ved celleoverfladen, så de kan genkende patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs) til stede på patogener før engulfment 3. Patogen binding efterfølges af receptor klyngedannelse på celleoverfladen og udløser dannelsen af en fagocytisk kop. Dette resulterer i actin-drevne membran remodeling der rager rundtmålet, vinder omslutter det og knibe-off til dannelse af en diskret phagosomal vacuole 2, 5. Fagosomet derefter modnes og forsurer ved efterfølgende fusion med sene endosomer og lysosomer, som danner fagolysosomet 6.
Selvom fagocytose er beskrevet som receptormedieret og actin-drevne begivenhed, denne proces har ligeledes henvist rumlig-tidslig modifikation af lipider, der udgør plasmamembranen, såsom phosphoinositider (PI'er) samt sphingolipider 7, 8. Mens actinpolymerisation dikteres af en lokal akkumulering af phosphoinositol-4,5-biphosphat (PI (4,5) P2) ved bunden af den fagocytiske kop, actin depolymerisering afhænger omdannelsen af (PI (4,5) P 2 til phosphoinositol-3,4,5-biphosphat (PI (3,4,5) P3) 3, 9. Begge modifikationerer af afgørende betydning, da de tidligere fører til en vellykket udvidelse af pseudopodier omkring målet, og sidstnævnte muliggør synker af partikler i cytosolen af fagocyt 10.
Celler, som har evnen til at fagocytere er enten professionelle fagocytter, ligesom makrofager / monocytter, granulocytter / neutrofiler og dendritiske celler (DC'er) eller ikke-professionelle fagocytter, såsom fibroblast og epitelceller 11. Fagocytose udført af alle fagocytter spiller en central rolle i væv vedligeholdelse og ombygninger, mens fagocytose udført af professionelle fagocytter er ansvarlig for koordineringen af det medfødte og adaptive immunrespons mod patogener. Professionelle fagocytter ikke kun opsluge og dræbe patogenet, men også præsenterer antigener til de lymfoide celler i det adaptive immunsystem. Dette bidrager til frigivelsen af proinflammatoriske cytokiner og til indgrebet af lymfoide celler, derfor fører tilden vellykkede blokade af infektion 12.
Konventionelle biokemiske teknikker har været medvirkende til at få viden om den molekylære mekanisme af forskellige cellulære processer under fagocytose, såsom post-translationelle modifikationer og forskellige høj affinitet associationer mellem proteiner. Men det er vanskeligt at få oplysninger om de rumlige og tidslige dynamik fagocytiske begivenheder ved hjælp af de konventionelle biokemiske metoder. Live-cell imaging ikke kun giver os mulighed for at overvåge cellulære begivenheder i en tid følsom måde, men også gør det muligt for os at få information på en enkelt celle niveau. Her beskriver vi en metode til at undersøge de forskellige stadier af fagocytose, samt til at analysere hele processen spatiotemporally hjælp konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af DC2.4 og RAW 264,7 cellelinier
BEMÆRK: makrofag-lignende cellelinje RAW 264.7 og den dendritiske cellelinje DC2.4 er både murin oprindelse, og følgende betingelser blev anvendt til dyrkning af cellerne.
- Grow RAW 264.7-celler i DMEM (Dulbeccos Minimal Eagles medium) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2.
- Grow DC2.4 celler i lignende forhold med den i RAW 264.7 celler, bortset fra brug RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium suppleret med L-Glutamin i stedet for DMEM.
2. Fremstilling af fluorescerende Konjugerede Partikler: C. albicans, Zymosan, IgG-belagte kugler
- Dyrkning Candida albicans
- Inokulere C. albicans stamme SC5314 fra en frossen glycerolstamopløsning i 25 ml YPD suppleret med Uri (2% Bacto-pepton, 1%gærekstrakt, 2% glucose og 80 ug / ml Uridin) natten over ved 30 ° C.
BEMÆRK: Undgå voksende Candida kultur mere end en OD 600 af 12. - Der tages 1 ml C. albicans og spin den ned ved 2000 xg i 5 min ved stuetemperatur.
- Aspirere supernatanten og re-suspendere pellet med 1 ml PBS.
- Opsaml pellet ved centrifugering ved 2000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Gentag trin 2.1.4.
- Beregn infektionsmultiplicitet (MOI) på C. albicans i forhold til antallet af fagocytter og fortsætte med fagocytose assay som beskrevet i afsnit 3. En OD600 på 1 svarer til 2,5 x 10 7 Candida albicans per 1 ml.
BEMÆRK: Generering af Candida-BFP er beskrevet i reference 13.
- Inokulere C. albicans stamme SC5314 fra en frossen glycerolstamopløsning i 25 ml YPD suppleret med Uri (2% Bacto-pepton, 1%gærekstrakt, 2% glucose og 80 ug / ml Uridin) natten over ved 30 ° C.
- Fremstilling af Zymosan og IgG-belagte kugler
BEMÆRK: Zymosan er en β-glucan-holdigtsvampe kulhydrat partikler forberedelse, der stammer fra Saccharomyces cerevisiae. Zymosan vides at fremkalde inflammatoriske signaler i makrofager og dendritiske celler, og det har været anvendt i udstrakt grad i fagocytose studier 13, 14, 15.- Kort fortalt vortexes røret, der indeholder det partikelformige, og udportionerer en tilstrækkelig mængde til et eksperiment i et 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Typisk bruger vi 01:10 forholdet (for en celle, tilsættes 10 zymosan partikler eller IgG-belagte kugler). - Der tilsættes 1 ml iskold PBS, og indsamle partikler ved centrifugering i 1 min ved 10.000 x g.
- Aspirere supernatanten og resuspender pellet i 1 ml iskold PBS.
- Gentag trin 2.2.2-2.2.3
BEMÆRK: Fortsæt til trin 2.2.5 eller opbevare røret ved 4 ° C indtil brug. - Sonikeres partiklerne i 10 sekunder i ultralydsbad sonikator (120 V, 50-60 kHz) for at undgå enny partikel sammenlægning.
- Kort fortalt vortexes røret, der indeholder det partikelformige, og udportionerer en tilstrækkelig mængde til et eksperiment i et 1,5 ml rør.
3. Fagocytose
BEMÆRK: Fagocytose er en kompleks proces, der begynder med binding af partiklerne på celleoverfladen af fagocytter ved interaktion af PRRS med ligander på overfladen af partiklen. Binding er efterfulgt af samlingen af actin og dets tilknyttede proteiner på kontaktstedet, og dannelsen af en fagocytisk kop. Den efterfølgende actin adskillelse forekommer ved fagosomet og resulterer i en fuldstændig omslutning af det partikelformige. Nedenfor beskriver vi de forskellige stadier af fagocytose.
- bindingsassay
BEMÆRK: Formålet med dette forsøg er at overvåge det første trin i fagocytose, der involverer interaktionen mellem ligander på målpartiklerne og receptorerne på fagocytter.- Seed omkring 5 x 10 4 celler i et kammer slide så de er 60-70% konfluente på tidspunktet for eksperimentet. alterntivt, plade celler på dækglas (i 24- eller 12-brønds format) eller glas-bottom 96 brønde. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2.
BEMÆRK: Celler kan tælles ved anvendelse af hæmocytometer eller en lignende teknik. - Placer kammeret slide (eller plade) ved 10 ° C i 10 min.
- Fjern forsigtigt mediet fra hver brønd med en pipette eller emhætte.
ADVARSEL: Udfør dette trin omhyggeligt som hver brønd på en kamre dækglas system er lille; det er let at forstyrre celler med spidsen af en pipette eller en stærk luftstrøm af en aspirator. - Bland fluorescensmærkede partikler med et celledyrkningsmedium (fremstillet som beskrevet ovenfor). Tilføj Candida -BFP (ved en MOI på 10), fluorescerende konjugeret-zymosan eller latex perler-kanin-IgG-FITC (10 partikler per celle) til cellerne. Brug et endeligt volumen på 200 pi medier til et kammer brønd for at sikre alle celler er dækket.
- Spin ned i kammeret slide på 277xg i 3 min ved 10 ° C.
BEMÆRK: Denne centrifugeringstrin bidrager til at øge kontakten mellem partikler og cellerne, og det synkroniserer bindingsprocessen. - Overdrage kammeret slide til et 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2 i 5 minutter.
- Fjern kammeret dias fra inkubatoren og opsug medierne.
- Vask cellerne 3 gange med iskold PBS.
BEMÆRK: Kontroller tilstedeværelsen af ubundne partikler med et lysmikroskop og vask flere gange med PBS om nødvendigt. Det er vigtigt at fjerne ubundne partikler fra brønden for at minimere baggrundsstøj under analysen. - Fix celler ved tilsætning af 500 pi 4% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i PBS ved inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur.
ADVARSEL: Dette trin kræver brug af 4% PFA, som er stærkt toksisk, ætsende, og potentielt carcinogen. Korrekt forsigtighed bør udvises forsigtighed ved brug denne væske. Også beskytte prøver fra lys. - Gentag 3.1.9 trin to gange.
BEMÆRK: I dette trin refill hvert hætteglas straks efter fjernelse af tidligere PBS. - Stoppe optagelsen ved inkubering med 500 pi af 50 mM NH4CI i PBS i 10 min.
- Vask cellerne to gange med PBS som beskrevet i trin 3.1.10.
- Permeabilisere celler ved tilsætning 250 pi bindingspuffer (0,1% saponin, 0,2% BSA i PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Stain F-actin ved tilsætning fluorescerende konjugeret phalloidin (fortyndet 1: 500 i bindingsbuffer). Cellerne inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask cellerne tre gange med PBS som beskrevet i trin 3.1.10.
- Capture billeder ved hjælp af et konfokalt mikroskop (63X objektiv, og 402 nm og 488 nm laser) og analysere billeder ved hjælp ImageJ 16.
BEMÆRK: En vellykket partikel binding er kendetegnet ved tilstedeværelsen af en fagocytisk cup på stedet, hvor det partikelformige kontakt den fagocytiske celler (figur 1). Se trin 3.2.5.
- Seed omkring 5 x 10 4 celler i et kammer slide så de er 60-70% konfluente på tidspunktet for eksperimentet. alterntivt, plade celler på dækglas (i 24- eller 12-brønds format) eller glas-bottom 96 brønde. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2.
- Fagocytose Optagelse Assay
BEMÆRK: Dette forsøg er udformet til at overvåge den fuldstændige internalisering af fluorescensmærkede partikler af fagocytter under anvendelse af konfokal mikroskopi (figur 2).- Seed omkring 5 x 10 4 celler i et kammer slide så de er 60-70% konfluente på tidspunktet for eksperimentet. Alternativt plade celler på dækglas (i 24- eller 12-brønds format) eller glas-bottom 96-brønds plader. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2.
BEMÆRK: Celler kan tælles ved anvendelse af hæmocytometer eller en lignende teknik. - Hold kammerobjektglas (eller plade) ved 10 ° C i 10 minutter.
BEMÆRK: Afkøling er nødvendig for at blokere endocytose samt uønsket fagocytose, og efterfølgende at have en synkroniseret fagocytose. - PerfOrm skridt fra 3.1.3 til 3.1.5
- Overfør kammeret slide til et 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2, og inkuberes i forskellige tidspunkter. Fix celler efter 30, 60 og 90 min efter infektion. Observere C. albicans begynder at danne hyfer ved 60 min efter infektion; fagocytter begynder at vise celledød (pyroptosis) efter 90 min 8.
BEMÆRK: Dette er en anbefaling, og optimering er afgørende afhængig af celletype og partikler anvendes. - Udfør trin fra 3.1.7 til 3.1.15. Analyser billeder ved hjælp ImageJ 16.
BEMÆRK: en vellykket optagelse er karakteriseret ved en komplet internalisering af et partikelformigt inde i cytoplasmaet af en phagocyt (figur 2). Farvning af fagocytter med celleoverflademarkør såsom phalloidin bidrager til at afgrænse konturen af celler. Det er også vigtigt at udføre z-stakke for at afgøre, om det partikelformige er bundet til celleoverfladen eller completely internaliseret.
- Seed omkring 5 x 10 4 celler i et kammer slide så de er 60-70% konfluente på tidspunktet for eksperimentet. Alternativt plade celler på dækglas (i 24- eller 12-brønds format) eller glas-bottom 96-brønds plader. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2.
- Live-Imaging fagocytose
BEMÆRK: I denne protokol beskriver vi brug af konfokal mikroskopi til at fange de forskellige stadier af fagocytose ved hjælp af fluorescens-konjugeret zymosan. Vi bruger den dendritiske cellelinje DC2.4 der stabilt udtrykker mCherry-mærkede F-actin 8, en biosensor, der viser fordelingen af filamentøse actin i levende celler. Da fagocytose er en actin-drevet proces levende billeddannelse i denne celle ikke kun gør det muligt at fange bevægelsen og dynamik F-actin netværk, men også for at visualisere de forskellige fagocytiske begivenheder inden de levende celler (Figur 3, Movie 1).- Seed omkring 5 x 10 4 celler i et kammer objektglas ved en koncentration således at de er 60-70% konfluente på tidspunktet for eksperimentet. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2.
BEMÆRK: Celler kan tælles ved hjælp af hæmocytometer eller enlignende teknik. - Hold kammer glider på is i 10 min.
BEMÆRK: Køling er nødvendigt for at blokere uønsket optagelse samt at have en synkroniseret fagocytose. - Udfør trin fra 3.1.3 til 3.1.5
- Pre-varme mikroskopbordet til 37 ° C og tempereres kammeret med 5% CO2. Vente 30-45 min for temperatur og CO 2 stabiliseres startes billeddannelse.
BEMÆRK: Da CO 2 og temperaturniveauer er kritiske for fagocytose, er det vigtigt at slå mikroskopet varmelegeme før forsøget at ækvilibrere miljøkammeret. - Placer kammeret slide indeholdende cellerne i mikroskopet inkubator kabinet ækvilibreret ved 37 ° C og 5% CO2.
- Udfør levende billeddannelse 17, 18.
BEMÆRK: Indstillingerne for lasereffekten (gain, pinhole, etc.) kan variere afhængigt af typen af the mikroskop og fluorescerende probe anvendes. Derfor anbefaler vi at konsultere manualen af mikroskopet for optimal betingelse for din live billeddannelse 17,18.- Brug konfokal laser scanning mikroskop (og den tilhørende software) til direkte billedvisning. Brug 63X 1.4NA olie målsætning med en pinhole på 1-1,1 Airy enheder.
- For at starte billedbehandling, brugte den lyse felt til at finde et repræsentativt område på kammeret dias. Dernæst skal du vælge feltet ved at klikke på Position option på softwaren. For at detektere GFP i Spor 1 anvendes filteret sæt til 488 nm laser med en stråledeler ved 582 nm, for at detektere bølgelængder mellem 488 og 582 nm.
- I Spor 2 vælge et filter sæt optimal for mCherry (RFP) ved hjælp af en stråledeler ved 578 nm og afsløre bølgelængder mellem 578 og 600 nm. Brug 488 nm og 578 nm lasere med 50% laser magt og en gevinst produktion på 600-700. Opnå billeder hvert 30. sek for i alt 90 min.
- Seed omkring 5 x 10 4 celler i et kammer objektglas ved en koncentration således at de er 60-70% konfluente på tidspunktet for eksperimentet. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microscope-baserede metode til at overvåge de forskellige stadier af fagocytose præsenteres. De forskellige begivenheder i fagocytose af forskellige fluorescerende partikler ved DC2.4 celler er vist. Under anvendelse af teknikkerne beskrevet her, undersøgte vi rolle sphingolipider i de tidlige stadier af fagocytose. Til dette formål DC2.4 dendritiske celler genetisk deficiente i Sptlc2, det enzym, der katalyserer det første og hastighedsbegrænsende trin i sphingolipidet biosyntesevejen, blev anvendt. Sammenlignet med vild type celler, Sptlc2 - / - DC2.4 celler er væsentligt reduceret niveau af sphingolipider herunder ceramid, sphingomyelin og glucosylceramid 8. Sptlc2 - / - DC2.4 celler er defekte i binding, såvel som i optagelsen af C. albicans, zymosan og IgG latexperler 8. I figur 1 er de bindende for fluorescens konjugeret-zymosan partikler i DC2.4 celler vises (se AFSn 3.1 for detaljer). Sptlc2 - / - DC2.4 celler viste signifikant mindre binding af zymosan end kontrollen DC2.4 celler (p = 0,0008, figur 1A). Antallet af zymosan partikler bundet pr celle var signifikant højere for kontrolceller end for Sptlc2 - / - DC2.4 celler (p <0,0001, figur 1C). Derefter undersøgte vi evnen hos Sptlc2 - / - DC2.4 celler til fagocytere C. albicans. Sptlc2 - / - DC2.4 celler viste signifikant mindre fagocytose af C. albicans (p <0,0005) sammenlignet med kontrolcellerne (figur 2A, 2B). Som forventet viste Sptlc2-deficiente celler signifikant højere antal ikke-fagocytiske celler (p <0,05, figur 1C) og nedsat antal C. albicans per celle (Figur 1C, D). Disse resultater understreger den rolle, som en intakt sphingolipid biosyntesevej i binding, såvel som i than optag af partikler. Figur 3 viser time-lapse billeder demonstrerer de tidlige stadier af fagocytose (se afsnit 3.3 for detaljeret procedure). Movie 1 viser live billeddannelse af DC2.4 celler stabilt udtrykker F-actin, en biosensor, der afslører fordelingen af trådformede actin i levende celler (se afsnit 3.1 for flere detaljer).
Figur 1: Binding assay af zymosan i DC2.4 celler. (A) Kontrol og Sptlc2 - / - DC2.4 celler blev inkuberet med fluorescens konjugeret zymosan, og deres evne til at binde de undersøgte ved konfokal mikroskopi partikler. Pile indikerer lokaliteter af binding. Scale bar = 100 um. (B, C) Kvantificering af antallet af bundne zymosan partikler (B) og antallet af zymosan partikler bundet pr cell (C) er vist. Bundne partikler blev kvantificeret og præsenteret som den procentdel i forhold til kontrollen. Alle grafer viser SD af tre uafhængige forsøg, og mindst 200 celler blev talt for hvert forsøg. Parret t-test blev anvendt til at analysere betydningen af de observerede forskelle. ** P <0,001. Scale bar = 100 um. Udskriv igen med tilladelse fra Tafesse et al. 2015 8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fagocytose af C. albicans i DC2.4 celler. (A) Celler blev inficeret med C andida -BFP som beskrevet i trin 3.2. Ved 90 min efter infektion blev celler fikseret og farvet med fluorescens-konjugeret phalloidi og filmede med konfokal mikroskopi. (B - D) Kvantificering af antallet af internaliserede Candida -BFP, ikke-fagocytiske celler, og antallet af Candida -BFP per celle er vist. Alle grafer viser SD af tre uafhængige forsøg, og mindst 200 celler blev talt for hvert forsøg. Parret t-test blev anvendt til at analysere betydningen af de observerede forskelle. ** P <0,001. Scale bar = 100 um. Udskriv igen med tilladelse fra Tafesse et al. 2015 8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Time-lapse billeddannelse af C. albicans optagelse at visualisere de tidlige stadier af fagocytose. Vildtype DC2.4 celler, der stabilt udtrykker F-actin -mCherry (F-actin) blev inkuberet med Candida -BFP (vist med rødt) og filmede med konfokal mikroskopi. Billeder taget med 30 sek intervaller vises. Stjernerne viser de forskellige stadier af actin remodeling under fagocytose. Scale bar = 100 um. Udskriv igen med tilladelse fra Tafesse et al. 2015 8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Levende billeddannelse. Vildtype DC2.4 celler stabilt udtrykker F-actin-mCherry (vist med grønt) smittet med Candida -BFP (vist med rødt). Levende billeddannelse blev udført ved anvendelse af konfokal mikroskopi som beskrevet i trin 3.3. Udskriv igen med tilladelse fra Tafesse et al. 2015 8.s / ftp_upload / 54.646 / 54646mov1.avi "target =" _ blank "> Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Professionelle fagocytter, såsom makrofager og dendritiske celler, opsluge og eliminere invaderende patogener derfor gør fagocytose en vigtig komponent i værtens forsvarssystem. Under denne proces fagocytter undergår omfattende membran reorganisering og cytoskelettet omlejring på deres celleoverflade 8, 19, 20. For bedre at forstå denne dynamiske proces, visualisering af de forskellige stadier af fagocytose er afgørende. Her beskrev vi et mikroskop-baseret metode, der blev anvendt til at overvåge de forskellige trin i fagocytose.
Den vigtigste betydning af den levende billeddannelse teknik er, at det giver bemærkelsesværdigt stand til at overvåge værtspatogene grænseflade på det molekylære niveau. Ved at tillade visualisering af de vigtigste trin i den mikrobielle infektion, live billedbehandling giver kritisk indblik i den grundlæggende karakter af immunresponsetmod patogener 8, 10, 21, 22. Foruden fagocytose, kan de beskrevne teknikker her udvides til at studere andre typer receptor-medieret endocytose, herunder macropinocytosis 10. Levende billeddannelse er også en værdifuld fremgangsmåde til at studere værtspatogene forholdet af intracellulære bakterier, såsom Mycobacterium tuberculosis og Salmonella typhi, samt parasitter, herunder Leishmania og Toxoplasma gondii 22, 23.
Der er flere fordele ved levende celler i de andre teknikker såsom konventionelle biokemiske metoder. Live-cell imaging giver os mulighed for at overvåge de rumlige og tidslige dynamik cellulære processer 8. Desuden levende billedbehandling giver os mulighed for at vinde informereation på en enkelt celle resolution 21. Fagocytose er en dynamisk cellulær proces, der involverer klyngedannelse af receptorer, actin og membran lipid remodellering i løbet af et par minutter 10. Live-billedbehandling giver os mulighed for at fange sådanne oplysninger i en tid følsom måde, som ellers er vanskelig at gennemføre.
Den største begrænsning ved denne teknik er, at den kræver omhyggelig optimering af forsøgsbetingelser og mikroskop opsætninger. Der er flere vigtige faktorer er afgørende for en vellykket opnå billeder. De kvaliteter af det fluorescerende protein (eller biosensor) anvendes til at visualisere fagocytter (såsom F-actin) samt arten af farvestoffet anvendes til at mærke det partikelformige er kritiske aspekter af billeddannelse. For levende billeddannelse, lige så vigtigt er det ligevægt af de miljømæssige kammer af mikroskopet setup. Afhængigt af instrumentet, kan ækvilibreringen tage fra 15 min til flere timer. Since CO 2 forsyning til formål at bevare en passende pH i dyrkningsmedier, er det nødvendigt at tillade tilstrækkelig runtime før opsætning af eksperimentet. I tilfælde, hvor CO 2 forsyning er utilstrækkelig og / eller ujævn, zwitterionisk organisk kemisk puffermiddel såsom HEPES kan suppleres til vækstmedierne. Langvarig eksponering af fluorescerende partikler og levende celler til konfokale lasere kan føre til fototoksicitet og blegning. Optimering laser effekt (mindre eksponeringstid jo bedre) og sikre, at skodder er lukket i mellem anskaffelser billede kan mindske disse problemer. Samlet set er beskrevet her teknikker er ideelle til at studere dynamiske forhold mellem patogener og fagocytter under fagocytose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Wendy laks og Nicki Watson i Keck facilitet på Whitehead Institute of MIT for billeddannelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Cell Signaling Technology | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium) | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Fetal Bovine serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
| FITC-coupled IgG-coated latex beads | Cayman | 500290 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Paraformaldehyde Solution (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Phalloidin-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Trypsin-EDTA (1x) (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers) | ThermoFisher | 155361 | |
| Glasstic slide 10 with grids | Hycor | 87144 |
References
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R.
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S.
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Aderem, A., Underhill, D. M.
- Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
- Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188 (2015).
- Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
- Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D.
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
- Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446 (2013).
- Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
- Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
- Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
- Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
- John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).
