Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

forberedelse og Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

Summary

Her beskriver vi fremstilling og anvendelse av en aktivitetsbasert sonde (ARN14686, undek-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oksoazetidin-3-yl] karbamat) som gjør det mulig for påvisning og kvantifisering av aktive form av proinflammatoriske enzymet N -acylethanolamine syre amidase (naaa), både in vitro og ex vivo.

Abstract

Aktivitetsbaserte protein profilering (ABPP) er en fremgangsmåte for identifikasjon av et enzym av interesse i en kompleks proteom- ved bruk av en kjemisk sonde som er rettet mot enzymets aktive seter. En reporter kode innføres i sonden gjør det mulig for påvisning av den merkede enzym ved in-gel fluorescens skanning, protein-blot, fluorescens mikroskopi, eller væskekromatografi-massespektrometri. Her beskriver vi utarbeidelse og bruk av det sammensatte ARN14686, et klikk kjemi aktivitetsbaserte probe (CC-ABP) som selektivt gjenkjenner enzymet N -acylethanolamine syre amidase (naaa). Naaa er en cystein hydrolase som fremmer betennelse ved å deaktivere endogene peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor (PPAR) alfa agonister som palmitoylethanolamide (PEA) og oleoylethanolamide (OEA). Naaa blir syntetisert som et inaktivt proenzym full-lengde, som aktiveres ved autoproteolysis i det sure pH-verdien i lysosomet. Lokaliserings studier have vist at naaa uttrykkes hovedsakelig i makrofager og andre monocytt-avledede celler, så vel som i B-lymfocytter. Vi gir eksempler på hvordan ARN14686 kan brukes til å oppdage og kvantifisere aktiv naaa ex vivo i gnager vev av protein blot og fluorescens mikroskopi.

Introduction

Vanligvis brukes fremgangsmåter for å undersøke uttrykk mønstre, interaksjoner og funksjoner av proteiner, inkludert væskekromatografi-massespektrometri plattformer for hagle analyse 1,2, gjær to-hybrid metoder 3,4, og in vitro-analyser, er begrenset ved at de er ute av stand til å vurdere aktiviteten av proteiner i sin opprinnelige tilstand. Aktivitetsbaserte protein profilering (ABPP) kan brukes til å fylle dette gapet. I denne tilnærmingen sonder små-molekyl er i stand til kovalent binding til det aktive sete av et enzym av interesse er konjugert til en rapportørgruppe som gir mulighet for påvisning av mål. Ved hjelp av klikk kjemi (CC), kan reporteren være integrert inn i sonden eller kan innføres etter mål inngrep har funnet sted 5,6. Den sistnevnte metode krever bruk av prober som inneholder passende kjemiske grupper, for eksempel en terminal alkyn eller azid, som kan modifiseres med en rekke rapportør reagenser via bio-ortogonale reaksjoner such som Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cykloaddisjon 7-9 eller Staudinger ligering 10,11.

Nylig har vi beskrevet forbindelsen ARN14686 som den første ABP for in vitro og in vivo deteksjon av cystein hydrolase, naaa 12. Naaa katalyserer den hydrolytiske deaktivering av mettede og monoumettede Fåes, inkludert oleoylethanolamide (OEA) og palmitoylethanolamide (PEA), som er endogene agonister for den anti-inflammatoriske nukleær reseptor PPAR-alfa 13-15. Naaa uttrykkes hovedsakelig i makrofager og andre monocytt-avledede celler, så vel som i B-lymfocytter 14,16, hvilket antyder en rolle i reguleringen av den medfødte immunrespons. Enzymet blir syntetisert i den grove endoplasmatiske retikulum i en inaktiv form, og aktiveres i sure i cellen ved hjelp av en mekanisme 17 autoproteolytisk. Autoproteolytisk cleavage genererer en ny N-terminale cystein (C131 i mus og rotter, NOK 126 hos mennesker), er at nukleofilen er ansvarlig for hydrolyse FAE 18,19. Farmakologisk hemming av naaa aktivitet endrer FAE syntese / nedbryting av balansen i favør av økt cellulære nivåer av Faes 16,20,21. Flere β-lakton og β-laktam-derivater er blitt vist å hemme aktiviteten naaa med høy potens og selektivitet 16,22-26. Disse inhibitorene virker gjennom S -acylation av den katalytiske cystein 16,27,28.

Forbindelsen ARN14686 ble designet basert på den kjemiske strukturen til systemisk aktiv, serin-avledede β-laktam naaa inhibitor, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oksoazetidin-3-yl] karbamat) 16. 4-butyl-cykloheksyl gruppe av ARN726 ble erstattet med en C9 mettet alifatisk kjede som bærer en terminal alkyn kode for etterfølgende CC konjugering med et azid bærende reporter tag. Vi valgte å lage en to-trinns ABP å minimally endre strukturen av den opprinnelige stillaset, og dermed opprettholde affiniteten av sonden for naaa. Dessuten unngår innføring av voluminøse koder, kunne en slik sonde være mer egnet for in vivo-behandling enn en direkte ABP. ARN14686 hemmer naaa med høy potens (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) ved å danne en kovalent addukt med den katalytiske cystein av enzymet 12. Eksperimenter i levende rotter viste at proben er selektivt i å fange naaa uttrykt i lungene. Acid ceramidase, en annen cystein amidase som deler 33-34% identitet med naaa, ble også identifisert som et lav-affinitet mål ved bruk av høy-probe-konsentrasjoner (10 uM in vitro, 10 mg / ml intravenøs, IV) 12. Vi har også anvendt ARN14686 for å studere nærværet av aktiv naaa i betent vev fra rotte etter administrering av Freunds fullstendige adjuvans (CFA) 29.

Her skisserer vi en protokoll for preparatipå av ARN14686 (figur 1) og dens anvendelse i etterforskningen av naaa aktivering ex vivo. Som et eksempel, beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å visualisere naaa i rotte potene etter CFA administrering. I dette eksperimentet blir proteinene ekstrahert fra labb vev etter intravenøs injeksjon av sonden, og ABP-merkede proteom- blir underkastet CC med biotin-azid. Biotinylerte prøver er anriket ved hjelp av streptavidin perler, og proteinblottene blir utført. I et annet program, beskriver vi lokalisering av aktive naaa ved fluorescens mikroskopi i muse lungene fra probe-behandlede mus. I dette tilfellet er vevet i snitt og deler er underkastet CC for rhodamin tilsetning. En arbeidsflyt ordningen er illustrert i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsiktig: Alle kjemi reaksjoner bør utføres i en ventilert avtrekkshette og med bruk av en laboratoriefrakk, hansker og vernebriller. Reaksjonene må også utføres i et nitrogenmiljø.

Etisk uttalelse: Våre prosedyrer som involverer dyr er utført i samsvar med de italienske forskrift om vern av dyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål (DM 116 192) og Det europeiske økonomiske fellesskap regelverket (EUT av EF L 358/1 12/18/1986 ).

MERK: Syntese av [(3 S) -2-oksoazetidin-3-yl] ammoniumacetat er beskrevet for store utbytter (50 g N-CBZ-L-serin), men det kan lett skaleres ned.

1. Synthesis

MERK: Se figur 1 for syntese reaksjonsskjemaet.

  1. Fremstilling av 2-pyridyl-undec-10-ynyl karbonat og undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-karboksylat
    1. I en 50 ml rundkolbe oppløses 350 mg av undec-10-yn-1-ol i 3,5 ml tørr diklormetan.
    2. Til løsningen i 1.1.1, tilsett 25 mg av 4-dimetylaminopyridin (DMAP) og 530 mg 2-dipyridylcarbonate (DPC). Omrør blandingen ved romtemperatur (RT) i 16 timer.
    3. Tilsett 20 ml diklormetan.
    4. Overfør blandingen til en skilletrakt. Tilsett 15 ml vann, rister den, og la de to faser skille seg.
    5. Åpne vannkranen, samle den organiske fasen (nederst), og lukk stoppekranen. Tilsett 15 ml av en mettet NaHCO3-løsning. Rist skilletrakt og la de to faser skilles. Gjenta dette trinnet to ganger til.
    6. Tørk det organiske lag med Na 2SO 4, filtreres gjennom bomull inn i en rundbunnet kolbe (tara først), og fordamp til tørrhet under redusert trykk (rotasjonsfordamper).
    7. Vei kolben og dannelse av 600 mg av olje som er en blanding av 2-pyridyl-undec-10-ynyl karbonat og undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-karboksylat i et forhold på 1,7: 1.
      1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) hovedkomponent δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1H), 2.18 til 2.11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) mindre komponent δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6.30 til 6.25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1H), 2.18 til 2.11 (m, 2H), 1,77 til 1,60 (m, 2H ), 1,52 til 1,20 (m, 12H).
    8. Bruk olje uten ytterligere separering eller rensing.
  2. Fremstilling av [(3 S) -2-oksoazetidin-3-yl] ammoniumacetat
    1. Fremstilling av benzyl-N - [(S) -1- (hydroksymetyl) -2 - [(4-metoksyfenyl) amino] -2-oksoetylyl] karbamat.
      1. I en 4-liters rundbunnet kolbe, oppløse 141,5 g p -anisidine i 1,5 liter tetrahydrofuran og 0,5 liter diklormetan.
      2. Avkjøl løsningen til 0 ° C i et isbad.
      3. Legg 50,0 g N-CBZ-L-serin og 43,9 g N - (3-dimetylaminopropyl) - N'-etylkarbodiimidhydroklorid.
      4. Rør blandingen med en magnetstav ved 0 ° C i 30 min.
      5. Fjerne løsningen fra isbadet og omrør med en magnetisk stav ved RT i 16 timer.
      6. Fordamp løsningsmidlene under redusert trykk (rotasjonsfordamper).
      7. Legg 400 ml 1: 1 cykloheksan / etylacetat, røres med en spatel, og dekanter.
      8. Gjenta trinn 1.2.1.7 to ganger til.
      9. Oppløs det gummiaktige residuet i 500 ml ethylacetat og vask med 400 ml 0,1 M HCl-løsning (10 ganger), med 400 ml mettet NaHCO3-løsning (2 ganger) og med 400 ml saltvann.
      10. Tørk det organiske lag medNa 2SO 4, filtreres oppløsningen gjennom bomull inn i en rundbunnet kolbe (tara først), og fordamper den til tørr tilstand under redusert trykk (rotasjonsfordamper).
      11. Vei kolben og oppnå 61,4 g av et hvitt, fast stoff.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) S = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42 til 7,25 (m, 6H), 6,91 til 6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 4.24 til 4.15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70 til 3,57 (m, 2H).
    2. Fremstilling av benzyl-N - [(S) -1- (4-metoksyfenyl) -2-okso-azetidin-3-yl] karbamat.
      1. Oppløs 58,6 g N - [(S) -1- (hydroksymetyl) -2 - [(4-metoksyfenyl) amino] -2-okso-etyl] karbamat i 1,6 l N, N-dimetylformamid.
      2. Avkjøl løsningen til 0 ° C med et isbad.
      3. Legg 50,6 g 1,1'-sulfonyldiimidazole og omrøres med en magnetstav i 30 minutter.
      4. Avkjøl løsningentil -20 ° C med et is / NaCl-bad og tilsett 10,2 g natriumhydrid (60% i mineral olje) porsjonsvis.
      5. Omrør blandingen ved -20 ° C i 1 time, og deretter slukke med 2 ml metanol og 1 liter vann.
      6. Vakuum filtrere bunnfallet, vask med 200 ml vann, og tørk under vakuum.
      7. Skaff 42,2 g av et hvitt, fast stoff.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42 til 7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2 H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
    3. Fremstilling av benzyl-N - [(S) -2-oksoazetidin-3-yl] karbamat.
      1. Suspender 9,0 g benzyl-N - [(S) -1- (4-metoksyfenyl) -2-oksoazetidin-3-yl] karbamat i 500 ml acetonitril og 400 ml vann.
      2. Avkjøl løsningen til 0 ° C i et isbad.
      3. Legg 45,4 g Ceric ammoniumnitrat porsjonsvis i løpet av 45 min og omrør med en magnetisk stav ved 0 ° C i 15 min.
      4. Legg 500 ml mettet NaHCO3-løsning forsiktig, og deretter legge til 500 ml etylacetat.
      5. Filtrer bunnfallet og vask med 200 ml etylacetat.
      6. Separer den bifasiske løsning og vask den vandige lag med 200 ml eddikester (3 ganger).
      7. Tørk det organiske lag med Na 2SO 4, tilsett 5 g aktivt kull, filtreres gjennom en pute av diatomé-silika, og fordamp til tørrhet under redusert trykk (rotasjonsfordamper).
      8. Legg dietyleter og rør med en slikkepott.
      9. Filtrer det faste materiale og oppnå 4,85 g av et off-white, fast stoff.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
      Fremstilling av [(S) -2-oksoazetidin-3-yl] -ammonium-acetat.
      1. Oppløs 0,93 ml eddiksyre i 245 ml etylacetat. Marker dette som "fangst løsning."
      2. Oppløs 3,28 g benzyl-N - [(R) -2-oksoazetidin-3-yl] karbamat i 298 ml etanol.
      3. Legg 14,1 ml av cykloheksadien og 3,27 g 10% palladium på karbon.
      4. Omrør suspensjonen ved RT i 12 timer, og deretter filtreres gjennom en kort pute av diatoméjord. Hell den eluerende væske direkte inn i fangst oppløsning.
      5. Fordamp løsningsmidlet under redusert trykk (rotasjonsfordamper), mens temperaturen ble holdt under 35 ° C.
      6. Triturer det oppnådde faste stoff med tetrahydrofuran og oppnå 1,72 g av et hvitt, fast stoff.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) S = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
  3. Fremstilling av undek-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oksoazetidin-3-yl] karbamat
    1. I en 10 ml rundbunnet kolbe, oppløse 60 mg [(3 S) -2-oksoazetidin-3-yl] ammonium-acetat i 2 ml tørr diklormetan.
    2. Avkjøl løsningen til 0 ° C i et isbad og tilsett 81 mL av N, N-diisopropyletylamin drop-klok.
    3. Oppløs 350 mg av den rå blanding inneholdende undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-karboksylat i 2 ml tørr diklormetan, legge den til løsningen, og omrør ved RT i 15 timer. Fordamp løsningsmidlet til tørrhet under redusert trykk (rotasjonsfordamper).
    4. Rens ved kolonnekromatografi (silikagel) ved anvendelse av en automatisert kolonnekromatografi apparat:
      1. Absorber prøven på silikagel, ekvilibrere kolonnen med cykloheksan, og laste prøven inn i patronen.
      2. Eluer med sykloheksan / etylacetat fra 100: 0 til 0: 100 og samle toppene på reagensglass.
      3. Fordamp løsningsmidlet fra fraksjonene som korresponderer til forbindelsen til tørrhet under redusert trykk (rotasjonsfordamper), og oppnå 40 mg av et hvitt, fast stoff.

2. Utarbeidelse av CC reagenser

  1. Utarbeidelse av 5 mM stamløsning av Tag-azid Molekyler
    1. Oppløs 1,5 mg av azid-PEG3-Fluor 545 i 0,5 ml dimetylsulfoksyd (DMSO). Gjør porsjoner i 0,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevar ved -20 ° C.
    2. Oppløs 1,1 mg av azid-PEG3-Biotin i 0,5 ml DMSO. Gjør porsjoner i 0,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevar ved -20 ° C.
  2. Fremstilling av 50 mM stamløsning av Tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP)
    1. Løs opp 14,3 mg TCEP i 1 ml vann, og gjøre det frisk hver gang.
  3. Fremstilling av 50 mM løsning av CuSO4 · 5H to O
    1. I hetteglass, oppløse 12.48 Mg CuSO4 · 5H 2 O i 1 ml vann. Oppbevar ved romtemperatur i opptil en måned.
  4. Fremstilling av 83,5 mM lagerløsning av tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amin (TBTA)
    1. I et hetteglass, oppløse 8,85 mg av TBTA i 200 ul DMSO. Oppbevar ved romtemperatur i opptil en måned.
  5. Utarbeidelse av 1,7 mm Arbeids Løsning av TBTA (umiddelbart før bruk)
    1. Tilsett 20 ul av 83,5 mM TBTA til en glassflaske og fortynn med 180 ml DMSO.
    2. Legg 800 mL av tert-butanol og virvle.

3. naaa Expression Analysis i Paw Tissue av CFA-behandlede rotter

MERK: Bruk Sprague-Dawley rotter som veide 175-200 g, og utfører alle prosedyrer i samsvar med retningslinjer for etisk bruk av dyr. Hus rotter i ventilerte bur på en 12-timers lys / mørke syklus og gi dem fri tilgang til mat og vann. For protokollen til CFEn behandling, se artikkel publisert av Bonezzi et al. 29 Bruk dyrene 7 dager etter CFA administrasjon.

  1. Intravenøs administrasjon av ARN14686
    1. Oppløs ARN14686 i kjøretøy (15% PEG og 15% Tween saltoppløsning). Beregn løsningskonsentrasjon i henhold til vekt rotte (dose 3 mg / kg, injeksjonsvolum 5 ml / kg).
    2. Fortsett med iv injeksjoner i tre naive og tre CFA-behandlede rotter. Plasser hver rotte i en passende plastholdenhet enhet. Deretter plasserer rotte hale i varmt vann i 2-4 minutter for å tillate vasodilatasjon, og injiserer det sammensatte iv via halevenen.
    3. Sprøyt tre rotter (naive og CFA-behandlet) iv med bilen bare.
  2. Paw Collection og Dissection
    1. Ofre rotter ved CO 2 innånding fire timer etter sonde eller kjøretøy administrasjon og samle sine poter ved å kutte dem 0,5 cm over kneleddet ved hjelp av en skalpell.
    2. Fjern forsiktig huden ved sakse-assistert disseksjon og dissekere ut bløtvev ved å skrape dem fra benet. Kast bein og samle de myke vev av potene. Snap fryse prøver i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C.
  3. Paw Homogenisering og lysosomale Protein Forberedelse
    MERK: Unngå å bruke vaskemidler og aminholdige buffere, som de kan hemme CC reaksjon.
    1. Kombiner pote vev fra 3 rotter (oppnådd som beskrevet i avsnitt 3.2.1) og homogenisere dem i 4 ml 320 mM sukrose i fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4) og en protease inhibitor cocktail (se Materiale / reagens Table); bruker en høy-ytelse spredning instrument (se Materiale / Reagens tabell).
    2. Sentrifuger vev homogenat i 20 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C; lagre supernatanten.
    3. Tilsett 2 ml 320 mM sukrose i PBS, og protease-inhibitor cocktail til vevet og pelletenhomogenisere en gang til.
    4. -Sentrifuge i 20 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C, og legge til supernatanten til en fra trinn 3.3.2.
    5. Sentrifuger de oppsamlede supernatantene i 30 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C.
    6. Vei pelleten og resuspender i to volumer av PBS (dvs. 200 ul for hver 100 mg pellet). Overfør til et 1,5 ml rør og fryse samling ved -80 ° C i 1 time.
    7. Tine prøvene og fryse på nytt i 1 time ved -80 ° C.
    8. Gjenta frysing / tining syklus to ganger til.
      MERK: Dette trinnet er ment å solubilisere proteinet. Fryse over natten om nødvendig.
    9. Sentrifuger i 1 time ved 100.000 xg ved 4 ° C. Samle supernatanten, som inneholder oppløselige lysosomale proteiner, og forkaste pellet. Oppbevar ved -80 ° C eller umiddelbart fortsette med protein kvantifisering.
    10. Kvantifisere proteininnhold ved hjelp av en BCA proteinanalyse 30 kommersielle kit (se Materiale / Reagens Table
    11. Oppbevar prøvene ved -80 ° C inntil bruk.
  4. CC med Azid-PEG3-Biotin
    MERK: Protokollen fra CC og streptavidin perle berikelse (trinn 3.4 til 3.6) er litt endret fra protokollen utgitt av Speers og Cravatt 31.
    1. Forbered 500 pl (1 mg / mL, i PBS) av lysosomale proteiner fra sonde og vehikkelbehandlede rotter (naive og CFA-behandlede rotter).
    2. Preclearen prøver med 40 ul av en 50% suspensjon av streptavidin-agarose (vask tre ganger med 1 ml PBS før bruk) i 1 time ved 4 ° C. Sentrifuger i 4 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C og ta supernatanten.
    3. Legg 11.3 mL av en 5 mM lager av Azid-PEG3-Biotin og vortex.
    4. Legg 11.3 mL av en 50 mM lager av nylaget TCEP og virvle.
    5. Premix 34 ul av en ferskt fremstilt arbeidsoppløsning av 1,7 mM TBTA med 11,3 ul av en 50 mM CuSO4 2 O lager.
    6. Legg 45,3 ml av en ferdigblandet TBTA / CuSO4 · 5H 2 O-løsning og virvle.
    7. Inkuber reaksjonsblandingen ved 25 ° C i 2 timer (en lengre inkubasjonstid ikke påvirker reaksjonen). Observer protein nedbør på dette trinnet. Bland etter den første timen av inkubasjon.
  5. Fjerning av overflødig CC reagenser
    1. Sentrifugere prøven 4 minutter ved 6500 xg ved 4 ° C og fjern supernatanten.
    2. Legg 750 ul kald metanol og resuspender ved sonikering (5 sek med en sonde-sonikator).
    3. Sentrifuger prøvene i 4 minutter ved 6500 xg ved 4 ° C og fjern supernatanten ved hjelp av en sprøyte og nål.
    4. Gjenta trinn 3.5.2 to ganger (ultralydbehandling er ikke nødvendig).
    5. Etter den siste vaskingen, tilsett 325 ul av natriumdodecylsulfat (SDS) 2,5% i PBS til protein pellet og sonikere 3x i 5 sek.
    6. Varme opp prøvene i 5 min ved 65 ° C og en sonikeregevinst.
    7. Sentrifuger i 5 min ved 6500 x g ved romtemperatur, og lagre den overliggende væske.
    8. Legg 1,4 ml PBS for å fortynne SDS-konsentrasjon til 0,5%. Oppbevares ved -20 ° C eller fortsette med streptavidin berikelse.
  6. streptavidin Enrichment
    1. Med PBS, bringe volumet av prøvene oppnådd i trinn 3.5.8 til 4,2 ml. Legg 40 ul av en 50% suspensjon av streptavidin-agarose ved hjelp av en cut-endetupp (vask tre ganger med 1 ml PBS før bruk).
    2. Inkuber i 2 timer ved RT med rotasjon og sentrifuger deretter i 2 minutter ved 1400 x g.
    3. Fjern supernatanten uten å tørke perlene pelletere og utnytte rest supernatant til å overføre perlene til en 1 ml spinnkolonne (se Materiale / Reagens tabell).
    4. Vask av tyngdekraften med 3 x 1 ml av 1% SDS (i PBS), 3x 1 ml av 6 M urea (i PBS), og 4 x 1 ml PBS.
    5. Bruk 2x 500 ul PBS for å overføre perlene til et 1,5 ml rør og sentrifuge i 2 minutter ved 1400 xg ved romtemperatur. Forsiktig aspirer supernatanten med en sprøyte og nål.
    6. Eluere harpiksbundne proteinene ved tilsetning av 25 ul elueringsbuffer (6 M urea, 2 M tiourea, 2% SDS, og 6 mM biotin, alle i PBS) i 15 min ved RT, etterfulgt av 15 minutter ved 95 ° C 32.
  7. protein blot
    1. Tilsett 5 ul av 6 x Laemmli-buffer (i 9 ml: 0,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 5 ml 20% SDS, 5 mg bromfenol blå, 3 ml glyserol, og H 2 O opp til 9 ml) og tilsett 5% β-merkaptoetanol umiddelbart før bruk. I korthet Sentrifuger prøvene ved 2000 x g for å pelletere harpiksen og last 25 ul av den oppnådde supernatant til en 4-12% polyakrylamidgel.
    2. Utfør gel elektroforese og protein overføring på en blotting membran i henhold til produsentens instruksjoner 33.
    3. Mett blotting-membran i 1 time med 10 ml av en blokkerende buffer (se Materiale / Reagens Tabell) inneholdende 0,1% Tween-20.Unngå å bruke melk, da det kan øke bakgrunnen.
    4. Vask membran med 10 ml 0,05% Tween-20 i PBS og tilsett 10 ul av fluorescerende streptavidin (se Materiale / Reagens tabell) ble oppløst i 10 ml blokkeringsbuffer pluss 0,1% Tween-20 i 1 time ved RT.
    5. Vask 4 ganger med 0,05% Tween-20 i PBS og en gang med PBS alene (10 min hver).
    6. Bruk et bilde scanner (se Materiale / Reagens tabell). Slå på instrumentet og den tilkoblede datamaskinen. Vent til den er klar.
    7. Start oppkjøpet programmet og velg fluorescens-modus. Velg membranområdet og velge målmappen for lagrede filer.
    8. Angi følgende oppkjøp parametre: 680 nm eksitasjon lengde, BPFR700 filter, 1000 V fotomultiplikatorrør (PMT) verdi (kanal 2), og 25 mikrometer pikselstørrelse. Hente bildet.

4. Lokalisering av katalytisk aktive naaa i Mouse Lunger av fluorescens Microskopiere

MERK: Bruk male 8-10 uker gamle mus og utføre alle prosedyrer i samsvar med retningslinjene for etisk bruk av dyr. Hus mus i ventilerte bur på en 12 timers lys / mørke syklus og gi dem fri tilgang til mat og vann.

  1. Intravenøs administrasjon av ARN14686 i Mus
    1. Oppløs ARN14686 i kjøretøyet: 15% PEG og 15% Tween-20 saltoppløsning. Beregn løsningskonsentrasjon i henhold til vekt mus (dose 3 mg / kg, injeksjonsvolum 5 ml / kg).
    2. Fortsett med iv injeksjon av 3 mus. Plasser hver mus i en passende plastholdenhet enhet. Deretter plasserer du musehale i varmt vann i 2-4 min for å tillate vasodilatasjon og injiserer det sammensatte iv via halevenen.
    3. Sprøyt tre mus iv med bilen bare.
  2. Lung Collection og Slice Forberedelse
    Advarsel: Håndter paraformaldehyde med omsorg i et avtrekksskap, og bruk hansker!
    1. Anesthetize mus med Chloral hydrat (400 mg / kg). Bekreft anestesi med en tå klype. Utfør en transcardial perfusjon som følger:
      1. Overfladisk kutte ventrale huden med saks og utsett thorax og bukhinnen og overflater.
      2. Overfladisk kutte bukhinnen med saks, like nedenfor xyphoid prosessen, og utsette membranen og visceral organer. Vær forsiktig så du ikke lage rift noen betydelig blodkar.
      3. Åpne brysthulen ved å skjære membranen fra en lateral del til den andre.
      4. Sett 25 G nål som er koblet til den automatiske sprøytepumpen og tilfører 20 ml 0,9% saltoppløsning, fulgt av 60 ml 4% PFA i fosfatbuffer (0,1 M, pH 7,4).
    2. Når perfusjon er fullført, trekker hjertet ved hjelp av pinsett og nøye dissekere den ut. Ta tak i luftrøret med pinsett og skjære helt gjennom den ved hjelp av saks. Trekk forsiktig luftrøret oppover og ta lungene fra brystkassen. Dissekere vevseparere den høyre lunge fra venstre.
    3. Postfix vevet i paraformaldehyd 4% i 1 time, fryse prøvene i kald 2-metylbutan, og lagre dem ved -80 ° C.
    4. Samle 40 mikrometer seksjoner ved hjelp av en cryostat, montere dem umiddelbart på lysbilder (en hver femte), og behandle dem for immunhistokjemi som beskrevet nedenfor.
  3. Tissue Slices Permeabilization og Blokking
    1. Vask med PBS (2x i 5 min) og permeabilize med 0,1% Triton X-100 PBS i 15 min ved RT.
    2. Vask med PBS (2x i 5 min) og blokker med 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 30 minutter ved romtemperatur.
    3. Vask med PBS (2x i 5 min) og fortsett med CC.
  4. CC med Azid-PEG3-Fluor 545 på vevssnitt
    1. Forbered en løsning ved å blande CC reagenser fremstilt som beskrevet i kapittel 2. For 1 ml oppløsning, tilsett: 2 ul Azid-PEG3-Fluor 545 (5 mM lager), 20 ul TCEP (nylaget 50 mM stock), 58,8 mL av TBTA (nylaget 1,7 mm Arbeids løsning), 20 ul CuSO4 · 5H 2 O (50 mM lager), og 900 mL PBS.
    2. Legg rundt 400 mL av CC mix til vevssnitt, som ble utarbeidet i henhold til punkt 4.2. Vær oppmerksom på at det valgte volumet av CC blanding er tilstrekkelig til å dekke skiver. Inkuber i 1 time ved romtemperatur beskyttet mot lys.
    3. Vask med PBS (1 x 5 min), kald metanol (1 x 5 min), ble en oppløsning av 1% Tween-20 og 0,5 mM EDTA i PBS (3x i 2 minutter), og PBS (1 x 5 min).
    4. Air tørr, tilsett en dråpe antifade mountant med DAPI (se Materiale / Reagens tabell), tett med dekkglass (unngå bobledannelse), og forsegle med polish. Oppbevar ved 4 ° C inntil analyse.
  5. image Acquisition
    1. Bruk en konfokalmikroskop utstyrt med 546 nm og 450 nm eksitasjon lasere (se Materiale / Reagens tabell) etterbrukerhåndboken.
    2. Velg et 60x objektiv med NA = 1,40, og pass på å forhåndsvise skyv gjennom okularene og å fokusere på et område av interesse.
    3. Bestem oppkjøpet parametere i henhold til prøve- og utstyr funksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ARN14686 er designet basert på skafottet av naaa inhibitor ARN726. 4-butyl-cykloheksyl gruppe av ARN726 ble erstattet med en C9 mettet alifatisk kjede som bærer et terminalt alkyn tag (figur 1). Alkynet koden ble innført for å tillate bruk av en to-trinns merking fremgangsmåte for å legge til en fluorofor eller et biotin-molekyl via CC. Denne funksjonen gjør ARN14686 et meget allsidig verktøy for å sondere naaa in vitro og in vivo.

Her viser vi to anvendelser av ARN14686, som er representative for potensialet i dette molekylet. Figur 2 er en ordning av den eksperimentelle prosedyren rapportert her. Etter intravenøs administrering av sonden, kan to forskjellige deteksjonsmetoder benyttes: i) analyse av aktiv naaa ekspresjon av protein blot og ii) analyse av aktiv naaa ekspresjon og lokalisasjon i celler etter fluorescence mikroskopi.

Den første representativt resultat ble nylig publisert av vår gruppe 29. Vi analyserte naaa uttrykk i en rottemodell av CFA-indusert labben betennelse. Sonden (3 mg / kg) eller vehikkel ble injisert IV i naive og CFA-behandlede rotter. Rottene ble avlivet 4 timer senere. CC ble utført på anriket lysosomale ekstrakter for å innføre en biotin-tag på sonde-merkede proteiner. Biotinylerte proteiner var neste beriket hjelp streptavidin perler. De eluerte proteiner ble analysert ved hjelp av protein blot som viser at nivået av aktiv naaa ble markert økt i potene hos rotter behandlet med CFA i forhold til de av kontrollrotter (figur 3). Fordelen med protein-blot-analyse er at den muliggjør en detaljert undersøkelse av sonde-reaktive proteom-, som er adskilt ved gel-elektroforese. Denne tilnærmingen gir også mulighet for avduking av potensielle probe off-mål. En no-sonde kontroll må være almåter inkludert for å utelukke endogene biotinylerte proteiner, som utgjør den eksperimentelle bakgrunn. Pilspissen i figur 3 indikerer slike bakgrunns proteiner, som i sin tur kan anvendes som en laste referanse kontroll.

I et annet upublisert eksperiment (figur 4), brukte vi ARN14686 å sondere naaa for ex vivo deteksjon av fluorescens mikroskopi. Vi administrert ARN14686 til mus på 3 mg / kg (iv) og avlivet dem 2 timer etter behandling av transcardial perfusjon. Lungene ble oppsamlet, postfiks, og fryst i kald 2-metylbutane. CC reaksjon for fluorophore tillegg ble utført direkte på vevssnitt av 40 mikrometer tykkelse, samlet med en cryostat. Analyse ved fluorescens mikroskopi viste tilstedeværelse av katalytisk aktive naaa i diffust vesikulær struktur som hører til alveolare makrofager. Sammenlignet med anvendelse av en protein-spesifikt antistoff, vil bare enctive enzymet er observert.

Figur 1

Fig. 1: ARN14686 syntesereaksjonsskjema undec-10-yn-2-ol ble aktivert ved dipyridylcarbonate (DPC) i nærvær av katalytiske 4-dimetylaminopyridin (DMAP) for å fremstille et blandet karbonat. Dette karbonat ble deretter reagert med amino laktam å oppnå målet molekylet ARN14686. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Arbeidsflyt ordningen av den generelle strategien vist i dette arbeidet Sonden blir injisert i dyr (rotter eller mus) og målrette uttrykk analyseres følgende to forskjellige eksperimentelle prosedyrens: i) merket proteom- utvinnes og biotin er lagt til av CC. Etter en berikelse fase av biotinylerte proteiner på streptavidin perler, er probe mål analysert av protein blot. ii) vevssnitt er forberedt og en fluorofor er lagt til av CC. Probe target lokalisering analyseres ved florescence mikroskopi. Dette tallet har blitt tilpasset fra Bonezzi et al. 29 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Fig. 3: Analyse av naaa aktivering i poter av CFA-behandlede rotter Protein blot analyse av streptavidin-anrikede proteiner fra naive rotter (banene 1 og 2) eller CFA-injiserte rotter 7 dager etter injeksjon (banene 3 og 4). Rotter fikk iv injeksjoner av bærer eller ARN14686 (3 mg / kg). Den blotting membranble probet med en fluoriserende streptavidin. Pilen indikerer naaa bandet; pilspissen indikerer en biotin-inneholdende bånd på rundt 90 kDa, hvilket viser at en tilsvarende mengde protein ble applisert i hver kolonne. Dette tallet har blitt forandret fra Bonezzi et al. 29 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Ex vivo påvisning av probe-merket naaa i muse lungene ved fluorescens mikros Representative bilder av lunge deler av kjøretøy- (A) eller ARN14686-injisert (B) mus etter CC med azid-PEG3-Fluor 545 er rapportert.. Et positivt signal (røde blodceller) ble detektert i ARN14686-injiserte mus, mens ikke noe signal ble detektert i vehicle administrert mus. En detalj av et azid-PEG3-Fluor 545 positiv alveolære makrofagen er vist i C ved høyere forstørrelse. Kjerner ble merket med DAPI (blå). Scale bar = 50 mikrometer i A og 10 mikrometer i C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enzymaktivitet er fint regulert på forskjellige nivåer, inkludert RNA-transkripsjon, proteinsyntese, proteintranslokasjon, post-translasjonell modifikasjon, og protein-protein-interaksjon. Ofte enzymet uttrykk alene ikke høyde for sin aktivitet. ABPP ble utviklet for å studere aktiviteten av proteiner i sin opprinnelige tilstand. To funksjonene er nødvendig: en kjemisk sonde som kovalent binder seg til det aktive sete av et enzym av interesse, og en reporter-tag for å detektere sonde-merket enzym.

Probe design og syntese er kritiske punkter i fremgangsmåten. Sonden skal ha tilstrekkelig affinitet og selektivitet for dets mål. Videre må nærværet av et reporter-tag ikke påvirke målrette inngrep. Dette problemet er i stor grad overvinnes ved utformingen av en to-trinns ABP, karakterisert ved at rapportør koden blir innført etter at målet er blitt fanget. Tag-fri prober er spesielt egnet for in vivo-studier, hvor proteinaktivitetkan evalueres i en levende celle eller organisme, med minimal ekstern endring. Den naaa probe ARN14686 er designet for å oppfylle kravene som er skissert ovenfor. Den β-laktam-reaktive stridshode ble valgt basert på tidligere resultater oppnådd med den β-laktam klasse av naaa inhibitorer 16,26. Disse forbindelser inhiberer naaa i en potent og selektiv måte ved kovalent binding til den katalytiske cystein av enzymet. Videre ble forbindelsene vist å være systemisk aktive 16. Vi innførte en C9 mettet alifatisk kjede, tar hensyn til økt affinitet naaa for lange alifatiske kjeder. En terminal alkyn ble tilsatt for å gi rom for to-trinns merking.

Et annet kritisk punkt er valg av dose og tiden for in vivo administrasjon. Dette avhenger av stabiliteten av sonden i plasma, dens target affinitet, og dens selektivitet. Riktig dose må velges for å tillate målinnfanging samtidig unngå engasjement av possible off-mål. Vi har funnet at 3 mg / kg iv ARN14686 var optimalt å fange naaa selektivt. Høyere doser resulterte i fangst av homolog cystein amidase, syre ceramidase. Med hensyn til behandling lengde, ved analyse vel-perfuserte organer som lunger, kan en kort tid (2 timer) være tilstrekkelig til å tillate sonden å reagere med målet. For poter, men ble vi nødt til å doble reaksjonstiden.

Et mulig problem i target-analyse av protein blot er på grunn av tilstedeværelsen av naturlig biotinylert proteiner. Disse vil uunngåelig bli identifisert sammen med spesifikke probe-mål. Vi fant at innføring av et preclearing takt med streptavidin perler før du utfører CC betydelig økt kvalitet på våre resultater. På den annen side kan tilstedeværelsen av opprinnelige biotinylerte proteiner brukes til å kontrollere for mulige lasting av gjenstander. Til slutt, med hensyn til lokalisering studier av fluorescens mikroskopi, er det svært viktig å være klar over pkappe selektivitet fordi, i motsetning til protein blotter, betyr fluorescens mikros ikke tillate forskjellsbehandling av målet fra off-mål. Foreløpige selektivitet studier bør utføres for å vurdere gjennomførbarhet og å sette opp optimale forsøksbetingelser.

Begrensninger av den beskrevne teknikk hovedsakelig angår nødvendigheten av å unngå eksperimentelle forhold som kan påvirke CC reaksjon, som for eksempel bruk av vaskemidler og amin-inneholdende buffere. Disse aspektene må tas på kontoen når du forbereder en cellelysat eller en vevhomogenatet. Dessuten, når en streptavidin anrikning fase er nødvendig, av mengden av utgangsmateriale som utgjør et annet problem, fordi denne fremgangsmåten er bare anvendelig når proteininnholdet ikke er mindre enn 250 ug. Denne grensen er satt på grunn av tekniske problemer, som arbeider volum, gjenvinning av protein, etter CC-induserte utfelling, og mengden av streptavidin harpiks som skal anvendes.

Previously, kan naaa aktiviteten bare evalueres ved å utføre aktivitetsanalyser, som krever bruk av en aktiveringsbuffer for in vitro-aktivering av enzym og substrat for solubilisering 14. Denne tilnærmingen gir informasjon om total naaa uttrykk, ikke om tilstedeværelse av aktive naaa. En annen mulighet er å måle vevsnivåer av PEA og OEA, men denne fremgangsmåte utgjør bare en indirekte måte å evaluere naaa aktivitet 34,35. I tillegg kan FAE nivåene påvirkes av andre faktorer som biosyntese. Den kjemiske sonde ARN14686 er den første ABP for naaa. Protokollen er beskrevet her illustrerer en enkel prosedyre for å fange og å visualisere den aktive formen av naaa, både in vitro og in vivo. Alle prøve manipulasjoner er etter at sonde-mål reaksjoner, og dermed gi pålitelig informasjon om in vivo tilstand av enzymet. Videre, bruk av ARN14686 i fluorescens mikros representerer et unikt verktøy to lokalisere aktiv naaa. Tilgjengelige antistoffer, som anerkjenner naaa katalytiske subenheten, ikke diskriminerer mellom naaa helaftens proenzym og aktivt enzym.

Med start fra den protokollen beskrevet her, kan naaa ekspresjon og aktivering bli analysert i forskjellige cellelinjer og dyremodeller av inflammasjon. Co-lokaliseringsstudier kan utføres for å bedre karakter rolle naaa i fysiologiske og patologiske tilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole  Sigma Aldrich 367818 Harmful
2-dipyridylcarbonate Fluorochem 11331 Harmful
2-Methylbutan Sigma Aldrich M32631 Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine Sigma Aldrich 107700 Toxic
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 Flammable, Corrosive
Acetonitrile  Sigma Aldrich 34998 Flammable, Toxic
Activated charcoal Sigma Aldrich 161551
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 Harmful
Azide-PEG3-Biotin Jena Biosciences CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545 Jena Biosciences CLK-AZ109
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227
Bio-spin columns Biorad 732-6204
Biotin Sigma Aldrich B4501
Blocking buffer Li-Cor Biosciences 927-40000
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA) Sigma Aldrich A7030
Bromophenol blue Sigma Aldrich B0126
Bruker Avance III 400 Bruker
Celite Sigma Aldrich 419931 Health hazard
Ceric ammonium nitrate  Sigma Aldrich 22249 Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate Sigma Aldrich C8383 Higly toxic
CuSO4.5H2O  Sigma Aldrich 209198 Toxic
Cyclohexadiene Sigma Aldrich 125415 Flammable, Health hazard
Cyclohexane Sigma Aldrich 34855 Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane Sigma Aldrich 34856 Harmful, Health hazard
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Acros Organics 348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) Sigma Aldrich 175943
Ethanol Sigma Aldrich 2860 Flammable, Harmful
Ethyl acetate Sigma Aldrich 34858 Flammable, Harmful
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Irdye 680-LT Streptavidin Li-Cor Biosciences 925-68031
IRDye680-LT Streptavidin  Licor 925-68031 Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol Sigma Aldrich 34966 Highly toxic
Methanol Sigma Aldrich 34860 Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E7750 Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806 Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide Sigma Aldrich 227056 Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine Fluorochem M03053 Harmful
Nikon A1 confocal microscopy Nikon Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0335BOX
Palladium on carbon Sigma Aldrich 330108
p-anisidine Sigma Aldrich A88255 Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde sigma Aldrich 441244 Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)  Sigma Aldrich P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI  Thermo Fisher Scientific P36931 Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich P8340
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)  Sigma Aldrich L3771 Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride  Sigma Aldrich 452912 Flammable
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313
Starion FLA-9000 immage scanner FUJIFILM Read  the user manual
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20349
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Tert-butanol Sigma Aldrich 360538 Toxic, flammable
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 186562 Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea Acros Organics 424542500 Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris Sigma Aldrich RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Sigma Aldrich C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
Triton-x100 Sigma Aldrich X100 Toxic
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Tween-80 Sigma Aldrich P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer IKA
Undec-10-yn-1-ol Fluorochem 13739 Harmful
Urea Sigma Aldrich U5378 Toxic, warm at 50 °C to dissolve

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Tags

Biokjemi aktivitetsbasert protein profilering aktivitetsbaserte sonde klikk kjemi, betennelser fluorescens mikroskopi,
forberedelse og<em&gt; I Vivo</em&gt; Bruk av en aktivitetsbasert Probe for<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S.,… More

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S., Bonezzi, F., Migliore, M., Di Martino, S., Summa, M., Piomelli, D. Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase. J. Vis. Exp. (117), e54652, doi:10.3791/54652 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter