Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

إعداد و Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

Summary

هنا، نحن تصف إعداد واستخدام مسبار على أساس النشاط (ARN14686، undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية) التي تسمح للكشف والقياس الكمي ل الشكل النشط من الانزيم proinflammatory N أميداز حمض -acylethanolamine (ناا)، سواء في المختبر والمجراة سابقا.

Abstract

على أساس النشاط التنميط البروتين (ABPP) هو وسيلة للتعرف على انزيم من الفائدة في بروتيوم معقدة من خلال استخدام مسبار الكيميائية التي تستهدف مواقع الإنزيم النشط. علامة مراسل أدخلت على التحقيق تسمح للكشف عن الإنزيم المسمى عن طريق المسح الضوئي في جل مضان، وصمة عار البروتين، المجهري مضان، أو السائل الطيف اللوني الشامل. هنا، نحن تصف إعداد واستخدام ARN14686 المجمع، تحقيقا على أساس النشاط بنقرة والكيمياء (CC-برنامج الجسر الأكاديمي) أن تعترف بشكل انتقائي الانزيم N أميداز حمض -acylethanolamine (ناا). ناا هو هيدرولاز السيستين الذي يعزز الالتهاب عن طريق إلغاء تنشيط مستقبلات الذاتية تنشيط ناشر-بيروكسية (PPAR) منبهات -alpha مثل palmitoylethanolamide (PEA) وoleoylethanolamide (أويا). ويتم تصنيع ناا باعتبارها proenzyme كامل طول الخاملة، التي يتم تفعيلها من خلال تحلل بروتيني ذاتي في درجة الحموضة الحامضية لليحلول. دراسات الترجمة حافي أظهرت أن ناا وأعرب في الغالب في الضامة وغيرها من الخلايا المشتقة الوحيدات، وكذلك في B-الخلايا الليمفاوية. نحن نقدم أمثلة على الكيفية التي يمكن أن تستخدم ARN14686 لكشف وتحديد نشط ناا فيفو السابقين في أنسجة القوارض لطخة البروتين والفحص المجهري مضان.

Introduction

يشيع استخدامها أساليب للتحقيق في أنماط التعبير، والتفاعلات، وظائف البروتينات، بما في ذلك منصات الطيف اللوني الشامل السائل لتحليل طلقات نارية 1،2، الخميرة أساليب اثنين هجينة 3،4، وفي فحوصات المختبر، تقتصر في أن تكون غير قادر على تقييم نشاط البروتينات في حالتها الأصلية. على أساس النشاط بروتين التنميط (ABPP) يمكن استخدامها لملء هذه الفجوة. في هذا النهج، جزيء صغير يسبر قادرة على ملزمة تساهميا إلى موقع نشط من انزيم من الفائدة مترافق إلى مجموعة المراسل أن يسمح للكشف عن الهدف. عن طريق النقر الكيمياء (CC)، لمراسل ويمكن دمجها في التحقيق أو يمكن إدخال بعد الاشتباك الهدف حدث 5،6. يتطلب الإجراء الأخير استخدام المجسات التي تحتوي على مجموعات كيميائية مناسبة، مثل آلكاين محطة أو أزيد، والتي يمكن تعديلها مع عدد من الكواشف مراسل عبر التفاعلات الحيوية متعامد يمثح باسم النحاس (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 أو شتاودينغر ربط 10،11.

في الآونة الأخيرة، ونحن الكشف عن ARN14686 مركب مثل برنامج الجسر الأكاديمي الأول للفي التجارب المختبرية وكشف الجسم الحي من هيدرولاز السيستين، ناا 12. ناا يحفز التعطيل حلمهي من القوات المسلحة المشبعة وغير المشبعة الاحادية، بما في ذلك oleoylethanolamide (أويا) وpalmitoylethanolamide (PEA)، والتي هي محفزات الذاتية للالمضادة للالتهابات مستقبل نووي PPAR ألفا 13-15. وأعرب عن ناا في الغالب في الضامة وغيرها من الخلايا المشتقة الوحيدات، وكذلك في B-الخلايا الليمفاوية 14،16، مما يشير إلى دور في تنظيم الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تصنيعه الانزيم في الشبكة الإندوبلازمية الخام في شكل غير نشط ويتم تنشيط في مقصورات الحمضية من الخلية بواسطة آلية autoproteolytic 17. الانقسام autoproteolytic يولد N السيستين -terminal الجديدة (C131 في الفئران والجرذان، C126 في البشر)، وهذا هو المسؤول النيوكليوفيل لFAE التحلل 18،19. تثبيط الدوائية النشاط ناا يغير FAE التوازن التوليف / تدهور لصالح زيادة مستويات الخلايا من القوات المسلحة 16،20،21. وقد ثبت عدة β-اكتون وβ لاكتام المشتقات لكبح النشاط ناا مع قوة عالية والانتقائية 16،22-26. هذه المثبطات تعمل من خلال S -acylation من السيستين الحفازة 16،27،28.

تم تصميم ARN14686 مركب على أساس التركيب الكيميائي للالنشطة للنظام، المستمدة سيرين β لاكتام ناا المانع، ARN726 (4 cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية) 16. تم استبدال مجموعة 4-بوتيل cyclohexyl من ARN726 مع سلسلة الأليفاتية المشبعة C9 تحمل علامة آلكاين محطة لتصريف CC لاحق مع علامة مراسل أزيد الحمل. لقد اخترنا لتصميم برنامج الجسر الأكاديمي من خطوتين لminimallذ تغيير هيكل السقالة الأصلية، وبالتالي الحفاظ على تقارب لجنة التحقيق لناا. وعلاوة على ذلك، وتجنب إدخال علامات ضخمة، يمكن لمثل هذا التحقيق أن يكون أكثر مناسبة لتلقي العلاج في الجسم الحي من برنامج الجسر الأكاديمي المباشر. ARN14686 يمنع ناا مع قوة عالية (hNAAA IC 50 = 6 نيوتن متر، rNAAA IC 50 = 13 نانومتر) من خلال تشكيل ناتج إضافة التساهمية مع السيستين الحفاز للانزيم 12. وأظهرت التجارب على الفئران الحية أن التحقيق هو انتقائية في التقاط أعرب ناا في الرئتين. وقد تم تحديد حمض سيراميداز، أميداز السيستين آخر يتقاسم الهوية 33-34٪ مع ناا، أيضا كهدف تقارب منخفضة عند استخدام تركيزات عالية من التحقيق (10 ميكرومتر في المختبر، 10 ملغ / مل في الوريد، والرابع) 12. وقد استخدمنا أيضا ARN14686 لدراسة وجود ناا فعال في أنسجة الفئران الملتهبة التالية إدارة مساعد الكامل فرويند (CFA) 29.

هنا، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول لpreparatiعلى من ARN14686 (الشكل 1) وتطبيقه على التحقيق في تفعيل ناا خارج الحي. وكمثال على ذلك، نحن تصف الإجراء التجريبي لتصور ناا في الكفوف الفئران بعد تناوله CFA. في هذه التجربة، يتم استخراج البروتينات من الأنسجة مخلب بعد حقن الرابع لجنة التحقيق، ويتعرض بروتيوم المسمى برنامج الجسر الأكاديمي إلى CC مع البيوتين أزيد. يتم إثراء عينات المعقدة البيروكسيديز باستخدام الخرز streptavidin، ويتم تنفيذ البقع البروتين. في تطبيق آخر، وصفنا توطين ناا نشط بواسطة المجهر مضان في الرئتين الماوس من الفئران المعالجة التحقيق. في هذه الحالة، يتم مقطوع الأنسجة ويتعرضون أقسام إلى CC لإضافة رودامين. ويتضح مخطط سير العمل في الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تحذير: يجب أن يتولى جميع التفاعلات الكيميائية في غطاء الدخان التهوية ومع استخدام معطف المختبر، والقفازات، ونظارات واقية. وينبغي أن يتم ردود الفعل أيضا في بيئة النيتروجين.

بيان الأخلاقي: اجراءاتنا التي تنطوي على الحيوانات تتم وفقا للوائح الإيطالية على حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية وأخرى علمية (DM 116192)، وأنظمة الجماعة الاقتصادية الأوروبية (الجريدة الرسمية للEC L 358/1 1986/12/18 ).

ملاحظة: توليف [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] يوصف خلات الأمونيوم للعوائد على نطاق واسع (50 غ ن -Cbz-L-سيرين)، ولكن يمكن زيادتها بسهولة إلى أسفل.

1. توليف

ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لنظام رد فعل التوليف.

  1. إعداد 2-بيرويل كربونات Undec-10-ynyl وUndec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-الكربوكسيل
    1. في 50 مل قارورة جولة القاع، حل 350 ملغ من undec-10-YN-1-أول في 3.5 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف.
    2. إلى الحل في 1.1.1، إضافة 25 ملغ من 4 dimethylaminopyridine (DMAP) و 530 ملغ من 2 dipyridylcarbonate (DPC). يحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 16 ساعة.
    3. إضافة 20 مل من ثنائي كلورو ميثان.
    4. نقل الخليط في قمع فصل. إضافة 15 مل من الماء، التخلص منه، والسماح للمرحلتين لفصل.
    5. فتح محبس، وجمع المرحلة العضوية (أسفل)، ثم قم بإغلاق محبس. إضافة 15 مل من المشبعة NaHCO 3 الحل. يهز قمع الفصل والسماح للمرحلتين منفصلتين. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
    6. تجفيف الطبقة العضوية مع نا 2 SO 4، من خلال تصفية القطن في قارورة ذهابا والقاع (الفارغة الأولى)، وتتبخر إلى جفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
    7. وزن القارورة والحصول على 600 ملغ من النفط الذي هو خليط من 2 بيرويل كربونات undec-10-ynyl وundec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-الكربوكسيل في نسبة 1.7: 1.
      1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) عنصرا رئيسيا δ = 8.39 (اليوم، J = 5.0، 2.0، 1H)، 7.98 (الدفتيريا، J = 7.9، 2.0، 1H)، 7.40 (د د د، J = 7.2، 4.9، 0.9، 1H)، 7.30 (د، ي = 8.2، 1H)، 4.22 (ر، ي = 6.6، 2H)، 2.73 (ر، ي = 2.4، 1H)، 2،18-2،11 (م، 2H)، 1.76 - 1.62 (م، 2H)، 1،50-1،23 (م، 12H).
      1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) عنصرا ضئيلا δ = 7.74 (اليوم، J = 7.2، 1.9، 1H)، 7.47 (اليوم، J = 6.7، 2.3، 1H)، 6.44 (د، ي = 9.4، 1H)، 6،30-6،25 (م، 1H)، 4.35 (ر، ي = 6.5، 2H)، 2.72 (ر، ي = 2.4، 1H)، 2،18-2،11 (م، 2H)، 1،77-1،60 (م، 2H )، 1،52-1،20 (م، 12H).
    8. استخدام النفط دون أي فصل آخر أو تنقية.
  2. إعداد [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] الأمونيوم خلات
    1. إعداد البنزيل N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4 methoxyphenyl) الأمينية] -2-oxoethYL] الكرباماتية.
      1. وفي 4-L قارورة جولة القاع، ويحل 141.5 غرام من ص -anisidine في 1.5 لتر من رباعي هيدرو الفوران و 0.5 لتر من ثنائي كلورو ميثان.
      2. تبريد حل ل0 درجة مئوية في حمام الثلج.
      3. إضافة 50.0 غرام من N -Cbz-L-سيرين و43،9 غرام من N - (3-dimethylaminopropyl) - N 'هيدروكلوريد -ethylcarbodiimide.
      4. يحرك الخليط مع شريط مغناطيسي في 0 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      5. إزالة الحل من حمام كريم واثارة مع شريط مغناطيسي على RT لمدة 16 ساعة.
      6. تتبخر المذيبات تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
      7. إضافة 400 مل من 1: 1 الهكسان الحلقي / خلات الإيثيل، وإثارة مع ملعقة، وصب.
      8. كرر الخطوة 1.2.1.7 مرتين أخريين.
      9. حل بقايا غائر في 500 مل من خلات الإيثيل، ويغسل مع 400 مل من 0.1 حل M حمض الهيدروكلوريك (10 مرات)، مع 400 مل من المشبعة NaHCO 3 حل (2 مرات)، ومع 400 مل من محلول ملحي.
      10. تجفيف الطبقة العضوية معنا 2 SO 4، تصفية حل من خلال القطن في قارورة ذهابا والقاع (الفارغة الأولى)، وتتبخر إلى جفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
      11. وزن القارورة والحصول على 61.4 غرام من مادة صلبة بيضاء.
        1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) δ = 9.86 (بكالوريوس، 1H)، 7.52 (د، 2H، J = 9.0 هرتز)، 7،42-7،25 (م، 6H)، 6،91-6،85 (م، 2H) ، 5.06 (د، 1H، J = 12.9 هرتز)، 5.02 (د، 1H، J = 12.9 هرتز)، 4.98 (ر، 1H، J = 5.6 هرتز)، 4،24-4،15 (م، 1H)، 3.72 (ق، 3H)، 3،70-3،57 (م، 2H).
    2. إعداد البنزيل N - [(S) -1- (4 methoxyphenyl) -2-أوكسو azetidin-3-YL] الكرباماتية.
      1. حل 58.6 غرام من N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4 methoxyphenyl) الأمينية] -2-أوكسو إيثيل] الكرباماتية في 1.6 لتر من N، N -dimethylformamide.
      2. تبريد حل ل0 درجة مئوية مع حمام الثلج.
      3. إضافة 50.6 غرام من 1،1'-sulfonyldiimidazole واثارة مع شريط مغناطيسي لمدة 30 دقيقة.
      4. تبريد الحلإلى -20 درجة مئوية مع / حمام كلوريد الصوديوم الجليد وإضافة 10.2 غرام من هيدريد الصوديوم (60٪ في الزيوت المعدنية) جزء من الحكمة.
      5. يحرك الخليط عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم يطفئ مع 2 مل من الميثانول و 1 لتر من الماء.
      6. فراغ تصفية الرواسب، ويغسل مع 200 مل من الماء، ويجف تحت فراغ.
      7. الحصول على 42.2 غرام من مادة صلبة بيضاء.
        1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) δ = 8.08 (د، 1H، J = 8.5 هرتز)، 7،42-7،28 (م، 5H)، 7.30 (د، 2H، J = 8.9 هرتز)، 6.95 (د ، 2H، J = 8.9 هرتز)، 5.06 (ق، 2H)، 4.86 (د د د، 1H، J = 8.5، 5.6، 2.6 هرتز)، 3.90 (ر، 1H، J = 5.6 هرتز)، 3.73 (ق، 3H) ، 3.55 (اليوم، 1H، J = 5.6، 2.6 هرتز).
    3. إعداد البنزيل N - [(S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية.
      1. تعليق 9.0 غرام من البنزيل N - [(S) -1- (4 methoxyphenyl) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية في 500 مل من الأسيتونتريل و 400 مل من الماء.
      2. تبريد حل ل0 درجة مئوية في حمام الثلج.
      3. إضافة 45.4 غرام من CERIج نترات الأمونيوم جزء من الحكمة أكثر من 45 دقيقة ويقلب مع شريط مغناطيسي في 0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      4. إضافة 500 مل من المشبعة NaHCO 3 حل بحذر، ثم قم بإضافة 500 مل من خلات الإيثيل.
      5. تصفية الراسب ويغسل مع 200 مل من خلات الإيثيل.
      6. فصل حل ثنائي الطور وغسل الطبقة المائية مع 200 مل من خلات الإيثيل (3 مرات).
      7. تجفيف الطبقة العضوية مع نا 2 SO 4، إضافة 5 غرام من الفحم المنشط، فلتر من خلال لوحة من السيليكا دياتومي، وتتبخر إلى جفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
      8. إضافة ايثر واثارة مع ملعقة.
      9. تصفية الصلبة والحصول على 4.85 غرام من مادة صلبة من البيض.
        1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) δ = 7.97 (د، 1H، J = 8.7 هرتز)، 7.94 (بكالوريوس، 1H)، 7.42- 7.30 (م، 5H)، 5.05 (ق، 2H)، 4.67 (د د د، 1H، J = 8.7، 5.4، 2.7 هرتز)، 3.40 (ر، 1H، J = 5.4 هرتز،)، 3.09 (اليوم، 1H، J = 5.4، 2.7 هرتز).
      إعداد [(S) -2-oxoazetidin-3-YL] -ammonium خلات.
      1. حل 0.93 مل من حمض الخليك في 245 مل من خلات الإيثيل. بمناسبة هذا بأنه "محاصرة حل."
      2. حل 3.28 غرام من benzyl- N - [(R) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية في 298 مل من الايثانول.
      3. إضافة 14.1 مل من cyclohexadiene و 3.27 غرام من 10٪ بلاديوم على الكربون.
      4. تحريك تعليق على RT لمدة 12 ساعة، ومن ثم تصفية من خلال لوحة قصيرة من الأرض دياتومي. صب السائل يبلغ حجمه مباشرة في حل محاصرة.
      5. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار)، والحفاظ على درجة حرارة أقل من 35 درجة مئوية.
      6. يسحن في الحصول متينة مع رباعي هيدرو الفوران والحصول على 1.72 غرام من مادة صلبة بيضاء.
        1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) δ = 7.68 (بكالوريوس، 1H)، 3.99 (د د د، 1H، J = 5.2، 2.4، 1.2 هرتز)، 3.32 (ر، 1H، J = 5.2 هرتز)، 2.79 (اليوم، 1H، J = 5.2، 2.4 هرتز)، 1.90 (ق، 3H).
  3. إعداد Undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية
    1. في 10 مل قارورة جولة القاع، ويحل 60 ملغ من [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] خلات الأمونيوم في 2 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف.
    2. تبريد حل ل0 درجة مئوية في حمام الثلج وإضافة 81 ميكرولتر من N، N -diisopropylethylamine قطرة من الحكمة.
    3. حل 350 ملغ من الخليط الخام التي تحتوي على undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-الكربوكسيل في 2 مل من ثنائي كلورو ميثان الجافة، إضافة إلى الحل، ويقلب في RT لمدة 15 ساعة. تتبخر المذيب للجفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
    4. تنقية بواسطة اللوني العمود (هلام السيليكا) باستخدام جهاز كروماتوجرافيا العمود الآلي:
      1. امتصاص العينة على هلام السيليكا، تتوازن العمود مع الهكسان الحلقي، وتحميل العينة إلى خرطوشة.
      2. أزل مع خلات الهكسان الحلقي / اثيل من 100: 0-0: 100 وجمع القمم في أنابيب الاختبار.
      3. تتبخر المذيب من الكسور المقابلة لمجمع للجفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار) والحصول على 40 ملغ من مادة صلبة بيضاء.

2. إعداد الكواشف CC

  1. إعداد 5 ملي محلول المخزون من الجزيئات تاج أزيد
    1. حل 1.5 ملغ من أزيد-PEG3 فلور 545 في 0.5 مل من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). جعل قسامات في 0.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
    2. حل 1.1 ملغ من أزيد-PEG3-البيوتين في 0.5 مل من DMSO. جعل قسامات في 0.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد 50 ملي حل الأوراق المالية من تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP)
    1. حل 14.3 ملغ من TCEP في 1 مل من الماء، وجعلها جديدة في كل مرة.
  3. إعداد 50 ملي حل من كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O
    1. في قارورة زجاجية، ويحل 120.48 ملغ من كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O في 1 مل من الماء. تخزين على RT لمدة شهر واحد.
  4. إعداد 83.5 ملي محلول المخزون من تريس [(1-البنزيل-1H-1،2،3-triazol-4-YL) الميثيل] أمين (TBTA)
    1. في قارورة زجاجية، ويحل 8.85 ملغ من TBTA في 200 ميكرولتر من DMSO. تخزين على RT لمدة شهر واحد.
  5. إعداد 1.7 ملي العمل الحل من TBTA (مباشرة قبل الاستعمال)
    1. إضافة 20 ميكرولتر من 83.5 ملي TBTA إلى قارورة زجاجية وتمييع مع 180 مل من DMSO.
    2. إضافة 800 ميكرولتر من -Butanol ثالثي ودوامة.

3. تحليل التعبير ناا في باو أنسجة الفئران المعالجة CFA،

ملاحظة: استخدام الذكور سبراغ داولي الفئران، وزنها 175-200 غرام، وأداء جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للاستخدام الأخلاقية للحيوانات. الفئران منزل في أقفاص التهوية على ضوء لمدة 12 ساعة / دورة الظلام ومنحهم حرية الوصول إلى الغذاء والماء. لبروتوكول CFوالعلاج، والرجوع إلى المقال الذي نشرته Bonezzi وآخرون. 29 استخدام الحيوانات بعد 7 أيام إدارة CFA.

  1. إدارة الوريد من ARN14686
    1. حل ARN14686 في السيارة (15٪ PEG و 15٪ من محلول ملحي توين). حساب تركيز المحلول وفقا لوزن الفئران (جرعة 3 ملغ / كغ، وحجم حقن 5 مل / كغ).
    2. المضي قدما في الرابع الحقن في ثلاث السذاجة وثلاثة الفئران المعالجة CFA. وضع كل فأر في جهاز ضبط النفس البلاستيك المناسب. ثم، ضع ذيل فأر في ماء دافئ لمدة 2-4 دقيقة للسماح توسع الأوعية، وحقن الرابع المجمع عن طريق الوريد الذيل.
    3. حقن ثلاثة الفئران (الساذج وCFA المعاملة) رابعا مع سيارة فقط.
  2. مخلب جمع وتشريح
    1. التضحية الفئران عن طريق CO 2 الاستنشاق 4 ساعات بعد التحقيق أو مركبة الادارة وجمع الكفوف بالقص 0.5 سم فوق مفصل الركبة باستخدام مشرط.
    2. بعناية إزالة الجلد عن طريق تشريح بمساعدة مقص وتشريح خارج الأنسجة الرخوة عن طريق كشط لهم من العظام. تجاهل العظام وجمع الأنسجة الرخوة في الكفوف. عينات تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  3. مخلب التجانس والليزوزومية إعداد البروتين
    ملاحظة: تجنب استخدام المنظفات الصناعية والمخازن التي تحتوي على الأمينات، لأنها يمكن أن تمنع رد فعل CC.
    1. الجمع بين الأنسجة مخلب من 3 الفئران (تم الحصول عليها كما هو موضح في القسم 3.2.1) والتجانس لهم في 4 مل من 320 ملي السكروز في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) والكوكتيل مثبط البروتياز (انظر المادة / الكاشف الجدول). استخدام أداة تفريق عالية الأداء (انظر المادة / الكاشف الجدول).
    2. أجهزة الطرد المركزي لجناسة الأنسجة لمدة 20 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية. حفظ طاف.
    3. إضافة 2 مل من 320 ملي السكروز في برنامج تلفزيوني والكوكتيل مثبط البروتياز لبيليه الأنسجة والتجانس مرة أخرى.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، وإضافة وطاف على واحد من الخطوة 3.3.2.
    5. أجهزة الطرد المركزي في supernatants المجمعة لمدة 30 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
    6. تزن بيليه و resuspend في مجلدين من برنامج تلفزيوني (أي 200 ميكرولتر لكل 100 ملغ من بيليه). نقل إلى أنبوب 1.5 مل جمع وتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. ذوبان الجليد العينات وتجميد مرة أخرى لمدة 1 ساعة على -80 درجة مئوية.
    8. تكرار دورة تجميد / الذوبان مرتين أخريين.
      ملحوظة: تم تصميم هذه الخطوة لإذابة البروتين. تجميد بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر.
    9. الطرد المركزي لمدة 1 ساعة على 100000 x ج في 4 درجات مئوية. جمع طاف، والذي يحتوي على البروتينات الليزوزومية القابلة للذوبان، وتجاهل بيليه. تخزين في -80 درجة مئوية أو الشروع فورا في تقدير البروتين.
    10. قياس محتوى البروتين باستخدام بروتين BCA فحص 30 مجموعة تجارية (انظر المادة / الكاشف الجدول
    11. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. CC مع أزيد-PEG3-البيوتين
    ملاحظة: بروتوكول CC وتخصيب حبة streptavidin (الخطوات 3،4-3،6) يتم تعديل قليلا عن البروتوكول الذي نشرته سبيرس وCravatt 31.
    1. إعداد 500 ميكرولتر (1 ملغ / مل، في برنامج تلفزيوني) من البروتينات الليزوزومية من الفئران probe- والمعالجة المركبة (الفئران ساذجة وتعامل CFA).
    2. عينات Preclear مع 40 ميكرولتر من الطين 50٪ من الاغاروز streptavidin (يغسل ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، واتخاذ طاف.
    3. إضافة 11.3 ميكرولتر من مخزون 5 مم من أزيد-PEG3-البيوتين ودوامة.
    4. إضافة 11.3 ميكرولتر من الأسهم 50 ملم من الطازجة TCEP ودوامة.
    5. بريمكس 34 ميكرولتر من حل العاملة الطازجة من 1.7 ملي TBTA مع 11.3 ميكرولتر من 50 ملي كبريتات النحاس 4 2 O الأسهم.
    6. إضافة 45.3 مل من محلول المخلوط TBTA / كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O ودوامة.
    7. احتضان رد الفعل عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (فترة حضانة أطول لا يؤثر على رد فعل). مراقبة هطول البروتين في هذه الخطوة. مزيج بعد الساعة الأولى من الحضانة.
  5. إزالة من الكواشف CC الزائدة
    1. عينات الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 6500 x ج في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
    2. إضافة 750 ميكرولتر من الميثانول الباردة و resuspend صوتنة (5 ثانية مع sonicator التحقيق).
    3. الطرد المركزي العينات لمدة 4 دقائق في 6500 x ج في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف باستخدام المحاقن والإبر.
    4. كرر الخطوة 3.5.2 مرتين (غير مطلوب صوتنة).
    5. بعد غسل الماضي، إضافة 325 ميكرولتر من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) 2.5٪ في برنامج تلفزيوني للبروتين بيليه ويصوتن 3X لمدة 5 ثوان.
    6. تسخين العينات لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية ويصوتن لربح.
    7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 6500 x ج في RT وحفظ طاف.
    8. إضافة 1.4 مل من برنامج تلفزيوني لتخفيف تركيز SDS إلى 0.5٪. مخزن في -20 درجة مئوية أو الاستمرار في تخصيب streptavidin.
  6. Streptavidin التخصيب
    1. مع برنامج تلفزيوني، ليصبح حجم العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.5.8 إلى 4.2 مل. إضافة 40 ميكرولتر من الطين 50٪ من الاغاروز streptavidin باستخدام تلميح نهاية قطع (يغسل ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام).
    2. احتضان لمدة 2 ساعة على RT مع دوران ثم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1400 ز س.
    3. إزالة طاف دون تجفيف حبات بيليه واستخدام طاف المتبقية لنقل الخرز إلى 1 مل تدور العمود (انظر المادة / الكاشف الجدول).
    4. يغسل عن طريق الجاذبية مع 3X 1 مل من 1٪ SDS (في برنامج تلفزيوني)، 3X 1 مل من 6 M اليوريا (في برنامج تلفزيوني)، و4X 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. استخدام 2X 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لنقل الخرز لأنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1400 x ج في RT. نضح بلطف طاف مع المحاقن والإبر.
    6. أزل البروتينات محددة الراتنج وذلك بإضافة 25 ميكرولتر من شطف العازلة (6 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 2٪ SDS، و 6 البيوتين مم، وكلها في برنامج تلفزيوني) لمدة 15 دقيقة في RT تليها 15 دقيقة في 95 درجة مئوية (32).
  7. البروتين وصمة عار
    1. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 6X Laemmli (9 مل: 0.5 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 5 مل من 20٪ SDS، 5 ملغ برموفينول الأزرق، 3 مل الجلسرين، وH 2 O ما يصل إلى 9 مل)، وإضافة 5٪ β-المركابتويثانول مباشرة قبل الاستعمال. لفترة وجيزة الطرد المركزي العينات في 2000 x ج لتكوير الراتنج وتحميل 25 ميكرولتر من طاف الحصول عليها إلى هلام بولي أكريلاميد 4-12٪.
    2. أداء الكهربائي للهلام ونقل البروتين على غشاء النشاف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 33.
    3. تشبع غشاء النشاف لمدة 1 ساعة مع 10 مل من عازلة تمنع (انظر المادة / الكاشف الجدول) تحتوي على 0.1٪ توين-20.تجنب استخدام الحليب، لأنها يمكن أن تزيد من الخلفية.
    4. يغسل الغشاء مع 10 مل من 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولتر من streptavidin الفلورسنت (انظر المادة / الكاشف الجدول) المذاب في 10 مل من عازلة تمنع بالإضافة إلى 0.1٪ توين-20 لمدة 1 ساعة على RT.
    5. تغسل 4 مرات مع 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني ومرة ​​واحدة مع برنامج تلفزيوني وحدها (10 دقيقة لكل منهما).
    6. استخدام الماسح الضوئي صورة (انظر المادة / الكاشف الجدول). التبديل على الصك وجهاز كمبيوتر متصل. انتظر حتى جاهزة.
    7. بدء تشغيل البرنامج اقتناء واختيار وضع مضان. حدد منطقة الغشاء واختيار مجلد وجهة لحفظ الملفات.
    8. تعيين المعلمات الاستحواذ التالية: 680 نانومتر طول الإثارة، BPFR700 التصفية، 1000 V أنبوب مضخم (PMT) بقيمة (قناة 2)، و 25 ميكرون حجم بكسل. الحصول على صورة.

4. توطين أحدث حفاز ناا في ماوس الرئتين بواسطة الإسفار مايكرووننسخ

ملاحظة: فئران عمرها أسابيع 8-10 استخدام الذكور، وتأدية جميع الإجراءات وفقا لمبادئ توجيهية لاستخدام الأخلاقية للحيوانات. الفئران منزل في أقفاص التهوية على 12 ساعة دورة الضوء / الظلام ومنحهم حرية الوصول إلى الغذاء والماء.

  1. إدارة الوريد من ARN14686 في الفئران
    1. حل ARN14686 في السيارة: 15٪ PEG و 15٪ توين 20 محلول ملحي. حساب تركيز المحلول وفقا لوزن الماوس (جرعة 3 ملغ / كغ، وحجم حقن 5 مل / كغ).
    2. المضي قدما في حقن الرابع من 3 الفئران. وضع كل الماوس في جهاز ضبط النفس البلاستيك المناسب. ثم، ضع ذيل الماوس في ماء دافئ لمدة 2-4 دقيقة للسماح توسع الأوعية وحقن الرابع المجمع عن طريق الوريد الذيل.
    3. ضخ 3 الفئران الرابع مع السيارة فقط.
  2. الرئة جمع وإعداد شريحة
    تحذير: التعامل مع امتصاص العرق مع الحرص في غطاء الدخان، وارتداء قفازات!
    1. تخدير الفئران مع chloهيدرات راؤول (400 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير مع قرصة أخمص قدميه. إجراء نضح transcardial على النحو التالي:
      1. قطع سطحي الجلد البطني مع مقص وفضح السطوح غشاء الصدر والبريتوني.
      2. قطع سطحي الغشاء البريتوني مع مقص، وأقل بقليل من عملية سيفي الشكل، وفضح الحجاب الحاجز والأجهزة الحشوية. يجب الحرص على عدم ممزق أي الأوعية الدموية كبير.
      3. فتح التجويف الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز من الجانب الوحشي واحدة إلى أخرى.
      4. إدراج إبرة 25 G متصلا ضخ حقنة الآلي ويبث 20 مل من 0.9٪ محلول ملحي تليها 60 مل من 4٪ PFA في العازلة الفوسفات (0.1 م، ودرجة الحموضة 7.4).
    2. وبمجرد أن نضح كاملة، وسحب القلب باستخدام ملقط وتشريح بعناية من ذلك. فهم القصبة الهوائية مع ملقط وقطع تماما من خلال ذلك باستخدام المقص. الساحبة بلطف صعودا القصبة الهوائية وإزالة الرئتين من القفص الصدري. تشريح الأنسجة لفصل الرئة اليمنى من الناحية اليسرى.
    3. بوستفيكس الأنسجة في امتصاص العرق 4٪ لمدة 1 ساعة، عينات تجميد في البرد 2-methylbutane، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    4. جمع 40 ميكرون المقاطع باستخدام ناظم البرد، جبل على الفور على الشرائح (واحد كل الخامس)، ومعالجتها لالمناعية كما هو موضح أدناه.
  3. الأنسجة شرائح Permeabilization والحجب
    1. يغسل مع برنامج تلفزيوني (2X لمدة 5 دقائق) وpermeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100 برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في RT.
    2. يغسل مع برنامج تلفزيوني (2X لمدة 5 دقائق) ومنع مع 3٪ زلال المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. يغسل مع برنامج تلفزيوني (2X لمدة 5 دقائق) والمضي قدما CC.
  4. CC مع أزيد-PEG3 فلور 545 على شرائح الأنسجة
    1. يعد حل عن طريق خلط الكواشف CC أعد كما هو موضح في القسم 2. ل1 مل من محلول، إضافة: 2 ميكرولتر من أزيد-PEG3 فلور 545 (5 الاسهم ملم)، 20 ميكرولتر من TCEP (الطازجة 50 ملي جواربك)، و 58.8 ميكرولتر من TBTA (الطازجة 1.7 ملي حل العمل)، و 20 ميكرولتر من كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O (50 الاسهم ملم)، و 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة حوالي 400 ميكرولتر من مزيج CC إلى شرائح الأنسجة، والتي تم إعدادها وفقا للمادة 4.2. الانتباه إلى أن حجم اختيار من مزيج CC كافية لتغطية شرائح. احتضان لمدة 1 ساعة على RT محمية من الضوء.
    3. يغسل مع برنامج تلفزيوني (1X لمدة 5 دقائق)، والميثانول البارد (1X لمدة 5 دقائق)، وهو حل من 1٪ توين 20 و 0.5 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني (3X لمدة 2 دقيقة)، وبرنامج تلفزيوني (1X لمدة 5 دقائق).
    4. الهواء الجاف، إضافة قطرة من antifade مرس مع دابي (انظر المادة / الكاشف الجدول)، وثيقة مع زلات غطاء (تجنب تشكيل فقاعة)، وختم بطلاء. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى التحليل.
  5. الحصول على الصور
    1. استخدام المجهر متحد البؤر مجهزة 546 نانومتر و 450 نانومتر ليزر الإثارة (انظر المادة / الكاشف الجدول) التاليةدليل المستخدم.
    2. حدد 60X عدسة موضوعية مع NA = 1.40، مع التأكد من معاينة الشريحة من خلال العدسات والتركيز على مساحة من الاهتمام.
    3. تحديد المعلمات الاستحواذ وفقا لخصائص العينة والمعدات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم تصميم ARN14686 بناء على سقالة من المانع ARN726 ناا. تم استبدال مجموعة 4-بوتيل cyclohexyl من ARN726 مع سلسلة الأليفاتية المشبعة C9 تحمل علامة آلكاين محطة (الشكل 1). وقدم العلامة آلكاين من أجل السماح باستخدام إجراء وضع العلامات من خطوتين لإضافة fluorophore أو جزيء البيوتين عبر CC. هذه الميزة تجعل ARN14686 أداة مرنة للغاية لتحقيق ناا في التجارب المختبرية والحية.

هنا، وتبين لنا اثنين من التطبيقات من ARN14686، التي تمثل من إمكانات هذا الجزيء الشكل 2 هو مخطط الإجراء التجريبي ذكرت هنا. بعد الادارة الرابع لجنة التحقيق، واثنين من طرق الكشف مختلفة يمكن استخدامها: أ) تحليل التعبير ناا نشط لطخة البروتين وب) تحليل التعبير ناا نشط وتوطين داخل الخلايا بواسطة fluorescencالبريد المجهر.

تم نشر نتيجة التمثيلية الأولى في الآونة الأخيرة من قبل مجموعتنا 29. قمنا بتحليل التعبير ناا في نموذج الفئران من التهاب مخلب الناجم عن CFA. تم حقن التحقيق (3 ملغ / كلغ) أو مركبة الرابع في الفئران ساذجة وCFA المعاملة. تم التضحية الفئران بعد 4 ساعات. تم إجراء CC على مقتطفات الليزوزومية المخصب لإدخال البيوتين العلامة على البروتينات وصفت التحقيق. كانت البروتينات المعقدة البيروكسيديز بجانب إثراء باستخدام الخرز streptavidin. وقد تم تحليل البروتينات مزال لطخة البروتين، وتبين أن مستويات ناا نشط ازدادت بشكل ملحوظ في الكفوف من الفئران التي عرضت لCFA بالنسبة لتلك الفئران التحكم (الشكل 3). الاستفادة من تحليل البروتين وصمة عار لأنه يمكن إجراء فحص مفصل للبروتيوم مسبار رد الفعل، الذي مفصولة الكهربائي للهلام. كما يسمح هذا النهج لإزاحة الستار عن التحقيق من الأهداف المحتملة. يجب أن يكون التحكم لم مسبار اللهالطرق المدرجة في أجل استبعاد البروتينات المعقدة البيروكسيديز الذاتية، التي تشكل خلفية التجريبية. رأس السهم في الشكل (3) يشير إلى هذه البروتينات الخلفية، والتي بدورها يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة إشارة التحميل.

في تجربة غير منشورة الثانية (الشكل 4)، وكنا ARN14686 للتحقيق ناا لخارج الحي الكشف عن طريق الفحص المجهري مضان. نحن تدار ARN14686 على الفئران في 3 ملغ / كغ (د) وضحوا لهم 2 ساعة بعد العلاج عن طريق نضح transcardial. تم جمع الرئتين، postfixed، وجمدت في البرد 2-metylbutane. تم إجراء رد فعل CC لإضافة fluorophore مباشرة على شرائح الأنسجة من 40 ميكرون سمك، جمعها مع ناظم البرد. وأظهر التحليل المجهري مضان وجود ناا نشاطا تحفيزيا في الهياكل حويصلي تنتشر ينتمون إلى الضامة السنخية. بالمقارنة مع استخدام الأجسام المضادة بروتين معين، فقط للوحظ انزيم التفاعلية الذي نظمه.

شكل 1

الشكل 1: ARN14686 مخطط رد فعل توليف YN-2-را Undec 10 تم تفعيلها من خلال dipyridylcarbonate (DPC) في وجود حفاز 4 dimethylaminopyridine (DMAP) لإنتاج كربونات مختلطة. وبعد ذلك كان رد فعل هذا كربونات مع اكتام الأمينية للحصول على جزيء الهدف ARN14686. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
ويتم تحليل مخطط سير العمل في الإستراتيجية العامة المبينة في هذا العمل يتم حقن التحقيق في الحيوانات (الجرذان أو الفئران) واستهداف التعبير التاليين إجراء التجارب المختلفة: الشكل 2.الصورة: أ) يتم استخراج بروتيوم وصفت ويضاف البيوتين التي كتبها CC. بعد مرحلة التخصيب من البروتينات المعقدة البيروكسيديز على حبات streptavidin، ويتم تحليل أهداف التحقيق من قبل لطخة البروتين. ب) يتم إعداد شرائح الأنسجة وأضافت fluorophore التي كتبها CC. ويتم تحليل توطين هدف التحقيق بواسطة المجهر تنوير. وقد تم تكييف هذا الرقم من Bonezzi وآخرون. 29 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: تحليل تفعيل ناا في الكفوف من الفئران المعالجة CFA تحليل البروتين وصمة عار من البروتينات التخصيب streptavidin من الفئران ساذجة (حارات 1 و 2) الفئران أو CFA حقن 7 أيام بعد الحقن (الحارات 3 و 4). تلقت الفئران الرابع حقن السيارة أو ARN14686 (3 ملغ / كلغ). غشاء النشافتم بحثها مع streptavidin الفلورسنت. يشير السهم الفرقة ناا. يشير السهم الفرقة التي تحتوي على البيوتين حوالي 90 كيلو دالتون، وتبين أن كمية مماثلة من بروتين تم تحميل في كل حارة. تم تعديل هذا الرقم من Bonezzi وآخرون. 29 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4): تحويلة فيفو الكشف عن وذكرت ناا في الرئتين الماوس بواسطة المجهر مضان المسمى مسبار الصور التمثيلية للأقسام الرئة من vehicle- (A) أو (B) الفئران المحقونة ARN14686 بعد CC مع أزيد-PEG3 فلور 545. تم الكشف عن إشارة إيجابية (خلايا الدم الحمراء) في الفئران المحقونة ARN14686، في حين تم الكشف عن أي إشارة في الخامسالفئران التي تديرها ehicle. ويرد بالتفصيل لأزيد-PEG3 فلور 545 البلاعم السنخية إيجابي في C في أعلى التكبير. وتميزت نوى مع دابي (الأزرق). شريط مقياس = 50 ميكرومتر في ألف و10 ميكرون في C. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وينظم نشاط انزيم بدقة على مختلف المستويات، بما في ذلك النسخ RNA، تخليق البروتين، النبات البروتين، وتعديل ما بعد متعدية، وتفاعل البروتين البروتين. في كثير من الأحيان، والتعبير انزيم وحده لا يفسر لنشاطها. وقد وضعت ABPP لدراسة نشاط البروتينات في حالتها الأصلية. مطلوبة سمتان: التحقيق الكيميائية التي تربط تساهمي إلى موقع نشط من انزيم من الفائدة وعلامة مراسل للكشف عن انزيم المسمى التحقيق.

تصميم التحقيق والتوليف والنقاط الحرجة من هذا الإجراء. يجب أن يكون التحقيق تقارب والانتقائية كافية لهدفه. وعلاوة على ذلك، يجب وجود علامة مراسل لن يؤثر استهداف الاشتباك. والتغلب على هذه المسألة إلى حد كبير تصميم برنامج الجسر الأكاديمي من خطوتين، حيث يتم إدخال بطاقة المراسل بعد أن تم القبض على الهدف. خالية من العلامة تحقيقات هي مناسبة خاصة للدراسات في الجسم الحي، الذي نشاط البروتينيمكن تقييمها في الخلية الحية أو الحي، مع تغيير خارجي الحد الأدنى. وقد تم تصميم المسبار ARN14686 ناا لتلبية الاحتياجات المحددة أعلاه. كان لاكتام β اختيار الرؤوس رد الفعل استنادا إلى النتائج السابقة التي تم الحصول عليها مع الطبقة β لاكتام مثبطات ناا 16،26. هذه المركبات تمنع ناا بطريقة فعالة وانتقائية عن طريق ربط تساهمي إلى السيستين الحفاز للانزيم. وعلاوة على ذلك، عرضت على المركبات لتكون نشطة بشكل منتظم 16. قدمنا ​​سلسلة الأليفاتية C9 المشبعة، مع الأخذ في الاعتبار زيادة تقارب من ناا لسلاسل دهنية طويلة. وأضيفت آلكاين محطة للسماح للمن خطوتين وضع العلامات.

خطوة حاسمة أخرى هو اختيار جرعة والوقت لفي إدارة الجسم الحي. هذا يعتمد على استقرار التحقيق في البلازما، تقارب هدفه، والانتقائية به. يجب تحديد الجرعة الصحيحة للسماح لالتقاط الهدف مع تجنب إشراك بوssible خارج-الأهداف. وجدنا أن 3 ملغم / كغم من ARN14686 الرابع كان الأمثل لالتقاط ناا بشكل انتقائي. أسفرت جرعات أعلى في القبض على أميداز السيستين مثلي، سيراميداز الحمضية. وفيما يتعلق طول العلاج، عند تحليل أجهزة perfused جيدا، مثل الرئتين، وهو وقت قصير (2 ساعة) قد تكون كافية للسماح للتحقيق لتتفاعل مع هذا الهدف. لالكفوف، إلا أننا اضطررنا لمضاعفة وقت رد الفعل.

ويرجع ذلك إلى وجود البروتينات المعقدة البيروكسيديز بشكل طبيعي وهناك قضية محتملة في تحليل الهدف من وصمة عار البروتين. ومن المحتم أن تحديد هذه جنبا إلى جنب مع أهداف التحقيق محددة. لقد وجدنا أن إدخال خطوة preclearing مع حبات streptavidin قبل تنفيذ CC زيادة كبيرة في جودة نتائجنا. من ناحية أخرى، فإن وجود البروتينات المعقدة البيروكسيديز الأم يمكن أن تستخدم للسيطرة على القطع الأثرية تحميل ممكنة. وأخيرا، فيما يتعلق دراسات التعريب بواسطة المجهر مضان، من المهم جدا أن تكون على علم عرداء الانتقائية لأنه، على عكس البقع البروتين، مضان المجهر لا تسمح بالتمييز الهدف من خارج الأهداف. يجب أن يتم تنفيذ دراسات الانتقائية الأولية لتقييم الجدوى وإعداد الظروف التجريبية الأمثل.

القيود المفروضة على تقنية الموضحة تتعلق أساسا إلى ضرورة تجنب الظروف التجريبية التي يمكن أن تؤثر على رد الفعل CC، مثل استخدام المنظفات الصناعية والمخازن التي تحتوي على الأمينات. يجب أن تؤخذ هذه الجوانب في المسؤولية عندما إعداد المحللة خلية أو جناسة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، عندما يطلب إلى مرحلة التخصيب streptavidin، وكمية بدءا المواد يشكل قضية أخرى، لأن هذا الإجراء لا ينطبق إلا عندما يكون محتوى البروتين لا يقل عن 250 ميكروغرام. يتم تعيين هذا الحد لأسباب فنية، مثل أحجام العمل، والانتعاش من البروتين، بعد هطول الأمطار الناجمة عن تغير المناخ، وكمية من الراتنج streptavidin لاستخدامها.

Previouslذ، النشاط ناا لا يمكن تقييمه إلا من خلال إجراء فحوصات النشاط، والتي تتطلب استخدام مخزن مؤقت تفعيل لتفعيل في المختبر من الانزيم والركيزة الإذابة 14. ويوفر هذا النهج معلومات حول تعبير مجموع ناا، وليس عن وجود ناا النشط. والاحتمال الآخر هو لقياس مستويات الأنسجة من الوكالة المنفذة للمشروع وأويا، ولكن يمثل هذا الأسلوب فقط وسيلة غير مباشرة لتقييم النشاط ناا 34،35. وبالإضافة إلى ذلك، مستويات FAE يمكن أن تتأثر بعوامل أخرى مثل الحيوي. وARN14686 التحقيق الكيميائي هو برنامج الجسر الأكاديمي الأول لناا. بروتوكول الموصوفة هنا يوضح إجراء بسيط لالتقاط وتصور الشكل النشط من ناا، سواء في التجارب المختبرية والحية. جميع التلاعب العينة هي لاحقة لردود الفعل التحقيق المستهدفة، وبالتالي إعطاء معلومات موثوق بها عن الدولة في الجسم الحي الانزيم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام ARN14686 في المجهر مضان يمثل أداة ر فريدس توطين نشط ناا. الأجسام المضادة المتاحة، والتي تعترف الوحيدات الحفاز ناا، لا تميز بين ناا كامل طول proenzyme وأنزيم نشط.

بدءا من بروتوكول الموصوفة هنا، يمكن تحليل التعبير ناا والتنشيط في خطوط مختلفة من الخلايا ونماذج حيوانية من التهاب. لا يمكن أن يؤديها دراسات شارك في التعريب لتوصيف أفضل لدور ناا في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole  Sigma Aldrich 367818 Harmful
2-dipyridylcarbonate Fluorochem 11331 Harmful
2-Methylbutan Sigma Aldrich M32631 Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine Sigma Aldrich 107700 Toxic
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 Flammable, Corrosive
Acetonitrile  Sigma Aldrich 34998 Flammable, Toxic
Activated charcoal Sigma Aldrich 161551
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 Harmful
Azide-PEG3-Biotin Jena Biosciences CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545 Jena Biosciences CLK-AZ109
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227
Bio-spin columns Biorad 732-6204
Biotin Sigma Aldrich B4501
Blocking buffer Li-Cor Biosciences 927-40000
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA) Sigma Aldrich A7030
Bromophenol blue Sigma Aldrich B0126
Bruker Avance III 400 Bruker
Celite Sigma Aldrich 419931 Health hazard
Ceric ammonium nitrate  Sigma Aldrich 22249 Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate Sigma Aldrich C8383 Higly toxic
CuSO4.5H2O  Sigma Aldrich 209198 Toxic
Cyclohexadiene Sigma Aldrich 125415 Flammable, Health hazard
Cyclohexane Sigma Aldrich 34855 Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane Sigma Aldrich 34856 Harmful, Health hazard
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Acros Organics 348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) Sigma Aldrich 175943
Ethanol Sigma Aldrich 2860 Flammable, Harmful
Ethyl acetate Sigma Aldrich 34858 Flammable, Harmful
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Irdye 680-LT Streptavidin Li-Cor Biosciences 925-68031
IRDye680-LT Streptavidin  Licor 925-68031 Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol Sigma Aldrich 34966 Highly toxic
Methanol Sigma Aldrich 34860 Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E7750 Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806 Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide Sigma Aldrich 227056 Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine Fluorochem M03053 Harmful
Nikon A1 confocal microscopy Nikon Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0335BOX
Palladium on carbon Sigma Aldrich 330108
p-anisidine Sigma Aldrich A88255 Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde sigma Aldrich 441244 Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)  Sigma Aldrich P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI  Thermo Fisher Scientific P36931 Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich P8340
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)  Sigma Aldrich L3771 Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride  Sigma Aldrich 452912 Flammable
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313
Starion FLA-9000 immage scanner FUJIFILM Read  the user manual
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20349
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Tert-butanol Sigma Aldrich 360538 Toxic, flammable
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 186562 Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea Acros Organics 424542500 Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris Sigma Aldrich RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Sigma Aldrich C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
Triton-x100 Sigma Aldrich X100 Toxic
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Tween-80 Sigma Aldrich P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer IKA
Undec-10-yn-1-ol Fluorochem 13739 Harmful
Urea Sigma Aldrich U5378 Toxic, warm at 50 °C to dissolve

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 117، على أساس النشاط بروتين التنميط، التحقيق على أساس النشاط، انقر فوق الكيمياء،
إعداد و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام من التحقيق على أساس آخر ل<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine حمض أميداز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S.,… More

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S., Bonezzi, F., Migliore, M., Di Martino, S., Summa, M., Piomelli, D. Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase. J. Vis. Exp. (117), e54652, doi:10.3791/54652 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter