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Biochemistry

तैयारी और Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

Summary

यहाँ, हम तैयार करने और एक गतिविधि आधारित जांच के उपयोग का वर्णन (ARN14686, undec-10-एन ynyl- - [(3 एस) -2-oxoazetidin-3-YL] carbamate) है कि पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है proinflammatory एंजाइम एन -acylethanolamine एसिड amidase के सक्रिय रूप (naaa), दोनों इन विट्रो और पूर्व vivo में।

Abstract

गतिविधि आधारित प्रोटीन रूपरेखा (ABPP) एक रासायनिक जांच है कि एंजाइम सक्रिय साइटों को लक्षित के उपयोग के माध्यम से एक जटिल proteome में ब्याज की एक एंजाइम की पहचान के लिए एक विधि है। एक पत्रकार टैग जांच में पेश में जेल प्रतिदीप्ति स्कैनिंग, प्रोटीन धब्बा, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, या तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा लेबल एंजाइम का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम तैयारी और यौगिक ARN14686 का उपयोग करते हैं, एक क्लिक के रसायन शास्त्र गतिविधि आधारित जांच (CC-एबीपी) है कि चुनिंदा एंजाइम एन -acylethanolamine एसिड amidase (naaa) पहचानता का वर्णन है। Naaa एक सिस्टीन hydrolase कि इस तरह के palmitoylethanolamide (मटर) और oleoylethanolamide (OEA) के रूप में अंतर्जात peroxisome proliferator सक्रिय रिसेप्टर (PPAR) -alpha एगोनिस्ट निष्क्रिय करने से सूजन को बढ़ावा देता है। Naaa एक निष्क्रिय पूर्ण लंबाई proenzyme, जो लाइसोसोम के अम्लीय पीएच में autoproteolysis से सक्रिय है के रूप में संश्लेषित है। स्थानीयकरण के अध्ययन जपता चला है कि मुख्य रूप से naaa बी लिम्फोसाइटों में, मैक्रोफेज और अन्य monocyte व्युत्पन्न कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और साथ ही साथ AVE। हम कैसे ARN14686 का पता लगाने और प्रोटीन धब्बा और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कृंतक ऊतकों में सक्रिय naaa पूर्व vivo यों इस्तेमाल किया जा सकता का उदाहरण देते हैं।

Introduction

अधिक इस्तेमाल किया तरीकों अभिव्यक्ति पैटर्न, बातचीत, और प्रोटीन के कार्यों, बन्दूक विश्लेषण 1,2, खमीर के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफार्मों सहित जांच करने के लिए दो संकर तरीकों 3,4, और इन विट्रो assays में, में सीमित कर रहे हैं वे कर रहे हैं कि उनके पैतृक राज्य में प्रोटीन की गतिविधि का आकलन करने में असमर्थ है। गतिविधि आधारित प्रोटीन रूपरेखा (ABPP) इस अंतर को भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण में, छोटे अणु covalently ब्याज की एक एंजाइम के सक्रिय साइट के लिए बाध्यकारी एक पत्रकार समूह है कि लक्ष्य का पता लगाने के लिए अनुमति देता है संयुग्मित हैं करने में सक्षम जांच। क्लिक रसायन विज्ञान (सीसी) का उपयोग करना, संवाददाता जांच में एकीकृत किया जा सकता है या लक्ष्य सगाई के बाद 5,6 हुआ है शुरू की जा सकती है। उत्तरार्द्ध प्रक्रिया में इस तरह के एक टर्मिनल alkyne या azide, जो सफलता जैव orthogonal प्रतिक्रियाओं के माध्यम से संवाददाता अभिकर्मकों के एक नंबर के साथ संशोधित किया जा सकता है के रूप में उपयुक्त रासायनिक समूहों, जिसमें जांच के उपयोग की आवश्यकताघन (मैं) के रूप में ज Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 या Staudinger बंधाव 10,11 -catalyzed।

हाल ही में, हम इन विट्रो के लिए पहले एबीपी के रूप में और सिस्टीन hydrolase, naaa 12 के विवो पता लगाने में यौगिक ARN14686 खुलासा किया। Naaa oleoylethanolamide (OEA) और palmitoylethanolamide (मटर) सहित संतृप्त और monounsaturated FAEs, जो विरोधी भड़काऊ परमाणु रिसेप्टर PPAR-अल्फा 13-15 की अंतर्जात एगोनिस्ट हैं की hydrolytic छोड़ना उत्प्रेरित। Naaa मुख्य रूप से है, साथ ही बी-लिम्फोसाइट 14,16 के रूप में, मैक्रोफेज और अन्य monocyte व्युत्पन्न कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नियमन में एक भूमिका का सुझाव दे। एंजाइम एक निष्क्रिय रूप में किसी न किसी जालिका में संश्लेषित है और एक autoproteolytic तंत्र 17 से सेल के अम्लीय डिब्बों में सक्रिय है। Autoproteolytic दरार एक नया एन -terminal सिस्टीन (उत्पन्न C13चूहों और चूहों में 1, मानव में C126), कि FAE के लिए जिम्मेदार nucleophile hydrolysis 18,19 है। Naaa गतिविधि के औषधीय निषेध FAEs 16,20,21 की वृद्धि की सेलुलर स्तर के पक्ष में FAE संश्लेषण / गिरावट संतुलन बदल। कई β-लैक्टोन और β लस्टम डेरिवेटिव उच्च शक्ति और चयनात्मकता 16,22-26 साथ naaa गतिविधि को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। इन अवरोधकों उत्प्रेरक सिस्टीन 16,27,28 के एस -acylation के माध्यम से काम करते हैं।

(- [(एस) -2-oxoazetidin-3-YL] carbamate 4-cyclohexylbutyl- एन) 16 यौगिक ARN14686 प्रणालीबद्ध सक्रिय, सेरीन व्युत्पन्न β लस्टम naaa अवरोध की रासायनिक संरचना, ARN726 के आधार पर तैयार किया गया था। ARN726 की 4-ब्यूटाइल-Cyclohexyl समूह एक C9 संतृप्त स्निग्ध श्रृंखला एक azide असर संवाददाता टैग के साथ बाद में सीसी विकार के लिए एक टर्मिनल alkyne टैग असर के साथ बदल दिया गया था। हम minimall करने के लिए एक दो कदम एबीपी डिजाइन करने के लिए चुना हैY मूल पाड़ की संरचना में परिवर्तन, इस प्रकार naaa के लिए जांच की आत्मीयता बनाए रखने। इसके अलावा, भारी टैग की शुरूआत से परहेज है, इस तरह के एक मामले की जांच के लिए एक सीधा एबीपी से इन विवो उपचार के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। ARN14686 उच्च शक्ति के साथ naaa रोकता (hNAAA आईसी 50 = 6 एनएम, rNAAA आईसी 50 = 13 एनएम) एंजाइम 12 का उत्प्रेरक सिस्टीन के साथ एक सहसंयोजक अभिवर्तन गठन से। लाइव चूहों में प्रयोगों से पता चला है कि जांच कब्जा naaa फेफड़ों में व्यक्त करने में चयनात्मक है। एसिड ceramidase, एक और सिस्टीन amidase कि naaa साथ 33-34% पहचान साझा भी जब उच्च सांद्रता जांच (इन विट्रो में 10 माइक्रोन, 10 मिलीग्राम / एमएल नसों में, चतुर्थ) 12 का उपयोग कर एक कम आत्मीयता लक्ष्य के रूप में पहचान की थी। हम भी पूरा Freund के सहयोगी (सीएफए) 29 के प्रशासन निम्नलिखित सूजन चूहे ऊतकों में सक्रिय naaa की उपस्थिति का अध्ययन करने के ARN14686 इस्तेमाल किया है।

यहाँ, हम preparati के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयारARN14686 (चित्रा 1) और naaa सक्रियण पूर्व vivo की जांच करने के लिए अपने आवेदन के पर। एक उदाहरण के रूप में, हम सीएफए प्रशासन के बाद चूहे पंजे में naaa कल्पना करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन है। इस प्रयोग में, प्रोटीन जांच के चतुर्थ इंजेक्शन के बाद पंजा ऊतक से निकाले जाते हैं, और एबीपी लेबल proteome बायोटिन azide के साथ सीसी के अधीन है। Biotinylated नमूने streptavidin मोतियों का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं, और प्रोटीन blots प्रदर्शन कर रहे हैं। एक और आवेदन में, हम जांच-इलाज चूहों से माउस फेफड़ों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा सक्रिय naaa के स्थानीयकरण का वर्णन है। इस मामले में, ऊतक sectioned है और वर्गों rhodamine इसके लिए सीसी के अधीन हैं। एक कार्यप्रवाह योजना चित्रा 2 में सचित्र है।

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Protocol

सावधानी: सभी रसायन विज्ञान प्रतिक्रियाओं एक हवादार धूआं हुड में और एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और सुरक्षात्मक काले चश्मे के उपयोग के साथ बाहर किया जाना चाहिए। प्रतिक्रियाओं भी एक नाइट्रोजन वातावरण में बाहर किया जाना चाहिए।

(ईसी की OJ एल 358/1 1986/12/18 हमारे प्रक्रियाओं जानवरों को शामिल प्रयोगात्मक और अन्य वैज्ञानिक उद्देश्यों (डीएम 116,192), और यूरोपीय आर्थिक समुदाय के नियमों के लिए इस्तेमाल जानवरों के संरक्षण पर इतालवी नियमों के अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं: नैतिक बयान )।

नोट: संश्लेषण [(3 एस) -2-oxoazetidin-3-YL] अमोनियम एसीटेट बड़े पैमाने पर पैदावार के लिए वर्णन किया गया है, लेकिन यह आसानी से नीचे पहुंचा जा सकता है (के एन -Cbz एल सेरीन 50 ग्राम)।

1. संश्लेषण

ध्यान दें: संश्लेषण प्रतिक्रिया योजना के लिए चित्रा 1 देखें।

  1. 2-pyridyl Undec-10-ynyl कार्बोनेट की तैयारी और Undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-कार्बोक्सिलेट
    1. एक 50 मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी में, undec- के 350 मिलीग्राम भंगसूखी क्लोराइड का 3.5 मिलीलीटर में 10-yn-1-राजभाषा।
    2. 1.1.1 में समाधान करने के लिए, 4-dimethylaminopyridine (DMAP) और 2-dipyridylcarbonate (डीपीसी) की 530 मिलीग्राम की 25 मिलीग्राम जोड़ें। 16 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में मिश्रण हिलाओ।
    3. क्लोराइड का 20 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. एक अलग करने कीप में मिश्रण स्थानांतरण। पानी के 15 मिलीलीटर जोड़ें, इसे हिला, और दो चरणों अलग करने के लिए अनुमति देते हैं।
    5. पानी निकलने की टोंटी खोलें, जैविक चरण (नीचे) जमा है, और फिर पानी निकलने की टोंटी बंद करें। एक संतृप्त 3 NaHCO समाधान के 15 मिलीलीटर जोड़ें। अलग करने कीप हिला और दो चरणों अलग न करे। इस कदम दो बार दोहराएँ।
    6. ना 2 अतः 4 के साथ कार्बनिक परत सूखा, एक दौर नीचे कुप्पी (बारदाना प्रथम) में कपास के माध्यम से फिल्टर, और कम दबाव (रोटरी बाष्पीकरण) के तहत सूखापन के लिए लुप्त हो जाना।
    7. कुप्पी वजन और है कि 2-pyridyl undec-10-ynyl कार्बोनेट और undec-10-ynyl 1.7 के अनुपात में 2-oxopyridine 1-कार्बोक्सिलेट का एक मिश्रण है तेल की 600 मिलीग्राम प्राप्त: 1।
      1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, DMSO- डी 6) प्रमुख घटक δ = 8.39 (डीडी, जम्मू = 5.0, 2.0, 1H), 7.98 (टीडी, जम्मू = 7.9, 2.0, 1H), 7.40 (DDD, जम्मू = 7.2, 4.9, 0.9, 1H), 7.30 (घ, जम्मू = 8.2, 1H), 4.22 (टी, जम्मू = 6.6, 2H), 2.73 (टी, जम्मू = 2.4, 1H) 2.18 - 2.11 (मीटर, 2H), 1.76 - 1.62 (मीटर, 2H) 1.50 - 1.23 (मीटर, 12H)।
      1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, DMSO- डी 6) छोटे घटक δ = 7.74 (डीडी, जम्मू = 7.2, 1.9, 1h), 7.47 (डीडी, जम्मू = 6.7, 2.3, 1H), 6.44 (घ, जम्मू = 9.4, 1H), 6.30 - स्कोर 6.25 (मीटर, 1h), 4.35 (टी, जम्मू = 6.5, 2H), 2.72 (टी, जम्मू = 2.4, 1H) 2.18 - 2.11 (मीटर, 2H), 1.77 - 1.60 (मीटर, 2H ), 1.52 - 1.20 (मीटर, 12H)।
    8. किसी भी आगे की जुदाई या शुद्धि के बिना तेल का प्रयोग करें।
  2. [(3 एस) -2-oxoazetidin-3-YL] अमोनियम एसीटेट की तैयारी
    1. लोबान एन की तैयारी - [(एस) -1 (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyphenyl) अमीनो] -2-oxoethYL] carbamate।
      1. एक 4-एल दौर नीचे कुप्पी में, tetrahydrofuran के 1.5 एल और क्लोराइड का 0.5 एल में पी -anisidine का 141.5 ग्राम भंग।
      2. एक बर्फ स्नान में 0 डिग्री सेल्सियस के समाधान कूल।
      3. एन -Cbz एल सेरीन का 50.0 ग्राम जोड़ें और एन के 43.9 जी - (3-dimethylaminopropyl) - एन '-ethylcarbodiimide हाइड्रोक्लोराइड।
      4. 30 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय पट्टी के साथ मिश्रण हिलाओ।
      5. बर्फ स्नान से समाधान निकालें और 16 घंटे के लिए आरटी पर एक चुंबकीय पट्टी के साथ हलचल।
      6. कम दबाव (रोटरी बाष्पीकरण) के तहत सॉल्वैंट्स लुप्त हो जाना।
      7. 1 के 400 मिलीलीटर जोड़ें: 1 cyclohexane / एथिल एसीटेट, एक रंग के साथ हलचल, और छानना।
      8. दोहराएँ कदम 1.2.1.7 दो बार।
      9. एथिल एसीटेट की 500 मिलीलीटर में चिपचिपा छाछ भंग और 0.1 एम एचसीएल समाधान (10 बार) के 400 मिलीलीटर के साथ धोने की संतृप्त 3 NaHCO समाधान 400 मिलीलीटर के साथ (2 बार), और नमकीन के साथ 400 मिलीलीटर।
      10. साथ कार्बनिक परत सूखी2 Na अतः 4, एक दौर नीचे कुप्पी (बारदाना प्रथम) में कपास के माध्यम से समाधान फ़िल्टर, और यह लुप्त हो जाना कम दबाव (रोटरी बाष्पीकरण) के तहत सूखापन के लिए।
      11. कुप्पी वजन और एक सफेद ठोस का 61.4 छ प्राप्त करते हैं।
        1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, DMSO- डी 6) δ = 9.86 (बी एस, 1H), 7.52 (घ, 2H, जम्मू = 9.0 हर्ट्ज), 7.42-7.25 (मीटर, 6H), 6.91-6.85 (मीटर, 2H) , 5.06 (घ, 1H, जम्मू = 12.9 हर्ट्ज), 5.02 (घ, 1H, जम्मू = 12.9 हर्ट्ज), 4.98 (टी, 1h, जम्मू = 5.6 हर्ट्ज), 4.24-4.15 (मीटर, 1h), 3.72 (एस, 3H), 3.70-3.57 (मीटर, 2H)।
    2. लोबान एन की तैयारी - [(एस) -1 (4-methoxyphenyl) -2-ऑक्सो-azetidin-3-YL] carbamate।
      1. एन के 58.6 ग्राम भंग - [(एस) -1 (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyphenyl) अमीनो] -2-ऑक्सो-एथिल] एन, एन -dimethylformamide के 1.6 एल में carbamate।
      2. एक बर्फ स्नान के साथ 0 डिग्री सेल्सियस के समाधान कूल।
      3. 1,1'-sulfonyldiimidazole की 50.6 छ जोड़ें और 30 मिनट के लिए एक चुंबकीय पट्टी के साथ हलचल।
      4. समाधान कूलएक बर्फ / NaCl स्नान के साथ -20 डिग्री सेल्सियस और सोडियम हाइड्राइड (खनिज तेल में 60%) की 10.2 ग्राम जोड़ने के लिए भाग-वार करने के लिए।
      5. 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण हिलाओ, और फिर मेथनॉल के 2 मिलीलीटर और पानी का 1 एल के साथ बुझा लेते हैं।
      6. वैक्यूम वेग फिल्टर, पानी की 200 मिलीलीटर से धो लें, और वैक्यूम के तहत शुष्क।
      7. एक सफेद ठोस का 42.2 छ प्राप्त करते हैं।
        1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, DMSO- डी 6) δ = 8.08 (घ, 1H, जम्मू = 8.5 हर्ट्ज), 7.42-7.28 (मीटर, 5 एच), 7.30 (घ, 2H, जम्मू = 8.9 हर्ट्ज), 6.95 (घ , 2H, जम्मू = 8.9 हर्ट्ज), 5.06 (एस, 2H), 4.86 (DDD, 1h, जम्मू = 8.5, 5.6, 2.6 हर्ट्ज), 3.90 (टी, 1h, जम्मू = 5.6 हर्ट्ज), 3.73 (एस, 3H) , 3.55 (डीडी, 1H, जम्मू = 5.6, 2.6 हर्ट्ज)।
    3. लोबान एन की तैयारी - [(एस) -2-oxoazetidin-3-YL] carbamate।
      1. निलंबित लोबान एन के 9.0 जी - [(एस) -1 (4-methoxyphenyl) -2-oxoazetidin-3-YL] carbamate पानी की 400 मिलीलीटर 500 मिलीलीटर acetonitrile की और में।
      2. एक बर्फ स्नान में 0 डिग्री सेल्सियस के समाधान कूल।
      3. Ceri के 45.4 ग्राम जोड़ेंसी अमोनियम नाइट्रेट हिस्से के लिहाज से 45 मिनट से अधिक और 15 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय पट्टी के साथ हलचल।
      4. सावधानी से संतृप्त 3 NaHCO समाधान 500 मिलीलीटर जोड़ें, और फिर एथिल एसीटेट की 500 मिलीलीटर जोड़ें।
      5. वेग फ़िल्टर और एथिल एसीटेट के 200 मिलीलीटर से धो लें।
      6. अलग biphasic समाधान और एथिल एसीटेट के 200 मिलीलीटर (3 बार) के साथ जलीय परत धो लें।
      7. ना 2 अतः 4 के साथ कार्बनिक परत सूखी, diatomaceous सिलिका के एक पैड के माध्यम से सक्रिय लकड़ी का कोयला के 5 ग्राम, फिल्टर जोड़ने के लिए, और कम दबाव (रोटरी बाष्पीकरण) के तहत सूखापन के लिए लुप्त हो जाना।
      8. Diethyl ईथर जोड़ें और एक रंग के साथ हलचल।
      9. फिल्टर ठोस और एक सफेद ठोस के 4.85 छ प्राप्त करते हैं।
        1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, DMSO- डी 6) δ = 7.97 (घ, 1H, जम्मू = 8.7 हर्ट्ज), 7.94 (बी एस, 1H), 7.42- 7.30 (मीटर, 5 एच), 5.05 (एस, 2H), 4.67 (DDD, 1h, जम्मू = 8.7, 5.4, 2.7 हर्ट्ज), 3.40 (टी, 1h, जम्मू = 5.4 हर्ट्ज), 3.09 (डीडी, 1H, जम्मू = 5.4, 2.7 हर्ट्ज)।
      [(एस) -2-oxoazetidin-3-YL] -ammonium एसीटेट की तैयारी।
      1. एथिल एसीटेट की 245 मिलीलीटर में एसिटिक एसिड के 0.93 मिलीलीटर भंग। के रूप में इस मार्क "समाधान फँसाने।"
      2. इथेनॉल की 298 मिलीलीटर में [(आर) -2-oxoazetidin-3-YL] carbamate - benzyl- एन की 3.28 ग्राम भंग।
      3. cyclohexadiene की 14.1 मिलीग्राम और कार्बन पर 10% पैलेडियम की 3.27 ग्राम जोड़ें।
      4. 12 घंटे के लिए आरटी पर निलंबन हिलाओ, और फिर diatomaceous पृथ्वी की एक छोटी पैड के माध्यम से फिल्टर। एल्यूटिंग तरल फँसाने समाधान में सीधे डालो।
      5. कम दबाव (रोटरी बाष्पीकरण) के तहत विलायक लुप्त हो जाना, 35 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान में रखते हुए।
      6. tetrahydrofuran साथ Triturate प्राप्त ठोस और एक सफेद ठोस के 1.72 छ प्राप्त करते हैं।
        1 एच एनएमआर (400 मेगाहर्ट्ज, DMSO- डी 6) δ = 7.68 (बी एस, 1H), 3.99 (DDD, 1h, जम्मू = 5.2, 2.4, 1.2 हर्ट्ज), 3.32 (टी, 1h, जम्मू = 5.2 हर्ट्ज), 2.79 (डीडी, 1H, जम्मू = 5.2, 2.4 हर्ट्ज), 1.90 (एस, 3H)।
  3. की तैयारी Undec-10-एन ynyl- - [(3 एस) -2-oxoazetidin-3-YL] carbamate
    1. एक 10 मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी में, शुष्क क्लोराइड के 2 मिलीलीटर में [(3 एस) -2-oxoazetidin-3-YL] अमोनियम एसीटेट के 60 मिलीग्राम भंग।
    2. एक बर्फ स्नान में 0 डिग्री सेल्सियस के समाधान कूल और, एन -diisopropylethylamine बूंद के लिहाज से एन के 81 μl जोड़ें।
    3. सूखी क्लोराइड के 2 मिलीलीटर में undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-कार्बोक्सिलेट युक्त कच्चे तेल के मिश्रण के 350 मिलीग्राम भंग समाधान करने के लिए इसे जोड़ने के लिए, और 15 घंटे के लिए आरटी पर हलचल। कम दबाव (रोटरी बाष्पीकरण) के तहत सूखापन के लिए विलायक लुप्त हो जाना।
    4. कॉलम क्रोमैटोग्राफी (सिलिका जेल) एक स्वचालित कॉलम क्रोमैटोग्राफी तंत्र का उपयोग करके शुद्ध:
      1. सिलिका जेल पर नमूना अवशोषित, cyclohexane साथ स्तंभ संतुलित करना, और कारतूस में नमूना लोड।
      2. 0 0 करने के लिए: 100 से cyclohexane / एथिल एसीटेट के साथ Elute 100 और टेस्ट ट्यूब पर चोटियों इकट्ठा।
      3. अंशों कम दबाव (रोटरी बाष्पीकरण) के तहत सूखापन के लिए परिसर के लिए इसी की विलायक लुप्त हो जाना और एक सफेद ठोस के 40 मिलीग्राम प्राप्त करते हैं।

2. सीसी अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 5 मिमी स्टॉक टैग-azide अणु के समाधान की तैयारी
    1. (DMSO) डाइमिथाइल sulfoxide के 0.5 मिलीलीटर में अब्द-PEG3-स्त्राव 545 के 1.5 मिलीग्राम भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में aliquots और दुकान बनाओ।
    2. DMSO के 0.5 मिलीलीटर में अब्द-PEG3 बायोटिन की 1.1 मिलीग्राम भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में aliquots और दुकान बनाओ।
  2. Tris के 50 मिमी स्टॉक समाधान की तैयारी (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP)
    1. पानी के 1 मिलीलीटर में TCEP की 14.3 मिलीग्राम भंग, और यह ताजा हर बार करते हैं।
  3. CuSO 4 की 50 मिमी समाधान की तैयारी · 5H 2 ओ
    1. एक कांच की शीशी में भंग 12पानी के 1 मिलीलीटर में CuSO 4 · 5H 2 ओ की 0.48 मिलीग्राम। अप करने के लिए एक महीने के लिए आरटी पर स्टोर।
  4. 83.5 मिमी स्टॉक Tris के समाधान की तैयारी [(1-लोबान-1H-1,2,3-triazol-4-YL) मिथाइल] अमाइन (TBTA)
    1. एक कांच की शीशी में, DMSO के 200 μl में TBTA की 8.85 मिलीग्राम भंग। अप करने के लिए एक महीने के लिए आरटी पर स्टोर।
  5. TBTA की 1.7 मिमी काम की तैयारी समाधान (तुरंत उपयोग करने से पहले)
    1. एक कांच की शीशी को 83.5 मिमी TBTA के 20 μl जोड़ें और DMSO के 180 मिलीलीटर के साथ पतला।
    2. Tert -Butanol और भंवर के 800 μl जोड़ें।

सीएफए इलाज चूहे का पंजा ऊतक में 3. naaa एक्सप्रेशन विश्लेषण

नोट: उपयोग पुरुष Sprague-Dawley चूहों, 175-200 ग्राम वजन, और जानवरों के नैतिक उपयोग के लिए दिशा-निर्देशों के अनुसार सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर हवादार पिंजरों में सदन चूहों और उन्हें भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच दे। सीएफ के प्रोटोकॉल के लिएएक इलाज है, लेख 7 दिन सीएफए प्रशासन के बाद Bonezzi एट अल। 29 उपयोग जानवरों द्वारा प्रकाशित करने के लिए देखें।

  1. ARN14686 की नसों में प्रशासन
    1. वाहन (15% खूंटी और 15% के बीच नमकीन घोल) में ARN14686 भंग। चूहे के वजन (खुराक 3 मिलीग्राम / किलो, इंजेक्शन की मात्रा 5 मिलीग्राम / किग्रा) के अनुसार समाधान एकाग्रता की गणना।
    2. तीन भोले और तीन सीएफए इलाज चूहों में चतुर्थ इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ें। एक उपयुक्त प्लास्टिक संयम डिवाइस में प्रत्येक चूहे रखें। फिर, 2-4 मिनट के लिए गर्म पानी में चूहे की पूंछ जगह वैसोडायलेटेशन अनुमति देने के लिए, और पूंछ नस के माध्यम से परिसर चतुर्थ इंजेक्षन।
    3. केवल वाहन के साथ तीन चूहों (भोले और सीएफए इलाज) चतुर्थ इंजेक्षन।
  2. पंजा संग्रह और विच्छेदन
    1. जांच या वाहन प्रशासन के बाद सीओ 2 साँस लेना 4 घंटा से चूहों बलिदान और संयुक्त घुटने के ऊपर उन्हें 0.5 सेमी काटने एक छुरी का उपयोग करके अपने पंजे इकट्ठा।
    2. ध्यान से कैंची की मदद से विच्छेदन के द्वारा त्वचा को हटाने और उन्हें हड्डी से scraping द्वारा मुलायम ऊतकों काटना। हड्डियों को त्यागें और पंजे के नरम ऊतकों इकट्ठा। -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में स्नैप फ्रीज नमूने हैं।
  3. पंजा homogenization और लाइसोसोमल प्रोटीन तैयारी
    नोट:, डिटर्जेंट और अमाइन युक्त buffers का उपयोग से बचें क्योंकि वे सीसी प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं।
    1. पंजा ऊतक फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 7.4 पीएच) और एक protease अवरोध कॉकटेल (देखें सामग्री / अभिकर्मक तालिका) में 4 320 मिलीलीटर मिमी सुक्रोज में (धारा 3.2.1 में वर्णित के रूप में प्राप्त) 3 चूहों से जुडा है और उन्हें homogenize; एक उच्च प्रदर्शन dispersing साधन का उपयोग (देखें सामग्री / अभिकर्मक तालिका)।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 20 मिनट के लिए ऊतक homogenate अपकेंद्रित्र; सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए।
    3. जोड़े पीबीएस में 320 मिमी सुक्रोज के 2 मिलीलीटर और ऊतकों को गोली protease अवरोध कॉकटेल औरएक बार फिर homogenize।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और कदम 3.3.2 से एक करने के लिए सतह पर तैरनेवाला जोड़ें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 XG पर 30 मिनट के लिए एकत्र supernatants अपकेंद्रित्र।
    6. पीबीएस के दो संस्करणों में गोली और resuspend वजन (यानी, गोली से प्रत्येक 100 मिलीग्राम के लिए 200 μl)। एक 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब पर स्थानांतरण और 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर।
    7. नमूने गला लें और -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए फिर से फ्रीज।
    8. ठंड / विगलन चक्र दो बार दोहराएँ।
      नोट: यह कदम प्रोटीन solubilize करने का इरादा है। यदि आवश्यक हो तो रात भर रुक।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100,000 XG पर 1 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला, जो घुलनशील प्रोटीन होता है लाइसोसोमल लीजिए, और गोली त्यागें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या तुरंत प्रोटीन मात्रा का ठहराव के साथ आगे बढ़ें।
    10. एक बीसीए प्रोटीन परख 30 वाणिज्यिक किट का उपयोग प्रोटीन सामग्री यों (देखें सामग्री / अभिकर्मक टेबल
    11. -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक नमूने संग्रहित करें।
  4. अब्द-PEG3 बायोटिन के साथ सीसी
    नोट: सीसी और streptavidin मनका संवर्धन (कदम 3.4-3.6) के प्रोटोकॉल थोड़ा प्रोटोकॉल Speers और Cravatt 31 द्वारा प्रकाशित से संशोधित कर रहे हैं।
    1. probe- और वाहन का इलाज चूहों (भोले और सीएफए इलाज चूहों) से लाइसोसोमल प्रोटीन के 500 μl (1 मिलीग्राम / एमएल, पीबीएस में) तैयार करें।
    2. streptavidin agarose की एक 50% घोल के 40 μl के साथ preclear नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए (उपयोग करने से पहले पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोने)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 4 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला ले।
    3. अब्द-PEG3 बायोटिन और भंवर के एक 5 मिमी स्टॉक का 11.3 μl जोड़ें।
    4. हौसले से तैयार TCEP और भंवर के एक 50 मिमी स्टॉक का 11.3 μl जोड़ें।
    5. एक 50 मिमी CuSO 4 की 11.3 μl के साथ 1.7 मिमी TBTA का एक नया तैयार काम समाधान के लिए Premix 34 μl 2 हे शेयर।
    6. एक premixed TBTA / CuSO 4 · 5H 2 हे समाधान और भंवर के 45.3 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. 2 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते (एक लंबे समय तक ऊष्मायन समय प्रतिक्रिया को प्रभावित नहीं करता है)। इस चरण में प्रोटीन वर्षा का निरीक्षण करें। ऊष्मायन के पहले घंटे के बाद मिला लें।
  5. अतिरिक्त सीसी अभिकर्मकों का हटाया
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6500 XG पर 4 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    2. sonication (एक जांच sonicator के साथ 5 सेकंड) द्वारा ठंड मेथनॉल और resuspend के 750 μl जोड़ें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 6500 XG पर 4 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला एक सिरिंज और सुई का उपयोग कर हटा दें।
    4. दो बार दोहराएँ कदम 3.5.2 (sonication के लिए आवश्यक नहीं है)।
    5. पिछले धोने के बाद, 5 सेकंड के लिए प्रोटीन गोली और sonicate 3x पीबीएस में सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) में 2.5% की 325 μl जोड़ें।
    6. 65 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए नमूने गर्मी और एक sonicateलाभ।
    7. आरटी पर 6,500 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए।
    8. पीबीएस के 1.4 मिलीलीटर 0.5% करने के लिए एसडीएस एकाग्रता कमजोर करने के लिए जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या streptavidin संवर्धन के साथ जारी है।
  6. streptavidin संवर्धन
    1. पीबीएस के साथ, 4.2 मिलीग्राम के लिए कदम 3.5.8 में प्राप्त नमूनों की मात्रा लाने के लिए। एक कट अंत टिप का उपयोग कर streptavidin agarose की एक 50% घोल के 40 μl जोड़ें (उपयोग करने से पहले पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोने)।
    2. रोटेशन के साथ आरटी पर 2 घंटे के लिए सेते हैं और फिर से 1400 x जी 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    3. सुखाने के मोती गोली और एक 1 के लिए मोती हस्तांतरण मिलीलीटर स्तंभ स्पिन अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला उपयोग के बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें (देखें सामग्री / अभिकर्मक तालिका)।
    4. 1% एसडीएस (पीबीएस में) की 3x 1 मिलीलीटर, 3x 1 (पीबीएस में) 6 एम यूरिया की मिलीलीटर, और 4x 1 पीबीएस के मिलीलीटर के साथ गंभीरता से धो लें।
    5. पीबीएस के उपयोग 2x 500 μl मोती आरटी पर 1400 XG पर 2 मिनट के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण करने के लिए। धीरे एक सिरिंज और सुई के साथ सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    6. आरटी पर 15 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस 32 पर 15 मिनट के बाद के लिए क्षालन बफर के 25 μl (6 एम यूरिया, 2 एम Thiourea, 2% एसडीएस, और 6 मिमी बायोटिन, पीबीएस में सभी) जोड़कर राल बाध्य प्रोटीन Elute।
  7. प्रोटीन ब्लाट
    1. (: 9 मिलीलीटर तक 0.5 मिलीग्राम 1 एम Tris एचसीएल का पीएच 6.8, 5 मिलीलीटर 20% की एसडीएस, 5 मिलीग्राम Bromophenol नीले, 3 मिलीलीटर ग्लिसरॉल, और एच 2 ओ 9 मिलीलीटर के लिए) और जोड़ने 6x Laemmli बफर के 5 μl जोड़ने उपयोग करने से पहले 5% β-mercaptoethanol तुरंत। संक्षेप में 2,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र एक 4-12% polyacrylamide जेल में राल और लोड प्राप्त सतह पर तैरनेवाला के 25 μl गोली।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 33 एक सोख्ता झिल्ली पर जेल वैद्युतकणसंचलन और प्रोटीन हस्तांतरण प्रदर्शन करना।
    3. एक अवरुद्ध बफर के 10 मिलीलीटर के साथ 1 घंटे के लिए सोख्ता झिल्ली तर (देखें सामग्री / अभिकर्मक तालिका) युक्त 0.1% बीच 20।, दूध का उपयोग कर के रूप में यह पृष्ठभूमि में वृद्धि कर सकते से बचें।
    4. 0.05% बीच 20 पीबीएस में से 10 मिलीलीटर के साथ झिल्ली धो और फ्लोरोसेंट streptavidin के 10 μl जोड़ने (देखें सामग्री / अभिकर्मक तालिका) आरटी पर बफर प्लस 0.1% बीच-20 के लिए 1 घंटा अवरुद्ध के 10 मिलीलीटर में भंग कर दिया।
    5. एक बार पीबीएस के साथ लड़की (10 मिनट प्रत्येक) पीबीएस में 0.05% बीच 20 के साथ 4 बार धोएं और।
    6. एक छवि स्कैनर का प्रयोग करें (देखें सामग्री / अभिकर्मक तालिका)। साधन और जुड़े कंप्यूटर पर स्विच। तैयार है जब तक प्रतीक्षा करें।
    7. अधिग्रहण के कार्यक्रम शुरू करने और प्रतिदीप्ति मोड का चयन करें। झिल्ली क्षेत्र का चयन करें और सहेजी गई फ़ाइलों के लिए गंतव्य फ़ोल्डर चुनें।
    8. निम्नलिखित अधिग्रहण पैरामीटर सेट: 680 एनएम उत्तेजना लंबाई, BPFR700 फिल्टर, 1000 वी photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) मूल्य (2 चैनल), और 25 माइक्रोन पिक्सेल आकार। छवि मोल।

प्रतिदीप्ति माइक्रो द्वारा माउस फेफड़ों में catalytically सक्रिय naaa 4. स्थानीयकरणप्रतिलिपि

नोट: उपयोग पुरुष 8 से 10 सप्ताह पुरानी चूहों और जानवरों के नैतिक उपयोग के लिए दिशा-निर्देशों के अनुसार सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर हवादार पिंजरों में सदन चूहों और उन्हें भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच दे।

  1. चूहे में ARN14686 की नसों में प्रशासन
    1. वाहन में ARN14686 भंग: 15% खूंटी और 15% बीच 20 खारा समाधान। माउस वजन (खुराक 3 मिलीग्राम / किलो, इंजेक्शन की मात्रा 5 मिलीग्राम / किग्रा) के अनुसार समाधान एकाग्रता की गणना।
    2. 3 चूहों के चतुर्थ इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ें। एक उपयुक्त प्लास्टिक संयम डिवाइस में प्रत्येक माउस रखें। फिर, 2-4 मिनट के लिए गर्म पानी में माउस पूंछ जगह वैसोडायलेटेशन की अनुमति है और पूंछ नस के माध्यम यौगिक चतुर्थ इंजेक्षन करने के लिए।
    3. केवल वाहन के साथ 3 चूहों चतुर्थ इंजेक्षन।
  2. फेफड़े संग्रह और टुकड़ा तैयारी
    चेतावनी: एक धूआं हुड में देखभाल के साथ paraformaldehyde संभाल, और दस्ताने पहनते हैं!
    1. Chlo के साथ चूहों anesthetizeRAL हाइड्रेट (400 / किलो मिलीग्राम)। एक पैर की अंगुली चुटकी के साथ संज्ञाहरण की पुष्टि करें। इस प्रकार के रूप में एक transcardial छिड़काव करें:
      1. अल्पज्ञता कैंची के साथ उदर त्वचा में कटौती और बेनकाब वक्ष और पेरिटोनियल झिल्ली सतहों।
      2. अल्पज्ञता, कैंची से पेरिटोनियल झिल्ली में कटौती सिर्फ xyphoid प्रक्रिया के नीचे, और डायाफ्राम और आंत अंगों को बेनकाब। किसी भी महत्वपूर्ण वाहिका फाड़ना नहीं सावधान रहो।
      3. एक पार्श्व पहलू से दूसरे के लिए डायाफ्राम काटने से वक्ष गुहा खोलें।
      4. 25 जी स्वचालित सिरिंज पंप से जुड़ा सुई डालें और 60 में 4% की मिलीलीटर फॉस्फेट बफर में पीएफए ​​(0.1 एम, 7.4 पीएच) के बाद 0.9% खारा समाधान के 20 मिलीलीटर पानी में डालना।
    2. एक बार छिड़काव पूरा हो गया है, संदंश का उपयोग दिल खींचने के लिए और ध्यान से इसे बाहर काटना। संदंश के साथ श्वासनली समझ और कैंची का उपयोग कर के माध्यम से यह पूरी तरह से काट दिया। धीरे ऊपर की तरफ श्वासनली tug और रिब पिंजरे से फेफड़ों को हटा दें। के लिए ऊतक काटनाबाएं से दाएं फेफड़े के अलग।
    3. पोस्टफिक्स 1 घंटा, ठंड 2-methylbutane में फ्रीज के नमूने के लिए में paraformaldehyde 4% ऊतक, और -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान।
    4. , एक cryostat का उपयोग कर 40 माइक्रोन वर्गों लीजिए उन्हें स्लाइड पर तुरंत माउंट (एक हर पांचवें), और नीचे के रूप में विस्तृत immunohistochemistry के लिए उन्हें प्रक्रिया।
  3. ऊतक स्लाइस Permeabilization और अवरुद्ध
    1. पीबीएस (5 मिनट के लिए 2x) से धोएं और आरटी पर 15 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन X-100 पीबीएस के साथ permeabilize।
    2. पीबीएस (5 मिनट के लिए 2x) से धोएं और आरटी पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ ब्लॉक।
    3. पीबीएस (5 मिनट के लिए 2x) से धो और सीसी के साथ आगे बढ़ें।
  4. ऊतक स्लाइस पर अब्द-PEG3-स्त्राव 545 सीसी के साथ
    1. धारा 2 में वर्णित के रूप में 1 मिलीलीटर समाधान के लिए तैयार सीसी अभिकर्मकों के मिश्रण से एक समाधान तैयार, जोड़ें: अब्द-PEG3-स्त्राव 545 (5 मिमी शेयर) के 2 μl, TCEP के 20 μl (हौसले से 50 मिमी stoc तैयारकश्मीर), TBTA की 58.8 μl (हौसले 1.7 मिमी काम कर समाधान तैयार), CuSO 4 · पीबीएस के 5H 2 ओ (50 मिमी शेयर), और 900 μl के 20 μl।
    2. ऊतक स्लाइस, जो धारा 4.2 के अनुसार तैयार किए गए सीसी मिश्रण के लगभग 400 μl जोड़ें। ध्यान दे कि सीसी मिश्रण के चुने मात्रा स्लाइस को कवर करने के लिए पर्याप्त है। आरटी पर 1 घंटे के प्रकाश से सुरक्षित लिए सेते हैं।
    3. पीबीएस (5 मिनट के लिए 1x), ठंड मेथनॉल (5 मिनट के लिए 1x), पीबीएस में 1% बीच 20 और 0.5 मिमी EDTA (2 मिनट के लिए 3x) का एक समाधान है, और पीबीएस (5 मिनट के लिए 1x) के साथ धोएं।
    4. शुष्क हवा, DAPI के साथ antifade mountant की एक बूंद को जोड़ने (देखें सामग्री / अभिकर्मक तालिका), कवर फिसल जाता है (बुलबुला गठन से परहेज) के साथ करीब है, और पॉलिश के साथ सील। विश्लेषण जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  5. चित्र अधिग्रहण
    1. एक confocal 546 एनएम और 450 एनएम उत्तेजना लेज़रों के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें (देखें सामग्री / अभिकर्मक तालिका) निम्नलिखितउपयोगकर्ता गाइड।
    2. , एनए = 1.40 के साथ एक 60x उद्देश्य लेंस का चयन eyepieces के माध्यम से स्लाइड पूर्वावलोकन करने के लिए सुनिश्चित कर रही है और ब्याज की एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने के लिए।
    3. नमूना और उपकरण सुविधाओं के अनुसार अधिग्रहण के मापदंडों का निर्धारण।

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Representative Results

ARN14686 naaa अवरोध ARN726 के पाड़ के आधार पर तैयार किया गया था। ARN726 की 4-ब्यूटाइल-Cyclohexyl समूह एक C9 संतृप्त स्निग्ध श्रृंखला एक टर्मिनल alkyne टैग (चित्रा 1) के असर के साथ प्रतिस्थापित किया गया था। alkyne टैग के क्रम में एक fluorophore या सीसी के माध्यम से एक बायोटिन अणु जोड़ने के लिए एक दो कदम लेबलिंग प्रक्रिया के उपयोग की अनुमति के लिए पेश किया गया था। यह सुविधा इन विट्रो और इन विवो में naaa की जांच के लिए एक बहुत बहुमुखी उपकरण ARN14686 प्रदान करता है।

यहाँ, हम ARN14686 के दो आवेदन, जो इस अणु की क्षमता के प्रतिनिधि हैं दिखा। चित्रा 2 प्रयोगात्मक प्रक्रिया रिपोर्ट यहाँ की एक योजना है। जांच के चतुर्थ प्रशासन के बाद, दो अलग अलग तरीकों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: i) प्रोटीन धब्बा द्वारा सक्रिय naaa अभिव्यक्ति के विश्लेषण और ii) fluorescenc द्वारा कोशिकाओं के भीतर सक्रिय naaa अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के विश्लेषणई माइक्रोस्कोपी।

पहली प्रतिनिधि परिणाम हाल ही में हमारे समूह 29 द्वारा प्रकाशित किया गया था। हम सीएफए प्रेरित पंजा सूजन के एक चूहे मॉडल में naaa अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। जांच (3 मिलीग्राम / किग्रा) या वाहन भोले और सीएफए इलाज चूहों में चतुर्थ इंजेक्ट किया गया था। चूहों 4 घंटा बाद में बलिदान किया गया। सीसी समृद्ध लाइसोसोमल निष्कर्षों पर प्रदर्शन किया गया था जांच-लेबल प्रोटीन पर एक बायोटिन टैग लागू करने के लिए। Biotinylated प्रोटीन अगले थे streptavidin मोतियों का उपयोग कर समृद्ध। Eluted प्रोटीन प्रोटीन धब्बा द्वारा विश्लेषण किया गया, दिखा रहा है कि सक्रिय naaa के स्तर को स्पष्ट रूप से नियंत्रण चूहों के उन लोगों के लिए सीएफए रिश्तेदार (चित्रा 3) के साथ इलाज चूहों के पंजे में बढ़ रहे थे। प्रोटीन धब्बा विश्लेषण का लाभ यह है कि यह जांच प्रतिक्रियाशील proteome, जो जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है की एक विस्तृत जांच के लिए सक्षम बनाता है। यह दृष्टिकोण भी संभावित जांच बंद लक्ष्यों के अनावरण के लिए अनुमति देता है। एक नहीं, जांच के नियंत्रण अल होना चाहिएतरीके आदेश अंतर्जात biotinylated प्रोटीन है, जो प्रायोगिक पृष्ठभूमि गठन को बाहर करने में शामिल थे। चित्रा 3 में नोक ऐसी पृष्ठभूमि प्रोटीन है, जो बारी में एक लोडिंग संदर्भ नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है इंगित करता है।

एक दूसरे अप्रकाशित प्रयोग (चित्रा 4) में, हम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पूर्व vivo का पता लगाने के लिए जांच के लिए naaa ARN14686 इस्तेमाल किया। हम 3 मिलीग्राम / किग्रा (iv) में चूहों को ARN14686 दिलाई और transcardial छिड़काव द्वारा उपचार के बाद 2 घंटा उन्हें बलिदान कर दिया। फेफड़े, एकत्र postfixed, और ठंड 2-metylbutane में जमे हुए थे। fluorophore इसके लिए सीसी प्रतिक्रिया 40 माइक्रोन मोटाई के ऊतक स्लाइस, एक cryostat के साथ एकत्र पर सीधे प्रदर्शन किया गया था। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण वायुकोशीय मैक्रोफेज से संबंधित विसरित vesicular संरचनाओं में catalytically सक्रिय naaa की उपस्थिति देखी गई। एक प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, केवल एक की तुलनाctive एंजाइम मनाया जाता है।

आकृति 1

चित्रा 1:। ARN14686 संश्लेषण प्रतिक्रिया योजना Undec-10-yn-2-राजभाषा उत्प्रेरक 4-dimethylaminopyridine (DMAP) की उपस्थिति में dipyridylcarbonate (डीपीसी) द्वारा सक्रिय हो गया था एक मिश्रित कार्बोनेट के उत्पादन के लिए। इस कार्बोनेट तो अमीनो lactam लक्ष्य अणु ARN14686 प्राप्त करने के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की गई थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। सामान्य रणनीति वर्तमान कार्य में दिखाया गया है कार्यप्रवाह योजना जांच जानवरों (चूहों या चूहों) में इंजेक्शन और लक्ष्य है अभिव्यक्ति दो अलग प्रयोगात्मक प्रक्रिया के बाद विश्लेषण किया जाता हैS: मुझे) लेबल proteome निकाला जाता है और बायोटिन सीसी से जोड़ा जाता है। streptavidin मोतियों पर biotinylated प्रोटीन का एक संवर्धन चरण के बाद, जांच के लक्ष्यों प्रोटीन धब्बा द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। ii) ऊतक स्लाइस तैयार कर रहे हैं और एक fluorophore सीसी से जोड़ा जाता है। जांच लक्ष्य स्थानीयकरण पुष्पन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया है। यह आंकड़ा Bonezzi एट अल से अनुकूलित किया गया है। 29 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। सीएफए इलाज चूहों के पंजे में naaa सक्रियण के विश्लेषण से 7 दिनों के इंजेक्शन के बाद भोले चूहों (गलियों 1 और 2) या सीएफए इंजेक्शन चूहों से streptavidin समृद्ध प्रोटीन की प्रोटीन धब्बा विश्लेषण (गलियों 3 और 4)। चूहे वाहन या ARN14686 (3 मिलीग्राम / किग्रा) के चतुर्थ इंजेक्शन प्राप्त किया। सोख्ता झिल्लीएक फ्लोरोसेंट streptavidin के साथ जांच की गई थी। तीर naaa बैंड इंगित करता है; नोक लगभग 90 केडीए के एक बायोटिन युक्त बैंड इंगित करता है, दिखा रहा है कि प्रोटीन के एक समान राशि प्रत्येक गली में भरी हुई थी। यह आंकड़ा Bonezzi एट अल से संशोधित किया गया है। 29 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। की जांच लेबल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा माउस फेफड़ों में naaa वाहन (ए) के फेफड़ों वर्गों या ARN14686 इंजेक्शन (बी) azide-PEG3-स्त्राव 545 सीसी के साथ के बाद चूहों के प्रतिनिधि चित्रों रिपोर्ट कर रहे हैं पूर्व vivo का पता लगाने। एक सकारात्मक संकेत (लाल कोशिकाओं), ARN14686 इंजेक्शन चूहों में पाया गया था, जबकि कोई संकेत वी में पाया गया थाehicle प्रशासित चूहों। एक azide-PEG3-स्त्राव 545 सकारात्मक वायुकोशीय बृहतभक्षककोशिका का विस्तार उच्च बढ़ाई सी में दिखाया गया है। नाभिक DAPI (नीला) के साथ चिह्नित किया गया। स्केल बार = ए में 50 माइक्रोन और सी में 10 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एंजाइम गतिविधि पतले आरएनए प्रतिलेखन, प्रोटीन संश्लेषण, प्रोटीन, बाद translational संशोधन, और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत सहित विभिन्न स्तरों पर विनियमित है। अक्सर, एंजाइम अभिव्यक्ति अकेले अपनी गतिविधि के लिए खाते में नहीं है। ABPP उनके मूल राज्य में प्रोटीन की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। दो सुविधाओं के लिए आवश्यक हैं: एक रासायनिक जांच है कि covalently ब्याज की एक एंजाइम और एक पत्रकार टैग की सक्रिय साइट को बांधता जांच लेबल एंजाइम का पता लगाने के लिए।

जांच के डिजाइन और संश्लेषण की प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण अंक हैं। जांच पर्याप्त समानता है और अपने लक्ष्य के लिए चयनात्मकता होना चाहिए। इसके अलावा, एक संवाददाता टैग की उपस्थिति सगाई लक्ष्य को प्रभावित नहीं करना चाहिए। यह समस्या काफी हद तक एक दो कदम एबीपी, जिसमें रिपोर्टर टैग के बाद लक्ष्य पकड़ा गया है शुरू की है की डिजाइन से दूर है। टैग से मुक्त जांच, विवो अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं जो प्रोटीन गतिविधि मेंएक जीवित कोशिका या जीव, कम से कम बाहरी परिवर्तन के साथ में मूल्यांकन किया जा सकता है। Naaa जांच ARN14686 आवश्यकताओं ऊपर उल्लिखित पूरा करने के लिए डिजाइन किया गया था। Β लस्टम प्रतिक्रियाशील बम naaa अवरोधकों 16,26 के β लस्टम वर्ग के साथ प्राप्त पहले परिणाम के आधार पर चुना गया था। इन यौगिकों covalently एंजाइम उत्प्रेरक सिस्टीन के बंधन से एक शक्तिशाली और चयनात्मक तरीके से naaa रोकना। इसके अलावा, यौगिकों प्रणालीबद्ध सक्रिय 16 होना दिखाया गया था। हम एक C9 संतृप्त स्निग्ध श्रृंखला शुरू की, खाते में लंबे स्निग्ध श्रृंखला के लिए naaa की वृद्धि की समानता ले रही है। एक टर्मिनल alkyne दो कदम लेबलिंग के लिए अनुमति देने के लिए जोड़ा गया है।

एक और महत्वपूर्ण कदम खुराक और इन विवो प्रशासन के लिए समय का चयन होता है। यह प्लाज्मा में जांच, अपने लक्ष्य आत्मीयता, और उसके चयनात्मकता की स्थिरता पर निर्भर करता है। सही खुराक, जबकि पुलिस की सगाई से बचने के लक्ष्य को पकड़ने के लिए अनुमति देने के लिए चयनित किया जाना चाहिएssible ऑफ लक्ष्य। हमने पाया है कि 3 मिलीग्राम / किग्रा ARN14686 चतुर्थ चुनिंदा naaa पर कब्जा करने के लिए इष्टतम था। ज्यादा खुराक लेने मुताबिक़ सिस्टीन amidase, एसिड ceramidase का कब्जा हो गया। उपचार की लंबाई के संबंध में, जब अच्छी तरह से भरकर रखा अंगों का विश्लेषण, फेफड़ों की तरह, एक कम समय (2 घंटा) से जांच कराने के लक्ष्य के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त हो सकता है। पंजे के लिए, हालांकि, हम प्रतिक्रिया समय को दोगुना करने के लिए बाध्य कर रहे थे।

प्रोटीन धब्बा द्वारा लक्ष्य विश्लेषण में एक संभव मुद्दा स्वाभाविक रूप से biotinylated प्रोटीन की उपस्थिति के कारण है। ये अनिवार्य रूप से विशेष जांच लक्ष्य के साथ एक साथ की पहचान की जाएगी। हमने पाया है कि सीसी प्रदर्शन से पहले streptavidin मोतियों के साथ एक preclearing कदम शुरू काफी हमारे परिणामों की गुणवत्ता में वृद्धि हुई। दूसरी ओर, देशी biotinylated प्रोटीन की उपस्थिति संभव लोड हो रहा है कलाकृतियों के लिए नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा स्थानीयकरण के अध्ययन के संबंध में, यह बहुत महत्वपूर्ण है पी के बारे में पता होनाचयनात्मकता बागे, क्योंकि प्रोटीन blots के विपरीत, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ऑफ लक्ष्य से लक्ष्य का गौरव अनुमति नहीं देता है। प्रारंभिक चयनात्मकता के अध्ययन व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए और इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों स्थापित करने के लिए किया जाना चाहिए।

वर्णित तकनीक की सीमाएं मुख्य रूप से प्रयोगात्मक शर्तों, ऐसे डिटर्जेंट और अमाइन युक्त buffers के उपयोग के रूप में है कि सीसी प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते परहेज की आवश्यकता से संबंधित हैं। इन पहलुओं जब एक सेल lysate या एक ऊतक homogenate तैयारी खाते में लिया जाना चाहिए। इसके अलावा, जब एक streptavidin संवर्धन चरण की आवश्यकता है, सामग्री शुरू की राशि एक और मुद्दा गठन किया है, क्योंकि यह प्रक्रिया केवल लागू है जब प्रोटीन सामग्री कम से कम 250 माइक्रोग्राम प्रति नहीं है। इस सीमा में इस तरह के काम कर संस्करणों, प्रोटीन वसूली, सीसी प्रेरित वर्षा के बाद, और streptavidin राल की राशि के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तकनीकी मुद्दों की वजह से सेट किया गया है।

Previouslवाई, naaa गतिविधि ही गतिविधि assays, जो एंजाइम की इन विट्रो सक्रियण के लिए और सब्सट्रेट solubilization 14 के लिए एक सक्रियण बफर के उपयोग की आवश्यकता के प्रदर्शन से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण सक्रिय naaa की उपस्थिति के बारे में नहीं, कुल naaa अभिव्यक्ति के बारे में जानकारी प्रदान करता है। एक और संभावना मटर और OEA के ऊतक के स्तर को मापने के लिए है, लेकिन इस विधि naaa गतिविधि 34,35 मूल्यांकन करने के लिए केवल एक अप्रत्यक्ष तरीके से प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, FAE स्तरों ऐसे जैवसंश्लेषण के रूप में अन्य कारकों से प्रभावित हो सकते हैं। रासायनिक जांच ARN14686 naaa के लिए पहले एबीपी है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल पर कब्जा करने और naaa का सक्रिय रूप visualizing के लिए एक सरल प्रक्रिया को दिखाता है, दोनों इन विट्रो में और vivo में। सभी नमूना जोड़तोड़ जांच लक्ष्य प्रतिक्रियाओं के बाद कर रहे हैं, इस प्रकार एंजाइम के vivo स्थिति के बारे में विश्वसनीय जानकारी दे रही है। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में ARN14686 के उपयोग के एक अनूठे उपकरण टी का प्रतिनिधित्व करता हैओ स्थानीय बनाना सक्रिय naaa। उपलब्ध एंटीबॉडी, जो naaa उत्प्रेरक सबयूनिट पहचान, naaa पूर्ण लंबाई proenzyme और सक्रिय एंजाइम के बीच भेदभाव नहीं करते।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल से शुरू, naaa अभिव्यक्ति और सक्रियण अलग सेल लाइनों और सूजन के पशु मॉडल में विश्लेषण किया जा सकता है। सह स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए बेहतर शारीरिक और रोग की स्थिति में naaa की भूमिका को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole  Sigma Aldrich 367818 Harmful
2-dipyridylcarbonate Fluorochem 11331 Harmful
2-Methylbutan Sigma Aldrich M32631 Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine Sigma Aldrich 107700 Toxic
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 Flammable, Corrosive
Acetonitrile  Sigma Aldrich 34998 Flammable, Toxic
Activated charcoal Sigma Aldrich 161551
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 Harmful
Azide-PEG3-Biotin Jena Biosciences CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545 Jena Biosciences CLK-AZ109
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227
Bio-spin columns Biorad 732-6204
Biotin Sigma Aldrich B4501
Blocking buffer Li-Cor Biosciences 927-40000
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA) Sigma Aldrich A7030
Bromophenol blue Sigma Aldrich B0126
Bruker Avance III 400 Bruker
Celite Sigma Aldrich 419931 Health hazard
Ceric ammonium nitrate  Sigma Aldrich 22249 Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate Sigma Aldrich C8383 Higly toxic
CuSO4.5H2O  Sigma Aldrich 209198 Toxic
Cyclohexadiene Sigma Aldrich 125415 Flammable, Health hazard
Cyclohexane Sigma Aldrich 34855 Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane Sigma Aldrich 34856 Harmful, Health hazard
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Acros Organics 348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) Sigma Aldrich 175943
Ethanol Sigma Aldrich 2860 Flammable, Harmful
Ethyl acetate Sigma Aldrich 34858 Flammable, Harmful
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Irdye 680-LT Streptavidin Li-Cor Biosciences 925-68031
IRDye680-LT Streptavidin  Licor 925-68031 Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol Sigma Aldrich 34966 Highly toxic
Methanol Sigma Aldrich 34860 Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E7750 Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806 Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide Sigma Aldrich 227056 Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine Fluorochem M03053 Harmful
Nikon A1 confocal microscopy Nikon Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0335BOX
Palladium on carbon Sigma Aldrich 330108
p-anisidine Sigma Aldrich A88255 Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde sigma Aldrich 441244 Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)  Sigma Aldrich P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI  Thermo Fisher Scientific P36931 Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich P8340
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)  Sigma Aldrich L3771 Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride  Sigma Aldrich 452912 Flammable
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313
Starion FLA-9000 immage scanner FUJIFILM Read  the user manual
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20349
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Tert-butanol Sigma Aldrich 360538 Toxic, flammable
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 186562 Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea Acros Organics 424542500 Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris Sigma Aldrich RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Sigma Aldrich C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
Triton-x100 Sigma Aldrich X100 Toxic
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Tween-80 Sigma Aldrich P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer IKA
Undec-10-yn-1-ol Fluorochem 13739 Harmful
Urea Sigma Aldrich U5378 Toxic, warm at 50 °C to dissolve

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References

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तैयारी और<em&gt; Vivo</em&gt; के लिए एक गतिविधि आधारित जांच के उपयोग<em&gt; एन</em&gt; -acylethanolamine एसिड Amidase
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Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S., Bonezzi, F., Migliore, M., Di Martino, S., Summa, M., Piomelli, D. Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase. J. Vis. Exp. (117), e54652, doi:10.3791/54652 (2016).

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