Summary
Her beskriver vi fremstilling og anvendelse af et aktivitetsbaseret sonde (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat), der giver mulighed for påvisning og kvantificering af aktive form af det proinflammatoriske enzym N -acylethanolamine syre amidase (NAAA), både in vitro og ex vivo.
Abstract
Aktivitetsbaseret proteinprofilering (ABPP) er en metode til identifikation af et enzym af interesse i en kompleks proteom ved anvendelse af en kemisk probe, som er målrettet mod enzymets aktive steder. En reporter tag indført i proben muliggør påvisning af det mærkede enzym ved in-gel fluorescens scanning, protein-blot, fluorescensmikroskopi eller væskekromatografi-massespektrometri. Her beskriver vi fremstilling og anvendelse af forbindelsen ARN14686, et klik kemi aktivitetsbaseret sonde (CC-ABP), som selektivt genkender enzymet N -acylethanolamine syre amidase (NAAA). NAAA er en cystein hydrolase, der fremmer inflammation ved at deaktivere endogene peroxisomproliferatoraktiveret receptor (PPAR) -alpha agonister, såsom palmitoylethanolamid (PEA) og oleoylethanolamide (OAS). NAAA syntetiseres som en inaktiv fuld længde proenzym, som aktiveres af autoproteolysis i det sure pH i lysosomer. Lokalisering undersøgelser have vist, at NAAA overvejende udtrykkes i makrofager og andre monocyt-afledte celler, såvel som i B-lymfocytter. Vi giver eksempler på, hvordan ARN14686 kan anvendes til at påvise og kvantificere aktiv NAAA ex vivo i gnavere væv ved protein-blot og fluorescensmikroskopi.
Introduction
Almindeligt anvendte metoder til at undersøge ekspressionsmønstre, interaktioner og funktioner af proteiner, herunder væskekromatografi-massespektrometri platforme til shotgun analyse 1,2, gær to-hybrid metoder 3,4, og in vitro-assays, er begrænset ved, at de er ude af stand til at vurdere aktiviteten af proteiner i deres native tilstand. Aktivitetsbaseret protein profilering (ABPP) kan bruges til at udfylde dette hul. I denne fremgangsmåde, små-molekyle prober i stand til kovalent binding til det aktive sted af et enzym af interesse er konjugeret til en reportergruppe, der giver mulighed for måldetektion. Brug af klik-kemi (CC), kan reporter integreres i proben eller kan indføres efter mål indgreb har fundet sted 5,6. Sidstnævnte procedure kræver brug af sonder, der indeholder relevante kemiske grupper, såsom en terminal alkyn eller azid, hvilket kan modificeres med en række reporter reagenser via bio-ortogonale reaktioner such som Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 eller Staudinger ligering 10,11.
For nylig beskrev vi forbindelsen ARN14686 som den første ABP til in vitro og in vivo detektion af cystein hydrolase, NAAA 12. NAAA katalyserer den hydrolytiske deaktivering af mættede og enkeltumættede Faes, herunder oleoylethanolamide (OAS) og palmitoylethanolamid (PEA), som er endogene agonister af den antiinflammatoriske nuklear receptor PPAR-alpha 13-15. NAAA udtrykkes overvejende i makrofager og andre monocyt-afledte celler, såvel som i B-lymfocytter 14,16, hvilket antyder en rolle i reguleringen af den medfødte immunreaktion. Enzymet syntetiseres i ru endoplasmatisk reticulum i en inaktiv form og aktiveres i sure rum i cellen med en autoproteolytisk mekanisme 17. Den autoproteolytisk spaltning genererer en ny N-terminal cystein (C131 i mus og rotter, C126 i mennesker), der er nukleofilen ansvarlig for FAE hydrolyse 18,19. Farmakologisk hæmning af NAAA aktivitet ændrer FAE syntese / nedbrydning balance til fordel for øget cellulære niveauer af FAES 16,20,21. Adskillige β-lacton og β-lactam-derivater har vist sig at inhibere NAAA aktivitet med høj styrke og selektivitet 16,22-26. Disse inhibitorer virker gennem S-acylering af den katalytiske cystein 16,27,28.
Forbindelsen ARN14686 designet baseret på den kemiske struktur af den systemisk aktive, serin-afledt β-lactam NAAA inhibitor, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat) 16. Det 4-butyl-cyclohexylgruppe af ARN726 blev erstattet med en C9 mættet alifatisk kæde, der bærer en terminal alkyn tag for efterfølgende CC konjugering med et azid-bærende reporter tag. Vi valgte at designe en to-trins ABP at minimally ændre strukturen af det oprindelige stillads opretholder således affiniteten af probe for NAAA. Desuden undgår indførelsen af voluminøse tags, kan en sådan probe være mere egnet til in vivo-behandling end en direkte ABP. ARN14686 inhiberer NAAA med stor styrke (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM) ved at danne en kovalent addukt med den katalytiske cystein af enzymet 12. Forsøg i levende rotter viste, at sonden er selektiv i at fange NAAA udtrykt i lungerne. Acid ceramidase, andet cystein amidase der deler 33-34% identitet med NAAA, blev også identificeret som en lav-affinitet mål, når ved hjælp af høj probe koncentrationer (10 uM in vitro, 10 mg / ml intravenøs, iv) 12. Vi har også benyttet ARN14686 at undersøge tilstedeværelsen af aktive NAAA i betændte rottevæv efter indgivelse af komplet Freunds adjuvans (CFA) 29.
Her vil vi skitsere en protokol for preparatipå af ARN14686 (figur 1) og dens anvendelse på undersøgelsen af NAAA aktivering ex vivo. Som et eksempel beskriver vi en eksperimentel procedure at visualisere NAAA i rotte poter efter CFA administration. I dette forsøg er proteiner ekstraheret fra paw væv efter intravenøs injektion af sonden, og ABP-mærkede proteom underkastes CC med biotin-azid. Biotinylerede prøver er beriget ved hjælp streptavidinkugler, og protein blots udføres. I en anden anvendelse, beskriver vi lokalisering af aktiv NAAA ved fluorescensmikroskopi i muselunger fra probe-behandlede mus. I dette tilfælde er vævet i snit og sektioner underkastes CC for rhodamin tilsætning. En arbejdsgang skema er illustreret i figur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Alle kemi reaktioner bør udføres i et ventileret stinkskab og med anvendelse af en lab coat, handsker og beskyttelsesbriller. Reaktionerne bør også udføres i et nitrogenmiljø.
Etisk erklæring: Vores procedurer, som involverer dyr udføres i overensstemmelse med de italienske bestemmelser om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (116.192 DM) og Det Europæiske Økonomiske Fællesskab forskrifter (EFT af EF L 358/1 1986/12/18 ).
BEMÆRK: Syntese af [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetat er beskrevet for store udbytter (50 g N-Cbz-L-serin), men det kan let skaleres ned.
1. Syntese
BEMÆRK: Se figur 1 til syntese reaktionsskema.
- Fremstilling af 2-pyridyl undec-10-ynyl carbonat og undec-10-ynyl 2-oxopyridin 1-carboxylat
- I en 50 ml rundbundet kolbe opløses 350 mg undec-10-yn-1-ol i 3,5 ml tør dichlormethan.
- Til opløsningen i 1.1.1, tilsættes 25 mg 4-dimethylaminopyridin (DMAP) og 530 mg 2-dipyridylcarbonate (DPC). Omrør blandingen ved stuetemperatur (RT) i 16 timer.
- Der tilsættes 20 ml dichlormethan.
- Overfør blandingen til en skilletragt. Der tilsættes 15 ml vand, ryst den, og lade de to faser til at adskille.
- Vandhanen åbnes, indsamle den organiske fase (nederst), og luk derefter stophane. Tilsættes 15 ml mættet NaHCO3-opløsning. Skilletragten rystes og lad de to faser adskilt. Gentag dette trin to gange mere.
- Tør det organiske lag med Na2SO 4, filtreres gennem bomuld i en rundbundet kolbe (tara første) og inddampes til tørhed under reduceret tryk (rotationsinddamper).
- Kolben vejes og opnå 600 mg olie, der er en blanding af 2-pyridyl undec-10-ynyl carbonat og undec-10-ynyl 2-oxopyridin 1-carboxylat i et forhold på 1,7: 1.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) hovedkomponent δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1 H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1 H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1 H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1 H), 2,18 - 2,11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) mindre komponent δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1 H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1 H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6,30 - 6,25 (m, 1 H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1 H), 2,18 - 2,11 (m, 2H), 1,77 - 1,60 (m, 2H ), 1,52 - 1,20 (m, 12H). - Brug olien uden yderligere adskillelse eller oprensning.
- Fremstilling af [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetat
- Fremstilling af benzyl-N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyphenyl) amino] -2-oxoethyl] carbamat.
- I en 4-liters rundbundet kolbe opløses 141,5 g p-anisidin i 1,5 I tetrahydrofuran og 0,5 I dichlormethan.
- Opløsningen afkøles til 0 ° C i et isbad.
- Tilføj 50,0 g N-Cbz-L-serin og 43,9 g N - (3-dimethylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide hydrochloride.
- Blandingen omrøres med en magnetisk bar ved 0 ° C i 30 min.
- Fjern opløsningen fra isbadet og omrøres med en magnetisk bar ved stuetemperatur i 16 timer.
- Fordampe opløsningsmidlerne under reduceret tryk (rotationsinddamper).
- Der tilsættes 400 ml 1: 1 cyclohexan / ethylacetat, omrøres med en spatel, og dekanteres.
- Gentag trin 1.2.1.7 to gange mere.
- Den gummiagtige remanens i 500 ml ethylacetat opløses og vaskes med 400 ml 0,1 M HCI-opløsning (10 gange), med 400 ml mættet NaHCO3-opløsning (2 gange), og med 400 ml saltvand.
- Tør det organiske lag medNa2SO 4, filtreres gennem bomuld i en rundbundet kolbe (tara først) og inddampes den til tørhed under reduceret tryk (rotationsinddamper).
- Kolben vejes og opnå 61,4 g af et hvidt fast stof.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) o = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1 H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
- Fremstilling af benzyl-N - [(S) -1- (4-methoxyphenyl) -2-oxo-azetidin-3-yl] carbamat.
- Opløs 58,6 g N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyphenyl) amino] -2-oxoethyl] carbamat i 1,6 l N, N-dimethylformamid.
- Opløsningen afkøles til 0 ° C med et isbad.
- Tilføj 50,6 g 1,1'-sulfonyldiimidazole og omrøres med en magnetisk bar i 30 minutter.
- Afkøl opløsningentil -20 ° C med et is / NaCl bad og tilsæt 10,2 g natriumhydrid (60% i mineralolie) portionsvis.
- Omrør blandingen ved -20 ° C i 1 time, og derefter stands med 2 ml methanol og 1 l vand.
- Vakuumfilter bundfaldet, vaskes med 200 ml vand, og tør under vakuum.
- Opnå 42,2 g af et hvidt fast stof.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 (ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
- Fremstilling af benzyl-N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat.
- Suspender 9,0 g benzyl-N - [(S) -1- (4-methoxyphenyl) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat i 500 ml acetonitril og 400 ml vand.
- Opløsningen afkøles til 0 ° C i et isbad.
- Tilføj 45,4 g Ceric ammoniumnitrat portionsvis i løbet af 45 minutter og omrøres med en magnetisk bar ved 0 ° C i 15 minutter.
- Der tilsættes 500 ml mættet NaHCO3-opløsning forsigtigt, og derefter tilsættes 500 ml ethylacetat.
- Filtrer bundfaldet og vask med 200 ml ethylacetat.
- Adskil tofasede opløsning og vask det vandige lag med 200 ml ethylacetat (3 gange).
- Tør det organiske lag med Na2SO 4, tilsættes 5 g aktivt kul, filtreres gennem en pude af diatomé silica, og der inddampes til tørhed under reduceret tryk (rotationsinddamper).
- Tilsæt diethylether og omrøres med en spatel.
- Filtrer faststoffet og opnå 4,85 g af et off-white fast stof.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7,30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
- Opløs 0,93 ml eddikesyre i 245 ml ethylacetat. Marker dette som "fældefangst løsning."
- Opløs 3,28 g benzyl- N - [(R) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat i 298 ml ethanol.
- Tilsættes 14,1 ml cyclohexadien og 3,27 g 10% palladium på carbon.
- Suspensionen omrøres ved stuetemperatur i 12 timer, og derefter filtreres gennem en kort pude af diatoméjord. Hæld eluering væske direkte ind i trapping opløsning.
- Opløsningsmidlet afdampes under reduceret tryk (rotationsinddamper), idet temperaturen holdes under 35 ° C.
- Udriv opnåede faste stof med tetrahydrofuran og opnå 1,72 g af et hvidt fast stof.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) o = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1 H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
- Fremstilling af benzyl-N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyphenyl) amino] -2-oxoethyl] carbamat.
- Fremstilling af undec-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat
- I en 10 ml rundbundet kolbe opløses 60 mg [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetat i 2 ml tør dichlormethan.
- Opløsningen afkøles til 0 ° C i et isbad, og der tilsættes 81 pi N, N-diisopropylethylamin dråbevis.
- Opløs 350 mg af den rå blanding indeholdende undec-10-ynyl 2-oxopyridin 1-carboxylat i 2 ml tør dichlormethan, tilføje den til opløsningen, og der omrøres ved stuetemperatur i 15 timer. Opløsningsmidlet afdampes til tørhed under reduceret tryk (rotationsinddamper).
- Der renses ved søjlekromatografi (silicagel) under anvendelse af et automatiseret søjlekromatografi apparat:
- Absorber prøven på silicagel, ligevægt kolonnen med cyclohexan, og indlæse prøven ind i patronen.
- Eluer med cyclohexan / ethylacetat fra 100: 0 til 0: 100 og indsamle toppe på reagensglas.
- Opløsningsmidlet afdampes de fraktioner svarende til forbindelsen til tørhed under reduceret tryk (rotationsinddamper), og opnå 40 mg af et hvidt fast stof.
2. Forberedelse af CC reagenser
- Fremstilling af 5 mM stamopløsning af Tag-azid Molekyler
- Opløs 1,5 mg azid-PEG3-Fluor 545 i 0,5 ml dimethylsulfoxid (DMSO). Foretag portioner i 0,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
- Opløs 1,1 mg azid-PEG3-Biotin i 0,5 ml DMSO. Foretag portioner i 0,5 ml mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
- Fremstilling af 50 mM stamopløsning af Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP)
- Opløs 14,3 mg TCEP i 1 ml vand, og gør det friske hver gang.
- Fremstilling af 50 mM opløsning af CuSO4 · 5H 2 O
- I et hætteglas opløses 12.48 Mg CuSO4 · 5H 2 O i 1 ml vand. Opbevar ved stuetemperatur i op til en måned.
- Fremstilling af 83,5 mM stamopløsning af Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (TBTA)
- I et hætteglas opløses 8,85 mg TBTA i 200 pi DMSO. Opbevar ved stuetemperatur i op til en måned.
- Udarbejdelse af 1,7 mM Working Opløsning af TBTA (umiddelbart før brug)
- Tilsæt 20 pi 83,5 mM TBTA til en glasbeholder og fortyndes med 180 ml DMSO.
- Tilføj 800 pi tert-butanol og vortex.
3. NAAA Expression Analysis in Paw Tissue af CFA-behandlede rotter
BEMÆRK: Brug Sprague-Dawley rotter, der vejer 175-200 g, og udføre alle procedurer i overensstemmelse med retningslinjer for etisk brug af dyr. rotter Hus i ventilerede bure på en 12-timers lys / mørke cyklus og give dem fri adgang til mad og vand. For protokollen af CFEn behandling, henvises til artikel udgivet af Bonezzi et al. 29. Brug dyr 7 dage efter CFA administration.
- Intravenøs administration af ARN14686
- Opløs ARN14686 i bærer (15% PEG og 15% Tween saltvandsopløsning). Beregne koncentrationen opløsning ifølge rotte vægt (dosis 3 mg / kg, injektionsvolumen 5 ml / kg).
- Fortsæt med iv injektioner i tre naive og tre CFA-behandlede rotter. Placer hver rotte i et passende plast fastholdelsesanordning. Derefter placere rotte hale i varmt vand i 2-4 minutter for at tillade vasodilation, og injicere forbindelsen iv via halevenen.
- Injicer tre rotter (naive og CFA-behandlet) iv med kun vehikel.
- Paw Indsamling og Dissection
- Sacrifice rotterne ved CO 2 indånding 4 timer efter sonde eller køretøj administration og indsamle deres poter ved at skære dem 0,5 cm over knæleddet ved hjælp af en skalpel.
- Fjern forsigtigt huden ved saks-assisteret dissektion og dissekere ud bløde væv ved at skrabe dem fra knoglen. Kassér knoglerne og indsamle det bløde væv i poterne. Snap fryse prøver i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
- Paw Homogenisering og Lysosomal proteinpræparat
BEMÆRK: Undgå at bruge rengøringsmidler og aminholdige buffere, da de kan hæmme CC reaktion.- Kombiner paw væv fra 3 rotter (opnået som beskrevet i afsnit 3.2.1) og homogeniseres dem i 4 ml 320 mM saccharose i phosphatpufret saltvand (PBS, pH 7,4) og en protease-inhibitor cocktail (se Materiale / Reagens tabel); bruge en højtydende dispergering instrument (se Materiale / Reagens tabel).
- Centrifugeres vævshomogenatet i 20 min ved 1.000 xg ved 4 ° C; gemme supernatanten.
- Tilsæt 2 ml 320 mM sucrose i PBS og proteaseinhibitoren cocktail til vævet pellet oghomogeniseres endnu en gang.
- Centrifuger i 20 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C, og der tilsættes supernatanten til en fra trin 3.3.2.
- Centrifuger de indsamlede supernatanter i 30 min ved 12.000 xg ved 4 ° C.
- Afvej pelleten og resuspender i to volumener PBS (dvs. 200 pi for hver 100 mg pellet). Overførsel til et 1,5 ml opsamlingsrør og fryse ved -80 ° C i 1 time.
- Optø prøverne og fryse igen i 1 time ved -80 ° C.
- Gentag frysning / optøning cyklus to gange mere.
BEMÆRK: Dette trin har til formål at solubilisere proteinet. Frys natten hvis det er nødvendigt. - Centrifuge i 1 time ved 100.000 x g ved 4 ° C. Saml supernatanten, som indeholder opløselige lysosomale proteiner, og kassér pillen. Opbevar ved -80 ° C eller umiddelbart fortsætte med protein kvantificering.
- Kvantificer proteinindholdet ved hjælp af en BCA proteinanalyse 30 kommercielle kit (se Materiale / Reagens Table
- Opbevare prøverne ved -80 ° C indtil anvendelse.
- CC med azid-PEG3-biotin
BEMÆRK: Protokollen af CC og streptavidin perle berigelse (trin 3,4-3,6) er ændret en smule fra den protokol udgivet af Speers og Cravatt 31.- Forbered 500 pi (1 mg / ml, i PBS) af lysosomale proteiner fra probe- og bærerbehandlede rotter (naive og CFA-behandlede rotter).
- Præclears prøver med 40 pi af en 50% opslæmning af streptavidin-agarose (vask tre gange med 1 ml PBS før anvendelse) i 1 time ved 4 ° C. Centrifugeres i 4 minutter ved 1.000 xg ved 4 ° C og tage supernatanten.
- Tilføj 11,3 pi af en 5 mM bestand af azid-PEG3-Biotin og vortex.
- Tilføj 11,3 pi af en 50 mM bestand af frisk tilberedt TCEP og vortex.
- Premix 34 pi af en frisk fremstillet brugsopløsning på 1,7 mM TBTA med 11,3 pi af en 50 mM CuSO4 2 O lager.
- Tilføj 45,3 ml en forblandet TBTA / CuSO4 · 5H 2 O løsning og vortex.
- Inkubér reaktionen ved 25 ° C i 2 timer (en længere inkubationstid påvirker ikke reaktionen). Overhold proteinpræcipitation på dette trin. Bland efter den første times inkubation.
- Fjernelse af overskydende CC Reagenser
- Centrifugér prøver i 4 minutter ved 6.500 xg ved 4 ° C og supernatanten fjernes.
- Tilføj 750 pi kold methanol og resuspender ved sonikering (5 sek med en sonde-sonikator).
- Centrifugeres prøverne i 4 minutter ved 6.500 xg ved 4 ° C og supernatanten fjernes ved anvendelse af en sprøjte og nål.
- Gentag trin 3.5.2 to gange (lydbehandling er ikke nødvendig).
- Efter den sidste vask tilsættes 325 pi natriumdodecylsulfat (SDS) 2,5% i PBS til proteinet pellet og soniker 3x i 5 sek.
- Opvarm prøverne i 5 min ved 65 ° C og sonikeres etgevinst.
- Centrifuger i 5 minutter ved 6500 xg ved stuetemperatur, og gem supernatanten.
- Tilføj 1,4 ml PBS til at fortynde SDS koncentration til 0,5%. Opbevares ved -20 ° C eller fortsætte med streptavidin berigelse.
- Streptavidin Berigelse
- Med PBS, bringe mængden af prøverne opnået i trin 3.5.8 til 4,2 ml. Tilsæt 40 pi af en 50% opslæmning af streptavidin-agarose anvendelse af en cut-ende spids (vask tre gange med 1 ml PBS før anvendelse).
- Der inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur med rotation og centrifugeres i 2 minutter ved 1400 x g.
- Fjern supernatanten uden at tørre perlerne pellet og bruge resterende supernatant til at overføre perlerne til en 1 ml spinde søjle (se Materiale / Reagent tabel).
- Vask af tyngdekraften med 3x 1 ml 1% SDS (i PBS), 3x 1 ml 6 M urinstof (i PBS), og 4x 1 ml PBS.
- Brug 2x 500 pi PBS for at overføre perlerne til et 1,5 ml rør og centrifugeres i 2 minutter ved 1.400 xg ved stuetemperatur. aspireres forsigtigt supernatanten med en sprøjte og kanyle.
- Eluer det harpiksbundne proteiner ved tilsætning af 25 pi elueringspuffer (6 M urinstof, 2 M thiourinstof, 2% SDS og 6 mM biotin, alle i PBS) i 15 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af 15 minutter ved 95 ° C 32.
- Protein Blot
- Tilsæt 5 pi 6x Laemmli puffer (9 ml: 0,5 ml 1 M Tris-HCI pH 6,8, 5 ml 20% SDS, 5 mg bromphenolblåt, 3 ml glycerol og H2O op til 9 ml) og tilsæt 5% β-mercaptoethanol umiddelbart før brug. Kort fortalt centrifugeres prøverne ved 2000 xg for at pelletere harpiks og belastning 25 pi den opnåede supernatant til en 4-12% polyacrylamidgel.
- Udføre gelelektroforese og protein overdragelse på Blottingmembranen ifølge producentens anvisninger 33.
- Mætte Blottingmembranen i 1 time med 10 ml af en blokerende buffer (se Materiale / Reagens tabel) indeholdende 0,1% Tween-20.Undgå at bruge mælk, da det kan øge baggrunden.
- Vask membranen med 10 ml 0,05% Tween-20 i PBS, og der tilsættes 10 pi fluorescerende streptavidin (se Materiale / Reagens Table) opløst i 10 ml blokerende buffer plus 0,1% Tween-20 i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask 4 gange med 0,05% Tween-20 i PBS og en gang med PBS alene (10 min hver).
- Brug et billede scanner (se Materiale / Reagens tabel). Tænd for instrumentet og den tilsluttede computer. Vent klar.
- Start erhvervelse programmet og vælg fluorescens mode. Vælg membranareal og vælg destinationsmappen for gemte filer.
- Indstil følgende erhvervelse parametre: 680 nm excitation længde, BPFR700 filter, 1.000 V fotomultiplikatorrør (PMT) værdi (kanal 2), og 25 um pixelstørrelse. Erhverve billedet.
4. Lokalisering af katalytisk aktive NAAA i Mouse Lunger af Fluorescence Microskopi
BEMÆRK: Brug male 8 til 10 uger gamle mus og udføre alle procedurer i overensstemmelse med retningslinjerne for etisk brug af dyr. Hus mus i ventilerede bure på en 12 timers lys / mørke cyklus og give dem fri adgang til mad og vand.
- Intravenøs administration af ARN14686 i mus
- Opløs ARN14686 i køretøjet: 15% PEG og 15% Tween-20 saltvandsopløsning. Beregne koncentrationen opløsning ifølge muse vægt (dosis 3 mg / kg, injektionsvolumen 5 ml / kg).
- Fortsæt med iv injektion af 3 mus. Placer hver mus i en passende plast fastholdelsesanordning. Derefter placeres musen halen i varmt vand i 2-4 minutter for at tillade vasodilation og injicere forbindelsen iv via halevenen.
- Injicer 3 mus iv med kun vehikel.
- Lung Indsamling og Slice Forberedelse
Advarsel: Håndter paraformaldehyd med omhu i et stinkskab, og brug handsker!- Bedøver mus med chloral hydrat (400 mg / kg). Bekræft anæstesi med en tå knivspids. Udfør en transcardial perfusion som følger:
- Overfladisk skære den ventrale huden med en saks og eksponere thorax og peritoneale membran overflader.
- Overfladisk skære den peritoneale membran med en saks, lige under xyphoid proces, og udsætte membranen og indre organer. Pas på ikke at lacerate nogen væsentlig kar.
- Åbne brysthulen ved at skære membranen fra én laterale side til den anden.
- Sæt 25 G nål forbundet til den automatiserede sprøjtepumpe og infundere 20 ml 0,9% saltvandsopløsning efterfulgt af 60 ml 4% PFA i phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4).
- Når perfusionen er færdig, trækkes hjerte med pincet og forsigtigt dissekere det ud. Tag fat i luftrøret med pincet og skåret fuldstændigt gennem det med en saks. slæbebåd forsigtigt luftrøret opad og fjerne lungerne fra brystkassen. Dissekere væv tiladskille den højre lunge fra venstre.
- Postfix vævet i paraformaldehyd 4% i 1 time, fryse prøverne i kold 2-methylbutan, og opbevar dem ved -80 ° C.
- Saml 40 um sektioner ved hjælp af en kryostat, montere dem straks på dias (én hver femte), og behandle dem for immunhistokemi som beskrevet nedenfor.
- Bedøver mus med chloral hydrat (400 mg / kg). Bekræft anæstesi med en tå knivspids. Udfør en transcardial perfusion som følger:
- Tissue Skiver Permeabilisering og blokering
- Vask med PBS (2x for 5 min) og permeabilisere med 0,1% Triton X-100 PBS i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Vask med PBS (2x for 5 min) og blokere med 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask med PBS (2x for 5 min) og fortsætte med CC.
- CC med azid-PEG3-Fluor 545 på vævssnit
- Forbered en løsning ved at blande de CC reagenser fremstillet som beskrevet i afsnit 2. For 1 ml opløsning, tilsættes: 2 pi af azid-PEG3-Fluor 545 (5 mM lager), 20 ul TCEP (frisk fremstillet 50 mM stock), 58,8 pi TBTA (frisk fremstillet 1,7 mM arbejder opløsning), 20 pi CuSO4 · 5H 2 O (50 mM stamopløsning) og 900 pi PBS.
- Tilføj omkring 400 ul CC mix til de væv skiver, der blev udarbejdet i overensstemmelse med afsnit 4.2. Vær opmærksom på at den valgte mængde af CC mix er tilstrækkelig til at dække de skiver. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Vask med PBS (1x i 5 minutter), kold methanol (1x i 5 min), en opløsning af 1% Tween-20 og 0,5 mM EDTA i PBS (3x i 2 min), og PBS (1x i 5 minutter).
- Air tør, tilsættes en dråbe antifade mountant med DAPI (se Materiale / Reagens Table), tæt med dækglas (undgå bobledannelse), og forsegle med polish. Opbevares ved 4 ° C indtil analyse.
- Billede Acquisition
- Brug et konfokalt mikroskop udstyret med 546 nm og 450 nm excitation lasere (se Materiale / Reagens tabel) efterbrugervejledningen.
- Vælg en 60X objektiv med NA = 1,40, og sørg for at få vist glide gennem okularerne og fokusere på et område af interesse.
- Bestem parametrene erhvervelse i henhold til prøven og udstyr funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ARN14686 designet baseret på stilladset af NAAA inhibitor ARN726. Det 4-butyl-cyclohexylgruppe af ARN726 blev erstattet med en C9 mættet alifatisk kæde, der bærer en terminal alkyn tag (figur 1). Den alkyn tag blev indført for at tillade anvendelse af en procedure i to trin mærkning for at tilføje en fluorofor eller en biotin molekyle via CC. Denne funktion gør ARN14686 et meget alsidigt værktøj til at probe NAAA in vitro og in vivo.
Her viser vi to anvendelser af ARN14686, der er repræsentative for potentialet i dette molekyle. Figur 2 er et arrangement med den eksperimentelle procedure rapporterede her. Efter intravenøs administration af sonden, kan to forskellige detektionsmetoder anvendes: i) analyse af aktiv NAAA ekspression ved protein-blot og ii) analyse af aktiv NAAA ekspression og lokalisering i celler efter fluorescence mikroskopi.
Den første repræsentativt resultat blev for nylig udgivet af vores gruppe 29. Vi analyserede NAAA ekspression i en rottemodel for CFA-induceret pote inflammation. Proben (3 mg / kg) eller vehikel blev injiceret iv i naive og CFA-behandlede rotter. Rotterne blev aflivet 4 timer senere. CC blev udført på berigede lysosomale ekstrakter til at indføre et biotin-mærke på probe-mærkede proteiner. Biotinylerede proteiner var næste beriget ved hjælp streptavidinkugler. De eluerede proteiner blev analyseret ved protein-blot, som viser, at niveauerne af aktiv NAAA markant blev forøget i poterne hos rotter behandlet med CFA forhold til dem for kontrolrotter (figur 3). Fordelen af protein-blot-analyse er, at den muliggør en detaljeret undersøgelse af probe-reaktive proteom, som er adskilt ved gelelektroforese. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for afsløringen af potentielle probe off-mål. En no-sonde kontrol skal være almåder med for at udelukke endogene biotinylerede proteiner, som udgør den eksperimentelle baggrund. Pilespidsen i figur 3 angiver sådanne baggrund proteiner, som igen kan anvendes som en loading henvisning kontrol.
I et andet eksperiment upubliceret (figur 4), vi anvendte ARN14686 til at probe NAAA til ex vivo detektion ved fluorescensmikroskopi. Vi administreret ARN14686 til mus ved 3 mg / kg (iv) og aflivet dem 2 timer efter behandling med transcardial perfusion. Lunger blev opsamlet, postfikseret, og frosset i kold 2-metylbutane. CC reaktion for fluorophor Desuden blev udført direkte på væv skiver af 40 um tykkelse, der er indsamlet med en kryostat. Analyse ved fluorescensmikroskopi viste tilstedeværelsen af katalytisk aktiv NAAA i diffust vesikuløse strukturer tilhører alveolære makrofager. Sammenlignet med anvendelsen af et protein-specifikt antistof, kun enctive enzym observeres.
Figur 1:. ARN14686 syntese reaktionsskema undec-10-yn-2-ol blev aktiveret ved dipyridylcarbonate (DPC) i nærvær af katalytisk 4-dimethylaminopyridin (DMAP) for at fremstille en blandet carbonat. Denne carbonat blev derefter omsat med det amino lactam at opnå målet molekylet ARN14686. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Arbejdsgang opbygningen af den generelle strategi vist i den foreliggende arbejde Sonden injiceres i dyr (rotter eller mus) og målrette ekspression analyseres efter to forskellige eksperimentelle fremgangsmådes: i) Det mærkede proteom udvindes og biotin er tilføjet af CC. Efter en berigning fase af biotinylerede proteiner på streptavidinkugler, er probe-mål analyseret ved protein-blot. ii) Tissue skiver er forberedt og en fluorofor er tilføjet af CC. Probe target lokalisering analyseres ved fluorescens mikroskopi. Dette tal er blevet tilpasset fra Bonezzi et al. 29 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Analyse af NAAA aktivering i poter CFA-behandlede rotter Protein blot-analyse af streptavidin-berigede proteiner fra naive rotter (bane 1 og 2) eller CFA-injicerede rotter 7 dage efter injektion (bane 3 og 4). Rotter fik iv injektioner af vehikel eller ARN14686 (3 mg / kg). Blottingmembranenblev probet med et fluorescerende streptavidin. Pilen angiver NAAA band; pilespidsen indikerer et biotin-indeholdende bånd på omkring 90 kDa, hvilket viser, at en lignende mængde af protein blev påsat i hver bane. Dette tal har været ændret siden Bonezzi et al. 29 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Ex vivo detektering af probe-mærket NAAA i muselunger ved fluorescensmikroskopi Repræsentative billeder af lungesnit af køretøj og (A) eller ARN14686-injiceret (B) mus efter CC med azid-PEG3-Fluor 545 er rapporteret.. Et positivt signal (erytrocytter) blev påvist i ARN14686-injicerede mus, medens intet signal blev påvist i vehicle-indgivne mus. En detalje af et azid-PEG3-Fluor 545 positive alveolær makrofag er vist i C ved større forstørrelse. Kerner blev markeret med DAPI (blå). Scale bar = 50 um i A og 10 um i C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enzymaktiviteten fint reguleret på forskellige niveauer, herunder RNA-transkription, proteinsyntese, protein translokation, post-translationel modifikation, og protein-protein-interaktion. Ofte enzym udtryk alene tager ikke højde for dets aktivitet. ABPP blev udviklet til at studere aktiviteten af proteiner i deres native tilstand. To funktioner er nødvendige: en kemisk probe, som kovalent binder til det aktive sted af et enzym af interesse og et reporter-tag til påvisning af proben-mærket enzym.
Probe design og syntese er kritiske punkter i proceduren. Sonden skal have tilstrækkelig affinitet og selektivitet for sit mål. Desuden må tilstedeværelsen af en reporter tag ikke påvirke målrette indgreb. Dette problem er i vid udstrækning overvindes ved konstruktionen af en to-trins ABP, hvori reporter tag er indført efter målet er blevet fanget. Tag-free prober er særligt egnede til in vivo-undersøgelser, hvori proteinaktivitetkan evalueres i en levende celle eller organisme, med minimal ekstern ændring. Den NAAA sonde ARN14686 designet til at opfylde de krav, der er skitseret ovenfor. Den β-lactam reaktiv sprænghoved blev valgt baseret på tidligere resultater opnået med β-lactam klasse af NAAA inhibitorer 16,26. Disse forbindelser inhiberer NAAA i en potent og selektiv måde ved kovalent binding til det katalytiske cystein af enzymet. Desuden blev forbindelserne vist at være systemisk aktive 16. Vi indførte et C9 mættet alifatisk kæde, under hensyntagen til den øgede affinitet af NAAA for lange alifatiske kæder. En terminal alkyn blev tilsat for at tillade to-trins mærkning.
Et andet kritisk trin er valg af dosis og tid til in vivo administrering. Dette afhænger af stabiliteten af sonden i plasma, sit mål affinitet og selektivitet. Den korrekte dosis skal vælges for at tillade target capture samtidig undgå indgreb af possible off-mål. Vi fandt, at 3 mg / kg ARN14686 iv var optimal til at fange NAAA selektivt. Højere doser resulterede i erobringen af det homologe cystein amidase, syre ceramidase. Med hensyn til behandling længde, når man analyserer well-perfunderede organer, som lunger, kan en kort tid (2 timer) være tilstrækkelig til at tillade sonden at reagere med målet. For poter, dog var vi nødt til at fordoble reaktionstiden.
En mulig problem i target analyse ved protein-blot skyldes tilstedeværelsen af naturligt biotinylerede proteiner. Disse vil uundgåeligt blive identificeret sammen med specifikke probe mål. Vi fandt, at indføre en preclearing takt med streptavidinkugler før du udfører CC stærkt øget kvaliteten af vores resultater. På den anden side kan tilstedeværelsen af native biotinylerede proteiner anvendes til at styre for mulige loading artefakter. Endelig med hensyn til localization studier ved fluorescensmikroskopi, er det meget vigtigt at være opmærksom på probe selektivitet fordi, i modsætning til protein blots, er fluorescens mikroskopi ikke tillade sondringen af målet fra off-mål. Foreløbige selektivitet undersøgelser bør udføres for at vurdere gennemførlighed og etablere optimale forsøgsbetingelser.
Begrænsninger af den beskrevne teknik hovedsageligt vedrører det nødvendigt at undgå eksperimentelle betingelser, der kan påvirke CC reaktionen, såsom anvendelse af detergenter og aminholdige buffere. Disse aspekter skal tages hensyn til dette ved udarbejdelsen af en cellelysat eller en vævshomogenat. Desuden, når en streptavidin berigelse fase er påkrævet, mængden af udgangsmateriale udgør et andet spørgsmål, fordi denne procedure gælder kun, når proteinindholdet ikke er mindre end 250 pg. Denne grænse er sat på grund af tekniske problemer, såsom arbejdsvilkår mængder, protein opsving, efter CC-induceret nedbør, og mængden af streptavidin harpiks, der skal bruges.
previously, NAAA aktivitet kunne kun evalueres ved at udføre aktivitetsassays, der kræver anvendelse af en aktivering buffer til in vitro-aktivering af enzymet og for substrat solubilisering 14. Denne tilgang indeholder oplysninger om alt NAAA udtryk, ikke om tilstedeværelsen af aktive NAAA. En anden mulighed er at måle væv niveauer af PEA og OAS, men denne metode udgør kun en indirekte måde at evaluere NAAA aktivitet 34,35. Desuden kan FAE niveauer påvirkes af andre faktorer, såsom biosyntese. Den kemiske sonde ARN14686 er den første ABP for NAAA. Protokollen beskrevet her illustrerer en enkel procedure til at indfange og visualisere den aktive form af NAAA, både in vitro og in vivo. Alle prøve manipulationer er efter probe-mål reaktioner, hvilket giver pålidelige oplysninger om in vivo-tilstand af enzymet. Endvidere er anvendelsen af ARN14686 i fluorescensmikroskopi betegner et unikt værktøj to lokalisere aktiv NAAA. Ledige antistoffer, som genkender NAAA katalytiske subunit, ikke diskriminerer mellem NAAA fuld længde proenzym og det aktive enzym.
Begyndende fra protokollen beskrevet her, kan NAAA ekspression og aktivering analyseres i forskellige cellelinier og dyremodeller for inflammation. Co-lokalisering studier kan udføres for at bedre karakterisere rolle NAAA i fysiologiske og patologiske tilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
References
- Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
- Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
- Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
- Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
- Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
- Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
- Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
- Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
- Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
- Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
- Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
- Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
- Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
- Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
- West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
- Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
- Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
- Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
- Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
- Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
- Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
- Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
- Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
- Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
- Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
- Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
- Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
- Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
- Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).
