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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

preparação e Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

Summary

Aqui, nós descrevemos a preparação e utilização de uma sonda com base na actividade (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo), que permite a detecção e quantificação da forma activa da enzima pró-inflamatória N-amidase ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

Abstract

perfis de proteína à base de Actividade (ABPP) é um método para a identificação de uma enzima de interesse em um proteoma do complexo através da utilização de uma sonda que tem como alvo química sítios activos da enzima. Uma etiqueta repórter introduzidos na sonda permite a detecção da enzima marcada por análise em gel de fluorescência, mancha de proteína, microscopia de fluorescência, ou espectrometria de massa de cromatografia de líquido. Aqui, descrevemos a preparação e utilização do ARN14686 composto, uma sonda baseada em atividades de cliques química (CC-ABP) que reconhece seletivamente a enzima N amidase ácido -acylethanolamine (NAAA). NAAA é uma hidrolase cisteína que promove a inflamação desactivando -alfa agonistas endógenos do receptor proliferador de peroxissoma activado (PPAR), tais como palmitoiletanolamida (PEA) e oleoletanolamina (OEA). NAAA é sintetizada como uma proenzima de comprimento completo inactiva, que é activada pelo autoproteolysis no pH ácido do lisossoma. estudos de localização have mostrado que NAAA é predominantemente expresso em macrófagos e outras células derivadas de monócitos, bem como em linfócitos-B. Nós fornecem exemplos de como ARN14686 podem ser usadas para detectar e quantificar NAAA activo ex vivo em tecidos de roedores por mancha de proteína e microscopia de fluorescência.

Introduction

Comumente usado métodos para investigar os padrões de expressão, interações e funções das proteínas, incluindo plataformas de espectrometria de cromatografia de massa de líquido para análise espingarda 1,2, fermento métodos de dois híbridos 3,4 e, em ensaios in vitro, são limitados em que eles são incapaz de avaliar a atividade das proteínas no seu estado nativo. profiling proteína baseado em atividades (ABPP) pode ser usado para preencher esta lacuna. Nesta abordagem, pequena molécula sondas capazes de se ligar covalentemente ao sítio activo de uma enzima de interesse conjugado com um grupo repórter que permite a detecção do alvo. Usando clique química (CC), o repórter pode ser integrado na sonda ou podem ser introduzidos após acoplamento alvo ocorreu 5,6. O último procedimento requer a utilização de sondas que contêm grupos químicos adequados, tais como um alcino ou azida de terminal, que pode ser modificado com uma série de reagentes repórter via reacções bio-ortogonal sucH, tal como o Cu (I) catalisada por Huisgen [3 + 2] cicloadição 7-9 ou Staudinger ligadura 10,11.

Recentemente, foi divulgada a ARN14686 composto como o primeiro ABP para o in vitro e in vivo de detecção da hidrolase de cisteína, NAAA 12. NAAA catalisa a desativação hidrolítica FAEs saturados e monoinsaturados, incluindo oleoletanolamina (OEA) e palmitoiletanolamida (PEA), que são agonistas endógenos do anti-inflamatório receptor nuclear PPAR-alfa 13-15. NAAA é predominantemente expresso em macrófagos e outras células derivadas de monócitos, bem como em linfócitos-B 14,16, sugerindo um papel na regulação da resposta imune inata. A enzima é sintetizada no retículo endoplasmático rugoso numa forma inactiva e é activado em compartimentos acídicos da célula através de um mecanismo 17 autoproteolica. A clivagem autoproteolítica gera uma nova cisteína N-terminal (C131 em ratinhos e ratos, C126 em seres humanos), que é o responsável por nucleófilo FAE hidrólise 18,19. A inibição farmacológica da actividade NAAA altera o equilíbrio síntese / degradação FAE em favor do aumento dos níveis celulares de FAEs 16,20,21. Vários derivados β-lactona e β-lactâmicos têm mostrado inibir a actividade de NAAA com elevada potência e selectividade 16,22-26. Estes inibidores actuam através de S-acilação da cisteína catalítica 16,27,28.

O ARN14686 composto foi concebido com base na estrutura química do, inibidor β-lactama NAAA-serina derivada sistemicamente activa, ARN726 (N-4 cyclohexylbutyl- - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo) 16. O grupo 4-butil-ciclo-hexilo de ARN726 foi substituído com uma cadeia alifática em C9 saturado tendo uma marcação alcino terminal para conjugação subsequente com uma tag de CC repórter azida de rolamento. Nós escolhemos para projetar um ABP em duas etapas para minimally alterar a estrutura do andaime original, mantendo, assim, a afinidade da sonda para NAAA. Além do mais, evitando a introdução de etiquetas volumosos, uma tal sonda poderia ser mais adequado para o tratamento in vivo do que um PAF directa. ARN14686 NAAA inibe com elevada potência (hNAAA CI50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) através da formação de um aducto covalente com a cisteína catalítica da enzima 12. Experimentos em ratos vivos mostraram que a sonda é seletiva na captura NAAA expressos em pulmões. Ácido ceramidase, outra cisteína-amidase que partilha 33-34% de identidade com NAAA, também foi identificado como um alvo de baixa afinidade ao utilizar concentrações elevadas de sonda (10 uM in vitro, 10 mg / ml por via intravenosa, iv) 12. Temos também utilizado ARN14686 para estudar a presença de NAAA activo em tecidos de rato a seguir à administração inflamadas de adjuvante completo de Freund (CFA) 29.

Aqui, descrevemos um protocolo para os preparatina de ARN14686 (Figura 1) e sua aplicação para a investigação de activação NAAA ex vivo. Como exemplo, descreve-se um procedimento experimental para visualizar NAAA nas patas de ratos após a administração CFA. Nesta experiência, as proteínas são extraídas a partir de tecido da pata após a injecção IV da sonda, e o proteoma ABP-marcado é submetido a CC com biotina-azida. amostras biotiniladas são enriquecidas utilizando esferas de estreptavidina, e manchas de proteínas são realizadas. Em outra aplicação, descreve-se a localização de NAAA activo por microscopia de fluorescência em pulmões de ratinho a partir de ratinhos tratados com sonda. Neste caso, o tecido é seccionado e secções são submetidos a CC, por adição de rodamina. Um regime de fluxo de trabalho é ilustrado na Figura 2.

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Protocol

Cuidado: Todas as reacções de química deve ser levada a cabo numa hotte ventilado e com a utilização de um revestimento do laboratório, luvas, e óculos de protecção. As reacções devem também ser levada a cabo num ambiente de azoto.

declaração ética: Nossos procedimentos que envolvem animais são realizados em conformidade com as normas italianas relativas à protecção dos animais utilizados para fins experimentais e outros científicos (DM 116192), e regulamentos Comunidade Económica Europeia (JO de CE L 358/1 1986/12/18 ).

NOTA: Síntese de [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amónio é descrita para as produções de larga escala (50 g de N-Cbz-L-serina), mas pode ser facilmente dimensionado para baixo.

1. Síntese

Nota: Consulte a Figura 1 para o esquema de reação de síntese.

  1. Preparação de carbonato de 2-piridilo-undec-10-inilo e undec-10-inilo 2-oxopiridina-1 carboxilato
    1. Em um frasco de 50 ml de fundo redondo, dissolver 350 mg de undec-10-in-1-ol em 3,5 ml de diclorometano seco.
    2. À solução em 1.1.1, adicionar 25 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) e 530 mg de 2-dipyridylcarbonate (DPC). Agita-se a mistura à temperatura ambiente (TA) durante 16 horas.
    3. Adicionar 20 ml de diclorometano.
    4. Transferir a mistura para um funil de separação. Adicionar 15 ml de água, agitá-lo, e permitir que as duas fases para separar.
    5. Abrir a torneira, recolher a fase orgânica (inferior), e, em seguida, fechar a torneira. Adicionar 15 ml de uma solução saturada de NaHCO3. Agitar a ampola de decantação e deixar as duas fases distintas. Repita este passo mais duas vezes.
    6. Seca-se a camada orgânica com Na 2 SO 4, filtra-se através de algodão em um balão de fundo redondo (tara em primeiro lugar), e evapora-se até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
    7. Pesa-se o balão e se obter 600 mg de um óleo que é uma mistura de carbonato de 2-piridilo undec-10-inilo e undec-10-inilo 2-oxopiridina 1-carboxilato de etilo em uma razão de 1,7: 1.
      1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) componente principal δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) componente menor δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6,30-6,25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
    8. Usar o óleo, sem qualquer outra purificação ou separação.
  2. Preparação de [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amónio
    1. Preparação de benzil N - [(S) -1- (hidroximetil) -2 - [(4-metoxifenil) amino] -2-oxoethil] carbamato.
      1. Numa 4-L balão de fundo redondo, dissolver 141,5 g de p-anisidina em 1,5 L de tetra-hidrofurano e 0,5 L de diclorometano.
      2. Arrefece-se a solução para 0 ° C num banho de gelo.
      3. Adicionar 50,0 g de N-Cbz-L-serina e 43,9 g de N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida N '.
      4. Agita-se a mistura com uma barra magnética, a 0 ° C durante 30 min.
      5. Remover a solução do banho de gelo e agita-se com uma barra magnética à TA durante 16 h.
      6. Evaporaram-se os solventes sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
      7. Adicionar 400 ml de 1: 1 ciclo-hexano / acetato de etilo, agita-se com uma espátula, e decanta-se.
      8. Repita o passo 1.2.1.7 mais duas vezes.
      9. Dissolve-se o resíduo gomoso em 500 ml de acetato de etilo e lava-se com 400 ml de solução 0,1 M de HCl (10 vezes), com 400 ml de solução saturada de NaHCO3 (2 vezes), e com 400 ml de salmoura.
      10. Seca-se a camada orgânica comNa 2 SO 4, filtrar a solução através de algodão em um balão de fundo redondo (tara em primeiro lugar), e evapora-la até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
      11. Pesa-se o balão e se obter 61,4 g de um sólido branco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) ô = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
    2. Preparação de benzil-N - [(S) -1- (4-metoxifenil) -2-oxo-azetidin-3-il] carbamato.
      1. Dissolve-se 58,6 g de N - [(S) -1- (hidroximetil) -2 - [(4-metoxifenil) amino] -2-oxo-etil] carbamato em 1,6 L de N, N-dimetilformamida.
      2. Arrefece-se a solução para 0 ° C com um banho de gelo.
      3. Adicionar 50,6 g de 1,1'-sulfonyldiimidazole e agita-se com uma barra magnética durante 30 min.
      4. Arrefecer a soluçãoa -20 ° C com um banho de gelo / NaCl e adicionar 10,2 g de hidreto de sódio (60% em óleo mineral) em porções.
      5. Agita-se a mistura a -20 ° C durante 1 h, e depois extingue-se com 2 ml de metanol e 1 L de água.
      6. Aspirador de filtrar o precipitado, lavar com 200 ml de água, e seco sob vácuo.
      7. Obter 42,2 g de um sólido branco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
    3. Preparação de benzil-N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato.
      1. Suspender 9,0 g de benzil-N - [(S) -1- (4-metoxifenil) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo em 500 ml de acetonitrilo e 400 ml de água.
      2. Arrefece-se a solução para 0 ° C num banho de gelo.
      3. Adicionar 45,4 g de ceric nitrato de amónio em porções, ao longo de 45 min e agita-se com uma barra magnética, a 0 ° C durante 15 min.
      4. Adicionar 500 ml de solução saturada de NaHCO3 com cautela, e em seguida, adicionar 500 ml de acetato de etilo.
      5. Filtra-se o precipitado e lava-se com 200 ml de acetato de etilo.
      6. Separa-se a solução bifásica e lava-se a camada aquosa com 200 ml de acetato de etilo (3 vezes).
      7. Seca-se a camada orgânica com Na 2 SO 4, adicionam-se 5 g de carvão activado, filtra-se através de uma almofada de sílica de diatomáceas e evapora-se até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
      8. Adicionar éter dietílico e agita-se com uma espátula.
      9. Filtra-se o sólido e obter 4,85 g de um sólido quase branco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
      Preparação de [(S) -2-oxoazetidin-3-il] -amónio de etilo.
      1. Dissolve-se 0,93 ml de ácido acético em 245 ml de acetato de etilo. Marcar este como "solução prendendo."
      2. Dissolve-se 3,28 g de benzil-N - [(R) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo em 298 ml de etanol.
      3. Adicionar 14,1 ml de ciclo-hexadieno e 3,27 g de paládio a 10% sobre carbono.
      4. Agita-se a suspensão à TA durante 12 h, e, em seguida, filtra-se através de uma curta almofada de terra de diatomáceas. Despeje o líquido eluição directamente na solução de trapping.
      5. Evapora-se o solvente sob pressão reduzida (evaporador rotativo), mantendo a temperatura abaixo de 35 ° C.
      6. Tritura-se o sólido obtido com tetra-hidrofurano e se obter 1,72 g de um sólido branco.
        1 H RMN (400 MHz, DMSO-d 6) ô = 7,68 (s largo, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
  3. Preparação de undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato
    1. Em um balão de 10 ml de fundo redondo, dissolvem 60 mg de [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amónio em 2 ml de diclorometano seco.
    2. Arrefece-se a solução para 0 ° C num banho de gelo e adicionar 81 ul de N, N-diisopropiletilamina gota a gota.
    3. Dissolve-se 350 mg da mistura em bruto contendo 10-undec-2-inil-oxopiridina um carboxilato de etilo em 2 ml de diclorometano seco, adicionar-se à solução, e agitar à TA durante 15 h. Evapora-se o solvente até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
    4. Purifica-se por cromatografia em coluna (gel de sílica), utilizando um aparelho de cromatografia em coluna automatizada:
      1. Absorver a amostra em gel de sílica, equilibrar a coluna com ciclo-hexano, e carregar a amostra para dentro do cartucho.
      2. Elui-se com ciclo-hexano / acetato de etilo desde 100: 0 a 0: 100 e recolher picos em tubos de ensaio.
      3. Evapora-se o solvente das fracções correspondentes ao composto até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo) e obter 40 mg de um sólido branco.

2. Preparação de Reagentes CC

  1. Preparação de 5 mM da solução de moléculas Tag-azida
    1. Dissolve-se 1,5 mg de azida-PEG3-Fluor 545 em 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Faça alíquotas de 0,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
    2. Dissolve-se 1,1 mg de azida-PEG3-Biotina em 0,5 ml de DMSO. Faça alíquotas de 0,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
  2. Preparação de 50 mM da solução de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)
    1. Dissolver 14,3 mg de TCEP em 1 ml de água, e torná-lo fresco cada vez.
  3. Preparação da solução 50 mM de CuSO 4 5H 2 O ·
    1. Em um frasco de vidro, dissolver 12.48 Mg de CuSO 4 5H 2 O · em 1 ml de água. Armazenar à temperatura ambiente por até um mês.
  4. Preparação de 83,5 mM de solução stock de Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA)
    1. Em um frasco de vidro, dissolver-se 8,85 mg de TBTA em 200 ul de DMSO. Armazenar à temperatura ambiente por até um mês.
  5. Preparação de Trabalho 1,7 mM Solução de TBTA (imediatamente antes da utilização)
    1. Adicionar 20 ul de TBTA 83,5 mM a um frasco de vidro e dilui-se com 180 ml de DMSO.
    2. Adicionar 800 mL de terc-butanol e vortex.

3. NAAA análise da expressão em Paw tecido conjuntivo de ratos tratados com CFA

NOTA: Use ratos Sprague-Dawley, pesando 175-200 g, e realizar todos os procedimentos de acordo com as diretrizes para o uso ético dos animais. ratos de casas em gaiolas ventiladas em uma luz 12-hr / ciclo escuro e dar-lhes livre acesso a comida e água. Para o protocolo de CFUm tratamento, consulte o artigo publicado por Bonezzi et al. 29 Usar animais 7 dias após a administração CFA.

  1. A administração intravenosa de ARN14686
    1. Dissolver ARN14686 no veículo (15% de PEG e Tween solução salina 15%). Calcula-se a concentração da solução de acordo com o peso de ratos (dose de 3 mg / kg, volume de injecção de 5 ml / kg).
    2. Proceda com injecções EV em três ingênua e três ratos tratados com CFA. Coloque cada rato em um dispositivo de retenção de plástico apropriado. Em seguida, coloque a cauda de rato na água morna por 2-4 min para permitir a vasodilatação e injetar o iv composto através da veia da cauda.
    3. Injectar iv três ratos (ingênua e CFA-tratado) com apenas veículo.
  2. Coleção pata e Dissection
    1. Sacrificar os ratos por inalação de CO 2 4 horas após a sonda ou veículo de administração e recolher as suas patas, cortando-0,5 cm acima da articulação do joelho utilizando um bisturi.
    2. Remova cuidadosamente a pele por dissecção assistida-tesoura e dissecar tecidos moles por raspagem-los a partir do osso. Descarte os ossos e recolher os tecidos moles das patas. Amostras congeladas de encaixe em azoto líquido e armazenar a -80 ° C.
  3. A pata homogeneização e lisossomais Preparação Proteína
    NOTA: Evite a utilização de detergentes e tampões contendo amina, como eles podem inibir a reação CC.
    1. Combinar tecido da pata a partir de 3 ratos (obtida tal como descrito na secção 3.2.1) e homogeneizá-los em 4 mL de sacarose 320 mM em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) e um cocktail de inibidor de protease (ver Tabela de Materiais / Reagente); usar um instrumento de dispersão de alto desempenho (ver Tabela de Materiais / Reagente).
    2. Centrifuga-se o homogeneizado de tecido durante 20 minutos a 1000 xg, a 4 ° C; salvar o sobrenadante.
    3. Adicionar 2 ml de sacarose 320 mM em PBS e o cocktail inibidor de protease para o sedimento de tecido ehomogeneizar mais uma vez.
    4. Centrifugar durante 20 minutos a 1000 xg, a 4 ° C, e adiciona-se o sobrenadante a um a partir do passo 3.3.2.
    5. Centrifugar os sobrenadantes recolhidos durante 30 min a 12000 xg, a 4 ° C.
    6. Pesa-se o sedimento e ressuspender em dois volumes de PBS (isto é, 200 ul para cada 100 mg de pelete). Transferir para um tubo de recolha de 1,5 ml e congelar a -80 ° C durante 1 h.
    7. Descongelar as amostras e congelar novamente durante 1 h a -80 ° C.
    8. Repetir o ciclo congelação / descongelação mais duas vezes.
      NOTA: Este passo destina-se a solubilização da proteína. Congelar durante a noite, se necessário.
    9. Centrifugar durante 1 h a 100000 xg, a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante, que contém as proteínas solúveis do lisossoma, e rejeitar o sedimento. Armazenar a -80 ° C ou prosseguir imediatamente com a quantificação de proteínas.
    10. Quantificar o teor de proteína usando um ensaio de proteína BCA 30 kit comercial (ver Tabela de Material / Reagente
    11. Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização.
  4. CC com azida-PEG3-Biotina
    NOTA: O protocolo de CC e enriquecimento talão estreptavidina (passos 3,4-3,6) são ligeiramente modificada do protocolo publicado por Speers e Cravatt 31.
    1. Preparar 500 ul (1 mg / ml, em PBS) de proteínas lisossómicas de ratos probe- e tratados com veículo (ratos ingénuos e CFA-tratados).
    2. Preclear amostras com 40 ul de uma lama a 50% de agarose e estreptavidina (lavar três vezes com 1 ml de PBS antes da utilização), durante 1 h a 4 ° C. Centrifugar durante 4 minutos a 1000 xg, a 4 ° C e levar o sobrenadante.
    3. Adicionar 11,3 ul de um estoque de 5 mM de azida-PEG3-Biotina e vortex.
    4. Adicionar 11,3 ul de um estoque de 50 mM de TCEP recém-preparados e vortex.
    5. Premix 34 ul de uma solução de trabalho preparada de fresco de TBTA 1,7 mM com 11.3 ul de uma CuSO4 50 mM 2 O estoque.
    6. Adicionar 45,3 ml de uma solução pré-misturada e vórtice TBTA / CuSO 4 5H 2 O ·.
    7. Incubar a reacção a 25 ° C durante 2 h (um tempo de incubação mais longo não afecte a reacção). Observar a precipitação da proteína nesta etapa. Misturar após a primeira hora de incubação.
  5. A remoção dos reagentes em excesso CC
    1. Centrifugar as amostras durante 4 min a 6500 xg, a 4 ° C e remover o sobrenadante.
    2. Adicionar 750 mL de metanol frio e ressuspender por ultra-sons (5 segundos com um sonicador de sonda).
    3. Centrifugar as amostras durante 4 min a 6500 xg, a 4 ° C e remove-se o sobrenadante utilizando uma seringa e agulha.
    4. Repita duas vezes passo 3.5.2 (ultra-sons não é necessário).
    5. Após a última lavagem, adicionar 325 ul de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a 2,5% em PBS para a pelete de proteína e sonicar 3x durante 5 seg.
    6. Aquecer as amostras durante 5 minutos a 65 ° C e uma sonicarganho.
    7. Centrifugar durante 5 minutos a 6500 xg à temperatura ambiente e guardar o sobrenadante.
    8. Adicionar 1,4 ml de PBS para diluir a concentração de SDS a 0,5%. Armazenar a -20 ° C ou continuar com o enriquecimento estreptavidina.
  6. estreptavidina Enriquecimento
    1. Com PBS, levar o volume das amostras obtidas no passo 3.5.8 para 4,2 ml. Adicionar 40 ul de uma lama a 50% de agarose e estreptavidina utilizando uma ponta de corte de extremidade (lavar três vezes com 1 ml de PBS antes da utilização).
    2. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com rotação e, em seguida, centrifuga-se durante 2 min a 1400 x g.
    3. Remover o sobrenadante sem secagem dos grânulos e peletes usar sobrenadante residual para transferir os grânulos a uma coluna de 1 ml de girar (ver Tabela de Materiais / Reagente).
    4. Lavar por gravidade com 3 x 1 ml de SDS a 1% (em PBS), 3 x 1 ml de 6 M de ureia (em PBS), e 4x 1 ml de PBS.
    5. Uso 2x 500 ul de PBS para transferir as esferas para um tubo de 1,5 ml e centrifugar durante 2 minutos a 1400 xg à temperatura ambiente. Com cuidado, aspirar o sobrenadante com uma seringa e agulha.
    6. Elui-se as proteínas ligadas à resina por adição de 25 ul de tampão de eluição (ureia 6 M, 2 M tioureia, 2% de SDS, e biotina 6 mM, todos em PBS) durante 15 min à t.a., seguido por 15 min a 95 ° C 32.
  7. proteína Blot
    1. Adicionar 5 uL de tampão de 6x Laemmli (para 9 ml: 0,5 ml de Tris-HCl 1 M pH 6,8, 5 ml de SDS a 20%, 5 mg de azul de bromofenol, 3 ml de glicerol, e H2O até 9 mL) e adicionar 5% β-mercaptoetanol imediatamente antes da utilização. Resumidamente centrifugar as amostras a 2000 xg para sedimentar a resina e de carga de 25 ul do sobrenadante obtido num gel de poliacrilamida a 4-12%.
    2. Efectuar a electroforese em gel e transferência de proteína sobre uma membrana de blotting de acordo com as instruções do fabricante 33.
    3. Saturar a membrana de blotting durante 1 hora com 10 ml de um tampão de bloqueio (ver Tabela de Materiais / Reagente) contendo 0,1% de Tween-20.Evitar o uso de leite, uma vez que pode aumentar o fundo.
    4. Lava-se a membrana com 10 ml de 0,05% de Tween-20 em PBS e adicionar 10 ul de estreptavidina fluorescente (ver Materiais / Reagente Tabela) dissolvido em 10 ml de tampão de bloqueio com 0,1% de Tween-20 durante 1 h à TA.
    5. Lavar 4 vezes com 0,05% de Tween-20 em PBS e uma vez com apenas PBS (10 min cada).
    6. Use um scanner de imagem (ver Tabela de Material / Reagente). Ligue o instrumento e o computador conectado. Espere até que esteja pronto.
    7. Inicie o programa de aquisição e seleccionar o modo de fluorescência. Seleccione a área de membrana e escolher a pasta de destino para os arquivos salvos.
    8. Defina os seguintes parâmetros de aquisição: 680 nm comprimento de excitação, filtro BPFR700, V tubo fotomultiplicador (PMT) valor 1.000 (canal 2), e 25 um tamanho de pixel. Adquirir a imagem.

4. Localização de NAAA cataliticamente activo no rato pulmões por fluorescência Microscópia

NOTA: Use masculino camundongos 8 a 10 semanas de idade e realizar todos os procedimentos de acordo com as diretrizes para o uso ético dos animais. Os ratos domésticos em gaiolas ventiladas em um 12 hr ciclo de luz / escuridão e dar-lhes livre acesso a comida e água.

  1. A administração intravenosa de ARN14686 em Ratos
    1. Dissolver ARN14686 no veículo: solução salina 15% de PEG e 15% de Tween-20. Calcula-se a concentração da solução de acordo com o peso do rato (dose de 3 mg / kg, volume de injecção de 5 ml / kg).
    2. Prosseguir com a injeção intravenosa de 3 ratos. Coloque cada rato em um dispositivo de retenção de plástico apropriado. Em seguida, coloque a cauda do rato em água morna por 2-4 min para permitir a vasodilatação e injetar o iv composto através da veia da cauda.
    3. Injectar 3 iv ratos com apenas veículo.
  2. Coleção de pulmão e Slice Preparação
    Aviso: Pega paraformaldeído com cuidado em um exaustor, e usar luvas!
    1. Anestesiar ratos com chlohidrato de RAL (400 mg / kg). Confirmar anestesia com uma pitada dedo do pé. Executar uma perfusão transcardial como se segue:
      1. Superficialmente cortar a pele ventral com uma tesoura e expor as superfícies da membrana torácicas e peritoneal.
      2. Superficialmente cortar a membrana peritoneal com uma tesoura, logo abaixo do processo xifóide, expondo o diafragma e os órgãos viscerais. Tenha cuidado para não dilacerar qualquer vasculatura significativo.
      3. Abrir a cavidade torácica, cortando o diafragma de uma face lateral para a outra.
      4. Inserir a agulha 25 G ligada à bomba de seringa automatizada e infundir 20 ml de solução salina a 0,9%, seguido de 60 mL de PFA a 4% em tampão fosfato (0,1 M, pH 7,4).
    2. Uma vez que a perfusão for concluída, puxe o coração usando uma pinça e dissecá-lo com cuidado para fora. Segure a traqueia com uma pinça e cortar completamente através dele com uma tesoura. Puxe delicadamente a traqueia para cima e retire os pulmões da caixa torácica. Dissecar o tecido aseparar o pulmão direito e esquerdo.
    3. Postfix o tecido em paraformaldeído 4% para 1 hr, amostras congelar no frio 2-metilbutano, e armazená-los a -80 ° C.
    4. Colete 40 mm seções usando um criostato, montá-los imediatamente em lâminas (uma em cada cinco), e processá-los para imuno-histoquímica como detalhado abaixo.
  3. Tissue Fatias permeabilização e Bloqueio
    1. Lavar com PBS (2 x durante 5 min) e permeabilizar com 0,1% de Triton X-100 de PBS durante 15 min à TA.
    2. Lavar com PBS (2 x durante 5 min) e bloquear com albumina de 3% de soro de bovino (BSA) em PBS durante 30 min à TA.
    3. Lavar com PBS (2x por 5 min) e avançar para o CC.
  4. CC com Azide-PEG3-Fluor 545 em fatias de tecido
    1. Prepara-se uma solução por mistura dos reagentes CC preparados como descrito no ponto 2. Para 1 ml de solução, adicionar: 2 ul de azida-PEG3-Fluor 545 (5 mM), 20 ul de TCEP (preparado de fresco a 50 mM stock), 58,8 ul de TBTA (preparado de fresco Solução de trabalho de 1,7 mM), 20 ul de CuSO 4 5H 2 O · (estoque 50 mM), e 900 ul de PBS.
    2. Adicionar cerca de 400 ul de mistura CC às fatias de tecido, que foram preparados de acordo com a secção 4.2. Preste atenção que o volume escolhido de mix CC é suficiente para cobrir as fatias. Incubar durante 1 h à TA, protegido da luz.
    3. Lavar com PBS (1x durante 5 min), metanol frio (1x durante 5 min), uma solução de 1% de EDTA mM e Tween-20 a 0,5 em PBS (3x durante 2 min), e de PBS (1x durante 5 min).
    4. Ar seco, adicione uma gota de antifade montagem com DAPI (ver Materiais / Tabela Reagente), estreita com lamelas (evitando a formação de bolhas), e selar com o polonês. Armazenar a 4 ° C até à análise.
  5. Aquisição de imagem
    1. Use um microscópio confocal equipado com 546 nm e 450 nm lasers de excitação (ver Tabela de Material / Reagente) seguinteo guia de usuário.
    2. Selecione uma lente objetiva de 60X com NA = 1,40, certificando-se de visualizar o slide através das oculares e se concentrar em uma área de interesse.
    3. Determinar os parâmetros de aquisição de acordo com as características da amostra e do equipamento.

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Representative Results

ARN14686 foi projetado com base no cadafalso da ARN726 inibidor NAAA. O grupo 4-butil-ciclo-hexilo de ARN726 foi substituído com uma cadeia alifática em C9 saturado tendo uma marcação alcino terminal (Figura 1). A tag alcino foi introduzida, a fim de permitir a utilização de um procedimento de marcação de dois passos para adicionar um fluoróforo ou uma molécula de biotina através de CC. Esta característica torna ARN14686 uma ferramenta muito versátil para sondar NAAA in vitro e in vivo.

Aqui, mostramos duas aplicações de ARN14686, que são representativos do potencial desta molécula. A Figura 2 é um esquema do procedimento experimental aqui relatado. Após a administração IV da sonda, dois métodos de detecção diferentes podem ser utilizados: i) análise de expressão NAAA activo por mancha de proteína e II a análise de expressão activa NAAA e localização) dentro de células por fluorescence microscopia.

O primeiro resultado representativo foi publicado recentemente pelo nosso grupo 29. Analisamos expressão NAAA em um modelo de rato da inflamação da pata induzida por CFA. A sonda (3 mg / kg) ou veículo foi injectado iv em ratos ingénuos e CFA-tratados. Os ratos foram sacrificados quatro horas mais tarde. CC foi realizado com extractos enriquecidos lisossomais para introduzir uma biotina-Tag para as proteínas marcadas com sonda. proteínas biotiniladas foram próxima enriquecida utilizando esferas de estreptavidina. As proteínas eluidas foram analisadas por transferência de proteína, mostrando que os níveis de NAAA activa foram marcadamente aumentado nas patas de ratos tratados com CFA em relação aos dos ratos de controlo (Figura 3). A vantagem da análise de mancha de proteína é que ela permite um exame detalhado do proteoma sonda-reactivo, o qual é separado por electroforese em gel. Esta abordagem também permite a revelação de potenciais sonda fora dos alvos. Um controle não-sonda deve estar almaneiras incluídos, a fim de excluir proteínas biotiniladas endógenos, que constituem o fundo experimental. A seta na Figura 3 indica que tais proteínas de fundo, que por sua vez podem ser utilizados como um controlo de referência carregamento.

Numa segunda experiência não publicados (Figura 4), foi utilizado para sondar ARN14686 NAAA para a detecção ex vivo por microscopia de fluorescência. Nós ARN14686 administrada a ratos a 3 mg / kg (iv) e sacrificaram-se-lhes 2 h após o tratamento por perfusão transcardial. Os pulmões foram recolhidas, fixadas posteriormente, e congelados em 2-metylbutane frio. A reação CC para além fluoróforo foi realizada diretamente sobre fatias de tecido de 40 mm de espessura, coletados com um criostato. A análise por microscopia de fluorescência revelou a presença de NAAA cataliticamente activo em estruturas vesiculares difusos pertencente a macrófagos alveolares. Em comparação com a utilização de um anticorpo específico para a proteína, apenas o umenzima ctive é observado.

figura 1

Figura 1:. ARN14686 esquema reaccional de síntese undec-10-in-2-ol foi activado por dipyridylcarbonate (DPC) na presença de catalisador 4-dimetilaminopiridina (DMAP), para produzir um carbonato misto. Este carbonato foi depois feito reagir com a lactama amino para obter a molécula alvo ARN14686. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Esquema de fluxo de trabalho da estratégia geral mostrado no presente trabalho A sonda é injetado em animais (ratos ou camundongos) e alvo de expressão é analisada duas seguintes procedimento experimental diferentes: i) O proteoma marcado é extraído e biotina é adicionado pelo CC. Depois de uma fase de enriquecimento de proteínas biotiniladas em esferas de estreptavidina, alvos de sondagem são analisados ​​por transferência de proteínas. ii) As fatias de tecido são preparados e um fluoróforo é adicionado por CC. Probe localização de alvos é analisado por microscopia de fluorescência. Este número foi adaptado de Bonezzi et al. 29 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3:. Análise de activação NAAA nas patas de ratos tratados com CFA análise de mancha de proteína de proteínas enriquecido com estreptavidina de ratos ingénuos (pistas 1 e 2) ou de ratos injectados com CFA 7 dias após a injecção (pistas 3 e 4). Os ratos receberam injecções IV de veículo ou ARN14686 (3 mg / kg). A membrana de blottingfoi sondado com uma estreptavidina fluorescente. A seta indica a banda NAAA; a seta indica uma banda de biotina contendo de cerca de 90 kDa, mostrando que uma quantidade semelhante de proteína foi carregada em cada faixa. Este valor foi modificado a partir Bonezzi et al. 29 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Ex detecção in vivo de imagens representativas de secções de pulmão de veículo- (A) ou (B) os ratos injectados com ARN14686 depois com azida de CC-PEG3-Fluor 545 NAAA nos pulmões de rato por microscopia de fluorescência marcado com sonda são relatados.. Um sinal positivo (eritrócitos) foi detectada em ratos injectados com ARN14686, enquanto nenhum sinal foi detectado no vcamundongos administrados-eículo. Um detalhe de uma azida-PEG3-Fluor 545 macrófagos alveolares positivo é mostrado em C na maior ampliação. Os núcleos foram marcadas com DAPI (azul). Barra de escala = 50 mm em A e 10 mm em C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A actividade enzimática é finamente regulados em níveis diferentes, incluindo a transcrição de ARN, a síntese de proteínas, a translocação da proteína, a modificação pós-translacional, e interacção proteína-proteína. Muitas vezes, a expressão da enzima sozinha não leva em conta para a sua actividade. ABPP foi desenvolvido para estudar a actividade de proteínas no seu estado nativo. Duas características são necessárias: uma sonda química que covalentemente liga-se ao sítio activo de uma enzima de interesse e um marcador repórter para detectar a sonda marcada com enzima.

design de sonda e síntese são pontos críticos do processo. A sonda deve ter afinidade e selectividade adequada para o seu alvo. Além disso, a presença de uma marcação repórter não deve afectar a alvo acoplamento. Este problema é largamente ultrapassado por concepção de um PAF em duas etapas, em que a etiqueta é introduzida repórter após o alvo foi capturado. Sondas de livre-Tag são particularmente adequados para estudos in vivo, em que a actividade de proteínaspode ser avaliada em uma célula viva ou organismo, com alteração mínima externo. O ARN14686 sonda NAAA foi concebido para cumprir os requisitos descritos acima. O β-lactama ogiva reactiva foi escolhido com base nos resultados anteriores obtidos com a classe β-lactama de inibidores naaa 16,26. Estes compostos inibem NAAA de um modo potente e selectivo por ligação covalente à cisteína catalítica da enzima. Além disso, os compostos mostraram ser sistemicamente activa 16. Introduzimos uma cadeia alifática em C9 saturado, tendo em conta o aumento da afinidade de NAAA para cadeias alifáticas longas. Um alcino terminal foi adicionada para permitir a marcação em dois passos.

Um outro passo crucial é seleccionar a dose e o tempo para a administração in vivo. Isto depende da estabilidade da sonda no plasma, a sua afinidade de alvo, e a sua selectividade. A dose correta deve ser selecionada para permitir a captura de alvo, evitando o envolvimento de possible off-alvos. Nós descobrimos que 3 mg / kg iv ARN14686 era ideal para capturar NAAA seletivamente. As doses mais elevadas resultaram na captura da amidase homólogas cisteína, ceramidase ácido. No que diz respeito ao tempo de tratamento, quando se analisa órgãos perfundidos bem, como os pulmões, um tempo curto (2 h) poderá ser suficiente para permitir que a sonda reage com o alvo. Para patas, no entanto, fomos obrigados a dobrar o tempo de reação.

Um possível problema na análise por mancha alvo de proteínas é devido à presença de proteínas naturalmente biotinilados. Estes irão inevitavelmente ser identificado juntamente com alvos de sondagem específicas. Descobrimos que a introdução de um passo preclearing com contas de estreptavidina antes de realizar CC aumentou muito a qualidade dos nossos resultados. Por outro lado, a presença de proteínas nativas biotinilados pode ser usada para controlar os possíveis artefactos de carregamento. Finalmente, no que diz respeito aos estudos de localização por microscopia de fluorescência, é muito importante ter consciência de probe selectividade porque, ao contrário manchas de proteína, microscopia de fluorescência não permite a distinção do alvo a partir off-alvos. estudos de seletividade preliminares devem ser realizados para avaliar a viabilidade e a criação de condições experimentais ideais.

Limitações da técnica descrita dizem essencialmente respeito à necessidade de evitar condições experimentais que podem afectar a reacção CC, tais como a utilização de detergentes e tampões contendo amina. devem ser tomadas estes aspectos em conta aquando da preparação de um lisado celular ou um homogeneizado de tecido. Além disso, quando é necessária uma fase de enriquecimento estreptavidina, a quantidade de material de partida constitui um outro problema, porque este processo só é aplicável quando o teor de proteína não é menos de 250 ug. Esse limite é definido devido a problemas técnicos, tais como os volumes de trabalho, recuperação de proteína, após precipitação induzida por CC, e a quantidade de resina estreptavidina a ser utilizado.

PreviouslY, actividade NAAA só poderia ser avaliada através da realização de ensaios de actividade, que requerem o uso de um tampão de activação para a activação in vitro da enzima e do substrato para a solubilização 14. Esta abordagem fornece informações sobre a expressão total de NAAA, não sobre a presença de NAAA ativa. Outra possibilidade é medir os níveis de tecido do PEA e OEA, mas este método representa apenas uma forma indireta de avaliar a atividade NAAA 34,35. Além disso, os níveis de FAE pode ser influenciado por outros factores, tais como a biossíntese. O ARN14686 sonda química é a primeira ABP para NAAA. O protocolo aqui descrito ilustra um procedimento simples para captar e visualizar a forma activa de NAAA, tanto in vitro como in vivo. Todas as manipulações de amostras são posteriores às reações sonda-alvo, dando assim informação fiável sobre o estado in vivo da enzima. Além disso, a utilização de ARN14686 em microscopia de fluorescência representa uma ferramenta única to localizar NAAA ativa. anticorpos disponíveis, que reconhecem a subunidade catalítica NAAA, não discriminam entre o NAAA proenzima de corpo inteiro e a enzima ativa.

A partir do protocolo descrito aqui, a expressão NAAA e a activação pode ser analisada em diferentes linhas de células e em modelos animais de inflamação. estudos de co-localização pode ser executada para melhor caracterizar o papel de NAAA em condições fisiológicas e patológicas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole  Sigma Aldrich 367818 Harmful
2-dipyridylcarbonate Fluorochem 11331 Harmful
2-Methylbutan Sigma Aldrich M32631 Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine Sigma Aldrich 107700 Toxic
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 Flammable, Corrosive
Acetonitrile  Sigma Aldrich 34998 Flammable, Toxic
Activated charcoal Sigma Aldrich 161551
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 Harmful
Azide-PEG3-Biotin Jena Biosciences CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545 Jena Biosciences CLK-AZ109
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227
Bio-spin columns Biorad 732-6204
Biotin Sigma Aldrich B4501
Blocking buffer Li-Cor Biosciences 927-40000
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA) Sigma Aldrich A7030
Bromophenol blue Sigma Aldrich B0126
Bruker Avance III 400 Bruker
Celite Sigma Aldrich 419931 Health hazard
Ceric ammonium nitrate  Sigma Aldrich 22249 Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate Sigma Aldrich C8383 Higly toxic
CuSO4.5H2O  Sigma Aldrich 209198 Toxic
Cyclohexadiene Sigma Aldrich 125415 Flammable, Health hazard
Cyclohexane Sigma Aldrich 34855 Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane Sigma Aldrich 34856 Harmful, Health hazard
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Acros Organics 348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) Sigma Aldrich 175943
Ethanol Sigma Aldrich 2860 Flammable, Harmful
Ethyl acetate Sigma Aldrich 34858 Flammable, Harmful
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Irdye 680-LT Streptavidin Li-Cor Biosciences 925-68031
IRDye680-LT Streptavidin  Licor 925-68031 Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol Sigma Aldrich 34966 Highly toxic
Methanol Sigma Aldrich 34860 Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E7750 Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806 Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide Sigma Aldrich 227056 Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine Fluorochem M03053 Harmful
Nikon A1 confocal microscopy Nikon Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0335BOX
Palladium on carbon Sigma Aldrich 330108
p-anisidine Sigma Aldrich A88255 Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde sigma Aldrich 441244 Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)  Sigma Aldrich P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI  Thermo Fisher Scientific P36931 Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich P8340
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)  Sigma Aldrich L3771 Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride  Sigma Aldrich 452912 Flammable
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313
Starion FLA-9000 immage scanner FUJIFILM Read  the user manual
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20349
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Tert-butanol Sigma Aldrich 360538 Toxic, flammable
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 186562 Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea Acros Organics 424542500 Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris Sigma Aldrich RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Sigma Aldrich C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
Triton-x100 Sigma Aldrich X100 Toxic
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Tween-80 Sigma Aldrich P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer IKA
Undec-10-yn-1-ol Fluorochem 13739 Harmful
Urea Sigma Aldrich U5378 Toxic, warm at 50 °C to dissolve

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References

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Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S., Bonezzi, F., Migliore, M., Di Martino, S., Summa, M., Piomelli, D. Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase. J. Vis. Exp. (117), e54652, doi:10.3791/54652 (2016).

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