यहाँ, हम तैयार करने और एक गतिविधि आधारित जांच के उपयोग का वर्णन (ARN14686, undec-10-एन ynyl- – [(3 एस) -2-oxoazetidin-3-YL] carbamate) है कि पता लगाने और मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है proinflammatory एंजाइम एन -acylethanolamine एसिड amidase के सक्रिय रूप (naaa), दोनों इन विट्रो और पूर्व vivo में।
गतिविधि आधारित प्रोटीन रूपरेखा (ABPP) एक रासायनिक जांच है कि एंजाइम सक्रिय साइटों को लक्षित के उपयोग के माध्यम से एक जटिल proteome में ब्याज की एक एंजाइम की पहचान के लिए एक विधि है। एक पत्रकार टैग जांच में पेश में जेल प्रतिदीप्ति स्कैनिंग, प्रोटीन धब्बा, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, या तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा लेबल एंजाइम का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। यहाँ, हम तैयारी और यौगिक ARN14686 का उपयोग करते हैं, एक क्लिक के रसायन शास्त्र गतिविधि आधारित जांच (CC-एबीपी) है कि चुनिंदा एंजाइम एन -acylethanolamine एसिड amidase (naaa) पहचानता का वर्णन है। Naaa एक सिस्टीन hydrolase कि इस तरह के palmitoylethanolamide (मटर) और oleoylethanolamide (OEA) के रूप में अंतर्जात peroxisome proliferator सक्रिय रिसेप्टर (PPAR) -alpha एगोनिस्ट निष्क्रिय करने से सूजन को बढ़ावा देता है। Naaa एक निष्क्रिय पूर्ण लंबाई proenzyme, जो लाइसोसोम के अम्लीय पीएच में autoproteolysis से सक्रिय है के रूप में संश्लेषित है। स्थानीयकरण के अध्ययन जपता चला है कि मुख्य रूप से naaa बी लिम्फोसाइटों में, मैक्रोफेज और अन्य monocyte व्युत्पन्न कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और साथ ही साथ AVE। हम कैसे ARN14686 का पता लगाने और प्रोटीन धब्बा और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा कृंतक ऊतकों में सक्रिय naaa पूर्व vivo यों इस्तेमाल किया जा सकता का उदाहरण देते हैं।
अधिक इस्तेमाल किया तरीकों अभिव्यक्ति पैटर्न, बातचीत, और प्रोटीन के कार्यों, बन्दूक विश्लेषण 1,2, खमीर के लिए तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफार्मों सहित जांच करने के लिए दो संकर तरीकों 3,4, और इन विट्रो assays में, में सीमित कर रहे हैं वे कर रहे हैं कि उनके पैतृक राज्य में प्रोटीन की गतिविधि का आकलन करने में असमर्थ है। गतिविधि आधारित प्रोटीन रूपरेखा (ABPP) इस अंतर को भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण में, छोटे अणु covalently ब्याज की एक एंजाइम के सक्रिय साइट के लिए बाध्यकारी एक पत्रकार समूह है कि लक्ष्य का पता लगाने के लिए अनुमति देता है संयुग्मित हैं करने में सक्षम जांच। क्लिक रसायन विज्ञान (सीसी) का उपयोग करना, संवाददाता जांच में एकीकृत किया जा सकता है या लक्ष्य सगाई के बाद 5,6 हुआ है शुरू की जा सकती है। उत्तरार्द्ध प्रक्रिया में इस तरह के एक टर्मिनल alkyne या azide, जो सफलता जैव orthogonal प्रतिक्रियाओं के माध्यम से संवाददाता अभिकर्मकों के एक नंबर के साथ संशोधित किया जा सकता है के रूप में उपयुक्त रासायनिक समूहों, जिसमें जांच के उपयोग की आवश्यकताघन (मैं) के रूप में ज Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 या Staudinger बंधाव 10,11 -catalyzed।
हाल ही में, हम इन विट्रो के लिए पहले एबीपी के रूप में और सिस्टीन hydrolase, naaa 12 के विवो पता लगाने में यौगिक ARN14686 खुलासा किया। Naaa oleoylethanolamide (OEA) और palmitoylethanolamide (मटर) सहित संतृप्त और monounsaturated FAEs, जो विरोधी भड़काऊ परमाणु रिसेप्टर PPAR-अल्फा 13-15 की अंतर्जात एगोनिस्ट हैं की hydrolytic छोड़ना उत्प्रेरित। Naaa मुख्य रूप से है, साथ ही बी-लिम्फोसाइट 14,16 के रूप में, मैक्रोफेज और अन्य monocyte व्युत्पन्न कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नियमन में एक भूमिका का सुझाव दे। एंजाइम एक निष्क्रिय रूप में किसी न किसी जालिका में संश्लेषित है और एक autoproteolytic तंत्र 17 से सेल के अम्लीय डिब्बों में सक्रिय है। Autoproteolytic दरार एक नया एन -terminal सिस्टीन (उत्पन्न C13चूहों और चूहों में 1, मानव में C126), कि FAE के लिए जिम्मेदार nucleophile hydrolysis 18,19 है। Naaa गतिविधि के औषधीय निषेध FAEs 16,20,21 की वृद्धि की सेलुलर स्तर के पक्ष में FAE संश्लेषण / गिरावट संतुलन बदल। कई β-लैक्टोन और β लस्टम डेरिवेटिव उच्च शक्ति और चयनात्मकता 16,22-26 साथ naaa गतिविधि को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। इन अवरोधकों उत्प्रेरक सिस्टीन 16,27,28 के एस -acylation के माध्यम से काम करते हैं।
(- [(एस) -2-oxoazetidin-3-YL] carbamate 4-cyclohexylbutyl- एन) 16 यौगिक ARN14686 प्रणालीबद्ध सक्रिय, सेरीन व्युत्पन्न β लस्टम naaa अवरोध की रासायनिक संरचना, ARN726 के आधार पर तैयार किया गया था। ARN726 की 4-ब्यूटाइल-Cyclohexyl समूह एक C9 संतृप्त स्निग्ध श्रृंखला एक azide असर संवाददाता टैग के साथ बाद में सीसी विकार के लिए एक टर्मिनल alkyne टैग असर के साथ बदल दिया गया था। हम minimall करने के लिए एक दो कदम एबीपी डिजाइन करने के लिए चुना हैY मूल पाड़ की संरचना में परिवर्तन, इस प्रकार naaa के लिए जांच की आत्मीयता बनाए रखने। इसके अलावा, भारी टैग की शुरूआत से परहेज है, इस तरह के एक मामले की जांच के लिए एक सीधा एबीपी से इन विवो उपचार के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। ARN14686 उच्च शक्ति के साथ naaa रोकता (hNAAA आईसी 50 = 6 एनएम, rNAAA आईसी 50 = 13 एनएम) एंजाइम 12 का उत्प्रेरक सिस्टीन के साथ एक सहसंयोजक अभिवर्तन गठन से। लाइव चूहों में प्रयोगों से पता चला है कि जांच कब्जा naaa फेफड़ों में व्यक्त करने में चयनात्मक है। एसिड ceramidase, एक और सिस्टीन amidase कि naaa साथ 33-34% पहचान साझा भी जब उच्च सांद्रता जांच (इन विट्रो में 10 माइक्रोन, 10 मिलीग्राम / एमएल नसों में, चतुर्थ) 12 का उपयोग कर एक कम आत्मीयता लक्ष्य के रूप में पहचान की थी। हम भी पूरा Freund के सहयोगी (सीएफए) 29 के प्रशासन निम्नलिखित सूजन चूहे ऊतकों में सक्रिय naaa की उपस्थिति का अध्ययन करने के ARN14686 इस्तेमाल किया है।
यहाँ, हम preparati के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयारARN14686 (चित्रा 1) और naaa सक्रियण पूर्व vivo की जांच करने के लिए अपने आवेदन के पर। एक उदाहरण के रूप में, हम सीएफए प्रशासन के बाद चूहे पंजे में naaa कल्पना करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन है। इस प्रयोग में, प्रोटीन जांच के चतुर्थ इंजेक्शन के बाद पंजा ऊतक से निकाले जाते हैं, और एबीपी लेबल proteome बायोटिन azide के साथ सीसी के अधीन है। Biotinylated नमूने streptavidin मोतियों का उपयोग कर समृद्ध कर रहे हैं, और प्रोटीन blots प्रदर्शन कर रहे हैं। एक और आवेदन में, हम जांच-इलाज चूहों से माउस फेफड़ों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा सक्रिय naaa के स्थानीयकरण का वर्णन है। इस मामले में, ऊतक sectioned है और वर्गों rhodamine इसके लिए सीसी के अधीन हैं। एक कार्यप्रवाह योजना चित्रा 2 में सचित्र है।
एंजाइम गतिविधि पतले आरएनए प्रतिलेखन, प्रोटीन संश्लेषण, प्रोटीन, बाद translational संशोधन, और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत सहित विभिन्न स्तरों पर विनियमित है। अक्सर, एंजाइम अभिव्यक्ति अकेले अपनी गतिविधि के लिए खात…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |