Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

förberedelse och Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

Summary

Här beskriver vi framställning och användning av en aktivitetsbaserad sond (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] karbamat) som gör det möjligt att upptäcka och kvantifiera aktiva formen av proinflammatoriska enzym N -acylethanolamine syra amidas (NAAA), både in vitro och ex vivo.

Abstract

Aktivitetsbaserad proteinprofilering (ABPP) är en metod för identifiering av ett enzym av intresse i en komplex proteomet genom användning av en kemisk sond som riktar enzymets aktiva platser. En reporter tag införs i sonden möjliggör påvisande av det märkta enzymet genom in-gel fluorescens skanning, protein blot, fluorescensmikroskopi, eller vätskekromatografi-masspektrometri. Här beskriver vi framställningen och användningen av föreningen ARN14686, ett klickkemi aktivitetsbaserad sond (CC-ABP) som selektivt känner igen enzymet N -acylethanolamine syra amidas (NAAA). NAAA är en cystein hydrolas som främjar inflammation genom att inaktivera endogena peroxisomproliferator-aktiverad receptor (PPAR) -alfa agonister såsom palmitoyletanolamid (PEA) och oleoylethanolamide (OEA). NAAA syntetiseras som ett inaktivt fullängds proenzym, som aktiveras av autoproteolys i det sura pH-värdet i lysosomen. Lokaliseringsstudier have visat att NAAA huvudsakligen uttryckt i makrofager och andra monocythärledda celler, såväl som i B-lymfocyter. Vi ger exempel på hur ARN14686 kan användas för att detektera och kvantifiera aktiv NAAA ex vivo i gnagare vävnader genom proteinblot och fluorescensmikroskopi.

Introduction

Vanligt använda metoder för att undersöka uttrycksmönster, interaktioner och funktioner av proteiner, inklusive vätskekromatografi-masspektrometri plattformar för hagelgevär analys 1,2, jäst två-hybrid metoder 3,4, och in vitro-analyser, är begränsade i att de är inte bedöma aktiviteten hos proteiner i deras naturliga tillstånd. Aktivitetsbaserad proteinprofilering (ABPP) kan användas för att fylla detta gap. Vid detta tillvägagångssätt sonder små-molekyl med förmåga att kovalent binda till det aktiva stället i ett enzym av intresse är konjugerade till en reportergrupp som möjliggör måldetektering. Med användning av klickkemi (CC), kan reportern integreras i proben eller kan införas efter målet ingrepp har inträffat 5,6. Det senare förfarandet kräver användning av sonderna innehåller lämpliga kemiska grupper, såsom en terminal alkyn eller azid, som kan modifieras med ett antal reporter reagens via bio-ortogonala reaktioner Such som Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cykloaddition 7-9 eller Staudinger ligering 10,11.

Nyligen avslöjas vi föreningen ARN14686 som den första ABP för in vitro och in vivo detektion av cystein hydrolas, NAAA 12. NAAA katalyserar hydrolytiska deaktivering av mättade och enkelomättade FAE, inklusive oleoylethanolamide (OEA) och palmitoyletanolamid (PEA), som är endogena agonister av den antiinflammatoriska nukleär receptor PPAR-alfa 13-15. NAAA huvudsakligen uttryckt i makrofager och andra monocythärledda celler, såväl som i B-lymfocyter 14,16, vilket tyder på en roll i regleringen av det medfödda immunsvaret. Enzymet syntetiseras i den grova endoplasmatiska retiklet i en inaktiv form och aktiveras i sura avdelningarna i cellen genom en autoproteolytisk mekanism 17. Den autoproteolytisk klyvning genererar en ny N-terminal cystein (C131 hos möss och råttor, C126 hos människa), är att nukleofilen ansvarig för FAE hydrolys 18,19. Farmakologisk hämning av NAAA aktivitet ändrar FAE balans syntes / nedbrytning till förmån för ökade cellulära nivåerna av FAE: 16,20,21. Flera β-lakton och β-laktamderivat har visats hämma NAAA aktivitet med hög potens och selektivitet 16,22-26. Dessa inhibitorer fungerar genom S-acylering av den katalytiska cystein 16,27,28.

Föreningen ARN14686 designades baserat på den kemiska strukturen hos den systemiskt aktiva, serin-härledda β-laktam NAAA-inhibitor, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] karbamat) 16. Den 4-butyl-cyklohexyl grupp ARN726 ersattes med en C9 mättad alifatisk kedja som bär en terminal alkyn tagg för efterföljande CC konjugering med en azid bärande reporter tagg. Vi valde att konstruera en två-stegs ABP att minimally förändra strukturen av den ursprungliga ställningen och upprätthåller därmed affiniteten av sonden för NAAA. Dessutom undviker införandet av skrymmande taggar, kan en sådan sond vara lämpligare för behandling in vivo än en direkt ABP. ARN14686 hämmar NAAA med hög potens (hNAAA IC 50 = 6 nM rNAAA IC 50 = 13 nM) genom att bilda en kovalent addukt med den katalytiska cystein av enzymet 12. Experiment i levande råttor visade att sonden är selektiv fånga NAAA uttryckt i lungorna. Syra ceramidas, en annan cystein amidas som delar 33-34% identitet med NAAA, identifierades också som en låg affinitet mål när du använder höga sondkoncentrationer (10 um vitro, 10 mg / ml intravenös, iv) 12. Vi har även använt ARN14686 för att studera närvaron av aktiva NAAA i inflammerade råttvävnader efter administration av fullständigt Freunds adjuvans (CFA) 29.

Här, vi beskriva ett protokoll för preparatining ARN14686 (Figur 1) och dess tillämpning på utredningen av NAAA aktivering ex vivo. Som ett exempel, beskriver vi ett experimentellt förfarande för att visualisera NAAA i rått tassar efter CFA administrering. I detta experiment, är proteiner som extraherats från tassvävnad efter intravenös injektion av sonden, och ABP-märkta proteomet utsattes för CC med biotin-azid. Biotinylerade prover anrikas med användning av streptavidinpärloma, och proteinblotting utförs. I en annan tillämpning beskriver vi lokalisering av aktiva NAAA med fluorescensmikroskopi i muslungor från prob-behandlade möss. I detta fall är den vävnad sektioneras och sektionerna utsätts för CC för rodamin tillsats. Ett arbetsflöde system visas i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Varning: Alla kemi reaktioner bör utföras i ett ventilerat dragskåp och med hjälp av en labbrock, handskar och skyddsglasögon. Reaktionerna bör också genomföras i en kvävemiljö.

Etisk uttalande: Våra som deltar i djurförsök utförs i enlighet med de italienska reglerna om skydd av djur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål (DM 116.192) och Europeiska ekonomiska gemenskapen föreskrifter (EGT EG L 358/1 1986/12/18 ).

OBS: Syntes av [(3 S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetat beskrivs för storskaliga utbyten (50 g N-Cbz-L-serin), men det kan lätt skalas ner.

1. Syntes

OBS: Se figur 1 för syntes reaktionsschema.

  1. Framställning av 2-pyridyl-undek-10-ynyl karbonat och undek-10-ynyl 2-oxopyridin 1-karboxylat
    1. I en 50 ml rundbottnad kolv, lös upp 350 mg undec-10-yn-1-ol i 3,5 ml torr diklormetan.
    2. Till lösningen i 1.1.1, tillsätt 25 mg 4-dimetylaminopyridin (DMAP) och 530 mg 2-dipyridylcarbonate (DPC). Rör om blandningen vid rumstemperatur (RT) under 16 h.
    3. Tillsätt 20 ml diklormetan.
    4. Överför blandningen i en separertratt. Tillsätt 15 ml vatten, skaka det, och låta de två faserna separera.
    5. Öppna kranen, samla den organiska fasen (botten), och stäng sedan kranen. Tillsätt 15 ml av en mättad NaHCOs 3 lösning. Skaka separertratten och låt de två faserna separera. Upprepa detta steg två gånger.
    6. Torka det organiska skiktet med Na 2 SO 4, filtrera genom bomull i en rundbottnad kolv (tara först), och indunsta till torrhet under reducerat tryck (rotationsindunstare).
    7. Väg kolven och erhålla 600 mg olja som är en blandning av 2-pyridyl undek-10-ynyl karbonat och undek-10-ynyl 2-oxopyridin 1-karboxylat i ett förhållande av 1,7: 1.
      1 H-NMR (400 MHz, DMSO-6) huvudkomponenten δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1 H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1 H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) mindre komponent δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6,30-6,25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1 H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
    8. Använd oljan utan ytterligare separation eller rening.
  2. Framställning av [(3 S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetat
    1. Framställning av bensyl-N - [(S) -1- (hydroximetyl) -2 - [(4-metoxifenyl) amino] -2-oxoethyl] karbamat.
      1. I en 4-liters rundbottnad kolv, lös upp 141,5 g p-anisidin i 1,5 L tetrahydrofuran och 0,5 L diklormetan.
      2. Kyl lösningen till 0 ° C i ett isbad.
      3. Lägga 50,0 g N-Cbz-L-serin och 43,9 g N - (3-dimetylaminopropyl) - N '-ethylcarbodiimide hydroklorid.
      4. Rör blandningen med en magnetisk bar vid 0 ° C under 30 min.
      5. Avlägsna lösningen från isbadet och rör om med en magnetisk bar vid RT under 16 h.
      6. Indunsta lösningsmedlen under reducerat tryck (rotationsindunstare).
      7. Tillsätt 400 ml av 1: 1 cyklohexan / etylacetat, rör om med en spatel, och dekantera.
      8. Upprepa steg 1.2.1.7 två gånger till.
      9. Lös upp gummiartade återstoden i 500 ml etylacetat och tvätta med 400 ml 0,1 M HCl-lösning (10 gånger), med 400 ml mättad NaHCOs 3 lösning (2 gånger), och med 400 ml koksaltlösning.
      10. Torka det organiska skiktet medNa 2 SO 4, filtrera lösningen genom bomullen i en rundbottnad kolv (tara först), och indunsta den till torrhet under reducerat tryck (rotationsindunstare).
      11. Väg kolven och erhålla 61,4 g av ett vitt fastämne.
        1 H-NMR (400 MHz, DMSO-dg) 6 = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
    2. Framställning av bensyl-N - [(S) -1- (4-metoxifenyl) -2-oxo-azetidin-3-yl] karbamat.
      1. Lös upp 58,6 g av N - [(S) -1- (hydroximetyl) -2 - [(4-metoxifenyl) amino] -2-oxo-etyl] karbamat i 1,6 L av N, N-dimetylformamid.
      2. Kyl lösningen till 0 ° C med ett isbad.
      3. Lägga 50,6 g 1,1'-sulfonyldiimidazole och rör om med en magnetisk bar under 30 min.
      4. Kyl lösningentill -20 ° C med ett is / NaCl-bad och tillsätt 10,2 g natriumhydrid (60% i mineralolja) portionsvis.
      5. Rör om blandningen vid -20 ° C under 1 h, och sedan släcka med 2 ml metanol och 1 L vatten.
      6. Vakuum filtrera fällningen, tvätta med 200 ml vatten, och torka under vakuum.
      7. Erhålla 42,2 g av ett vitt fastämne.
        1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
    3. Framställning av bensyl-N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] karbamat.
      1. Suspendera 9,0 g bensyl N - [(S) -1- (4-metoxifenyl) -2-oxoazetidin-3-yl] karbamat i 500 ml acetonitril och 400 ml vatten.
      2. Kyl lösningen till 0 ° C i ett isbad.
      3. Lägga 45,4 g ceric ammoniumnitrat portionsvis under 45 minuter och rör om med en magnetisk bar vid 0 ° C under 15 min.
      4. 500 ml mättad NaHCOs 3 lösning försiktigt och sedan 500 ml etylacetat.
      5. Filtrera fällningen och tvätta med 200 ml etylacetat.
      6. Separera den tvåfasiga lösningen och tvätta vattenskiktet med 200 ml etylacetat (3 gånger).
      7. Torka det organiska skiktet med Na 2 SO 4, tillsätt 5 g aktiverat träkol, filtrera genom en kudde av kiselgur, och indunsta till torrhet under reducerat tryck (rotationsindunstare).
      8. Tillsattes dietyleter och rör om med en spatel.
      9. Filtrera det fasta ämnet och erhålla 4,85 g av ett benvitt fastämne.
        1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7,30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
      Framställning av [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] -ammonium Acetat.
      1. Lös upp 0,93 ml ättiksyra i 245 ml etylacetat. Markera detta som "fånga lösning."
      2. Lös 3,28 g bensyl N - [(R) -2-oxoazetidin-3-yl] karbamat i 298 ml etanol.
      3. Lägg 14,1 ml cyklohexadien och 3,27 g 10% palladium på kol.
      4. Rör om suspensionen vid RT under 12 h, och sedan filtrera genom en kort kudde av diatoméjord. Häll eluerande vätskan direkt in i infångningslösning.
      5. Indunsta lösningsmedlet under reducerat tryck (rotationsindunstare), varvid temperaturen hölls under 35 ° C.
      6. Triturera den erhållna fasta substansen med tetrahydrofuran och erhållande av 1,72 g av ett vitt fastämne.
        1 H-NMR (400 MHz, DMSO-dg) 6 = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
  3. Framställning av undek-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-yl] karbamat
    1. I en 10 ml rundbottnad kolv, lös upp 60 mg av [(3 S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetat i 2 ml torr diklormetan.
    2. Kyl lösningen till 0 ° C i ett isbad och tillsätt 81 | il av N, N-diisopropyletylamin droppvis.
    3. Lös 350 mg råblandning innehållande undec-10-ynyl 2-oxopyridin en-karboxylat i 2 ml torr diklormetan, lägga till lösningen, och rör om vid rumstemperatur under 15 timmar. Indunsta lösningsmedlet till torrhet under reducerat tryck (rotationsindunstare).
    4. Rena med kolonn-kromatografi (silikagel) med användning av en automatiserad kolonnkromatografi apparat:
      1. Absorbera provet på silikagel, jämvikta kolonnen med cyklohexan och ladda provet in i patronen.
      2. Eluera med cyklohexan / etylacetat från 100: 0 till 0: 100 och samla toppar på provrören.
      3. Indunsta lösningsmedlet av de fraktioner som motsvarade föreningen till torrhet under reducerat tryck (rotationsindunstare) och erhållande av 40 mg av ett vitt fastämne.

2. Beredning av CC Reagens

  1. Framställning av 5 mM stamlösning av Tag-azid Molekyler
    1. Lös upp 1,5 mg av azid-PEG3-Fluor 545 i 0,5 ml dimetylsulfoxid (DMSO). Gör alikvoter i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.
    2. Lös upp 1,1 mg av azid-PEG3-biotin i 0,5 ml DMSO. Gör alikvoter i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.
  2. Framställning av 50 mM stamlösning av tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP)
    1. Lös 14,3 mg TCEP i 1 ml vatten, och gör det färska varje gång.
  3. Framställning av 50 mM lösning av CUSO4 · 5H 2 O
    1. I en glasflaska, upplösa 12.48 Mg CuSO 4 · 5H 2 O i 1 ml vatten. Förvara vid RT i upp till en månad.
  4. Framställning av 83,5 mM stamlösning av tris [(1-bensyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) metyl] amin (TBTA)
    1. I en glasflaska, upplösa 8,85 mg TBTA i 200 pl DMSO. Förvara vid RT i upp till en månad.
  5. Framställning av 1,7 mm Arbets Lösning av TBTA (omedelbart före användning)
    1. Tillsätt 20 | il av 83,5 mM TBTA till en glasflaska och späd med 180 ml DMSO.
    2. Tillsätt 800 pl av tert-butanol och skaka.

3. NAAA Expression Analys i Paw Tissue av CFA-behandlade råttor

OBS: Använd Sprague-Dawley, vägande 175-200 g, och utföra alla procedurer i enlighet med riktlinjer för etisk användning av djur. Hus råttor i ventilerade burar på en 12-timmar ljus / mörker-cykel och ge dem fri tillgång till mat och vatten. För protokollet av CFEn behandling, se artikel publicerad av Bonezzi et al. 29 Använd djur 7 dagar efter CFA administration.

  1. Intravenös administrering av ARN14686
    1. Upplösa ARN14686 i vehikel (15% PEG och 15% Tween saltlösning). Beräkna lösningens koncentrationen enligt råttvikt (dos 3 mg / kg, injektionsvolym 5 ml / kg).
    2. Fortsätt med iv injektioner i tre naiva och tre CFA-behandlade råttor. Placera varje råtta i en lämplig plast kvarhållande anordning. Sedan placera råttan svansen i varmt vatten i 2-4 min för att medge vasodilation, och injicera föreningen IV via svansvenen.
    3. Injicera tre råttor (naiva och CFA-behandlade) iv med endast fordon.
  2. Paw Insamling och Dissection
    1. Offra råttor genom CO2 inhalering fyra timmar efter sond eller fordon administration och hämta sina tassar genom att skära dem 0,5 cm ovanför knäleden med hjälp av en skalpell.
    2. Försiktigt bort huden genom sax assisterad dissektion och dissekera ut mjukdelar genom att skrapa dem från benet. Kasta ben och samla de mjuka vävnader tassarna. Snap frysa proverna i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C.
  3. Tass Homogenisering och lysosomalt protein Framställning
    OBS: Undvik att använda rengöringsmedel och amininnehållande buffertar, eftersom de kan hämma CC reaktionen.
    1. Kombinera tass vävnad från 3 råttor (som erhållits såsom beskrivits i avsnitt 3.2.1) och homogenisera dem i 4 ml av 320 mM sackaros i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) och en proteashämmare cocktail (se Material / Reagens tabell); använda en högpresterande dispergeringsmedel instrument (se Material / Reagens tabell).
    2. Centrifugera vävnadshomogenatet under 20 min vid 1000 xg vid 4 ° C; spara supernatanten.
    3. Tillsätt 2 ml av 320 mM sackaros i PBS och proteasinhibitorcocktail till vävnaden pelleten ochhomogenisera en gång till.
    4. Centrifugera i 20 min vid 1000 xg vid 4 ° C, och tillsätt supernatanten till en från steg 3.3.2.
    5. Centrifugera de uppsamlade supernatanterna för 30 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C.
    6. Väg pelleten och återsuspendera i två volymer PBS (dvs 200 ^ för varje 100 mg pellet). Överför till en 1,5 ml uppsamlingsrör och frys vid -80 ° C under 1 timme.
    7. Tina proverna och frysa igen i 1 h vid -80 ° C.
    8. Upprepa frys / tining cykeln två gånger till.
      Anmärkning: Detta steg är avsett att solubilisera proteinet. Frysa över natten om det behövs.
    9. Centrifugera i en timme vid 100.000 xg vid 4 ° C. Samla in supernatanten, som innehåller lösliga lysosomala proteiner, och kasta pelleten. Förvara vid -80 ° C eller omedelbart fortsätta med protein kvantifiering.
    10. Kvantifiera proteinhalten med hjälp av en BCA-proteinanalys 30 kommersiellt kit (se Material / Reagens Table
    11. Lagra proverna vid -80 ° C fram till användning.
  4. CC med azid-PEG3-Biotin
    OBS: Protokollet av CC och streptavidin pärla anrikning (steg 3,4-3,6) ändras något från protokollet publiceras av Speers och Cravatt 31.
    1. Förbereda 500 pl (1 mg / ml, i PBS) av lysosomala proteiner från probe- och vehikelbehandlade råttor (naiva och CFA-behandlade råttor).
    2. Preclear prover med 40 | il av en 50% uppslamning av streptavidin-agaros (tvätta tre gånger med 1 ml PBS före användning) under 1 h vid 4 ° C. Centrifugera i 4 min vid 1000 xg vid 4 ° C och ta supernatanten.
    3. Lägg 11,3 pl av en 5 mM lager av azid-PEG3-Biotin och virvel.
    4. Lägg 11.3 il av en 50 mM lager av nygjord TCEP och virvel.
    5. Premix 34 fil av en nyframställd arbetslösning av 1,7 mM TBTA med 11,3 | il av en 50 mM CUSO4 2 O lager.
    6. Lägg 45,3 ml av en färdigblandad TBTA / CUSO4 · 5H 2 O lösning och virvel.
    7. Inkubera reaktionen vid 25 ° C under 2 h (betyder en längre inkubationstid inte påverkar reaktionen). Beakta proteinutfällning i detta steg. Blanda efter den första timmen av inkuberingen.
  5. Avlägsnande av överskott CC Reagens
    1. Centrifugera prover för 4 min vid 6500 xg vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
    2. Med 750 | il kall metanol och återsuspendera genom sonikering (5 sek med en sond-sonikator).
    3. Centrifugera prover för 4 min vid 6500 xg vid 4 ° C och avlägsna supernatanten med användning av en spruta och nål.
    4. Upprepa steg 3.5.2 två gånger (ultraljudsbehandling krävs inte).
    5. Efter den sista tvättningen, tillsätt 325 | il av natriumdodecylsulfat (SDS) 2,5% i PBS till de proteinpellet och sonikeras 3x i 5 sek.
    6. Värma proverna för 5 minuter vid 65 ° C och låt ligga enfå.
    7. Centrifugera i 5 minuter vid 6500 xg vid RT och spara supernatanten.
    8. Lägga 1,4 ml PBS för att späda SDS-koncentrationen till 0,5%. Förvara vid -20 ° C eller fortsätta med streptavidin anrikning.
  6. streptavidin Anrikning
    1. Med PBS, ta volymen av de prov som erhålls i steg 3.5.8 till 4,2 ml. Tillsätt 40 | il av en 50% uppslamning av streptavidin agaros med användning av en cut-ändspetsen (tvätta tre gånger med 1 ml PBS före användning).
    2. Inkubera i 2 h vid RT med rotation och centrifugera sedan i 2 min vid 1400 x g.
    3. Avlägsna supernatanten utan att torka pärlorna pellets och använda restvätskan för att överföra pärlorna till en 1 ml spinnkolonn (se Material / Reagens tabell).
    4. Tvätta av tyngdkraften med 3 x 1 ml av 1% SDS (i PBS), 3x 1 ml av 6 M urea (i PBS), och 4x 1 ml PBS.
    5. Användning 2x 500 | j, l PBS för att överföra pärlorna till ett 1,5 ml rör och centrifugera i 2 min vid 1400 xg vid RT. aspirera försiktigt supernatanten med en spruta och nål.
    6. Eluera de hartsbundna proteiner genom tillsats av 25 | il elueringsbuffert (6 M urea, 2 M tiourea, 2% SDS, och 6 mM biotin, alla i PBS) under 15 min vid RT, följt av 15 min vid 95 ° C 32.
  7. protein Blot
    1. Tillsätt 5 | il 6x Laemmli-buffert (för 9 ml: 0,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 5 ml av 20% SDS, 5 mg bromfenolblått, 3 ml glycerol, och H2O upp till 9 ml) och tillsätt 5% β-merkaptoetanol omedelbart före användning. centrifugera kort proverna vid 2000 xg för att pelletera harts och last 25 pl av den erhållna supernatanten i en 4-12% polyakrylamidgel.
    2. Utför gelelektrofores och proteinöverföring på en läsk membran enligt tillverkarens anvisningar 33.
    3. Mätta läsk membranet under 1 h med 10 ml av en blockeringsbuffert (se Material / Reagens tabell) innehållande 0,1% Tween-20.Undvik att använda mjölk, eftersom det kan öka bakgrunden.
    4. Tvätta membranet med 10 ml 0,05% Tween-20 i PBS och tillsätt 10 | il av fluorescerande streptavidin (se Material / Reagens tabell) löst i 10 ml blockeringsbuffert plus 0,1% Tween-20 under 1 h vid RT.
    5. Tvätta 4 gånger med 0,05% Tween-20 i PBS och en gång med enbart PBS (10 min vardera).
    6. Använd en bildskanner (se Material / Reagens tabell). Slå på instrumentet och den anslutna datorn. Vänta tills färdig.
    7. Starta insamlingsprogram och välj fluorescens läge. Välj membranområdet och välj destinationsmapp för sparade filer.
    8. Ange följande förvärvsparametrar: 680 nm excitation längd, BPFR700 filter, 1000 V fotomultiplikatorrör (PMT) värde (kanal 2) och 25 nm pixelstorlek. Hämta bilden.

4. Lokalisering av katalytiskt aktiva NAAA i mus lungorna genom Fluorescence Microskopiera

OBS: Använd male 8-10 veckor gamla möss och utföra alla procedurer i enlighet med de riktlinjer för etisk användning av djur. Hus möss i ventilerade burar på en 12 timmar ljus / mörker-cykel och ge dem fri tillgång till mat och vatten.

  1. Intravenös administrering av ARN14686 hos möss
    1. Lös ARN14686 i fordonet: 15% PEG och 15% Tween-20 saltlösning. Beräkna lösningens koncentrationen enligt mus vikt (dos 3 mg / kg, injektionsvolym 5 ml / kg).
    2. Fortsätt med intravenös injektion av 3 möss. Placera varje mus i en lämplig plast kvarhållande anordning. Sedan placera musen svansen i varmt vatten i 2-4 min för att medge vasodilatation och injicera föreningen IV via svansvenen.
    3. Injicera tre möss iv med endast fordon.
  2. Lung Insamling och Slice Förberedelser
    Varning: Hantera paraformaldehyd med omsorg i ett dragskåp och handskar!
    1. Söva möss med Chloral-hydrat (400 mg / kg). Bekräfta anestesi med en tå nypa. Utför en transcardial perfusion enligt följande:
      1. Ytligt skära ventrala huden med sax och exponera bröstkorg och bukhinnan ytor.
      2. Ytligt skära peritonealmembranet med sax, precis under xyphoid processen, och exponera membranet och viscerala organ. Var noga med att inte SARGA någon betydande kärl.
      3. Öppna brösthålan genom att skära membranet från en laterala sidan till den andra.
      4. För in 25 G-nål som är ansluten till den automatiserade sprutpumpen och ingjuta 20 ml av 0,9% saltlösning, följt av 60 ml av 4% PFA i fosfatbuffert (0,1 M, pH 7,4).
    2. När perfusionen är klar, dra hjärtat med pincett och försiktigt dissekera ut. Ta tag i luftstrupen med pincett och skär helt igenom det med sax. Dra försiktigt luftstrupen uppåt och ta bort lungorna från bröstkorgen. Dissekera vävnad tillseparera höger lunga från vänster.
    3. Postfix vävnaden i paraformaldehyd 4% under 1 timme, frysa proverna i kall 2-metylbutan, och förvara dem vid -80 ° C.
    4. Samla 40 um sektioner med hjälp av en kryostat, montera dem direkt på objektglas (en var femte), och behandla dem för immunohistokemi enligt nedan.
  3. Vävnadsskivor Permeabilization och Blockering
    1. Tvätta med PBS (2 x för 5 min) och permeabilisering med 0,1% Triton X-100 PBS i 15 min vid RT.
    2. Tvätta med PBS (2 x för 5 min) och blockera med 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS under 30 min vid RT.
    3. Tvätta med PBS (2x för 5 min) och fortsätt med CC.
  4. CC med Azid-PEG3-Fluor 545 på vävnadsskivor
    1. Bered en lösning genom att blanda CC reagens framställda såsom beskrivits i avsnitt 2. För en ml lösning, tillsätt 2 pl Azid-PEG3-Fluor 545 (5 mM stam), 20 pl TCEP (nyframställd 50 mM STOCk), 58,8 pl TBTA (nyberedd 1,7 mM arbetslösning), 20 pl CUSO4 · 5H 2 O (50 mM lager), och 900 pl PBS.
    2. Lägg cirka 400 pl CC mix till vävnadssnitt, som framställdes i enlighet med punkt 4.2. Uppmärksamma att den valda volymen av CC mix är tillräckligt för att täcka skivorna. Inkubera under 1 h vid RT skyddad från ljus.
    3. Tvätta med PBS (1 x för 5 min), kall metanol (1 x för 5 min), en lösning av 1% Tween-20 och 0,5 mM EDTA i PBS (3x i 2 min) och PBS (1 x för 5 min).
    4. Lufttorka, tillsätt en droppe antifade monterings med DAPI (se Material / Reagens tabell), nära med täckglas (undvika bubbelbildning) och försegla med polish. Lagra vid 4 ° C fram till analys.
  5. Image Acquisition
    1. Använd en konfokalmikroskop utrustad med 546 nm och 450 nm excitation laser (se Material / Reagens tabell) eftermanualen.
    2. Välj en 60X objektiv med NA = 1,40, och se till att förhandsgranska bilden genom okularen och fokusera på ett område av intresse.
    3. Bestäm insamlingsparametrar enligt provet och utrustningsfunktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ARN14686 designades baserat på ställningen av inhibitor ARN726 den NAAA. Den 4-butyl-cyklohexyl grupp ARN726 ersattes med en C9 mättad alifatisk kedja som bär en terminal alkyn tag (figur 1). Alkynen tag infördes för att tillåta användning av ett förfarande i två steg märkning för att lägga till en fluorofor eller en biotin molekylen via CC. Detta särdrag gör ARN14686 ett mycket mångsidigt verktyg för att sondera NAAA in vitro och in vivo.

Här visar vi två tillämpningar av ARN14686, som är representativa för potentialen i denna molekyl. Figur 2 är ett schema över den experimentella procedur som rapporterats här. Efter intravenös administrering av sonden, kan två olika detektionsmetoder användas: i) analys av aktiv NAAA uttryck av protein blot och ii) analys av aktiv NAAA uttryck och lokalisering inom celler genom fluorescence mikroskopi.

Den första representativt resultat publicerades nyligen av vår grupp 29. Vi analyserade NAAA expression i en råttmodell av CFA-inducerad tassinflammation. Sonden (3 mg / kg) eller vehikel injicerades IV i naiva och CFA-behandlade råttor. Råttorna avlivades 4 h senare. CC utfördes på anrikade lysosomala extrakt för att införa en biotin-tag på sondmärkta proteiner. Biotinylerade proteiner nästa berikat med hjälp av streptavidin pärlor. De eluerade proteinerna analyserades genom proteinblot, som visar att nivåer av aktivt NAAA var markant ökad i tassarna hos råttor som behandlats med CFA i förhållande till de av kontrollråttor (figur 3). Fördelen med proteinblotanalys är att den möjliggör en detaljerad undersökning av sonden reaktiva proteom, som separeras genom gelelektrofores. Detta tillvägagångssätt gör det också möjligt för avtäckningen av potentiella prob off-mål. En icke-sond kontroll måste vara alsätt i syfte att utesluta endogena biotinylerade proteiner, som utgör den experimentella bakgrund. Pilspetsen i figur 3 indikerar sådana bakgrundsproteiner, som i sin tur kan användas som lastreferenskontroll.

I ett andra opublicerad experiment (figur 4), använde vi ARN14686 att sondera NAAA för ex vivo detektion genom fluorescensmikroskopi. Vi administreras ARN14686 till möss vid 3 mg / kg (iv) och avlivades dem 2 h efter behandling genom transcardial perfusion. Lungor uppsamlades, postfixerades, och frystes i kall 2-metylbutane. CC reaktionen för fluoroforen Dessutom utfördes direkt på vävnadssnitt av 40 um tjocklek, som samlats in med en kryostat. Analys genom fluorescensmikroskopi visade närvaron av katalytiskt aktivt NAAA i diffunderade vesikulära strukturer som hör till alveolära makrofager. Jämfört med användningen av ett protein-specifik antikropp, endast enctive enzym observeras.

Figur 1

Figur 1:. ARN14686 syntesreaktionsschema undek-10-yn-2-ol aktiverades genom dipyridylcarbonate (DPC) i närvaro av katalytisk 4-dimetylaminopyridin (DMAP) för att producera en blandad karbonat. Denna karbonat omsattes sedan med aminolaktam att erhålla målmolekylen ARN14686. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:. Workflow system för den allmänna strategin som visas i detta arbete Sonden injiceras i djur (råttor eller möss) och rikta uttryck analyseras efter två olika experimentella förfarandes: i) Den märkta proteomet extraheras och biotin tillsätts av CC. Efter en anrikningsfasen av biotinylerade proteiner på streptavidinpärloma är sond mål analyserades genom protein blot. ii) Vävnads skivor är beredda och en fluorofor sätts av CC. Probe mål lokalisering analyseras genom BLOMNINGSTID mikroskopi. Denna siffra har anpassats från Bonezzi et al. 29 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Analys av NAAA aktivering i tassar av CFA-behandlade råttor Protein blot-analys av streptavidin-anrikade proteiner från naiva råttor (spår 1 och 2) eller CFA-injicerade råttor 7 dagar efter injektion (spår 3 och 4). Råttor erhöll iv injektioner av fordon eller ARN14686 (3 mg / kg). Den läsk membransonderades med en fluorescerande streptavidin. Pilen indikerar NAAA bandet; pilspetsen indikerar en biotin-innehållande band av omkring 90 kDa, som visar att en liknande mängd protein laddades i varje spår. Denna siffra har modifierats Bonezzi et al. 29 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Ex vivo-detektering av sond-märkt NAAA i muslungor genom fluorescensmikroskopi Representativa bilder av lungsnitt av fordons- (A) eller ARN14686-injicerades (B) möss efter CC med azid-PEG3-Fluor 545 rapporteras.. En positiv signal (röda blodkroppar) detekterades i ARN14686-injicerade möss, medan ingen signal detekterades i vehicle administrerade möss. En detalj av en azid-PEG3-Fluor 545 positiva alveolär makrofag visas i C vid högre förstoring. Kärnor märkta med DAPI (blå). Skala bar = 50 pm i A och 10 mikrometer i C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enzymaktivitet är fint regleras på olika nivåer, inklusive RNA-transkription, proteinsyntes, proteintranslokation, post-translationell modifiering, och protein-proteininteraktion. Ofta enzymuttryck ensam inte redogöra för sin verksamhet. ABPP utvecklades för att studera aktiviteten av proteiner i deras nativa tillstånd. Två funktioner som krävs: en kemisk sond som kovalent binder till det aktiva stället i ett enzym av intresse och en reporter-tagg för att detektera sond-märkt enzym.

Probe design och syntes är kritiska punkter i förfarandet. Sonden skall ha tillräcklig affinitet och selektivitet för sitt mål. Dessutom måste närvaron av en reporter taggen inte påverkar mål engagemang. Det här problemet till stor del övervinnas genom utformning av ett två-stegs ABP, där reportern taggen införes efter det att målet har fångats. Taggfria prober är speciellt lämpliga för in vivo-studier, i vilka proteinaktivitetkan utvärderas i en levande cell eller organism, med minimal yttre förändring. Den NAAA sond ARN14686 har utformats för att uppfylla de krav som anges ovan. Den β-laktam reaktiv stridsspets valdes baserat på tidigare resultat som erhållits med β-laktam klass NAAA hämmare 16,26. Dessa föreningar inhiberar NAAA i en potent och selektivt sätt genom att kovalent binda till den katalytiska cystein av enzymet. Dessutom har föreningarna visat sig vara systemiskt aktiva 16. Vi införde en C9 mättad alifatisk kedja, med hänsyn till den ökade affinitet NAAA för långa alifatiska kedjor. En terminal alkyn tillsattes för att göra det möjligt för två steg märkning.

En annan avgörande steg är att välja dos och tidpunkt för administrering in vivo. Detta beror på stabiliteten av sonden i plasma, sitt mål affinitet, och dess selektivitet. Rätt dos måste väljas för att möjliggöra målinfångning samtidigt undvika ingrepp possible off-targets. Vi fann att 3 mg / kg ARN14686 IV optimalt att fånga NAAA selektivt. Högre doser resulterade i att fånga den homologa cystein amidaset, syra ceramidas. Med avseende på behandlingslängd, vid analys väl-perfunderade organ, som lungorna, kan en kort tid (2 timmar) vara tillräcklig för att medge för sonden att reagera med målet. För tassar, men vi var tvungna att fördubbla reaktionstiden.

En möjlig fråga i mål analys av proteinblot beror på närvaron av naturligt biotinylerade proteiner. Dessa kommer oundvikligen att identifieras tillsammans med specifika prob mål. Vi fann att införa en preclearing steg med streptavidin pärlor innan du utför CC ökade kraftigt kvaliteten på våra resultat. Å andra sidan kan närvaron av nativa biotinylerade proteiner användas för att styra för förutsedda last artefakter. Slutligen med avseende på lokaliseringsstudier genom fluorescensmikroskopi, är det mycket viktigt att vara medveten om probe selektivitet eftersom den till skillnad proteinblotting, inte fluorescensmikroskopi inte tillåter distinktionen av målet från off-mål. Preliminära selektivitet studier bör genomföras för att utvärdera genomförbarheten och för att ställa in optimala experimentella betingelser.

Begränsningar av den beskrivna tekniken avser främst nödvändigheten av att undvika experimentella betingelser som kan påverka CC reaktion, såsom användning av tvättmedel och amininnehållande buffertar. Dessa aspekter måste tas in på kontot när du förbereder ett cellysat eller en vävnadshomogenat. Dessutom, när det krävs en streptavidin anrikningsfasen, mängden av utgångsmaterial är en annan fråga, eftersom detta förfarande är endast tillämpligt när proteininnehållet är inte mindre än 250 mikrogram. Denna gräns är satt på grund av tekniska problem, såsom arbetsvolymer, proteinutvinning, efter CC-inducerad utfällning, och mängden av streptavidin harts som ska användas.

Previously, kunde NAAA aktivitet endast utvärderas genom att utföra aktivitetsanalyser, vilka kräver användning av en aktiveringsbuffert för aktiveringen av enzymet in vitro och för substrat solubilisering 14. Denna metod ger information om total NAAA uttryck, inte om förekomsten av aktiva NAAA. En annan möjlighet är att mäta halten av PEA och OEA, men denna metod utgör endast ett indirekt sätt att utvärdera NAAA aktivitet 34,35. Dessutom kan FAE nivåer påverkas av andra faktorer såsom biosyntesen. Den kemiska sonden ARN14686 är den första ABP för NAAA. Protokollet som beskrivs här illustrerar en enkel procedur för att fånga och visualisera den aktiva formen av NAAA, både in vitro och in vivo. Alla prov manipulationer efter probe-mål reaktioner, vilket ger tillförlitlig information om tillståndet hos enzymet in vivo. Dessutom användning av ARN14686 i fluorescensmikroskopi utgör ett unikt verktyg to lokalisera aktiva NAAA. Tillgängliga antikroppar, som känner igen NAAA katalytiska subenheten, inte diskriminera mellan NAAA fullängds proenzym och aktivt enzym.

Med utgångspunkt från det protokoll som beskrivs här, kan NAAA uttryck och aktivering analyseras i olika cellinjer och djurmodeller av inflammation. Co-lokaliseringsstudier kan utföras för att bättre karaktärisera rollen av NAAA i fysiologiska och patologiska tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole  Sigma Aldrich 367818 Harmful
2-dipyridylcarbonate Fluorochem 11331 Harmful
2-Methylbutan Sigma Aldrich M32631 Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine Sigma Aldrich 107700 Toxic
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 Flammable, Corrosive
Acetonitrile  Sigma Aldrich 34998 Flammable, Toxic
Activated charcoal Sigma Aldrich 161551
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 Harmful
Azide-PEG3-Biotin Jena Biosciences CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545 Jena Biosciences CLK-AZ109
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227
Bio-spin columns Biorad 732-6204
Biotin Sigma Aldrich B4501
Blocking buffer Li-Cor Biosciences 927-40000
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA) Sigma Aldrich A7030
Bromophenol blue Sigma Aldrich B0126
Bruker Avance III 400 Bruker
Celite Sigma Aldrich 419931 Health hazard
Ceric ammonium nitrate  Sigma Aldrich 22249 Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate Sigma Aldrich C8383 Higly toxic
CuSO4.5H2O  Sigma Aldrich 209198 Toxic
Cyclohexadiene Sigma Aldrich 125415 Flammable, Health hazard
Cyclohexane Sigma Aldrich 34855 Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane Sigma Aldrich 34856 Harmful, Health hazard
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Acros Organics 348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) Sigma Aldrich 175943
Ethanol Sigma Aldrich 2860 Flammable, Harmful
Ethyl acetate Sigma Aldrich 34858 Flammable, Harmful
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Irdye 680-LT Streptavidin Li-Cor Biosciences 925-68031
IRDye680-LT Streptavidin  Licor 925-68031 Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol Sigma Aldrich 34966 Highly toxic
Methanol Sigma Aldrich 34860 Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E7750 Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806 Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide Sigma Aldrich 227056 Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine Fluorochem M03053 Harmful
Nikon A1 confocal microscopy Nikon Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0335BOX
Palladium on carbon Sigma Aldrich 330108
p-anisidine Sigma Aldrich A88255 Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde sigma Aldrich 441244 Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)  Sigma Aldrich P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI  Thermo Fisher Scientific P36931 Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich P8340
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)  Sigma Aldrich L3771 Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride  Sigma Aldrich 452912 Flammable
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313
Starion FLA-9000 immage scanner FUJIFILM Read  the user manual
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20349
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Tert-butanol Sigma Aldrich 360538 Toxic, flammable
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 186562 Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea Acros Organics 424542500 Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris Sigma Aldrich RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Sigma Aldrich C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
Triton-x100 Sigma Aldrich X100 Toxic
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Tween-80 Sigma Aldrich P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer IKA
Undec-10-yn-1-ol Fluorochem 13739 Harmful
Urea Sigma Aldrich U5378 Toxic, warm at 50 °C to dissolve

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Tags

Biochemistry aktivitetsbaserad proteinprofilering aktivitetsbaserad sond klicka kemi, inflammation fluorescensmikroskopi,
förberedelse och<em&gt; In Vivo</em&gt; Användning av en aktivitetsbaserad Probe för<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S.,… More

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S., Bonezzi, F., Migliore, M., Di Martino, S., Summa, M., Piomelli, D. Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase. J. Vis. Exp. (117), e54652, doi:10.3791/54652 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter