Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per la valutazione sopravvivenza dei semi, la germinazione e la dormienza in condizioni di campo che utilizzano sepolti, strisce sementi etichettate di test vitalità cloruro di tetrazolio (TZ).
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di valutare in modo affidabile la sopravvivenza seme nel tempo in condizioni di campo.
Banche del seme del terreno sono una riserva di dispersi, semi non germinati ancora vitali distribuiti sia sulla superficie del suolo, all'interno lettiera di superficie o all'interno del profilo del suolo, che possono persistere transitoriamente o per molti anni 1,2. Quando i metodi di sepoltura di semi simili a quelli presentati qui sono stati applicati ad uno studio di 17 anni con diverse decine di specie, semi vitali sono stati trovati in molte delle specie testate 3. Seed dormienza è un blocco di germinazione dei semi fino a quando la combinazione appropriata delle condizioni per la sopravvivenza piantina nascono 4. Rimanendo dormiente può permettere semi di sopravvivere condizioni difficili, come ad esempio basse temperature invernali, la limitazione di nutrienti, o siccità stagionale, fino a quando un trigger esterno per la dormienza-release consente per la germinazione. Trigger per dormienza-release possono variare da esposizione al freddo estesi, composti lasciati da fire, o attacco fisico sul cappotto di seme per abrasione o il contatto con gli acidi dello stomaco degli animali 5. Come spunti di germinazione possono essere generi o specie specifici e spesso il risultato di oltre la selezione naturale, disadattivi germinazione dei semi è quella che si verifica in un momento inopportuno, e può causare la mortalità semi o piantine o scarsa crescita delle piantine. Mentre dormienza è stato classificato in un certo numero di tipi basati sui meccanismi di dormienza rilascio (ad esempio, dormienza fisica, dormienza fisiologica), 6 seme dormienza rimane una delle meno argomenti inteso in biologia vegetale. Così, gli studi sul campo che consentono di valutare lo stato dei singoli semi o gruppi di semi in condizioni ecologiche rilevanti hanno una maggiore capacità esplicativa di quelli che semplicemente si basano su prove di germinazione standard in laboratorio.
Lo sfruttamento delle caratteristiche del seme note in grado di fornire informazioni sui meccanismi di dormienza. Controllo di dormienza seme è complex, compreso il controllo genetico di fattori fisiologici e morfologici. Mentre una comprensione completa della larghezza di meccanismi dormienza è ancora stata chiarita, un modello generale è emersa, comportante un rapporto di feedback tra i due ormoni vegetali acido gibberellico (GA) e abscissico (ABA) 7. In questo modello generalizzato per semi con una componente fisiologica alla loro dormienza, GA serve come segnale di immissione dormienza, mentre ABA serve a mantenere lo stato dormiente. Effetti genetici materni, nonché l'ambiente di crescita materno può influenzare dormienza e altri tratti di semi, come la dimensione, attraverso i tessuti maternamente generati ei segnali di sviluppo 8. Maternamente generato strutture esterne (o rivestimenti di semi) può mantenere la dormienza, a volte in combinazione con spunti fisiologici. Dal rivestimenti di semi di origine materna sono controllati dai geni della pianta madre, essi potrebbero non riflettere reale make-up genetico nucleare del seme. Noi ci abbiamoEd i acheni Helianthus annuus da una serie di ibrido crop-wild attraversa per prendere in giro questi materna vs. embrione effetti genetici sulle caratteristiche del seme 9,10. Così, disegni di studio che includono diverse specie, i tipi di croce, o genotipi possono raccogliere informazioni circa la ecologia e genetica di semi di dormienza, la germinazione e la sopravvivenza.
Un importante esempio di come semi di germinazione e sopravvivenza fenotipi possono influenzare la dinamica delle popolazioni può essere visto in zone ibride colture-wild. Selezione durante la domesticazione delle piante coltivate elimina la maggior parte dormienza e riduce la capacità di un seme di sopravvivere al di fuori della stagione di crescita. Eppure flusso genico, o ibridazione, tra i tipi coltivate e selvatiche nelle zone ibride colture-wild possono reintrodurre alleli nel grano (o varianti genetiche) in una popolazione selvatica, con potenziali effetti sulle dinamiche della banca del seme. Ibridi tra parenti coltivate e selvatiche potenzialmente trovano in zone ibride colture-wild può possedereuna varietà di fenotipi dormienza intermedi, con pochi fenotipi attesi per sopravvivere condizioni di fuori della coltivazione (es mesi invernali) 11.
Lo scopo di questo manoscritto è quello di mostrare come, utilizzando il metodo della striscia di sepoltura seme, siamo in grado di valutare la germinazione, dormienza, e la sopravvivenza di una vasta gamma di tipologie di semi in diversi periodi di tempo per indagare la loro variazione naturale in condizioni di campo. Nel nostro esempio, abbiamo impiegato semi di girasole da 15 tipi di ibridi incrociati colture-wild dal momento che siamo interessati ad effetti genetici materni ed embrione sulle caratteristiche del seme.
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Protocol
1. Raccogliere seme da più specie o Croci controllata di una singola specie
Nota: Questo esempio del seme utilizzato da 15 tipi incrociate all'interno della annuus specie Helianthus (girasole) utilizzando selvaggio, ibrido, e tipi di colture come il genitore materno (che produce seme).
- Alla fine della stagione di crescita, raccogliere teste di semi maturi in sacchetti etichettati. Pulire seme dal loglio e luogo di semi in buste etichettati con dei genitori a croce in formato standard (ad esempio, materno x paterna).
- seme di massa insieme in grandi buste utilizzando la stessa quantità di seme da un numero uguale di identici tipi trasversali dei genitori. Ad esempio, 100 semi da 10 tipi incrociate con gli stessi genitori materni e paterni. Etichettare le buste con l'identificazione (tipo incrociato) le informazioni. Queste buste grandi sono maestri di sementi da utilizzare nella compilazione strisce sepoltura nella sezione 2.
| Parent materna | |||
| Parent Paternal | Wild: wXw | F 1: WXC | Crop: CxC |
| Wild: wXw | 0% wXw | 25% F 1 xW † | 50% CXW † |
| BC: WxF1 o F1xW | 12,5% WxBC | 37,5% F 1 XBC | 62,5% CxBC |
| F 1: WXC | 25% wxf 1 † | 50% F 1 xF 1 | 75% CxF 1 † |
| F 2: F 1 xF 1 | 25% wxf 2 | 50% F 1 xF 2 | 75% CxF 2 |
| Crop: CxC | 50% WXC † | 75% F 1 xC † | 100% CxC |
Tabella 1. parentale croce tIPI prodotte dalla mano impollinazione. girasole tipi incrociati ibride colture-wild sono state prodotte con la mano l'impollinazione per l'uso in esperimento di semi di sepoltura. Per tutti i tipi di fondo, il genitore materno elencato per primo e il genitore paterna elencato secondo. tipi Croce contrassegnati con † fanno parte di reciproci coppie di tipo trasversale con gli stessi alleli% del raccolto, ma diversi genitori materni. La tabella è stata precedentemente pubblicata in: Pace, BA et al. (2015) 15.
2. Creare personalizzate strisce Burial Seed
NOTA: In questo esempio, abbiamo avuto tre trattamenti data di uscita e 15 replicati, quindi abbiamo richiesto 45 strisce totale. Questo esempio utilizza 15 scomparti per striscia così, abbiamo richiesto abbastanza tessuto di poliestere a maglia fine o zanzariere per ospitare 15, 7 x 10 cm scomparti. Vedere la Figura 1.
- Inizia dal taglio di una striscia di 20 x 105 centimetri di tessuto per ogni striscia di semi.
- Misurare e segnare scomparti, quindi piegare il tessuto a metà. Utilizzando un higpistola per colla h-temperatura, guarnizione uno corto (10 cm) fine. Una volta che la colla si raffredda leggermente, ma non completamente, premere i lati del tessuto insieme per creare una tenuta.
ATTENZIONE: ad alta temperatura colla e colla punte pistola può provocare ustioni se il contatto con la pelle è prolungata. - linee di colla dal bordo ripiegato della breve estremità aperta ad ogni segno di comparto. Premere le due parti di tessuto insieme lungo le linee di colla per garantire guarnizioni senza fori tra i compartimenti. I semi che migrano tra i compartimenti contribuiscono a errore sperimentale.
NOTA: Ora che sono stati creati i comparti, il bordo spiegato dovrebbe rimanere aperto e pronto a ricevere semi e le loro informazioni di identificazione (nome croce tipo). - Casualmente assegnare i tipi di croce seme di scomparti per ogni striscia.
- Riempire compartimenti seme con un unico numero di semi (20 per ciascun comparto sono utilizzati in questo esempio). Per le etichette, usare marcatori permanenti industriali sul cut-to-fit freccette da giardino in plastica in modo che siano in grado diresistere sepoltura.
NOTA: i metodi di etichettatura alternative possono essere utilizzati. - Dopo ogni scomparto è riempita con semi e la sua etichetta, chiudere il vano immediatamente con la pistola colla ad alta temperatura. Proseguire fino a quando l'intera striscia di seme è completamente sigillato. Etichettare striscia complessiva nel primo compartimento con replicare, blocco e / o informazioni sul trattamento.
NOTA: Per il nostro studio, dato che abbiamo avuto traslochi temporali, blocchi, e si replicano le strisce all'interno di blocchi, abbiamo incluso tutte queste informazioni. - Verificare la presenza di spazi tra compartimenti e colla posto come necessario prima di passare al successivo strip.
- Riempire compartimenti seme con un unico numero di semi (20 per ciascun comparto sono utilizzati in questo esempio). Per le etichette, usare marcatori permanenti industriali sul cut-to-fit freccette da giardino in plastica in modo che siano in grado diresistere sepoltura.
Figura 1. sepoltura striscia seme schematica. Esempio di striscia sepoltura mostrando identificazione del tipo di croce per i singoli comparti. genitore materno è nominata per prima con il genitore paterna elencati secondo. I colori indicano diversa discendenza materna,con il giallo per il selvaggio, blu per F 1 ibrido, e rosso per il raccolto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
3. Bury strisce seme nel campo
- Scavare trame alla profondità specificata per le strisce di casa. Assegnare strisce a singoli blocchi in cui strisce sono disposte in modo casuale per consentire la data di uscita da utilizzare come trama principale e l'identità vano (in questo esempio, di tipo incrociato) come sottotrama in analisi.
- Coprire le strisce con la terra. Tagliare il metallo panno hardware di maglie, da 10 cm più grande di trame e posto oltre le strisce sepolti. Utilizzare U-pin per proteggere i bordi e gli spigoli della copertura del panno con la terra.
NOTA: Questo rivestimento è di escludere che scavano i predatori di semi. Come ulteriore opzione, Mercer et al. 13 costruito e scatole di stoffa hardware che circondavano le strisce di sementi a causa della forte pressione Gopher nel loro campo loca sepoltizione.) - Mettere bandiere di geometra colorato per distinguere posizione strip e rimozione date per completare record chiaro scritte.
4. Scavare strisce e valutare Seed
- Scavare le strisce di semi assegnati a una certa data rimozione. Mantenere le strisce in un ambiente umido fresco fino a raggiungere il laboratorio in cui la valutazione del seme avrà luogo. Questo può essere realizzato avvolgendo strisce in giornali bagnati e metterli in un dispositivo di raffreddamento per il trasporto o il trasporto di notte.
- Risciacquare fango e terreno da strisce in acqua fino a quando le strisce sono abbastanza pulite che i detriti esterni saranno non oscuri i semi.
- Usare le forbici per tagliare aperto uno scomparto alla volta. Conte semi germinati e rimuoverli. Conte semi chiaramente morti (ad esempio, Marcio, o semi putrefatti). Mettere i semi non germinati in etichetta, carta assorbente umida Petri dimensioni per distinguere ulteriormente i semi non germinati, dormienti, e morti.
- Posizionare piastre di Petri con non germinato schiacciatosemi in un set di camera di crescita per le condizioni di germinazione standard: 25 ° C / 10 ° C 12 ore giorno / notte. Consentire semi una settimana di germinare. Qualsiasi che, contare questi come valida, ma non germinati dal momento che non germinano in condizioni di campo.
- Dopo il trattamento camera di crescita, prova rimanendo semi non germinati per la vitalità usando Tetrazolium cloruro (TZ) 13. Per fare questo, costituiscono una soluzione per cento di TZ adatti alla specie di studio utilizzando il AOSA Tetrazolium Testing Handbook 14. Per questo esempio, si usa una soluzione 1%.
- Tagliare i semi non germinati a metà e porre una metà erano l'embrione e endosperma sono visibili in una capsula di Petri contenente soluzione abbastanza TZ per coprire il seme (semi possono galleggiare, questo è bene).
- Posizionare i piatti TZ Petri in un incubatore a 30 ° C e attendere 3 ore. Nota: Le temperature più elevate si ottengono una reazione più veloce, se desiderato, ma overstaining è un rischio.
<li> Rimuovere piastre di Petri dal termostato e valutare. I semi che si sono macchiati rosso nei loro embrioni sono germinabili, mentre i semi non colorati sono morti. Consultare il manuale Tetrazolium Testing AOSA per maggiori dettagli su casi marginali distintivi e particolari specie.
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Representative Results
Tipi incrociate con vario materna percentuale di parentela e delle colture allele (Tabella 1) differivano tra le date di rimozione in percentuale germinato, non germinato schiacciato, e semi di morti (Fig. 2 e 3). Utilizzando test TZ di semi non germinati, abbiamo trovato alcuni semi dormienti veramente al secondo rimozione (inizio primavera) (Tabella 2), mentre tutti i semi non germinati dalla terza rimozione (primavera) sono stati trovati per essere veramente in sospeso.
In generale, più bassi delle colture percentuali di alleli ridotto la germinazione disadattivi nel tardo autunno (Fig. 2). Alla rimozione della primavera, tutti i tipi di croce era alta la germinazione, ma differivano nella loro proporzione morti e non germinato schiacciato (Fig. 3). In particolare, i tipi di fondo con il raccolto di parentela materna avevano una più alta mortalità materna, mentre i tipi croce selvatici sono stati più propensi a rimanere non germinato schiacciato. Entro la primavera,germinazione è diminuito per alcuni tipi di croce. Mentre contro-intuitivo, questo è probabilmente dovuto alla mortalità seme all'interno delle strisce di sepoltura per germinare in precedenza tipi trasversali. Di conseguenza, la mortalità era più alto per più tipi di colture croce-like (cioè quelli con percentuali allele più alta nel grano) prodotto da colture genitori materni (Fig. 3)
Figura 2. La germinazione al primo ritiro nel tardo autunno. La germinazione di girasole tipi incrociati colture-wild alla prima data di uscita, nel tardo autunno. tipi trasversali sono organizzati in asse y aumentando le percentuali delle colture allele come indicato. genitore materno è nominata per prima per ogni tipo di croce. Germinazione dei minimi quadrati mezzi (con SE barre), seguiti dalla stessa lettera non sono significativamente differenti utilizzando un aggiustamento Tukey-Kramer per confronti multipli. Figura è stato precedentemente pubblicato in: PacE, et al. (2015) 15. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Percentuale Germinati, non germinato schiacciato, e la mortalità per la seconda rimozione (primavera) e terzo rimozione (primavera). Percentuale germinati per l'inizio della primavera (A), la molla (B), per cento non germinato schiacciato per l'inizio della primavera (C), la molla ( D), e cento morti per l'inizio della primavera (e) e le date di rimozione della molla (F). tipi ibridi incrociati colture wild girasole sono organizzati aumentando percentuali coltura alleliche, con il più colture come sulla cima y e il più wild-simili in fondo l'asse y. genitore materno tipo Croce è nominata per prima. Minimi quadratimezzi per seme germinato, non germinato schiacciato e morti (con SE barre) seguita dalla stessa lettera non sono significativamente differenti utilizzando un aggiustamento Tukey-Kramer per confronti multipli. Figura è stato precedentemente pubblicato in: Pace, et al (2015) 15.. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| tipo Croce | TZ Dormant | Errore standard |
| wXw | 0,071 | 0,0131 |
| WxBC | 0,041 | 0,0126 |
| WxF1 | 0,089 | 0,0136 |
| WxF2 | 0,054 | 0,0126 |
| F1xW | 0 | 0,0126 |
| F1xBC | 0.013 | 0,0126 |
| WXC | 0.075 | 0,0131 |
| F1xF1 | 0,007 | 0,0126 |
| F1xF2 | 0.013 | 0,0126 |
| CXW | 0 | 0,0126 |
| CxBC | 0 | 0,0126 |
| F1xC | 0 | 0,0126 |
| CxF1 | 0 | 0,0126 |
| CxF2 | 0 | 0,0126 |
| CxC | 0 | 0,0126 |
Tabella 2. I semi che possono contribuire ad una banca del seme persistente. Medie dei minimi quadrati per la percentuale frazione dormiente di semi non germinati al secondo (inizio primavera) la rimozione. I semi sono stati determinati per essere praticabile con tetrazolio cloroide dopo incubazione in condizioni di germinazione favorevoli. La tabella è stata precedentemente pubblicata in: Pace, et al (2015) 15..
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Discussion
Qui vi presentiamo i metodi per l'utilizzo di strisce di semi di sepoltura per osservare la germinazione del seme, dormienza e la mortalità delle scorte di sementi diverse in periodi di tempo preselezionato nel campo. I vantaggi di usare strisce anziché singoli pacchetti giacciono in (1) la velocità del nastro e la costruzione compartimento sul creazione di singoli pacchetti; e (2) la facilità e la velocità di rimozione comparti multipli in un unico movimento, senza il pericolo di omettere un pacchetto o la rimozione di uno involontariamente. Come due delle date di rimozione nell'esempio qui presentate sono state durante i mesi invernali quando il terreno è duro e le condizioni del campo sono freddi, questo metodo riduce sia il lavoro e la possibilità di errore umano. strisce Seed aiutano anche logistica sperimentali consentendo ricercatori per randomizzare sedi compartimentali in laboratorio in modo che non può essere alterato da errore umano nel campo. Attraverso la selezione dei tempi di rimozione che comprendeva l'ampiezza dei tempi di germinazione naturale previsti eravamoin grado di fare inferenze su banca dei semi dinamiche-nel nostro esempio il potenziale di sementi ibride a persistere nella banca del seme e contribuire alle popolazioni future. Una limitazione di questo metodo è che alcuni migrazione di sementi tra compartimenti può essere inevitabile, a seconda della dimensione del seme. Per questa ragione, (e come indicato nel protocollo), è importante che gli investigatori doppio verificare che le guarnizioni colla ad alta temperatura tra compartimenti per minimizzare la migrazione seme.
Alcuni problemi con esperimenti di sepoltura di semi possono essere evitati pensando astutamente sui tempi. Seleziona le date di sepoltura e la rimozione, a volte rilevanti per i cicli naturali delle specie di studio e gli obiettivi dello studio. E 'meglio piantare più presto dopo le sementi naturali sparso possibile. Le date di rimozione dovrebbero essere selezionati sulla base di osservazione di tempo l'emergenza delle piantine di picco per la valutazione del comportamento normale germinazione; l'aggiunta di date precedenti permette anche ai ricercatori di catturare la germinazione precoce. because nostro lavoro precedente aveva indicato che un po 'di germinazione disadattivi stava avvenendo a causa della completa mancanza di dormienza in alcuni tipi di fondo, abbiamo selezionato una data molto precoce rimozione solo poche settimane dopo la sepoltura (rimozione 1, tardo autunno) 15, 16.
Il vantaggio di strisce oltre singoli pacchetti è che una dozzina o più comparti possono essere sepolti, rimossi, e valutati come uno, consentendo di disegni sperimentali complesse che coinvolgono tutto, dai più date di rimozione per l'irrigazione o trattamenti nutrienti. Gli investigatori dovrebbero prendersi cura di costruire blocchi che consentono i trattamenti che sono più preoccupati con la comprensione di essere l'effetto principale. Il nostro esempio sottolineato il comportamento seme nel corso del tempo, ma altri trattamenti può applicare, che richiederebbe considerazione della disposizione in campo e replicare disposizione all'interno dei blocchi durante la fase di progettazione sperimentale. Assegnando in modo casuale posizione sepoltura striscia all'interno dei blocchi, tempo di rimozione può essere analizzato come l'effetto principale.
<p class = "jove_content"> Dopo la rimozione delle strisce di sementi, la preparazione di uno stack pre-etichettati di carta assorbente Petri dimensioni per tutta la fascia prima che inizi la valutazione riduce l'errore umano. Allo stesso modo, l'apertura e la valutazione di un unico vano alla volta aiuta a mantenere la precisione. Quando si posizionano i semi non germinati nelle camere di crescita, assicurarsi che le temperature diurne e notturne corrispondono condizioni ottimali di germinazione di semi per le specie di studio. Mentre le condizioni di germinazione normali (25 ° C / 10 ° C 12 giorno ora / giorno) può essere adatto per un'ampia varietà di specie, questo non è il caso per tutte le specie.Si consideri che l'applicazione del trattamento TZ e la valutazione dei pattern di colorazione semi influenza fortemente studio di outcome. Nel valutare i semi germinati dopo il trattamento camera di crescita, consultare la letteratura (o AOSA Tetrazolium Testing Handbook 14) per la corretta concentrazione di TZ per una determinata specie. Mentre a giudicare singoli TZ macchiato seeds, è importante ricordare la differenza tra la vitalità del seme e la capacità di un seme di germinare-debolmente semi macchiate potrebbe indicare che respirano il tessuto, che può essere in grado di uscire dal terreno e produrre una piantina. Ciò premesso, veramente semi dormienti sono quelli che rimangono non germinati in condizioni ottimali di germinazione, ancora una volta provato sono ancora fortemente vitale. Questi semi sono gli unici semi che possono contribuire ad una banca del seme persistente e germinare nei prossimi anni.
Un certo numero di applicazioni per questi metodi sono possibili al di là di quelle descritte qui. Strisce di sepoltura di semi possono essere personalizzati per qualsiasi numero di unità sperimentali e progetti sperimentali. Essi possono essere applicati a confrontare diverse specie, dimensioni di semi o condizioni / trattamenti. Sulla base di questi metodi ha il potenziale per approfondire la conoscenza della biologia sementi di base di molte specie in un contesto ecologicamente rilevanti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small coin envelopes | Any | ||
| Large coin envelopes | Any | ||
| fine meshed polyester mosquito netting | Any | ||
| high-temperature glue gun | Any | ||
| high-temperature glue stick refills | Any | ||
| Industrial permenant markers | Any | ||
| plastic garden labels | Any | ||
| scissors | Any | ||
| Shovel | Any | ||
| Metal mesh hardward cloth | Any | ||
| Surveyor's flags, multiple colors | Any | ||
| Wet newspaper | Any | ||
| cooler | Any | ||
| blotter paper | Any | ||
| petri dishes | Any | ||
| Temp. controlled growth chamber | Any | ||
| razor blades | Any | ||
| Petri dishes | Any | ||
| Tetrazolium chloride | Any | ||
| water | Any | ||
| heat incubator | Any |
References
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