Summary
ここでは、埋葬、標識されたシードストリップ及びテトラゾリウムクロリド（TZ）生存性テストを使用して、フィールド条件の下で種子生存率、発芽と休眠を評価するためのプロトコルを提示します。
Introduction
この方法の全体的な目的は、確実に、フィールド条件下で経時的に種子の生存率を評価することです。
土壌シードバンクは、一過性または長年1,2持続し得るいずれかの土壌表面上に、表面のゴミの中、または土壌断面内に分散分散し、実行可能な、まだ未発芽種子の予備です。ここに提示されたものと同様のシード埋葬方法は数十種を使用して17年間の研究に適用されたときに、生存可能な種子は、3試験の種の多くで発見されました。種子休眠は生存実生のための条件の適切な組み合わせは、4を発生するまで、発芽をシードするブロックです。休眠リリースのための外部トリガが発芽することが可能になるまで休眠残って、種子がそのような低い冬の気温、栄養制限、または季節の干ばつなどの過酷な条件を、生き残るために許可することができます。休眠リリースのトリガーはfで左拡張寒さ、化合物への暴露から変化させることができます怒り、または動物の胃の酸5との磨耗や接触による種皮の物理攻撃。発芽手がかりは、属または種特異的であることと、多くの場合、過去の自然淘汰の結果でわかるように、不適応種子発芽が不適切なときに発生し、種子や苗木死亡または悪い苗の成長につながる可能性があることです。休眠は休眠リリース（ 例えば 、物理的休眠、生理的休眠）のメカニズムに基づいて種類数に分類されてきたが、6種子休眠は、少なくともの1植物生物学のトピックを理解まま。したがって、個々の種または関連する生態学的条件の下で種子のグループの状態の評価を可能にするフィールドの研究は、単に実験室での標準的な発芽試験に依存しているものよりも高い説明力を持っています。
既知の種特性の搾取は休眠のメカニズムへの洞察を提供することができます。種子休眠の制御は共同です生理学的および形態学的要因の遺伝的制御を含むmplex、。休眠機構の幅を完全に理解するにはまだ解明されていないが、一般的なモデルは、2つの植物ホルモンジベレリン（GA）とアブシジン酸（ABA）7間のフィードバック関係を含む、浮上しています。 ABAは休眠状態を維持する働きをしながら、彼らの休眠に対する生理的成分を有する種子のためのこの一般化モデルでは、GAは、休眠解除のための信号となります。母性遺伝的影響だけでなく、母体の成長環境は母系生成組織と発生シグナル8を介して、休眠やサイズなどの他の種子の特性に影響を与えることができます。母性発生した外部構造体（または種子被覆材）は、生理的手がかりと組み合わせた時刻に、休眠を維持することができます。母体由来シード材が母植物の遺伝子によって制御されているので、彼らは、種子の実際の核の遺伝子構成を反映していない場合があります。私達は私達を持っていますED作物野生ハイブリッドの配列からヒマワリの1年生の痩果は9,10。このように、多様な種、十字型、または遺伝子型を含む研究デザインについての情報を収集することができますシードの特性上、これらの母体の対胚遺伝的影響を引き出すために交差します種子休眠、発芽および生存の生態と遺伝。
種子発芽および生存の表現型は、人口動態に影響を与えることができる方法の重要な例は、作物野生ハイブリッドゾーンで見ることができます。栽培植物の栽培時の選択はほとんど休眠性を排除し、成長期の外で生き残るために種子の能力を低下させます。しかし、作物の野生ハイブリッドゾーンの栽培と野生型間の遺伝子流動、またはハイブリダイゼーションは、種子バンクのダイナミクスの潜在的な影響で、野生集団に作物の対立遺伝子（または遺伝子変異体）を再導入することができます。栽培と近縁野生種間の雑種は、潜在的に有することができる作物野生ハイブリッドゾーンで発見しますわずか数栽培の外部条件を生き残るために期待される表現型（ 例えば 、冬季）11との中間休眠の表現型の多様性、。
この原稿の目的は、私たちが現場条件の下で彼らの自然な変化を調査するために、異なる期間で発芽、休眠、および種子の種類の範囲の生存を評価することができるシード埋葬ストリップ法を使用して、方法を示すことです。私たちは種子の特性上、母体と胚遺伝的影響に興味を持っているので、この例では、15作物野生ハイブリッドクロスタイプからヒマワリの種を採用しました。
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Protocol
1.複数の種または単一の種の制御された交雑から種子を収集
注：母性（シード生成する）親として野生、ハイブリッド、および作物の種類を使用して、種ヒマワリの1年生内の15のクロスタイプ（ヒマワリ）から種子を使用この例。
- 生育期の終わりに、標識された袋に成熟種子の頭を収集します。標準形式での親のクロスタイプ（ すなわち 、母性のx父方）で標識された封筒での籾殻と場所、種子からクリーンシード。
- 同一の親のクロスタイプの同数から種子の等量を使用して大規模な封筒で一緒にバルク種子。例えば、同じ母系と父系の両親と10のクロスタイプから100の種子。 （クロスタイプ）の情報を識別して封筒にラベルを付けます。これらの大きな封筒は、第2節に埋葬ストリップを充填で使用するためのシードマスターです。
| 母親の親 | |||
| 父方の親 | ワイルド：WxW | F 1：WXC | クロップ：CXC |
| ワイルド：WxW | 0％WxW | 25％F 1 XW† | 50％CXW† |
| BC：WxF1またはF1xW | 12.5％WxBC | 37.5％F 1 XBC | 62.5％CxBC |
| F 1：WXC | 25％WxF 1† | 50％F 1 XF 1 | 75パーセントのCxF 1† |
| F 2：F 1 XF 1 | 25％WxF 2 | 50％F 1 XF 2 | 75パーセントのCxF 2 |
| クロップ：CXC | 50％WXC† | 75％のF 1クロスシー† | 100％CXC |
表1.親のクロストン手受粉。ひまわりの作物野生ハイブリッドクロスタイプから生産YPESはシード埋葬実験で使用するための人工授粉を用いて製造されました。すべてのクロスタイプの場合、母体の親が最初にリストされ、父方の親は、第二記載されています。 †でマークされたクロス型は同じ％の作物の対立遺伝子が異なる母方の両親との相互クロスタイプのペアの一部です。ペース、BA ら ：表は、以前に公開されています。 （2015）15。
2.カスタムシード埋葬ストリップを作成します。
注：この例では、3除去日付トリートメントや15の反復を持っていたので、我々は合計45ストリップを必要としました。この例では、ストリップあたり15区画はので、私たちは15、7×10cmの区画を収容するために十分な細かいメッシュのポリエステル布や蚊帳を必要と使用しています。 図1を参照してください。
- 各シードストリップのための布の20×10センチメートルのストリップを切断することによって起動します。
- その後、半分に生地を折る、測定し、区画をマーク。 HIGを使用しましたH-温度グルーガンは、1ショート（10センチメートル）の端をシールします。接着剤が少しではなく、完全に冷えたら、シールを作成するために一緒に生地の側面を押してください。
注意：皮膚との接触が延長される場合は高温接着剤や接着剤銃のヒントは、火傷を引き起こす可能性があります。 - 各区画マークで開いた短い方の端に折り畳まれた縁から、グルーライン。コンパートメント間の穴がないシールを確実にするために接着剤の線に沿って2つのファブリックの側面を押してください。コンパートメントの間の移行種子は実験誤差に寄与する。
注：今の区画が作成されていることを、折り畳まれていないエッジが開いて種子とその識別情報（クロスタイプ名）を受信する準備ままにしてください。 - ランダムに各ストリップのための区画にシードクロスタイプを割り当てます。
- 種子の背番号（各区画20は、この例で使用されている）でシードコンパートメントを埋めます。ラベルには、彼らがすることができるようにカットツーフィットプラスチックの庭のダーツに産業マーカーを使用埋葬に耐えます。
注意：代替的標識法を使用することができます。 - 各区画は、種子及びそのラベルで充填された後、高温の接着剤銃で直ちに区画をシール。全体シードストリップが完全に密封されるまで進みます。複製、ブロックおよび/または治療情報と第一の区画で、全体的なストリップにラベルを付けます。
注：私たちは時間的な除去、ブロックを持っていたし、ブロック内のストリップを複製するため、私たちの研究のために、私たちはこの情報のすべてが含まれていました。 - 次のストリップに移動する前に、必要に応じて区分し、スポット接着剤の間のギャップを確認してください。
- 種子の背番号（各区画20は、この例で使用されている）でシードコンパートメントを埋めます。ラベルには、彼らがすることができるようにカットツーフィットプラスチックの庭のダーツに産業マーカーを使用埋葬に耐えます。
図1.埋葬シードストリップ概略図。個々の区画のためのクロスタイプ識別を示す埋葬ストリップの例。母親の親は、第二の列挙され父方の親と最初に表示されます。色は異なる母体の親子関係を示し、作物のためのF 1雑種のための青、野生の黄色、赤と。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3.フィールドにシードストリップベリー
- 家のストリップに指定された深さにプロットを掘ります。分析におけるサブプロットとしてストリップはランダム除去日がメインプロットと区画IDとして使用されることを可能にするために配置された個々のブロック（この例では、十字型）にストリップを割り当てます。
- 地球とストリップをカバーしています。カット金属メッシュのハードウェア布が埋設されたストリップの上にプロットし、場所10cmよりも大きくなるように。地球とエッジとカバーの布端を固定するU-ピンを使用してください。
注：このカバーは穴を掘るシード捕食者を排除するためです。別の選択肢として、マーサーら 13を構築し、その分野のLOCAに強烈なゴーファーの圧力に起因するシードストリップを囲まれたハードウェア布の箱を埋める。） - ストリップの場所と除去の日付が明確に書かれたレコードを補完するために区別するために着色された測量のフラグを配置します。
4.ストリップを発掘し、種子を評価
- 与えられた除去の日付に割り当てられたシードストリップを掘ります。彼らは種子の評価が行われる実験室に到達するまでクールな湿った環境でストリップを維持します。これは、湿った新聞にストリップを包装及び輸送または翌日配達のためにクーラーに置くことによって達成することができます。
- ストリップは、外部破片があいまい種子ないことを十分にきれいになるまで水でストリップからの泥や土を洗い流してください。
- 一度にオープンつの区画をカットするはさみを使用してください。発芽した種子をカウントし、それらを削除します。明らかに死んだ種子（ 例えば、腐敗、または腐敗の種子）をカウントします。さらに、未発芽休眠、および死んだ種を区別するために標識、濡れたペトリサイズ吸取紙に未発芽種子を置きます。
- 発芽してペトリ皿を置きます25°C / 10°C 12時間の昼/夜：標準的な発芽条件のための成長チャンバセットに種子。シード1週間が発芽することを許可します。でもそれ、彼らは野外条件下で発芽しなかったので、これらのような生存したが、未発芽をカウントします。
- 成長チャンバ処理後、試験はテトラゾリウムクロリド（TZ）13を用いて生存率を未発芽種子の残り。これを達成するために、AOSAテトラゾリウム試験ハンドブック14を用いた研究の種のためのTZの適切なのパーセント溶液を作ります。この例では、1％溶液が使用されます。
- 半分に未発芽種子をカットし、半分を置き、胚と胚乳は（種子が浮くことがあり、これは大丈夫です）種子をカバーするのに十分なTZ溶液を含むペトリ皿に表示されました。
- 30℃に設定したインキュベーターにTZペトリ皿を置き、3時間を待ちます。注：必要であれば、より高い温度は、より速い反応になりますが、過度染色は危険です。
<LI>インキュベーターからペトリ皿を削除し、評価します。染色されていない種子が死んでいる一方で、その胚で赤色に染色されている種子は、発芽可能です。マージナル例および特定の種を区別について詳しくは、AOSAテトラゾリウムテストハンドブックを参照してください。
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Representative Results
多様母体の親子と作物の対立遺伝子の割合がクロスタイプ（ 表1）は、パーセントで除去日付を横切って異なった未発芽、発芽、および死んだ種子（ 図2及び3）。第三の除去（スプリング）により未発芽すべての種子が本当に休止状態であることが判明した一方で未発芽種子のTZテストを使用して、我々は、第二の除去（早春）（ 表2）で、いくつかの真の休眠種子を発見しました。
一般的に、低い作物の対立遺伝子の割合は、晩秋に不適応な発芽を減少させた（ 図2）。早春の除去では、すべてのクロスタイプは高い発芽していたが、その割合は死んでいない未発芽（ 図3）が異なっていました。母体の野生のクロスタイプは未発芽残ることが多かった一方で、特に、作物母体の親子関係とのクロスタイプはより高い死亡率を持っていました。ばねによって、発芽は、いくつかのクロスタイプのために減少しました。直感に反するが、これが原因以前の発芽クロスタイプのための埋葬ストリップ内の種子の死亡に起因する可能性が高いです。したがって、死亡率は、より多くの作物のようなクロスタイプ（ すなわち 、より高い作物対立遺伝子の比率を持つもの）作物母方の両親（ 図3）によって生成されるために高かったです
晩秋の最初の除去で図2.発芽。最初の除去の日におけるヒマワリ作物野生のクロスタイプの発芽、晩秋インチクロスタイプはマークとして作物対立遺伝子の割合を増加させることにより、y軸上に編成されます。母親の親は、各クロスタイプのために最初に表示されています。同じ文字が続く（SEバー付き）発芽最小二乗手段多重比較のためのテューキー・クレーマー調整を使用して有意差はありません。パック：図は、以前に公開されていますE、 ら。（2015）15。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.パーセント発芽、早春（C）、春ための第二の除去（早春）と第3の除去（春）早春（A）、春（B）のために発芽。パーセント、未発芽％ を未発芽、および死亡率 （ D）、および早春（E）とスプリング（F）除去の日付のデッドパーセント。ひまわり作物野生ハイブリッドクロスタイプは、ほとんどの作物のようなy軸の下部にあるy軸と最も野生様の上で、作物の対立遺伝子の割合を増加させることによって編成されています。クロスタイプ母性親が最初に表示されます。最小二乗同じ文字が続く（SEバー付き）、発芽した未発芽とデッドシードするための手段は、多重比較のためのTukey-Kramerの調整を使用して有意差はありません。図は、以前に掲載されました：ペース、 ら（2015）15。。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| クロスタイプ | TZ休止 | 標準誤差 |
| WxW | 0.071 | 0.0131 |
| WxBC | 0.041 | 0.0126 |
| WxF1 | 0.089 | 0.0136 |
| WxF2 | 0.054 | 0.0126 |
| F1xW | 0 | 0.0126 |
| F1xBC | 0.013 | 0.0126 |
| WXC | 0.075 | 0.0131 |
| F1xF1 | 0.007 | 0.0126 |
| F1xF2 | 0.013 | 0.0126 |
| CXW | 0 | 0.0126 |
| CxBC | 0 | 0.0126 |
| F1xC | 0 | 0.0126 |
| CxF1 | 0 | 0.0126 |
| CxF2 | 0 | 0.0126 |
| CXC | 0 | 0.0126 |
永続的シードバンクに貢献する可能性が高い表2種子。最小二乗は、第二（早春）除去における未発芽種子の割合休眠端数するための手段。種子は、テトラゾリウム塩素を使用して、生存可能であると判断されました良好な発芽条件でのインキュベーション後のIDE。 。、ら （2015）15ペース：表は、以前に公開されています。
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Discussion
ここでは、フィールド内の予め選択された期間での種子発芽、休眠および多様な種株式の死亡率を観察するために、シード埋葬ストリップを使用するための方法を提示します。個々のパケットは、個々のパケットの作成以上のストリップとコンパートメント構造の（1）の速度にあるのではなくストリップを使用することの利点。 （2）パケットを省略したり、意図せずにいずれかを除去する危険性なしに一つの動きで複数の区画を除去する容易さと速さを。土が硬く、フィールド条件が冷えているときに、ここで示す例で除去日付の2は、冬の間だったように、この方法は、労働と人間のミスの可能性の両方を低減します。種子のストリップはまた、研究者がフィールドにヒューマンエラーによって変更することができないようにして、実験室でのコンパートメントの位置をランダム化することを可能にすることによって、実験の物流を支援します。我々が予測された自然発芽倍の幅を包含除去時間の選択によって種子バンクのダイナミクスにおける当社の例ハイブリッド種子は、種子バンクに固執し、将来の集団に貢献するための可能性について推論を行うことができます。この方法の1つの制限は、区画間の種子の一部の移動が、種子の大きさに応じて、避けられないことです。このため、（およびプロトコルに記載されているように）研究者は、種子の移動を最小限に抑えるために区画間の高温接着剤シールを二重にチェックすることが重要です。
シード埋葬実験といくつかの問題がタイミングについてちゃっかり考えることによって回避することができます。研究種及び研究目的の自然のサイクルに関連した時間に埋葬し、除去の日付を選択します。それは、すぐに自然の種子はできるだけ流した後に植えるのがベストです。除去の日付は通常の発芽挙動の評価のためのピーク実生発生時間の観察に基づいて選択する必要があります。以前の日付の添加はまた、研究者は早期発芽をキャプチャすることができます。ベックause私たちの以前の研究は、いくつかの不適応な発芽は、いくつかのクロスタイプで休眠性の欠如を完了することが原因で発生した、我々は数週間しか埋葬（除去1、晩秋）15、16の後に非常に早期除去の日付を選択したことを示していました。
個々のパケットを超えるストリップの利点は、ダース以上の区画は、埋め込み除去し、灌漑や栄養治療に複数の削除の日付からすべてを含む複雑な実験的なデザインを可能にする、1として評価することができるということです。調べでは、彼らが主な効果であることを理解した上で、最も懸念している治療を可能にするブロックを構築するために世話をする必要があります。私たちの例では、時間をかけて、シード行動を強調したが、他の治療法は、それがフィールドレイアウトの考慮を必要とし、実験的な設計段階でブロック内の配置を複製することになる適用することができます。ランダムブロック内のストリップ埋葬位置を割り当てることにより、除去時間は、主効果として分析することができます。
<評価が始まる前にストリップ全体のためにペトリサイズ吸取紙の前標識されたスタックを準備シードストリップを除去した後、Pクラス= "jove_contentは">、ヒューマンエラーを低減します。同様に、開いて一度に1つのコンパートメントを評価して精度を維持するのに役立ちます。成長室に未発芽種子を配置すると、昼と夜の温度が研究種のための最適な種子の発芽条件と一致していることを確認してください。標準的な発芽条件（25℃/ 10℃12時間の昼/夜）種の多種多様な適切かもしれないが、これは、すべての種には当てはまりません。シード染色パターンのTZ処理アプリケーションと評価強く研究結果に影響を与えると考えています。成長チャンバ処理後の未発芽種子を評価する場合、所与の種のためのTZの正確な濃度に関する文献（またはAOSAテトラゾリウムテストハンドブック14）を参照してください。判断しながら、個々のTZステンド秒EEDS、種子の生存率と土壌から出現し、苗を生産することができない場合があり、組織を、呼吸を示すことができる染色した種子-弱を発芽する種子の能力の違いを覚えておくことが重要です。それは本当に休眠種子が最適発芽条件で発芽したままものであると述べ、まだ試験したときにまだ強く生存しています。これらの種子は、永続的シードバンクに貢献し、今後数年間で発芽する可能性が高いだけ種子です。
これらのメソッドのアプリケーションの数は、ここで概説したものを超えても可能です。種子埋葬ストリップは実験単位と実験計画の実質的に任意の数のためにカスタマイズすることができます。彼らは、異なる種、種子の大きさ、または状態/処置を比較するために適用することができます。これらのメソッドの建物は、生態学的に関連するコンテキストで多くの種の基本的な種子生物学の知識を深める可能性を秘めています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small coin envelopes | Any | ||
| Large coin envelopes | Any | ||
| fine meshed polyester mosquito netting | Any | ||
| high-temperature glue gun | Any | ||
| high-temperature glue stick refills | Any | ||
| Industrial permenant markers | Any | ||
| plastic garden labels | Any | ||
| scissors | Any | ||
| Shovel | Any | ||
| Metal mesh hardward cloth | Any | ||
| Surveyor's flags, multiple colors | Any | ||
| Wet newspaper | Any | ||
| cooler | Any | ||
| blotter paper | Any | ||
| petri dishes | Any | ||
| Temp. controlled growth chamber | Any | ||
| razor blades | Any | ||
| Petri dishes | Any | ||
| Tetrazolium chloride | Any | ||
| water | Any | ||
| heat incubator | Any |
References
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