Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma frö survivor, groning och dvala under fältförhållanden med hjälp av begravda, märkta utsädesremsor och tetrazoliumklorid (TZ) lönsamhet testning.
Introduction
Det övergripande målet med denna metod är att på ett tillförlitligt sätt bedöma frö överlevnad över tiden under fältmässiga förhållanden.
Fröbank är en reserv av spridda, livskraftiga ännu ungerminated frön fördelade antingen på markytan, inom ytan strö, eller i markprofilen, som kan kvarstå gående eller under många år 1,2. När utsädes nedgrävning metoder som liknar dem som presenteras här applicerades på en 17-årig studie med flera dussin arter, var livsdugliga frön som finns i många av de arter som testades tre. Seed dvala är ett block till frögroning tills en lämplig kombination av villkor för plantor överlevnad uppstår fyra. Återstående vilande kan tillåta frön att överleva svåra förhållanden, såsom låga vintertemperaturer, näringsbegränsning eller säsongs torka tills en extern trigger för dvala frisättning möjliggör groning. Utlösare för dvala frisättning kan variera från exponering för utökade kyla, föreningar kvar av fire, eller fysiska angrepp på fröskalet genom nötning eller kontakt med djur magsyra 5. Som groning ledtrådar kan vara släkten eller arter specifika och ofta resulterar från tidigare naturligt urval, är maladaptiv frögroning det som inträffar vid en olämplig tidpunkt, och kan leda till utsäde eller plantor dödlighet eller dålig planttillväxt. Även dvala har klassificerats i ett antal olika typer baserade på mekanismerna för dvala frisättning (t.ex. fysisk dvala, fysiologisk dvala), förblir 6 frö dvala en av de minst förstådda ämnen i växtbiologi. Således, fältstudier som möjliggör bedömning av status för enskilda frön eller grupper av frön enligt relevanta ekologiska förhållanden har högre förklaringsvärde än de som helt enkelt förlita sig på standard grobarhetsprov i laboratoriet.
Utnyttjande av kända egenskaper utsäde kan ge insikt i de mekanismer av dvala. Kontroll av utsäde dvala är complex, inklusive genetisk kontroll av fysiologiska och morfologiska faktorer. Medan en full förståelse för bredden av dvala mekanismer har ännu inte klarlagd, har en generell modell dykt upp, som omfattar en återkopplingsförhållande mellan de två växthormoner gibberellsyra (GA) och abskisinsyra (ABA) 7. I denna generaliserade modell för utsäde med en fysiologisk komponent till sin dvala, fungerar GA som signal för dvala release, medan ABA tjänar till att bibehålla den vilande tillstånd. Moderns genetiska effekter samt moderns uppväxtmiljö kan påverka dvala och andra utsädes egenskaper, såsom storlek, genom matern genererade vävnader och utvecklingssignaler 8. Matern genererade externa strukturer (eller utsäde beläggningar) får behålla dvala, ibland i kombination med fysiologiska signaler. Eftersom maternella utsäde beläggningar styrs av moderplantan gener, kan de inte speglar fröet faktiska kärn genuppsättning. Vi har ossEd Helianthus annuus slutna frukter från en rad grödor vilda hybrid korsar utröna dessa moderns vs. embryo genetiska effekter på utsädes egenskaper 9,10. Således kan studiedesign som inkluderar olika arter, korstyper eller genotyper fram information om ekologi och genetik av utsäde dvala, groning och överlevnad.
Ett viktigt exempel på hur frögroning och överlevnad fenotyper kan påverka populationsdynamik kan ses i grödor vilda hybridzoner. Val under domesticering av odlade växter eliminerar de flesta dvala och minskar ett frö förmåga att överleva utanför växtsäsongen. Ändå genflöde, eller hybridisering mellan odlade och vilda typer i grödor vilda hybridzoner kan återinföra grödor alleler (eller genetiska varianter) i en vild population, som kan påverka fröbanken dynamik. Hybrider mellan odlade och vilda släktingar funnit potentiellt grödor vilda hybridzoner kan haen mängd mellanliggande dvala fenotyper, med endast ett fåtal fenotyper som förväntas att överleva förhållanden utanför odling (t.ex. vintermånaderna) 11.
Syftet med detta manuskript är att visa hur man med fröet begravning remsmetoden kan vi utvärdera groning, dvala, och överlevnaden av en rad typer utsäde vid olika tidsperioder för att undersöka deras naturliga variation under fältmässiga förhållanden. I vårt exempel använde vi solrosfrön från 15 grödor vild hybrid korstyper eftersom vi är intresserade av moderns och embryo genetiska effekter på utsädes egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Samla Seed från flera arter eller kontrollerade korsningar av en enda art
Obs: Det här exemplet används utsäde från 15 tvärtyper inom arten Helianthus annuus (solros) med hjälp av vild, hybrid, och slagen av gröda som moderns (utsädes) förälder.
- Vid slutet av växtsäsongen, samla mogna fröställningar i märkta påsar. Ren säd från agnar och plats utsäde i kuvert märkta med föräldra korstyp i standardformat (dvs moderns x fader).
- Bulk frö tillsammans i stora kuvert med hjälp av lika stora mängder av utsäde från ett lika stort antal identiska föräldrakorstyper. Till exempel, 100 frön från 10 tvär typer med samma moderns och faderns föräldrar. Märk kuvert med att identifiera (korstyp) information. Dessa stora kuvert utsäde mästare för användning vid fyllning begravningsremsor i avsnitt 2.
| maternal Parent | |||
| paternal Parent | Vild: WxW | F 1: WXC | Gröda: CXC |
| Vild: WxW | 0% WxW | 25% F 1 xW † | 50% CXW † |
| BC: WxF1 eller F1xW | 12,5% WxBC | 37,5% F 1 XBC | 62,5% CxBC |
| F 1: WXC | 25% WxF 1 † | 50% F 1 xF en | 75% CXF 1 † |
| F 2: F 1 xF 1 | 25% WxF 2 | 50% F 1 xF 2 | 75% CXF 2 |
| Gröda: CXC | 50% WXC † | 75% F 1 xC † | 100% CXC |
Tabell 1. Föräldratvär types framställda från hand pollinering. Sunflower grödor vild hybrid korstyper producerades med handpollinering för användning i utsädes begravning experiment. För alla tvär typer moderns förälder visas först och fader förälder listas andra. Cross typer markerade med † är en del av ömsesidiga kors typ par med samma% grödor alleler men olika moderns föräldrar. Tabell har tidigare publicerats i: Pace, BA et al. (2015) 15.
2. Skapa anpassade Seed Burial Strips
OBS: I detta exempel, hade vi tre borttagning datum behandlingar och 15 replikat, så vi krävs 45 remsor totalt. I exemplet används 15 fack per band så krävs vi tillräckligt finmaskigt polyesterväv eller myggnät för att hysa 15, 7 x 10 cm fack. Se figur 1.
- Börja med att skära en 20 x 105 cm remsa av tyg för varje frö remsa.
- Mät och markera fack, sedan vika tyget på mitten. Med användning av en high-temperatur limpistol, försegla ett kort (10 cm) änden. När limmet svalnar något, men inte helt och hållet, tryck på tyg sidor tillsammans för att skapa en tätning.
VARNING: Hög temperatur lim och limpistol tips kan orsaka brännskador vid kontakt med huden förlängs. - Limlinjer från den vikta kanten till den öppna kortände i varje fack märke. Tryck på de två tygla räta längs limmet linjer för att säkerställa tätningar utan hål mellan fack. Frön migrerar mellan facken bidra till experimentella fel.
OBS: Nu när facken har skapats, bör den ovikta kanten förbli öppen och redo att ta emot utsäde och deras identifierande information (korstyp namn). - Slumpmässigt tilldela frö korstyper att fack för varje remsa.
- Fyll utsäde fack med en enhetlig antal frön (20 för varje fack används i detta exempel). För etiketter, använder industri permanenta markörer på cut-to-fit plast trädgård dart, så att de kanmotstå begravning.
OBS: Alternativa märkningsmetoder kan användas. - Efter varje fack är fylld med utsäde och dess etikett, försegla utrymmet omedelbart med hög temperatur limpistol. Fortsätt tills hela frön remsan är helt förseglad. Märka övergripande remsan i den första avdelningen med replikat, blockera och / eller behandling information.
OBS: För vår studie, eftersom vi hade tids flyttningar, block, och replikera remsor inom block, ingår vi all denna information. - Kontrollera om det saknas mellan fack och plats lim som behövs innan vi går vidare till nästa remsa.
- Fyll utsäde fack med en enhetlig antal frön (20 för varje fack används i detta exempel). För etiketter, använder industri permanenta markörer på cut-to-fit plast trädgård dart, så att de kanmotstå begravning.
Figur 1. Begravd frö band schema. Exempel på begravning remsa visar korstyp identifiering för enskilda avdelningar. Maternal förälder är noterat först med faders förälder listas andra. Färger indikerar olika moderns härstamning,med gult för vild, blå för F 1 hybrid, och rött för grödan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Bury Seed Strips i fält
- Gräva tomter till det angivna djupet för att hysa remsor. Tilldela band på enskilda block i vilka remsor är slumpmässigt anordnade för att möjliggöra borttagning datum som skall användas som huvudsakliga handlingen och fack identitet (i det här exemplet, korstyp) som subploten i analysen.
- Täck remsor med jord. Cut metallnät hårdvara trasa för att vara 10 cm större än tomter och plats över begravda remsor. Använd U-stift för att säkra kanterna och täcka duk kanter med jord.
OBS: Denna beläggning är för att utesluta gräva utsäde rovdjur. Som ett annat alternativ, Mercer et al. 13 konstruerad och begravdes lådor av hårdvara duk som omgav utsädesremsor på grund av intensiv gopher tryck inom sitt område location.) - Placera färgade Besiktningar flaggor för att skilja band läge och borttagning datum för att komplettera tydlig skriftlig dokumentation.
4. Gräv Strips och Utvärdera Seed
- Gräva upp utsäde remsor som tilldelats ett visst avlägsnande datum. Behåll remsorna i en sval fuktig miljö tills de når laboratoriet där utvärderings frö kommer att äga rum. Detta kan åstadkommas genom att linda remsorna i vått tidning och placera dem i en kylare för transport eller över natten sjöfart.
- Skölj lera och jord från remsor i vatten tills remsor är rena nog att yttre skräp inte dunkla frön.
- Använda sax för att skära upp ett fack åt gången. Räkna grodda frön och ta bort dem. Räkna klart döda frön (t.ex. ruttna eller putrefied frön). Placera ungerminated frön på märkt, våt Petri-storlek läskpapper för att ytterligare särskilja ungerminated, vilande och döda frön.
- Placera petriskålar med ungerminatedfrön i en tillväxtkammare set för normal grobarhet villkor: 25 ° C / 10 ° C 12 tim dag / natt. Låt frön en vecka att gro. Alla som inte räkna dessa som livskraftiga, men ungerminated eftersom de inte gro under fältmässiga förhållanden.
- Efter tillväxtkammaren behandling, testa återstående ungerminated frön för livsduglighet med hjälp av tetrazoliumklorid (TZ) 13. För att åstadkomma detta, utgör en procent lösning av TZ lämplig för studie som använder den AOSA Tetrazolium Testing Handbook 14. För detta exempel används en 1% lösning som används.
- Skär ungerminated frön i halvor och placera hälften var embryot och frövitan är synliga i en petriskål med tillräckligt TZ lösning för att täcka fröet (frön kan flyta, är det okej).
- Placera TZ petriskålar i en inkubator inställd på 30 ° C och vänta 3 timmar. Obs: Högre temperaturer kommer att resultera i en snabbare reaktion, om så önskas, men overstaining är en risk.
<li> Ta bort petriskålar från inkubatorn och utvärdera. Frön som har färgats rött i deras embryon är GROBAR, medan ofärgade frön är död. Rådfråga AOSA Tetrazolium Testing handbok för mer information om utmärkande marginella fall och vissa arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tvär typer med varierande maternal härstamning och gröda allel i procent (Tabell 1) skilde över flyttdatum i procent grodde, ungerminated, och döda utsäde (Fig. 2 och 3). Använda TZ testning av ungerminated frön, vi hittade några riktigt vilande frön i andra borttagning (vårvintern) (tabell 2), medan alla frön ungerminated av tredje borttagning (våren) befanns vara verkligt vilande.
I allmänhet lägre skörde allel procenttal minskade maladaptiv groning under senhösten (Fig. 2). Vid början av våren bort alla tvär typer hade hög grobarhet, men skilde sig i deras andel döda och ungerminated (Fig. 3). I synnerhet tvär typer med grödor moderns härstamning hade högre dödlighet medan moderns vilda korstyper var mer sannolikt att förbli ungerminated. Senast våren,groning minskade för vissa korstyper. Medan krånglig, är detta sannolikt på grund av utsäde dödlighet inom grav remsor för tidigare gro korstyper. Följaktligen var dödligheten högre för mer grödor liknande tvärtyper (dvs de med högre skörde allel procent) som produceras av skörde moderns föräldrar (Fig. 3)
Figur 2. Groning vid första avhämtningen i senhösten. Groning av solros grödor vilda korstyper vid första borttagning datum, i slutet av hösten. Cross typer organiseras på y-axeln genom att öka gröda allel procentsatser som markerats. Maternal förälder visas först för varje korstyp. Groning minsta kvadrat medel (med SE staplar) följt av samma bokstav är inte signifikant annorlunda med hjälp av ett Tukey-Kramer justering för multipla jämförelser. Siffra har tidigare publicerats i: Pace, et al. (2015) 15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Andel grodda, ungerminated och dödlighet för andra borttagning (tidigt på våren) och tredje borttagning (våren). Procent grott för tidigt på våren (A), fjäder (B), procent ungerminated för tidigt på våren (C), fjäder ( D), och procent död tidigt på våren (E) och fjäder (F) borttagning datum. Solros grödor-vild hybridkorstyper är organiserade genom att öka gröda allel procentsatser, med den mest grödan liknande på toppen av y-axeln och den mest wild-liknande på botten av y-axeln. Korstyp maternal förälder listas först. Minst kvadratermedel för grott, ungerminated och död frö (med SE staplar) följt av samma bokstav är inte signifikant annorlunda med hjälp av ett Tukey-Kramer justering för multipla jämförelser. Siffra har tidigare publicerats i: Pace, et al (2015) 15.. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| korstyp | TZ Dormant | Standard fel |
| WxW | 0,071 | 0,0131 |
| WxBC | 0,041 | 0,0126 |
| WxF1 | 0,089 | 0,0136 |
| WxF2 | 0,054 | 0,0126 |
| F1xW | 0 | 0,0126 |
| F1xBC | 0,013 | 0,0126 |
| WXC | 0,075 | 0,0131 |
| F1xF1 | 0,007 | 0,0126 |
| F1xF2 | 0,013 | 0,0126 |
| CXW | 0 | 0,0126 |
| CxBC | 0 | 0,0126 |
| F1xC | 0 | 0,0126 |
| CxF1 | 0 | 0,0126 |
| CxF2 | 0 | 0,0126 |
| CXC | 0 | 0,0126 |
Tabell 2. Frön som kan bidra till en ihållande fröbank. Minsta kvadratmetoden för procent vilande fraktion av ungerminated frön i andra (vårvintern) tas bort. Frön bestämdes att vara lönsamt att använda tetrazolium kloride efter inkubation under gynnsamma grobarhet förhållanden. Tabell har tidigare publicerats i: Pace, et al (2015) 15..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi metoder för att använda utsäde nedgrävning remsor för att observera frögroning, dvala och dödlighet av olika frökapslar vid förvalda tidsperioder inom området. Fördelarna med att använda remsor snarare än enskilda paket ligger i (1) hastigheten av band och fack konstruktion över skapandet av individuella paket; och (2) den lätthet och hastighet för att ta bort flera fack i en rörelse utan risk för att utelämna ett paket eller ta bort ett oavsiktligt. Som två av flyttdatum i exemplet som presenteras här var under vintermånaderna när marken är hård och fältförhållanden är kalla, reducerar denna metod både arbete och risken för mänskliga fel. Seed remsor stöd också experimentella logistik genom att tillåta forskare att slumpmässigt kompartment platser i laboratoriet på ett sätt som inte kan ändras av den mänskliga faktorn på fältet. Genom val av flytt gånger som omfattade bredden av förväntade naturliga grobarhet gånger vi varkunna dra slutsatser om fröbank dynamik-i vårt exempel potential för hybridutsäde att framhärda i fröbank och bidra till framtida populationer. En begränsning med denna metod är att en del vandring av utsäde mellan avdelningar kan vara oundvikliga, beroende på storleken av fröet. Av denna anledning, (och som anges i protokollet) är det viktigt att utredarna dubbelkolla hög temperatur lim tätningar mellan fack för att minimera frö migration.
Vissa problem med utsäde grav experiment kan undvikas genom att tänka listigt om timing. Välj nedgrävning och borttagning datum ibland är relevanta för de naturliga cykler av studie arter och studiemålen. Det är bäst att plantera så snart efter naturlig frö skjul som möjligt. Datum för avlägsnande skall väljas baserat på observationer av topp planta uppkomst tid för bedömning av normal groning beteende; tillsats av tidigare datum gör det också möjligt för forskare att fånga tidig groning. because vårt tidigare arbete hade visat att vissa maladaptiv groning var inträffar på grund av total avsaknad av dvala i vissa korstyper, valde vi en mycket tidigt datum bort bara några veckor efter begravning (avlägsnande 1 senhösten) 15, 16.
Fördelen med remsor över individuella paket är att ett dussin eller flera fack kan begravas, avlägsnas, och utvärderas som en, vilket möjliggör komplexa experimentell design omfattar allt från flera flyttdatum till bevattning eller närings behandlingar. Utredarna bör vara noga med att konstruera block som gör det möjligt för behandlingar som de är mest intresserade av att förstå att vara den huvudsakliga effekten. Vårt exempel betonade frö beteende över tid, men andra behandlingar kan appliceras som skulle kräva ersättning av fältlayout och replikera arrangemang inom block under försöksdesignfasen. Genom att slumpmässigt tilldela band begravning position inom block, kan avlägsnande tid analyseras som den huvudsakliga effekten.
<p class = "jove_content"> Efter avlägsnande av utsädes remsor, framställning av en pre-märkt bunt Petri-storlek läskpapper för hela remsan innan bedömning börjar minskar risken för mänskliga misstag. På samma sätt öppnar och utvärdera samma utrymme i taget bidrar till att upprätthålla noggrannhet. Vid placering ungerminated frön i odlingskammare, vara säker på att dag och natt temperaturer matchar optimala frögroning villkor för studie arter. Medan standard groning förhållanden (25 ° C / 10 ° C 12 timmar dag / natt) kan vara lämplig för en mängd olika arter, är detta inte fallet för alla arter.Tänk på att TZ behandling tillämpning och utvärdering av utsäde färgningsmönster påverkar starkt studieresultaten. Vid bedömningen av de ungerminated fröna efter tillväxtkammaren behandlingen, konsultera litteraturen (eller AOSA Tetrazolium Testing Handbok 14) för den korrekta koncentrationen av TZ för en viss art. Medan döma enskilda TZ målat sEEDS, är det viktigt att komma ihåg skillnaden mellan utsäde livskraft och ett frö förmåga att gro-svagt färgade frön kan indikera respiring vävnad, som kanske inte kan dyka upp ur jorden och producera en planta. Vad som sägs, verkligen vilande frön är de som förblir ungerminated under optimala grobarhet förhållanden, men när den testades fortfarande starkt livskraftig. Dessa frön är de enda frön som kan bidra till en ihållande fröbank och gro under de kommande åren.
Ett antal ansökningar om dessa metoder är möjliga utöver de som beskrivs här. Seed gravremsor kan anpassas för praktiskt taget alla antal experimentella enheter och experimentell design. De kan tillämpas för att jämföra olika arter, utsädes storlekar eller villkor / behandlingar. Med utgångspunkt i dessa metoder har potential att fördjupa kunskapen om basutsäde biologi många arter på ett ekologiskt relevant sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small coin envelopes | Any | ||
| Large coin envelopes | Any | ||
| fine meshed polyester mosquito netting | Any | ||
| high-temperature glue gun | Any | ||
| high-temperature glue stick refills | Any | ||
| Industrial permenant markers | Any | ||
| plastic garden labels | Any | ||
| scissors | Any | ||
| Shovel | Any | ||
| Metal mesh hardward cloth | Any | ||
| Surveyor's flags, multiple colors | Any | ||
| Wet newspaper | Any | ||
| cooler | Any | ||
| blotter paper | Any | ||
| petri dishes | Any | ||
| Temp. controlled growth chamber | Any | ||
| razor blades | Any | ||
| Petri dishes | Any | ||
| Tetrazolium chloride | Any | ||
| water | Any | ||
| heat incubator | Any |
References
- Walck, J. L., Baskin, J. M., Baskin, C. C., Hidayati, S. N. Defining transient and persistent seed banks in species with pronounced seasonal dormancy and germination patterns. Seed Sci Res. 15 (3), 189-196 (2005).
- Alexander, H. A., Schrag, A. M. Role of soil seed banks and newly dispersed seeds in population dynamics of the annual sunflower. Helianthus annuus. J Ecol. 91, 987-998 (2003).
- Burnside, O. C., Wilson, R. G., Weiseberg, S., Hubbard, K. Seed longevity of 41 weed species buried 17 years in eastern and western. Weed Sci. 44 (1), 74-86 (1996).
- Baskin, C. C., Baskin, J. M. Seeds: Ecology, biogeography, and evolution of dormancy and Germination. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Baskin, J. M., Baskin, C. C. A classification system for seed dormancy. Seed Sci Res. 14 (1), 1-16 (2004).
- Donohue, K., et al. Environmental and genetic influences on the germination of Arabidopsis thaliana in the field. Evolution. 54 (4), 740-757 (2005).
- Roach, D. A., Wulff, R. D.
- Pace, B. A., Alexander, H. M., Emry, J. D., Mercer, K. L. Seed fates in crop-wild hybrid sunflower: crop allele and maternal effects. Evol Appl. 8 (2), 121-132 (2015).
- Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids. Am J Bot. 101 (7), 1176-1188 (2014).
- Stewart, N. C., Matthew, J., Halfhill, D., Warwick, S. I. Transgene introgression from genetically modified crops into their wild relatives. Genetics. 4, 806-817 (2003).
- Mercer, K. L., Shaw, R. G., Wyse, D. L. Increased germination of diverse crop-wild hybrid sunflower seeds. Ecol Appl. 16, 845-854 (2006).
- Delouche, J. C., Still, T. W., Rapset, M., Lienhard, M. The tetrazolium test for seed viability. Mississippi Sta Uni Ag Exp Sta Techn Bull. 51, 1-63 (1962).
- Association of Official Seed Analysts. Tetrazolium Testing Handbook. , 653 Constitution Avenue NE, Washington, DC 20002, USA. (2010).
- Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids. Am J Bot. 10 (7), 1176-1188 (2014).
- Weiss, A. N., Primer, S. B., Pace, B. A., Mercer, K. L. Maternal effects and embryo genetics: germination and dormancy of crop-wild sunflower hybrids. Seed Sci Res. 23, 241-255 (2013).
