Abstract
Den genekspression platform analysen muliggør en robust og meget reproducerbar kvantificering af ekspressionen af op til 800 transkripter (mRNA eller miRNA) i en enkelt reaktion. Den miRNA-analysen tæller udskrifter ved direkte imaging og digitalt tælle miRNA molekyler, der er mærket med farvekodede fluorescerende stregkodede probe sæt (en reporter probe og en capture sonde). Stregkoder hybridiseres direkte til modne miRNA, der er blevet forlænget med ligering af et unikt oligonucleotid tag (miRtag) til 3'-enden. Revers transskription og amplifikation af transkripter er ikke nødvendige. Reporter prober indeholde en sekvens af seks farver positioner befolkede anvendelse af en kombination af fire fluorescerende farver. De fire farver over seks positioner anvendes til at konstruere et gen-specifik farve stregkode sekvens. Post-hybridisering behandling er automatiseret på en robot prep station. Efter hybridisering de overskydende sonder vaskes bort, og de trepartsstrukturer (capture provære-miRNA-reporter probe) er fastgjort til en streptavidin-overtrukket objektglas via biotinmærket opfangningsprobe. Imaging og stregkode optælling sker ved hjælp af en digital analysator. De immobiliserede stregkodede miRNA visualiseres og filmede med et mikroskop og kamera, og de unikke stregkoder afkodes og tælles. Data, kvalitetskontrol (QC), normalisering og analyse lettes ved en specialdesignede databehandling og analyse software, der følger med analysen software. Assayet demonstrerer høj linearitet over et bredt område af ekspression, såvel som høj følsomhed. Prøve og assay forberedelse ikke involverer enzymatiske reaktioner, revers transkription, eller forstærkning; har få skridt; og er i høj grad automatiseret, hvilket reducerer investigator effekter og resulterer i høj konsistens og teknisk reproducerbarhed. Her beskriver vi anvendelsen af denne teknologi til at identificere cirkulerende miRNA forstyrrelser i irritabel tyktarm.
Introduction
Irritabel tyktarm (IBS) er den mest almindelige ambulante diagnose i Gastroenterology, plager 10 - 15% af den almindelige befolkning, og som repræsenterer en betydelig byrde for sundhedsvæsenet. I øjeblikket er der ingen generelt accepterede diagnostiske biomarkører for IBS (dvs. er diagnosen baseret på kliniske symptomer og udelukke andre organiske lidelser, såsom GI malignitet, inflammatoriske tarmsygdomme, og gastrointestinale (GI) infektioner). Når man studerer genekspressionsprofiler i fælles betingelser med subklinisk histopatologi, såsom IBS, høj følsomhed og nøjagtighed (reproducerbarhed) Der er behov for, som perturbationer i genekspression profiler er ofte subtile 1-3. miRNA er blevet identificeret som både diagnostiske og funktionelle mål i IBS 4,5, og vi er særligt interesseret i at vurdere deres anvendelse som cirkulerende biomarkører for IBS-associerede biologiske forstyrrelser 3,4,6,7. Den kliniske anvendelse af omløbTing biomarkører er af aktuel interesse på grund af den lethed og minimalt invasiv karakter af indsamlingen af biomarkører 'kilde (f.eks perifert blod) fra patienter.
Genekspression platform assays, på grund af deres unikke kemi og strømlinet, hovedsagelig automatiseret workflow, give et mikroarray platform, der giver bredt og kan tilpasses dækning (800 mål i en enkelt reaktion) af transkriptomet for målrettet opdagelse. De giver også høj præcision og linearitet over et bredt spektrum af ekspressionsniveauer i kvantificeringen af transkriptomisk mål. Assayet kræver ikke revers transkription af RNA, amplifikation af resulterende cDNA, eller andre enzymatiske reaktioner. Således er potentielle fejl indført ved de høje cyklus antal forstærkning fra RNA-arter med lav tæthed eller sjældne splejsningsvarianter reduceret med processen med digital optælling. Det betyder, at en lang række prøvetyper, såsom oprenset samledeRNA (dvs. mRNA + miRNA), RNA fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) prøver samt rå vævs- og cellelysater, kan anvendes med de assays.
RNA af interesse detekteres ved hjælp af et par af prober (opsamling og reporter sonder), som hver indeholder en target-specifik sekvens, der genkender en tilsvarende område på målet RNA. For at sikre påvisning af korte RNA'er (dvs. miRNA), er den modne miRNA sekvensen forlænget ved annealing en unik oligonucleotid tag (miRtag) til 3'-enden af molekylet. Et brodannende oligonukleotid, der er gratis til en del af både det modne mål miRNA og miRNA-specifikke miRtag, anvendes til at sikre sekvensspecificitet. Capture og reporter prober ligere til 3'- og 5'-ender af det modne miRNA-miRtag kompleks hhv. Indfangningsproberne har en biotinmærke ved 3 'enden, som giver dem mulighed for at vedhæfte til overfladen af en streptavidin-overtrukket objektglas, Fixing indfangningsproben-miRNA-miRtag-reporter sonde komplekset til dias. En elektrisk strøm anvendes derefter til at orientere kompleks på glidefladen, hvilket tillader fluorescerende stregkoder bæres af reporter sonde på 5'-enden, der skal visualiseres ved mikroskopi og charge-coupled device (CCD) kamera. Stregkoder tælles og afkodes, hvilket giver en optælling af de specifikke mål miRNA. Den fluorescerende stregkode består af seks positioner, der kan benyttes af en af fire fluorescerende farver, som kan anvendes til at konstruere flere end 4.000 farve-stregkode kombinationer, hver koder for et specifikt RNA.
Prøve forberedelse (dvs. RNA rensning eller celle / væv lysat forberedelse), samt hybridisering af capture og reporter sonder, er færdig på bænken. Tolv prøver kan multiplekses på en enkelt dias. Efter natten over hybridisering, er alle yderligere forberedelse eksemplar udført af en robot prep station. De fyldte objektglas overføres derefter til annonceigital analysator til billeddannelse, optælling, afkodning og databehandling. De resulterende data importeres til den medfølgende software, hvor de videreforarbejdes med en høj grad af brugerkontrol. Den unikke kemi, simple metoder, automatiseret natur, simpel datatype (tæller), og den samlede strømlinet arbejdsgang for analysen lette høj præcision genekspression kvantificering, hvilket gør det til et nyttigt redskab i at studere cirkulerende miRNA udtryk profiler og underskrifter i funktionelle forhold såsom IBS.
Protocol
Den her beskrevne forskning blev godkendt af Institutional Review Board for National Institutes of Health (Clinicaltrial.gov # NCT00824941).
1. Indsamling af fuldblodsprøver
- Indsaml fuldblodsprøver (2,5 ml) fra undersøgelsens deltagere via venepunktur i blodprøvetagning rør indeholdende en RNA stabiliserende opløsning (der giver mulighed for langtidsopbevaring), og opbevar dem ved -80 ° C indtil RNA oprensning.
2. Total RNA Purification
- Optø og inkuberes blod rør i 2 timer, og derefter centrifugeres dem ved hjælp af en swing-out rotor i 10 min ved 5000 x g. Fjern supernatanten ved forsigtigt at hælde eller pipettering den ud i et spild rør, og pas på ikke at forstyrre bundfaldet.
- Vask pillen ved at tilføje 4 ml RNase-frit vand, sæt hætten sikkert, og vortex indtil pelleten synligt opløst. Centrifuge ved anvendelse af en swing-bucket rotor ved 5.000 xg i 10 minutter og reflytte supernatanten, som beskrevet i trin 2.1.
- Tilføj 350 ul BM1 buffer (medfølger) til pillen. Vortex pelleten indtil det er synligt opløst, og overføre den til en 2-ml forarbejdning rør til automatiseret total RNA-ekstraktion.
- Udføre automatiseret rensning af intracellulær RNA, herunder miRNA, fra fuldblodet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt RNA-ekstraktion kit, som kan automatiseres på en robot RNA-ekstraktion system.
BEMÆRK: Den automatiserede robotsystem vi brugte kan behandle tolv prøver ad gangen, og det tager 3 timer for RNA rensning protokollen til at fuldføre.- Indlæse pre-loaded pipettespidser, centrifugerør, puffere og reagenser tilvejebragt i RNA-oprensningskit ind robotic RNA-ekstraktion system.
- Vælg "Blood miRNA Del A" protokol fra valgmenuen protokollen og starte kørslen.
BEMÆRK: Se supplerende materialer for en beskrivelse af de automatiserede procedurer. - Når robotten er completed del A i automatiserede miRNA rensning protokol, tømme affaldsbeholderen, og fjern de anvendte plast og reagensbeholdere fra robotsystem.
- Luk lågene på alle de mikro-centrifugerør indeholdende elueres RNA og placere dem i shaker adapter. Vælg "Blood miRNA Del B" i menuen protokolvalg at inkubere prøverne ved 65 ° C i 5 min.
- Når robotten er færdig kører del B miRNA rensning protokol, straks fjerne prøverne og chill dem på is.
- Kvantificere og evaluere det oprensede RNA kvalitet anvendelse af et spektrofotometer.
BEMÆRK: Som pr protokol anbefalinger til miRNA-analysen, en koncentration på 33 ng minimum / ul er påkrævet, og alle prøver skal opfylde eller overstige 280/260 forhold på 1,9 og en 260/230 ratio på 1,8 minimum for at sikre fravær af betydelig organisk forurening, som kan påvirke analysens ydeevne (henviser til Reference 17). - Opbevar prøverne ved -80 ° C.
3. miRNA Prøveforberedelse
- Normalisere 12 RNA-prøver til 33 ng / pl hjælp nuklease-frit vand.
- Forbered en 1: 500 fortynding af miRNA kontrol, i analysen kit hjælp nuklease-frit vand. Hold på is.
- Forbered annealing mester mix: kombinere 13 pi annealing buffer (medfølger), 26 pi miRtag reagens (medfølger), og 6,5 ul miRNA kontroller (forberedt i trin 3.2) ved hjælp af 10- og 20-ul pipetter.
- Anvendelse af en 10-pi pipette tilsættes 3,5 pi af annealing mastermix og 3 pi af RNA-prøven (dvs. 100 ng) til hvert af tolv 0,2-ml strimmel rør. Flick til at blande, spinde ned med en bordplade mini mikrocentrifuge (2000 xg), og plads i thermocycler (94 ° C i 1 min, 65 ° C i 2 minutter, og 45 ° C i 10 min, hold ved 48 ° C) .
- Forbered ligation mester mix ved at kombinere 3 μl af ligeringspuffer (billede) og 19,5 pi af polyethylenglycol (PEG; forudsat) under anvendelse af en 20-pi pipette. Tilføj 2,5 pi af ligering masterblandingen til hver af strimlen rør fra trin 3.4 under anvendelse af en 10-pi pipette.
- Bland forsigtigt, spinde ned med en bordplade mini mikrocentrifuge (2.000 xg), og vende tilbage til thermocycler ved 48 ° C i 5 min. Efter 5 minutter under anvendelse af en 10-pi pipette tilsættes 1 ul ligase direkte til hvert rør i thermocycler og inkubere dem ved 48 ° C i 3 min, 47 ° C i 3 min, 46 ° C i 3 min, 45 o C i 5 min, og 65 ° C 10 min; hold ved 4 ° C.
- Fjern rørene fra thermocycler, bland dem forsigtigt, dreje dem ned med en bordplade mini mikrocentrifuge (2000 xg), og der tilsættes 1 ml af ligation oprydning enzym (medfølger). Inkuber rørene i thermocycler (37 ° C i 1 time og 70 ° C i 10 min, hold ved 4 o
- Fjern rørene og ved hjælp af en 100-pi pipette, tilsættes 40 ul nuklease-frit vand, blandes, og spin ned med en bordplade mini mikrocentrifuge (2000 xg).
4. miRNA Hybridisering
- Optø journalisten og capture probe sæt (medfølger) på is og spin dem ned med en bordplade mini mikrocentrifuge (2000 xg).
- Ved hjælp af en 200-pi pipette, tilsættes 130 pi hybridiseringspuffer til reporter kodesæt rør (130 pi) at skabe hybridiseringen mastermix. Bland og spin ned med en bordplade mini mikrocentrifuge (2000 xg).
BEMÆRK: Reporter og indfanger sonder er specifikke og standard for hver miRNA indgår i panelet. Brugerdefinerede paneler og bruger-designet opsamling og probe sæt kan udformes. - 12 nye 0,2-ml strimler rør tilsættes 20 pi af hybridisering mastermix anvendelse af en 20-pi pipette.
- Denaturere miRNA prøver fra trin 3.7 ved 85 ° C for 5 min og køle dem på is. Tilsæt 5 pi til hver af rørene fra trin 4.3 under anvendelse af en 10-pi pipette.
- Programmér thermocycler til 65 ° C ved en 30-ul volumen-beregnede temperatur og opvarmet låg på det evigt tidsindstilling (ikke programmere den til at rampe ned til 4 ° C i slutningen af kørslen).
- Anvendelse af en 10-pi pipette, tilsættes 5 ul af indfangningsproben sat til hvert rør, blandes, spinde ned med en benchtop mini mikrocentrifuge (2.000 xg), og anbringes straks i thermocycler ved 65 ° C. Inkuber i mindst 12 timer og ikke mere end 30 timer.
5. Prep Station og Digital Analyzer
- Læg prep station.
- Åbn døren stationen og indlæse reagenser plader (medfølger), patron (medfølger), pipettespidser (medfølger), præparerede prøver i tolv 0,2 ml bånd rør, og tolv tomme 0.2 ml strimmel rør (medfølger). Fjern strimlen rør hætter og reagens plade dækning. Luk prep-stationdøren og køre den relevante analyse fra kontrolpanelet.
BEMÆRK: Post-hybridisering behandlingen er den samme, uanset assayet køres. Alle reagenser og plast bagværk færdigpakkede og kræver ingen forberedelse, undtagen at bringe dem til stuetemperatur og centrifugering ned reagensholdige plader med 96 brønde ved 2000 xg i 2 min. Alle komponenter er lagt i klart definerede positioner i prep station. Se supplerende materialer for en beskrivelse af de automatiserede procedurer.
- Åbn døren stationen og indlæse reagenser plader (medfølger), patron (medfølger), pipettespidser (medfølger), præparerede prøver i tolv 0,2 ml bånd rør, og tolv tomme 0.2 ml strimmel rør (medfølger). Fjern strimlen rør hætter og reagens plade dækning. Luk prep-stationdøren og køre den relevante analyse fra kontrolpanelet.
- Visualiser og tælle stregkoder af de immobiliserede og orienterede trepartsaftaler komplekser.
- Fjern patronen fra prep station, forsegle det med dækglas forudsat, og læg den i den digitale analysator i åbningen over kameraets optik.
- Vælg den relevante assay (miRNA panel assay) og assay-version er angivet på analysen kit og køre programmet.
BEMÆRK: Den digitale analysator tager derefter på se billeder for hver prøve position ent fire excitationsbølgelængder, hvilket tillader de fluorescerende stregkoder, der skal læses og dekodes. Specifikke stregkoder, svarende til en specifik miRNA, tælles. - Eksportere data filer til en USB eller direkte til serveren via en internet forbindelse.
6. Databehandling og analyse
- Klik på fanen "Rå data" og vælg "Importer RCC filer". Vælg den mappe, der indeholder RCC filer (rå data filer) fra USB.
- Klik på "Næste", vælg alle QC kasser, og klik på "Importer".
- Klik på "Ny Study" fanen. Navn og beskrive undersøgelsen og gemme.
- I den nye undersøgelse, skal du vælge "Ny Experiment" fanen og navn og beskriver den nye eksperiment. Klik på "Næste" og vælg RLF mappe fra venstre rude, der indeholder de relevante rå datafiler, der er blevet uploadet. Når det er blevet valgt, skal du klikke på "Keep Selected", og klik derefter på "Næste".
- Tilføjeanmærkninger, hvis det ønskes, og klik "Næste".
- Vælg baggrundssubtraktion metode; enten negativ kontrol, blank lane subtraktion, eller en brugerdefineret subtraktion kan vælges. Når det er valgt, klik på "Næste".
BEMÆRK: Bestem den mest hensigtsmæssige korrektion baggrund tilgang baseret på de tekniske parametre og biologisk sammenhæng med undersøgelsen.
BEMÆRK: Tæller er mindre præcis til lav overflod mål. Med henblik på undersøgelsen beskriver vi her blev data først behandlet uden baggrund korrektion for at undersøge QC parametre og undersøge variation i tæller for miRNA forskellige forekomster tværs tekniske gentagelser. Dataene blev derefter oparbejdes ved hjælp af en tærskel 25-count baggrund. - Vælg "Top 100" normalisering, og klik derefter på "Næste".
- For at opnå ratio data, skal du vælge forholdet parametre, og klik derefter på "Næste".
- Klik på "Færdig".
- Klik på navngivne exeksperimentere i venstre rude for at afsløre en drop down menu, der indeholder "Raw", "Normaliseret", "sammenbygget", "Ratio data", og "Analyse af data".
- Klik på "Rå data" og observere en QC rapport i højre rude. Overhold et flag ud for de prøver, som ikke består standard QC parametre. Byg en ny "Undersøgelse", som ikke omfatter de mærkede prøver og oparbejde som beskrevet, eller blot udelukke flagede QC prøver fra dataanalyse trin ved at vælge "Ekskluder prøver ved QC / normalisering flag".
- Export "Raw", "normal" eller "sammenbygget" datafiler i CVS eller en anden kompatibel filformat til analyse i anden statistisk eller microarray software.
- Vælg "Normalized data" fra venstre rude og vælge de prøver, der skal indgå i analysen i højre rude.
- Klik på "Analyse", og vælg den ønskede analyse (f.eks, "Heat Kort & #34 ;, "Violin Plot", "Box Plot", "Scatter Plot", eller "Histogram Plot"). Vælg de ønskede Udelukkelseskriterier kasser (fx udelukke vildskuddet prøver eller gener, udelukke prøverne af QC flag, udelukke kontrol gener, og / eller udelukke normaliseringsreglerne sonder fra dataanalyse).
- Vælg individuelle prøver, der skal udelukkes fra analysen som ønsket.
- Vælg individuelle gener, der skal udelukkes fra eller indgår i analysen som ønsket.
- Vælg parametrene for den valgte statistiske eller datavisualisering manipulation og klik på "Finish".
Representative Results
Transkriptomisk perturbation i funktionelle lidelser kan være hårfin, og for at detektere disse subtile ændringer i ekspression, kvantificering af genekspression skal være præcis. Den genekspression platform assaysystem reducerer teknisk støj gennem sin højt automatiseret karakter, og den unikke kemi det bruger producerer høj præcision genekspression data. Teknisk replikater vist i figur 1 demonstrerer høj reproducerbarhed i både endogene (blå prikker) og viral miRNA (orange prikker; housekeeping-gener er repræsenteret ved gule prikker) ekspression kvantificering, der er muligt ved hjælp af denne metode. Ved hjælp af denne metode, viral (figur 2a) og endogene (figur 2b) miRNA, der viser afvigelse fra forventet udtryk, som defineret af sunde undersøgelsens deltagere, kan identificeres som mål af interesse i IBS. Det skal bemærkes, at det er uklart, om de virale miRNAdetekteres her stammer fra virale gener integreret i det humane genom eller fra virusmængde. Da analysen kun tæller modne miRNA med single-nukleotid specificitet, cross hybridisering med lignende endogene humane miRNA er usandsynlig. Ikke desto mindre, differentierede steady state niveauer af disse molekyler er af interesse som biomarkører. Præcisionen af metoden giver mulighed for at blive opdaget forstyrrelser blandt lavt udtryk mål, som nøjagtig påvisning af disse udskrifter ikke er oversvømmet af mere rigelige udskrifter. Subtle perturbationer kan også pålideligt observeret. Figur 3 og 4 viser nogle af disse forstyrrelser i cirkulerende miRNA i IBS og IBS-undertyper sammenlignet med raske kontroller, og figur 5 og 6 (begge tilpasset fra 3) viser de to væsentligste differentielt forhøjede miRNA (Figur 5: miRNA 342-3p, Figur 6: miRNA 150). i IBS deltagere figur 6 er et eksempel på den grafiske produktion af resultater, der genereres fra det tilknyttede programmel.
. Figur 1: Normaliseret Tæller fra to Tekniske Gentagelser Tekniske replikater køre på to separate patroner viser høj lineær korrelation (r 2 = 0,90, y = 1.03x - 0,4) over området af den normaliserede (normaliseret til top 100 udtrykte miRNA) miRNA tæller (log2 tæller på x- og y-akse). Scatter plot omfatter data for endogene humane miRNA i blå (654 miRNA), endogene virale miRNA i orange (80 miRNA), og husholdning gener i gul (8 gener). Endogene virale miRNA var tilgængelige på tidligere versioner af analysen (version 1.4 blev anvendt her), men er ikke længere på den standard assay, selv om de er tilgængelige som brugerdefinerede tilføjelser./54693fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Normaliserede greverne af Viral og endogene humane miRNA i IBS-forstoppelse (IBS- C) versus raske kontroller Forstyrrelser i (a) viral (orange) og (b) endogene humane miRNA (blå) er tydelige i dette eksempel, hvor miRNA tællinger (log2 forvandlet) af IBS-C deltagere (y-akse) er svandt mod miRNA tællinger (log2 forvandlet) af raske kontroller (x-akse). De fleste af miRNA udtrykker meget på samme måde i begge populationer, men nogle især afviger fra den korrelation. Disse afvigelser er tydelige blandt både sjældne og rigeligt udtrykte mål. Venligstklik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. MiRNA er betydeligt og ensartet udtrykkes forskelligt i IBS Sammenlignet med raske kontrolpersoner differentielt udtrykte miRNA i IBS er afsløret ved hjælp af den lineære diskriminant analyse effekt størrelse metode, som kombinerer test af statistisk signifikans med kontrol for sammenhæng i kategorier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. MiRNA er betydeligt og ensartet udtrykkes forskelligt i IBS undertyper Sammenlignet med raske kontrolpersoner miRNA var differentially udtrykt i IBS-undertyper (-D: diarré, -C: forstoppelse). sammenlignet med raske kontrolpersoner ved hjælp af lineære diskriminant analyse effekt størrelse metode, som kombinerer test af statistisk signifikans med kontrol for sammenhæng i kategorier Klik her for at se et større version af denne figur.
Figur 5:. Differentiel ekspression af miRNA-342-3p Kronisk mavesmerter af ukendt ætiologi er en vigtig symptom på IBS. Boksen plot viser, at MIR-342-3p (normaliserede tællinger på y-aksen), en miRNA forbundet med kronisk blære smerter af ukendt ætiologi, viste sig at være til stede i omløb ved højere tællinger på tværs af alle IBS undertyper sammenlignet med raske kontroller. Søjlerne repræsenterer ikke-outlier rækkevidde, kassenes den inter-kvartil rækkevidde og den blå firkant medianen tæller. Modificeret fra 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Differentiel ekspression af miRNA-150 A violin plot viser, at IBS deltagere havde signifikant højere cirkulerende miR-150 tællinger sammenlignet med raske kontroller (log2 forvandlet tæller på y-aksen).. Kurverne angiver hyppigheden af tællinger i kategorien, de lodrette streger repræsenterer den 1. og 3. kvartiler, og den røde firkant angiver medianen tæller. Modificeret fra 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
På miRNA assayet især det kritisk ikke at bruge urensede lysater (disse kan bruges i mRNA og protein assays), som reagenserne ikke er blevet optimeret til brug med lysater, og prøveforberedelse reaktioner sandsynligvis vil blive inhiberet. Derudover forureninger fremført fra lysis og RNA oprensningstrin (f.eks guanidinium forbindelser, ethanol og phenoler) kan inhibere ligerings- og prøve rensning reaktioner. God kvalitet RNA er derfor afgørende for følsomheden og nøjagtigheden af miRNA-analysen.
Ved hjælp af en thermocycler med et opvarmet låg er afgørende for at sikre korrekt temperaturkontrol at optimere ydeevnen for alle reaktionstrin. Under trin 3.5.1, er det vigtigt ikke at fjerne strimlerne fra thermocycler for at holde temperaturen under tilsætningen af ligasen. Fjernelse strimlerne at tilføje ligasevil kompromittere reaktionen. Ved afprøvning af hybridiseringstrin, er det afgørende at undgå kraftig omrystning, pipettering eller flicking ved blanding reagenser i rørene, da dette kan forskyde reporter prober. For at sikre optimal ydeevne og konsistens, er det vigtigt at grundigt at blande reagenser i rørene ved forsigtig zappe. Altid spin ned reaktioner efter blanding, og brug en ny pipettespids hver gang et reagens dispenseres at sikre nøjagtig pipettering og for at undgå utilsigtet krydskontaminering.
Ændringer og fejlfinding
De kodesæt kan tilpasses til at omfatte kun mål af interesse. På denne måde kan omkostningerne være afbalanceret for at give mulighed for afprøvning af store prøvesæt når yderligere efterforskning eller validering af en bio-signatur. Brugerdefinerede prober kan designet til gener eller mål ikke tilgængelig fra a la carte menu. Følsomhed for mindre rigelige mål eller lav koncentration RNA kan væremanipuleres ved at tillade en længere hybridisering tid og / eller ved anvendelse højere opløsning digital tælling.
I vores undersøgelse har vi brugt den foruddefinerede 800 target miRNA panel med total RNA fra fuldblod; dog kan analyserne tilpasses til at omfatte færre miRNA, hvis der behov for en mere målrettet tilgang. kan tilberedes i alt 24 prøver på en enkelt dag, forskudt i to sæt af 12, fordi to patroner mageligt kan føres gennem post-hybridisering behandling på robot prep station og afbildet på det digitale analysator den næste dag. Forskudt behandling af prøverne i partier af 12 er vigtigt at standardisere hybridiseringstiden. Patroner, der er blevet afbildet kan gemmes og opbevares ved 4 ° C til scannes igen, hvis data analyser tyder på, at en højere opløsning scanning kan forbedre påvisningen af sjældnere miRNA. Påvisning af sjældnere molekyler kan også forbedres ved at hybridisere prøverne i længere tid; dog kan forlænges hybridisering Result i overmætning og kan kun forbedre resultat, hvis den RNA-koncentrationerne er lav (som i ekstracellulær vesikel-afledt RNA). Platformens følsomhed og præcision tillader relativt lav overflod miRNA troværdigt tælles.
Begrænsninger af teknikken
Det beskrevne genekspression assay platform kun kan rumme op til 800 mål pr array. Den er derfor ikke egnet til hele miRNA-transkriptom / hele transkriptom undersøgelser. Eneste kendte, beskrives, og kan påvises specifikke mål ved hjælp af platformen, så det er ikke egnet til opdagelsen af nye molekylære arter. Andre metoder, såsom RNASeq eller andre traditionelle microarray metoder, er mere egnet til hele transkriptom forundersøgelser.
Betydningen af Teknik med Respekt for eksisterende / Alternative Metoder
IBS er kendetegnet ved en kombination af symptomer, prinmært herunder mavesmerter; visceral hypersensitivitet; og ændringer i afføringsvaner, såsom hyppig diarré, forstoppelse, eller en kombination af begge 9,10. IBS symptomer har ingen kendt organisk årsag, og patienterne ikke udgør med klinisk signifikant inflammation, histopatologiske forstyrrelser af mave-tarm væv eller systemiske markører 9-12. Forskning tyder på, at den biologiske dysregulering i IBS er subtile, subklinisk, og heterogene, med fælles temaer opstå omkring betændelse og immunforsvar 10. Derfor havde vi brug for at styre eksperimentator-introduceret variation og bruge en platform, der var i stand til pålideligt at detektere subtile forstyrrelser i genekspression. De unikke egenskaber af assayet og systemet standardisere prøvebehandling og reducere eksperimentatoren håndtering gennem automatisering, hvilket reducerer teknisk varians til at producere meget reproducerbare data. Disse funktioner giver mulighed for fokuserede undersøgelser og producere meget præcis og replicable data. Dette muliggør detektion af subtile perturbationer og perturbationer blandt lav-ekspressionsvektorer mål, kan blive overset eller oversvømmet af signalerne fra mere rigelige mål ved brug intensity- eller amplifikation-baserede metoder. PCR-baserede microarrays og RNAseq metoder er brugbare alternativer til anvendelse af den beskrevne platform og kan være attraktiv som alternativ, når større gennemløb er påkrævet, eller når formålet er at karakterisere hele transkriptom eller at lede efter nye molekyler. Dog kan alternativer ikke så godt i præcist og nænsomt detektering og kvantificering sjældne mål og subtile forstyrrelser.
Fremtidige Programmer eller vejvisning efter Mastering denne teknik
Cirkulerende miRNA udtryk i IBS deltagerne viste en række forstyrrelser, der blev fundet at være både væsentlig og konsekvent under kategori. De identificerede miRNA var forbundet med relevante pathways og patologiske tilstande, herunder en funktionel smertetilstand (miR-342-3p: kronisk blære smerter) 8 og inflammation (miR-150) 13. Eksemplet Undersøgelsen var baseret på en sonderende kohorte bruges til at definere mål og systemer af interesse. En mere målrettet, mindre miRNA vifte blev derefter konstrueret, sænke per prøve omkostninger og giver mulighed for meget større kohorter, der skal analyseres i en omkostningseffektiv måde for at validere og forfine underskrifter og biomarkører. Den genekspression platform analysesystem en balance mellem det traditionelle sonderende karakter af microarray og mere målrettet, hypotese-drevet dataindsamling at forfine og afprøve molekylære signaturer og biomarkører 14-16. Fremgangsmåden vil blive anvendt til at undersøge molekylære og protein perturbationer i in vivo og in vitro modeller, hvor de beskrevne target miRNA er eksperimentelt overudtrykt eller inhiberes. Nye assays mulighed for samtidig kvantificering af mRNA'er og proteins direkte fra celler og væv lysater. Desuden vil ved at optimere rensningen af specifikke fraktioner af perifert blod og ekskrementer (fx urin) og ved at tilpasse og optimere visse analyseparametre, molekylære profiler og underskrifter lave molekylære koncentration fraktioner (f.eks exosomal fraktioner) undersøges.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nCounter Prep-Station | Nanostring | N/A | Essential |
| nCounter Digital Analyzer | Nanostring | N/A | Essential |
| Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | Can use suitable equivalent |
| Centrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| MiniMicroCentrifuge | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Pipettes (1,000, 100, 20, 10 µl) | Any | N/A | Can use suitable equivalent |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood miRNA Kit | Qiagen | 763134 | Can use suitable equivalent |
| PAXgene Blood Tubes | VWR | 77776-026 | Can use suitable equivalent |
| nCounter Human miRNA Assay Kit | Nanostring | 150625 | Essential |
| nCounter Master Kit | Nanostring | 100050 | Essential |
| nSolver | Nanostring | N/A | Essential |
References
- Aerssens, J., et al. Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).
- Akbar, A., et al. Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain. Gut. 57, 923-929 (2008).
- Fourie, N. H., et al. Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome. Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).
- Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome. Gut. 59, 775-784 (2010).
- Zhou, Q., Verne, G. N. miRNA-based therapies for the Irritable Bowel Syndrome. Expert Opin Biol Ther. 11, 991-995 (2011).
- Orlova, I. A., et al. MicroRNA modulation in complex regional pain syndrome. J Transl Med. 9, 1-11 (2011).
- Park, C. -K., et al. Extracellular MicroRNAs Activate Nociceptor Neurons to Elicit Pain via TLR7 and TRPA1. Neuron. 82, 47-54 (2014).
- Gheinani, A. H., Burkhard, F. C., Monastyrskaya, K. Deciphering microRNA code in pain and inflammation: lessons from bladder pain syndrome. Cell Mol Life Sci. 70, 3773-3789 (2013).
- Drossman, D. A., et al. Rome III: The Functional Gastrointestinal Disorders. , 3rd edn, Degnon Associates, Inc. (2006).
- Chey, W. D., Kurlander, J., Eswaran, S. Irritable bowel syndrome: A clinical review. JAMA. 313, 949-958 (2015).
- Del Valle-Pinero, A. Y., Sherwin, L. B., Anderson, E. M., Caudle, R. M., Henderson, W. A. Altered vasoactive intestinal peptides expression in irritable bowel syndrome patients and rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. World J Gastroenterol. 21, 155-163 (2015).
- Henderson, W. A., et al. Inverse relationship of interleukin-6 and mast cells in children with inflammatory and non-inflammatory abdominal pain phenotypes. World J Gastrointest Pathophysiol. 3, 102-108 (2012).
- Pekow, J. R., Kwon, J. H. MicroRNAs in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 18, 187-193 (2012).
- Veldman-Jones, M. H., et al. Flexible Molecular Subtyping of Clinical DLBCL Samples Using the NanoString nCounter System. Clin Cancer Res. 21, 2367-2378 (2015).
- Lee, J., et al. Nanostring-Based Multigene Assay to Predict Recurrence for Gastric Cancer Patients after Surgery. PLoS ONE. 9, e90133 (2014).
- Lohavanichbutr, P., et al. A 13-gene signature prognostic of HPV-negative OSCC: discovery and external validation. Clin Cancer Res. 19, 1197-1203 (2013).
- nCountermiRNA Expression Assay User Manual (MAN-C0009-05). , NanoString Technologies, Inc. Available from: http://www.nanostring.com/media/pdf/MAN_nCounter_miRNA_Expression_Assay.pdf (2013).
